1.

Metode de marcare molecular

bazate pe restricie enzimatic

2. Migrarea produilor in gel de

poliacrilamid

Genomul uman: 46 perechi de cromozomi

Componentul principal al cromozomilor: AND
(conine informaii pentru producerea proteinelor necesare vieii)
din cele 3 mld. de perechi de baze (pb)
circa 4% codific proteine
restul sunt adesea doar de umplutur
secvene repetitive organizate n
aglomerri (clusters)
De ex: secvena D1S80,
(AGGACCACCAGGAAGG)n)
ADN este identic n cea mai mare parte,
variabilitatea gsindu-se mai ales n aceste
secvene repetitive

Secvenele (10-100 pb per repetiie), pot fi

analizate folosind enzime de restricie,
- funcioneaz ca foarfeci moleculare i taie
ADN-ul la nivelul unor secvene specifice

Enzimele de restrictie (ER)

sunt endonucleaze bacteriene care scindeaz moleculele

ADN (prin hidroliza legturilor fosfodiester

dintre nucleotide) la nivelul
unor zone strict specifice
genernd fragmente de
lungimi variabile
fragmente de restrictie (FR)

Enzimele de restrictie
Numrul si dimensiunea fragmentelor generate depind:

- frecvena cu care apar situsurile de recunoatere

ale enzimei respective

Enzimele de restrictie
EcoRI : GAATTC

Nomenclatura
numr mare de enzime de restricie a impus adoptarea unei
nomenclaturi universale:
- un cod de 3 litere (italic) prima litera semnificnd genul
- celelalte 2 specia bacterian de la care a fost izolat enzima
(spre exemplu, Eco Escherichia coli);
- poate fi o a patra liter (n format normal) indic tulpina
bacterian (ex: EcoR);
- dac are mai mult de 1 sistem de restricie-modificare, apar
numere romane: I, II, III

BglI BglII
(Bacillus globigii): AGATCT
HindIII (Haemophilus influenzae) : DNA sequence AAGCTT
TaqI
(Thermus aquaticus): 5'TCGA
3'AGCT

Enzimele de restrictie

Marcarea RFLP
n ntregul genom uman, o secven de recunoatere de 6 pb apare de circa 730
000 de ori
dac se taie genomul cu o anumit enzim de restricie, se obin aproximativ 730
000 fragmente de restricie de lungimi diferite
- ceea ce nseamn c i lungimea fragmentelor respective de restricie este
diferit ntre indivizi
Numim acest fenomen polimorfismul lungimii fragmentelor de restricie
(RFLP - restriction fragment length polymorphism).
Tehnica se bazeaz pe proprietatea endonucleazelor de a recunoate

secvene specifice scurte de ADN (4-8 pb) i de a rupe molecula de ADN

la nivelul acestor secvene
Datorit faptului c secvenele recunoscute de endonucleaze se repet
aleatoriu de mai multe ori de-a lungul genomului, vor rezulta n urma
digestiei enzimatice cu o (anumit endonucleaz) mai multe fragmente de
lungimi diferite
Scopul analizei RFLP este obinerea de amprente genetice
Marcarea RFLP se bazeaz pe tehnica Southern Blot
dezvoltata de E. Southern

Principiul tehnicii Southern Blot

-Extragerea ADN; -Restricia AND
-Electroforeza produsilor PCR
-Gel incubat in NaOH 0,5 M cu scopul
obtinerii de lanturi de ADN monocatenare;
- transfer pe o membrana de nitroceluloza
Dupa uscarea ei, membrana se aseaza pe un film de raze X
-imersata intr-o solutie care contine un singur lant de AND
complementar cu secventa ADNului de analizat
-proba radioactiva este indicata prin aparitia unui spot alb
pe film

Exemplu: enzima RsaI in cazul RFLP

Migrare in agarosa
The diagnosis of Plum Pox virus in 10
infected leaves, using P1 and P2
primers

Migrare in poliacrilamida
PPV-D strain: 61 pb
182 pb

243pb
182 pb

PPV-M strain: 243 pb

61 pb

PPV-Rec strain: 61 pb
182 pb
243 pb

Viral strain differentiation with RsaI, using RFLP technique

Alte tehnici bazate pe digestia enzimatica

Markerii AFLP
- bazat pe amplificarea selectiv a o parte
din fragmentele de ADN, obinute n urma
digestiei enzimatice
- produii de amplificare vor fi migrai
electroforetic n gel de poliacrilamid
- polimorfismele sunt date de lungimea
fragmentelor amplificate, metoda fiind
foarte sensibil
adaptai pentru studierea speciilor
neexploatate

Gelul de poliacrilmida
se obin prin polimerizarea a dou componente acrilamid i metilen

bis-acrilamid
mai frecvent se folosesc geluri n care concentraiile celor dou
componente sunt 16% (acrilamida) i 0,4% (metilen-bis-acrilamida).
reacie este iniiat de persulfatul de amoniu, (NH4)2S2O8 - (PSA)
ca si catalizator se folosete N,N,N,N-tetrametilendiamina (T-EMED)
naintea polimerizrii amestecul este a ezat ntre dou plci de sticl
Se las gelul la polimerizat timp de 20-30 min
Gelul astfel polimerizat este ataat la un sistem de separare vertical.
sistem ce permite contactul cu ambele capete ale gelului prin
intermediul unor camere destinate soluiilor tampon (n care se afl
electrozii).
probele (proteinele) denaturate sunt amestecate cu un colorant,
albastru de bromfenol, ncrcat negativ
Tampon pentru electroforez : TBE 1x
Dupa migrare gelul de coloreaza prin metoda (argentica - AgNO3)

Tehici care se folosesc de migrarea in gel de poliacrilamida

Tehnica PCR, bazat pe primerii SSR (Simple sequence repeat)

pentru a putea fi utilizai ca markeri trebuie cunoscut localizarea lor n

genom
- prezint un grad ridicat de polimorfism - secvene scurte (1-10 pb, de
obicei 2-3 pb) de nucleotide ce se repet n tandem
- majoritatea markerilor SSR - constituii din repetiii dinucleotidice
[(AC)n, (AG)n i (AT)n] abundente i prezint un grad ridicat de
polimorfism

Identificarea polimorfismului se face prin electroforez n gradient de

denaturare (DGGE denaturing gradient gel electrophoresis)

- Gel de agaroz pt. produii ce difera ntre ei ca mrime prin

fragmente mai mari de 20 pb
- gel de 6%poliacrilamida pt produi ce difera intre ei ca
marime prin fragmente mai putin de 10 - 20 pb
Markerii SSR i gsesc aplicabilitate n:

- genotipizarea indivizilor,
- evaluarea germoplasmei, a diversitii genetice,
- cartarea genomului,
- amprentarea genetic,
- studii de filogenie i de evoluionism.

Amprenta genetic realizat la varieti de cire cu primerul SSR - UCDCH17

186pb
188pb
190 pb

Markerii SRAP (Sequence-related amplified polymorphism)

identificare

germoplasmei,
construcia de harti
cromozomale,
amprentarea genomice
SRAP technology is used
to analyze genetic
similarities among
genotypes and genetic
differentiation between
the species