STRUCTUR ACIZI NUCLEICI

Curs general

Moleculele vieii
Viata depinde de stocarea stabila i compacta a informaiei
genetice ; Activitatile moleculelor celulare sunt guvernate de
principiile de baza ale chimiei; Apa celular, ionii anorganici, i
mici molecule organice reprezint aproximativ 75-80% din
greutatea celulei vii; Macromoleculele (proteine, polizaharide,
ADN) reprezinta restul.

Celule Procariote
Organisme unicelulare
Dou tipuri pricipale: bacterii i archaea
Relaii structurale simple

Celule eucariote
Organisme unicelulare i multicelulare
Plante i animale
Structural mult mai complexe: organite, citoschelet...

Structura celulei animale

Structura celulei vegetale

Complexitatea
structural a
organismului uman

Nucleul
Separ: ADN de citosol; transcriptia de translaie
Caracteristici: - membrana extern; membrana intern; porii
nucleari; nucleoli

La Eucariote ADN este mpachetat n cromozomi

Fiecare cromozom conine o
singur molecul linear de ADN
asociat cu proteinele.
Intregul ADN compactat n
cromozomii unui organism este
localizat n genom. Secvenierea i
alte tehnici au evideniat c peste
90% din genomul vertebratelor nu
codific pentru ARNm sau alte tipuri
de
ARN.
La
organismele
multicelulare acest ADN conine
multe regiuni care sunt similare dar
nu identice.
Imagine de cromozomi n metafaz
evideniai prin tehnica fluorescent
de hibridizare in situ (FISH)

Acizii nucleici
Acizii nucleici sunt substane care au fost pentru prima dat
izolate
din nucleii celulelor. Exist acizi nucleici i n citoplasma celulelor.
Dou tipuri de acizi nucleici:
ADN (acid dezoxiribonucleic) localizat n principal n nucleul
celulelor (cnd acesta este individualizat) ca n cazul eucariotelor);
ARN (acizi ribonucleici), prezeni n principal n citoplasma
celulelor dar i n nucleu.
Acizii nucleici ADNi ARN au rol esenial n sinteza proteinelor,
compui fundamentali ai celulei, suportul marii majoriti a activitilor
biologice.
ADN este suportul ereditii;
ARN reprezint acidul nucleic care permite sinteza proteic

Structuri generale macromolecule

Toi acizii nucleici au o structur general comun

Principalele cinci baze

din structura acizilor
nucleici

A, G, T, C sunt prezente n ADN

A, G, U, C sunt prezente n ARN

Structurile ceto-enol ale bazelor azotate

Forele de stivuire
Stivuirea inelelor de
adenin din cristalul 9-metiladenin.
Suprapunerea parial a
inelelor reprezint o asociere
tipic a bazelor n structuri
cristaline i n dubla elice a
acizilor nucleici

Terminologie nucleozide

Baze azotate
Nume

Ribonucleozide
S/3L

Dezoxiribonucleozide

Nume

S/3L

S/1L

Nume

S/3L

S/1L

Baze
Pirimidinice

Pyr

nuclozide
Pirimidinice

Pyd

2dezoxiribonucleozide dPyd
pirimidinice

dY/Yd

Citozin

Cyt

Citidin

Cyd

2.dezoxicitidina

dC/Cd

Uracil

Ura

Uridin

Urd

2-dezoxiuridina

Timin

Thy

Ribozil-timin

Thd

(2-dezoxi)timina

dThd

dT/Td

Baze Purinice

Pur

nucleozide
Purinice

Puo

2dezoxiribonucleozide dPuo
purinice

dR/Rd

Adenina

Ade

Adenozina

Ado

2-dezoxiadenozina

dAdo

dA/Ad

Guanina

Gua

Guanozina

Guo

2-dezoxiguanozina

dGuo

dG/Gd

Xantina

Xan

Xantozina

Xao

2-dezoxixantozina

dXao

dX/Xd

Hipoxantina

Hyp

Inozina

Ino

dCyd
dUrd

dU/Ud

Conformaia nucleozidelor
conformaie
envelope

conformaie twist

Conformaie C3-endo

Conformaie C2-endo

Izomeri de rotaie n jurul legturii glicozidice

Orientrile sterice permise bazelor purinice i pirimidinice n raport cu

ataarea lor la unitatea ribozic

Terminologie general nucleotide

Nume

Simboluri

Nucleozid x- fosfat

Nuc-5P

NMP

x- difosfat

Nuc-5PP

NDP

x- trifosfat

Nuc-5PPP

NTP

5- fosfat

Cyd 5.P

CMP

5- difosfat

Cyd - 5PP

CDP

5- trifosfat

Cyd - 5PPP

CTP

5- fosfat

Urd - 5P

UMP

5- difosfat

Urd - 5PP

UDP

5- trifosfat

Urd - 5PPP

UTP

5- fosfat

dThd - 5P

dTMP

5- difosfat

dThd - 5PP

dTDP

5- trifosfat

dThd - 5PPP

dTTP

Citidin

Uridin

dtimin

Adenozin 5- fosfat

Ado 5 P

AMP

5- difosfat

Ado - 5PP

ADP

5- trifosfat

Ado - 5PPP

ATP

Guo - 5P

GMP

Guanozin 5- fosfat

Structura
general
nucleotide

Conformaia unei uniti nucleotidice

este determinat de apte unghiuri de
torsiune

Structura ATP

Complexul ATP-magneziu

Complexul ATP-magneziu

cAMP

UDP-glucoza

S-adenozilmetionina (SAM)

Reactii de transfer de grupari metil

Acetil-CoA

Acetil CoA

NAD(P)+

NAD+
NADP+

FAD

Constituenii ADN i ARN

Acid
nucleic

ARN

ADN

Pentoza

D-riboza

2-deoxi
D-riboza

NMP majore
Pyr

Pur

dT

dA

dC

dG

NMP
minore

Foarte
diverse
ARNt

Derivai
metilai ai
A i C

Structura general a acizilor nucleici

Formarea legturilor
fosfodiester

ADN-dublu helix format din catene complementare

Informaia

genetic

este

purtat de molecule de ADN foarte

lungi, i codificat n secvena linear
de nucleotide A, T, C i G ;
Molecula de ADN, n form de
dubl elice, compus dintr-o pereche
de catene complementare formate din
nucleotide

care

sunt

meninute

mpreun prin legturi de hidrogen

care se realizeaz ntre perechile de
baze G-C i A-T ;

Tipuri de legturi de hidrogen (I)

mprechere de adenine n
structura cristalului de 9metil-adenin

mperecheri Hoogsteen
ntre A i T

mperechere ipotetic
ntre C i T

mperecheri tip Watson-Crick

Alte tipuri de mperecheri

Tipuri de legturi de hidrogen (II)

Tipuri de legturi de hidrogen (III)

Tipuri de legturi de hidrogen (IV)

ADN - dublu helix format din catene antiparalele

Fiecare caten de ADN posed o polaritate chimic datorat legturii
dintre glucide i gruprile fosfat, care alterneaz la nivelul scheletului.
Cele dou catene ale unei molecule
de ADN sunt antiparalele, adic posed
orientare invers;
Fiecare din cele dou catene pot
servi ca matri pentru sinteza celeilalte
catene.
Astfel, aceeai informaie genetic
este purtata de cele dou catene care
formeaz dubla elice.

Dublul Helix
caracteistici structurale

Structura ADN B
Imaginea se bazeaz pe
studiile cu raze X realizate
pe dodecamerul
d(CGCGAATTCGCG)

Structura ADN B

Vedere pertenticular pe axa helixului. n schem legturile fosforice sunt marcate n

albastru iar bazele n rou. Sint marcate n alb bazele, legturile fosfodiester i legturile de hidrogen
dintre dou baze.
Vedere de-a lungul axei helixului

Caracteristicile conformaiilor elicei ADN

Caracteristici
Sens de rsucire
Numr pb/tur
Pasul (nlinea pe
ax)/pe plan de baze
nclinare baze fa de
ax/rotaia planului
bazelor
Diametru

Conformaie B Conformaie A

Conformaie Z

drept

drept

stng

10,4 (10,0-10,7)

11

12 (6 dinucleotide)

3,4nm
0,34 nm

2,8 nm
0,26 nm

4,5 nm
0,37 nm

10
360

200
330

90
-600/dinucleotid

2 nm

2,3 nm

1,8 nm

conformaii
dPyd:pentoz
legtura glicozidic

E
anti

E
anti

E
anti

dPuo: pentoz
legtura glicozidic

E
anti

E
anti

E
syn

Mare i profund
ngust i
profund

ngust i profund
Mare i profund

ngust i profund

Fosa: mare
mic

Structura ADN A

Vedere de-a lungul axei helixului

Structura ADN A

Vedere perpenticular pe axa helixului

Structura ADN Z

Vedere de-a lungul axei helixului

Structura ADN Z

Vedere perpenticular pe axa helixului

Trecerea ADN B n ADN Z

Trecerea ADN-B n ADN Z, reprezentat la nivelul unui fragment de 4 pb, implic

rsucirea cu 1800 a fiecrei perechi de baze n raport cu lanul oz-fosfat

ADN sufer separri reversibile ale catenelor

Metode de determinare a mrimii acizilor nucleici

Metodele de determinare a dimensiunilor
acestor macromolecule se bazeaz pe
diferite caracteristici. Mrimea poate fi
determinat prin mai multe metode:
Microscopie electronic: datorit
dimensiunilor lor acizii nucleici pot
vizualizai prin aceast tehnic. Metoda se
potrivete foarte bine moleculelor de ADN
de mrime medie (cteva mii la 200 000
pb)

Electroforeza n gel:
Este o tehnic de separare a moleculelor n funcie de masa lor molecular.
Condiiile de densitate de sarcin asemntoare sunt realizate n mod natural, de ctre
scheletul oz-fosfat. De asemenea, dependena logaritmic, distan de migrare n
funcie de mrime, este bine respectat. Pentru separarea moleculelor de acizi nucleici
de diferite dimensiuni sunt folosite geluri de agaroz cu poroziti variate (Figura 2.2).
Pentru facilitarea estimrilor cantitative exist colecii de polimeri marcheri de mas
molecular utilizai pentru etalonarea separrilor. De altfel, aceast metod de
separare este omniprezent n manipulrile de biologie molecular. Electroforeza se
poate realiza i n geluri de poliacrilamid pentru situaiile n care este necesar
separarea moleculelor polinucleotidice mici sau oligonucleotidelor. Prin electroforeza
n gel de poliacrilamid este posibil identificarea unor fragmente care difer numai
printr-un singur nucleotid. Din acest motiv tehnica este foarte util n secvenializarea
acizilor nucleici i n determinarea regiunilor de polimorfism normal sau patologic
determinat de existena unor mutaii.

Mrimea unor molecule de ADN din diferite surse, comparat cu cea

a unei proteine fibroase, colagenul, i celulele procariote i eucariote.
ADN/particule/
organisme

n de baze
(kb)

Mas
(MDa)

Lungime
(nm)

(nm)

Virusuri ADN
SV40
fag X174
fag

5,2
5,4
48

3,2
3,6
32

1,7x10-3 (1,7m)
1,8x10-3 (1,8 m)
17x10-3 (17 m)

2
2
2

Procariote
E. coli

4000

2600

1,36

Eucariote
Drosofila
Om

62 000
125 000

41000
80 000

21
41

2
2

2x4
2x23

Colagen

3x1000
amino
acizi

0,33

0,3x10-3 (0,3 m)

1,5

Celule
Bacteria E. coli
Mamifere

2x10-3 (0,5x2 m)
aprox 10x10-3 (10 m)

numr de
cromoz
omi

Moleculele ADN de mrime mare sunt analizate i prin:

a) metoda clasic de ultracentrifugare cu toate c forele de

frecare existente ntre aceste molecule limiteaz cmpul aplicaiilor
(molecule de pn la 1,5 x 106 pb); Prin aceast tehnic pot fi
separate, n gradient de densitate de clorur de cesiu, urmtoarele: i)
fragmente de ADN care au un coninut diferit n guanin i citozin;
ii) ADN genomic bacterian; iii) ADN plasmidial; iv) ARN total, etc.
Diferitele tipuri de ARN ribozomal de la eucariote i procariote
poate fi separat foarte simplu prin ultracentrifugare n gradient de
zaharoz

Separarea acizilor
nucleici
prin
ultracentrifugare:
a)
Separare ADN prin
ultracentrifugare
n
gradient de CsCl; b)
separare ARN prin
ultracentrifugare
n
gradient de zaharoz

Electroforez n cmp pulsatoriu. a) principiu de separare; b)

electroforegram obinut n urma separrii unor fragmente
mari de ADN. Vizualizarea a fost realizat n urma colorrii cu
bromur de etidium.

Polimerizarea nucleotidic

Structura unei molecule ARN:

a)
evidenierea
nlnuirii
nucleotidelor i vectorizarea catenei;
b) reprezentrile prescurtat i
simbolic.

Hidroliza acizilor nucleici

Degradarea unui polinucleotid poate s se refere la: i) legtura
fosfodiester atunci cnd se produce o depolimerizare; ii) unitile nucleotidice
dac se rupe legtura glicozidic i se degradeaz componentele. n ambele
cazuri hidroliza poate fi de natur chimic sau enzimatic.

Hidroliza chimic a acizilor nucleici

Tratamentul acid afecteaz la fel ARN i ADN:
Comportamentul ARN i ADN la hidroliz bazic este foarte diferit:
Condiii

Produi de hidroliz
ARN

Acide
pH 1,0 + nclzire
pH 4,0
Alcaline

ADN

pentoze + fosfai + baze

baze purinice + AN apurinici
NMP (2 sau 3)

Produii de degradare chimic a acizilor nucleici

Schema mecanismului de hidroliza ARN prin cataliza bazic: 1. Hidroxilul din

2 este deprotonat de ctre ionul hidroxid; 2. Alcoxidul, nucleofil, atac
gruparea fosfodiester cu formarea unui diester ciclic 2: 3; 3. Un al doilea
hidroxid provoac hidroliza uneia sau alteia dintre legturile ester: se obin
izomeri 2 i 3 fosfat.

Scindarea enzimatic
Enzimele care catalizeaz hidroliza legturii fosfodiester din structura acizilor nucleici,
fosfodiesterazele, sunt numite i nucleaze. Acestea sunt prezente n toate celulele i sunt
foarte utile n metabolismul acizilor nucleici i proteinelor. O parte dintre a ceste nucleaze
sunt secretate de ctre pancreasul exocrin, n intestin, i particip direct la digestie hranei.
Aceste enzime prezint niveluri de specificitate comparabile cu cele ale peptidazelor i
proteazelor. Ele se pot clasifica n funcie de:
a) modul lor de atac al catenei: i) exonucleaze, enzimele care acioneaz la
nivelul extremitii catenelor; ii) endonucleaze, enzimele care atac n interiorul catenelor;
b) specificitatea lor fa de substrat: i) pentru tipul de acid nucleic: ribonucleaze
pentru ARN, deoxiribonucleaze pentru ADN i nucleaze pentru ambele; ii) pentru tipul de
structur: mono- sau dublu catenar;
c) specificitatea lor de recunoatere a situsurilor: i) specificitate pentru baze; ii)
specificitate pentru secvene;
d) tipul de rupere a legturii fosfodiester: i) exonucleazele i endonucleazele de tip d
scindeaz extremitatea 5 i duc la formarea de 3NMP; ii) exonucleazele i endonucleazele
de tip p scindeaz extremitatea 3 i determin formarea 5NMP (Figura 2.8);

Scindarea
enzimatic

Nucleaze

Substrate1

Tietur
tip ; specificitate

Produi

p
extremitatea 3

5-NMP

Exonucleaze
fosfodiesteraza (venin de arpe)

ARN, ADN s

fosfodiesteraza (splin)

ARN, ADN s

d
extremitatea 5

3-NMP

exonucleaza I (E. coli)

AND

p
extremitatea 3

5-NMP

exonucleaza III (E. coli)

AND

p
extremitatea 3

5NMP+ADNs

endonucleaza S1 (Aspergillus
oryzae)

ARN,ADN
s,d

p
aleatoare

5-NMP +ON n 5
P

ribonucleaz T1 (Aspergillus
oryzae)

ARN s

p
G/N

5-NMP +ON n 3
P

ribonucleaza A (pancreas)

ARN s

d-Pyr/N

3-NMP +ON n 3
P

Deoxiribonucleaza II (timus)

ADN s

d sPyr/dPur

ON n 3 P

Endonucleaze

Exemple de enzime de
restricie i situsurile
recunoscute de acestea

Exemple de enzime de restricie i palindroamele recunoscute de

acestea cu marcarea situsurilor de clivare i a axei de simetrie: a)
obinerea de capete coezive; b) obinerea de capete drepte

Endonucleaza (sursa)

Numr de situsuri de tiere

Virus SV40

fag X174

fag

EcoRI (E. coli RY13)

BamHI (Bacillus amyloliquefaciens H)

HaeIII (Haemophilus aegypticus)

19

11

>50

Metode spectrofotometrice
Determinarea absorbiei n ultraviolet cu ajutorul unui spectrofotometru
permite verificarea puritii unei soluii de ADN sau ARN. n urma determinrii
densitii optice se va obine un pic la 260 nm. Pentru estimarea puritii este necesar
calcularea raportului densitilor optice la 260 nm/280 nm care, n mod normal, trebuie
s fie apropiat de valoarea 1,8-2,0. n cazul ADN, un raport mai ridicat indic o
contaminare cu ARN. Dac exist o contaminare cu proteine (280 nm) sau fenol (270
nm), raportul va fi net inferior valorii de 1,8. Dac ADN i ARN sunt puri, cantitatea
poate fi apreciat astfel:

unitatea DO (260 nm) = 50 ng/l pentru ADN dublu-catenar

unitatea DO (260 nm) = 33 ng/l pentru ADN monocatenar
unitatea DO (260 nm) = 40 ng/l pentru ARN

Utilizarea de mini-gelulri

Determinarea secvenei primare a acizilor nucleici

Metoda chimic Maxam W. Gilbert

Metoda dideoxi a lui F. Sanger

Sinteza n faz solid a catenelor unui

polinucleotid prin metoda fosforamidiilor

Denaturarea
ADN

Msurarea absorbiei moleculelor denaturate

Determinarea Tm

Analiza denaturrii ADN

Renaturarea
ADN

Estimarea absorbanei n funcie de structur i

temperatur

Absorbana relativ a ADN monocatenar i bicatenar

Estimarea denaturarii termice

Electroforeza i autoradiografia ADN

Ultracentrifugarea

Ecuaiile Svedberg

Ultracentrifugarea ADN n gradient de CsCl

Ultracentrifugarea ARN n gradient de sucroz

Enzime de restricie

Super-helixurile ADN

Linking number

Writhing number

Forme suprarsucite

Structuri topoizomere

Topoizomeri i
topoizomeraze

Separarea topoizomerilor ADN SV40 DNA

evideniaz existena mai multor topoizomeri
cu un numr diferit de suprarsuciri

Rolul topoizomerazelor n replicarea ADN

Moleculele de ADN se pot ndoi i ncolci n
spaiu conducnd la modificri de topologie cum ar
fi formarea supra-rsucirilor
Topoizomerazele
sunt
enzime
care
controleaz topologia ADN i realizeaz etape
eseniale n diferite etape ale replicrii avnd drept
rezultat nlturarea constrngerilor.

Topoizomeraze

Topoizomeraza de tip I relaxeaz ADN prin inducerea de

tieturi la nivelul unei singure catene a duplexului ADN

Topoizomeraza de tip II modific topologia ADN prin

scindarea si resudarea ambelor catene

Mecanism topoizomeraze

Modelul activitii catalitice a topoizomerazei II (ADN

giraza) din E. coli

ADN giraza nltur super-rsuricirile pozitive care apar n

mod normal la nivelul furcii de replicare

Separarea moleculelor de de ADN circular replicate este

realizat de topoizomeraza de tip II

Topoizomeraza de tip II separ

cromatidele lineare surori

Discuii
De ce T n ADN i U n ARN
De ce deoxiriboz n ADN i riboz n ARN
De ce 2 helixuri (catene ) n ADN i una n ARN

ADN de la diferite organisme:

Virusurile
Procariotele
Eucariotele
ADN din mitocondrii (ADNmt)

Tipuri de legturi de hidrogen care sunt

specifice structurii secundare a ARN

Tipuri de baze
modificate
prezente n
structura acizilor
nucleici

Structura ARN de transport: a) Motivele elementare

de structur 2-D; b) Structura teriar n form de L.

Tipuri de structuri secundare posibile ale ARNr de

tip 16S: a) la archebacterii; b) eucariote, drojdii; c)
mitocondrie de mamifer (bovine)

Structura ARNr de 16 S de la E. Coli de 1542 nucleotide

bazat pe compararea secvenelor de la diferite tulpini (se
presupune ca aceasta structura este conservata evolutiv)

Sinteza moleculelor de
ARNm: a) transcripia ARNm
policistronic la procariote; b)
transcripia i maturarea
ARNm la eucariote; ARN
transcris de la nivelul unei
uniti complexe (albastru)
poate fi procesat pe mai multe
ci pentru a conduce la unul sau
la mai multe uniti ARNm
monocistronice funcionale.
Liniile punctate marchez
nlturarea intronilor.

Moleculele de ADN ARN posed conformaii diferite

Inversiunile repetitive formeaz structuri foldback

Schema unei molecule de ARNt ncrcat: a) schema general

a structurii secundare a moleculei; b) modul de formare a
legturii ntre ARNt i aminoacil

Recunoasterea
codon
anticodon

Tipuri de molecule de
ARNt. Sunt marcate
elementele de identitate
majore n cele patru tipuri.
Fiecare baz din structura
ARNt este reprezentat de
cercuri pline. Cercurile
roii indic poziiile
identice pentru
recunoaterea ARNt de
ctre aminoacil-ARNt
sintetaz. Bazele din
structura anticodonului
care reprezint elemente de
identificare sunt subliniate.

Diferitele tipuri de ARN

Moleculele de ARN mesager
Moleculele de ARN de transfer: structura secundar sub
form de frunz de trefl; structura teriar 3-D n L a
moleculelor ARNt
Moleculele de ARN ribozomal; particulele ribozomale
Ribozimele
Moleculele snARN

Comparaie ARNm la procariote i eucariote

Procariote: operonii
bacterieni ARNm este
policistronic;
Eucariote:
ARNm este monocistronic i
conine exoni i introni.

Exemple de structuri adoptate de ARNr

Structura ribozomilor la procariote & eucariote

Structura general a ARNt

Exemple de molecule ARNsn

Structura cap de ciocan a unei ribozime

ADN mitocondrial i din cloroplaste

Se consider c mitocondriile au evoluat din bacterii care prezint o relaie
simbiotic cu celulele ancestrale care conin un nucleu eucariot. Majoritatea genelor
originale din aceste organite au fost transferate genomului nuclear n timpul evoluiei,
pstrnd diferite gene n organitele diferitelor organisme;
ADNmt de la mamifere conine numai aprox 16 kb; acesta nu conine introni
i prezint numai o mic regiune necodant. ADNmt de la plante i drojdii este mult
mai mare. Toate tipurile de ADNmt codific pentru ARNr, ARNt i pentru cteva
proteine implicate n transportul mitocondrial al electronilor i n sinteza ATP;
Majoritatea ADNmt este motenit mai degrab din ou (ovul) dect din sperm,
mutaiile n ADNmt fiind motenite pe linie matern;
Ribozomii mitocondriali se aseamn cu ribozomii bacterieni ca structur,
sensibilitate la cloramfenicol i rezisten la cicloheximid;
Codul genetic pentru ADNmt de la animale i fungi difer de cel bacterian i
de cel al genomului nuclear prin aceea c numeroi codoni codific pentru aminoacizi
sau semnale STOP alternative; Mitocondriile plantelor par s foloseasc codul standard
nuclear i bacterian;
Mutaiile ADNmt pot determina maladii neuromusculare umane, probabil
datorit necesitii crescute de ATP a acestor esuturi. n general pacienii prezint un
amestec de mitocondrii care conin ADNmt normal i mutant n celule (heteroplasmie).
Severitatea fenotipic este mai mare cu ct proporia de ADNmt este mai mare;
ADN din cloroplaste este circular i conine aproximativ 120-160 kb, n
funcie de speciile de plante. Acestea codific pentru aproximativ 120 de proteine i
folosesc codul genetic standard.

ADN
mitocondrial
uman