Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Metode Analitice Perform Ante Aplicate in Cercetarea Farmaceutica UV IR MS RMN
Metode Analitice Perform Ante Aplicate in Cercetarea Farmaceutica UV IR MS RMN
2
h = constanta lui Planck = 6,62.10-27 erg.s
se msoar n:
- microni ( ) 1 =10-6 m = 10-3 mm
- milimicroni (m ) 1m = 10-9 m = 10-6 mm
- nanometri (nm) 1nm = 10-9 m = 10-3 .
1 nm = 10-9 m = 10-7 cm = 10; 1 = 10-8 cm = 10-1 nm = 10-10 m;
1mm = 10-6 m = 10-4 cm = 103 nm.
Funcie de lungimea de und a radiaiilor electromagnetice, domeniile spectrale
sunt cele indicate n tabelul 1.
Tabelul 1. Domeniile spectrale funcie de lungimea de und
Dup cum se poate observa i din relaia , aceste mrimi sunt invers
proporionale, deci la lungimi de und mari, energiile sunt mici i invers.
O cuant luminoas (un foton) poate fi absorbit de un atom sau molecul, dac
prin aceasta atomul sau molecula trec la unul din nivelele de energie superioare ce
difer de starea de plecare prin energia fotonului.
Energia moleculei () este dat de suma energiilor electronice, de vibraie i de
rotaie:
= electronice + vibraie + rotaie
Exist dou tipuri de salturi de energie molecular obinute n mod diferit:
- prin excitaii electronice, ce corespund energiilor radiaiilor cu cuprins
ntre 200 i 800 nm, implicnd saltul electronilor pe nivele energetice superioare - un
orbital de antilegtur - acestea determin spectrele de absorbie n UV i VIS (spectre
electronice);
3
- prin excitaiile moleculare determinate de radiaiile IR ( = 2,0 - 25 m,
domeniul cel mai utilizat) rezult spectrele moleculare (de rotaie vibraie sau spectrele
IR)
- de rotaie 100 - 15000 m;
- de vibraie 1,5 - 100 m.
Absorbia radiaiei electromagnetice de o anumit lungime de und este
dependent de caracteristicile structurale ale moleculei i d o indicaie asupra
prezenei acesteia, figura 1.
4
Tabelul 2. Energia i lungimea de und corespunztoare energiei interne
Tipul de energie intern
Rotaie
Vibraie
Electronic
Domeniul, eV
1,24.10-2 - 1,24. 10-4
0,828 - 0,0124
8,28 - 0,828
corespunztoare
energiei
100 - 10 m
1,5 - 100 m
150 1500 nm
5
- hipocrom: maximum de absorbie se deplaseaz spre lungimi de und mai
mici (violet) i intensitatea maxim de absorbie este influenat de factori structurali i
de mediu.
Creterea intensitii absorbiei se numete efect hipercromic, scderea
intensitii absorbiei se numete efect hipocromic.
n figura 4 sunt prezentate i alte fenomene ce apar n cazul absorbiei luminii
de ctre moleculele substanelor.
S
1
T
1
VR 1
S0
1C
ISC1
ISC2
A
VR 2
VR 3
P
VR 4
I / Io = 10- cl ; I = Io.10- cl
unde: I = intensitatea luminii transmise (ce prsete proba);
Io = intensitatea luminii incidente (ce ptrunde n prob);
= coeficient molar de extincie sau absorbtivitate molar;
6
c = concentraia soluiei ce absoarbe (n mol/L);
l = grosimea stratului absorbant (cm).
I / Io = T = transmitan sau transmisie - este deci raportul dintre intensitatea
luminii transmise I i intensitatea luminii incidente Io.
Aplicnd logaritmul pentru Io / I rezult:
log (Io / I) = log (1 / T) = cl = A = E = D = absorban (A), extincie (E) sau
densitate optic (D).
Deci, legea care st la baza spectrofotometriei se exprim simplu:
A = .c.l
Legea de baz a spectrofotometriei spune c absorbana (extincia) este
proporional cu concentraia i cu grosimea stratului absorbant.
O alt mrime utilizat n spectrofotometrie rezult tot din relaia de mai sus.
Raportul A / c.l = a = absorbtivitate sau coeficient de extincie (k), n care c este
concentraia (n g / L) (alt unitate de concentraie dect molaritatea) i l este grosimea
stratului absorbant (n cm).
Dac n relaia de mai sus, l = 1 cm, c = 1 mol/L, relaia devine:
A=
se numete n acest caz absorbtivitate molar (absorban molar sau
coeficient molar de extincie). Aceast mrime este o caracteristic a moleculei i
variaz numai cu lungimea de und. Deci, prin absorbtivitate molar se nelege
absorbana unei soluii cu concentraia de 1 mol / L i grosimea stratului absorbant de
1 cm, la o anumit lungime de und.
O alt mrime utilizat este absorbana specific (coeficient de extincie
specific sau simplu extincie specific).
E1%
Se noteaz A1%
1cm (FR X) sau 1cm i reprezint absorbana unui strat de soluie
Domeniul n care
Solventul
absoarbe (nm)
pn la 190
Diclormetan
Domeniul n care
absoarbe (nm)
200 230
8
n-Hexan
Metanol
Etanol
Ciclohexan
Eter etilic
Acetonitril
1,4-Dioxan
Izooctan
Glicerin
pn la 195
200 210
200 210
200 210
200 210
200 212
200 220
200 220
200 230
1,2-Dicloretan
Cloroform
Acetat de etil
Tetraclorur de carbon
Dimetilformamid
Benzen
Toluen
Piridin
Aceton
200 233
200 250
200 260
200 265
200 270
200 280
200 285
200 305
200 - 330
Metode de dozare
Metode directe
In cazul substanelor la care se cunoate valoarea absorbanei specifice sau
molare determinarea se face astfel:
Se msoar absorbana (densitatea optic - D, A, E) a soluiei de analizat si
folosind relaia A = .c.l se determin concentraia cunoscnd valoarea lui i l,
(l reprezint grosimea cuvei i de regul este de 1 cm = 10 mm).
Dac pentru o substan se cunoate valoarea absorbanei specifice, se poate
calcula concentraia n substana de analizat pe baza relaiei:
c=
A
1%
A
1cm
=> c n g% (m/v)
................................. c g/100 ml
Metode indirecte
La soluia de analizat se adaug un reactiv ce determin scderea absorbanei
(de exemplu prin formarea unui complex). Curba de etalonare va avea forma
urmtoare, figura 6:
Metoda diferenial
Este o tehnic spectrofotometric n care soluia de referin (martorul) conine
componentul major din prob iar spectrul nregistrat reprezent diferena dintre
absorbana probei i a soluiei de referin.
10
Deosebirea fa de metodele clasice const n nlocuirea martorului clasic cu
aceast soluie de referin.
De exemplu, la determinarea liganzilor pentru anumite enzime, soluia de
referin este constituit din enzima i solvent iar proba conine enzim i ligandul n
acelai solvent.
Titrimetrie spectrofotometric
Se determin punctul de echivalen ntr-o titrare prin msurarea variaiei
absorbanei funcie de volumul de soluie adugat. Se reprezint grafic aceast
variaie. Punctul de inflexiune reprezint volumul de echivalen. Curbele de titrare
pot avea formele (1) in cazul in care solutia titrata este colorata si la titrare culoarea
dispare, sau (2) cazul in care produsul de reactie este colorat, figura 7.
Spectre derivate
Spectrul de absorbie este reprezentarea grafic a absorbanei funcie de
lungimea de und, A = f () - spectru de ordin 0. n scopul analitic acest spectru
poate fi derivat, obinndu-se spectrele derivate:
- de ordinul nti:
dA
= f ' ()
d
- de ordinul doi:
d2A
= f " ()
2
d
- de ordinul n:
dnA
= f n ()
dn
11
n figura 8 sunt prezentate efectele derivrii unui spectru cu un singur maxim de
absorbie.
Derivata I-a se obine prin reprezentarea vitezei de variaie a absorbanei n
funcie de lungimea de und, spectrul ncepe i se termin la valoarea zero, trecnd
prin zero la aceeai valoare a lungimii de und corespunztoare maximului de
absorbie.
12
Spectrele derivate pot fi utilizate la confirmarea identitii unui compus prin
compararea cu spectrele unor compui de referin. Dac spectrele sunt similare
compuii sunt identici.
Un efect nedorit al procesului de derivare este scderea raportului semnal /
zgomot odat cu creterea gradului de derivare.
Aplicaii
Efectuarea unei determinri cantitative (dozri) spectrofotometrice sau
elaborarea unei noi metode de dozare cuprinde urmtoarele etape de lucru:
a) Studiul reaciei chimice ce st la baza determinrii (reacie de culoare)
implicnd:
- alegerea reactivului de culoare,
- a solventului, stoechiometria reaciei,
- viteza de apariie a culorii,
- stabilitatea n timp a speciei colorate,
- influena diferiilor factori asupra reaciei de culoare (pH, temperatur, ordinea
adugrii reactivilor, prezena speciilor strine, interfereni),
- sensibilitatea reaciei de culoare,
- domeniul optim de concentraie.
b) Studiul aspectului fizic al determinrii: alegerea lungimii de und la care
compusul colorat prezint absorban maxim i a metodei de msurare.
c) Verificarea valabilitii legii Lambert-Beer.
d) Construirea curbei de etalonare.
e) Msurarea absorbanei probei de analizat (prelucrat n aceleai condiii cu
etalonul) i deducerea valorii concentraiei de pe curba de etalonare.
Sensibilitatea metodei spectrofotometrice depinde de doi factori: sensibilitatea
reaciei de culoare i sensibilitatea nregistrrii (observrii) diferenelor mici de
absorban.
Sensibilitatea reaciei de culoare este proporional cu coeficientul molar de
extincie al substanei ce absoarbe.
Pe baza unor considerente teoretice se poate prevedea c valoarea maxim a lui
este de ordinul 105 (100000).
Sandell afirma c: sensibilitatea (S) unei reacii de culoare este dat de
cantitatea de substan ( g) dintr-un strat de soluie cu seciunea de 1 cm2 ce produce
o absorban egal cu 0,001 (de exemplu, sensibilitatea reaciei Fe2+ cu o-fenantrolin
este 0,05 g/cm2; iar pentru Mn2+ dup oxidare la MnO - este 0,1 g/cm2).
4
13
14
Pentru determinarea n vizibil se utilizeaz reactivi de culoare: de exemplu
pentru fenobarbital acetatul de cobalt i izopropilamin. ( max = 560 nm).
Acidul ascorbic
Spectrul de absorbie n UV trasat n soluie de HCl 0,01N prezint
max
= 245
A1%
nm i A1%
1cm =695, iar n tampon fosfat de pH = 6,4 max = 265 nm, 1cm = 945.
Pentru domeniul vizibil se utilizeaz o serie ntreag de reacii de culoare cum ar fi
reacia produsului de oxidare (acidul dehidroascorbic) cu hidrazine => hidrazone
colorate.
n reacia cu diclorfenilindofenol se obine o curb descendent (decolorare).
Sulfamide
Metodele de dozare ale sulfamidelor sunt prezentate n tabelul 4.
Tabelul 4. Absorbana specific pentru cteva sulfamide
Sulfamida
Sulfapiridina
Sulfapiridina
Sulfapiridina
Sulfadiazina
Tolbutamid
(UV)
240
261
270
270
228
max
A 11%
cm
620 (ap)
680
857
844 (etanol)
500 (etanol)
15
Tabelul 5. Reactivi folosii pentru determinarea spectrofotometric a unor cationi.
Reactivul
Alizarina
Ionul ce se
determin
Zr
max
525
max
5,3.103
1,7.104
6,6.104
Acidul cromotropic
Difeniltiocarbazona
Ti
Pb
460
520
8-hidroxichinoleina
Nitrozo-R (sare de Na)
Al
Co
386
500
Fe (II)
Zn
508
515
6,6.103
1,5.104
1,1.104
2,3.104
Cu
Mn
436
460
1,3.105
9,8.104
1,10-fenetrolina
Piridilazonaftol
Ditiocarbamat de Na
Bis - baze Schiff
Hormonii corticosteroizi
Hormonii
corticosteroizi
(hidrocortizon,
flumetazona,
fluocinolona,
1%
prednisolona etc.) prezint maxim de absorbie la max = 240 nm, A1cm = 400.
Pentru dozri n vizibil, reacia cu albastru de tetrazoliu max = 525 nm.
Acidul salicilic i derivaii si
Acidul salicilic i derivaii si se determin prin reacia cu Fe3+ n mediu neutru,
obinndu-se compui cu max = 525 nm.
16
n aceste ecuaii s-a inut seama de faptul c absorbana total la cele dou
lungimi de und este determinat de suma componentelor x i y (conform spectrului de
absorbie)
Prin rezolvarea sistemului de ecuaii, rezult:
cx =
A 1 AY1%
A 2 AY1%
2
1
;
1%
1%
b(A1X% 1 AY1%
A
)
2
X2
Y 1
cy =
A 2 A1X% 2 b c x
AY1%
b
2
unde:
cx = concentraia componentului x n prob (% m/v);
cy = concentraia componentului y n prob;
A 1 = absorbana probei la lungimea de und 1;
A 2 = absorbana probei la lungimea de und 2;
A1%
x 1 = absorbana specific a componentei x la lungimea de und 1;
A1%
x 2 = absorbana specific a componentei x la lungimea de und 2;
absorbana specific a componentei y la lungimea de und 1;
A1%
y 2 = absorbana specific a componentei y la lungimea de und 2;
A1%
y 1 =
17
Pentru a calcula absorbana specific a celor dou componente la cele dou
lungimi de und (dac nu se cunoate) se folosesc soluii etalon de concentraie 1%
(m/v).
Se poate determina concentraia i folosind coeficientul molar de extincie
(A = .c.b), sistemul de ecuaii fiind asemntor. Se va deduce n acest caz
concentraia soluiei de analizat n moli/L.
Coeficientul molar de extincie, dac nu este cunoscut, se determin
experimental prin msurarea absorbanei soluiei etalon la cele dou lungimi de und.
De exemplu: A = 0,750; c = 4,63.10-4 M; b = 1 cm.
= A/(c.b) = 0,750 / 4,63.10-4 = 1577 cm-1. M-1
18
Spectrometria I.R.
Radiaiile IR constituie partea spectrului electromagnetic cu lungimea de und
superioar radiaiilor vizibile i inferioare undelor radio.
Spectrul electromagnetic
19
cantitativ, motiv pentru care un spectru de rotaie molecular prezint un ansamblu de
linii fine.
n schimb, radiaiile cu lungime de und mai mic (1 - 100 m), deci cu
energii mai mari, sunt capabile, atunci cnd sunt absorbite, s produc modificri tranziii - n energiile de vibraie molecular. Aceste tranziii sunt cuantificate i ele,
dar spectrele de vibraie nu vor mai prezenta linii ci benzi mai mult sau mai puin late,
datorit faptului c fiecrei tranziii de energie de vibraie i se pot asocia tranziii de
energie de rotaie.
Intensitile bezilor de absorbie sunt indicate fie prin transmisie T, fie prin
absorban A (D,E).
Transmisia = energia fascicolului IR dup trecerea prin prob / energia
fascicolului IR la intrarea n prob;
T = I/I0.
A = log (1/T) = log(I0/I)
T% = (I/I0).100
T% = transmitan]a substanei de analizat (n procente);
I = intensitatea luminii transmise;
I0 = intensitatea luminii incidente.
Exist dou tipuri de vibraii moleculare:
- vibraii de alungire (stretching) i
- vibraii de deformare (bending)
O vibraie de alungire este cea n cursul creia doi atomi se apropie i se
deprteaz periodic de-a lungul axei lor comune (se modific continuu distana
interatomic).
20
Mx
My
Se obine relaia:
1
2c
f
Mx My
Mx + My
21
n general, constanta de for a legturii este de ordinul a 5 .105 dyn/cm pentru
legturi simple, respectiv de 2 sau de 3 ori mai mare pentru legturi duble respectiv
triple.
Prin aplicarea formulei n cazul legturii C-H, considernd masele celor doi
atomi 19,8.10-24 g respectiv 1,64.10-24 g (M1 = 12 g.mol-1/6.1023 atomi.mol-1 = 19,8.1024;
M2 = 1 g.mol-1/6.1023 atomi.mol-1 = 1,66.10-24), frecvena de vibraie a acestei legturi
va fi 3040 cm-1 (3,3 m).
n realitate, frecvena pentru legturile C-H din gruprile metil i metilen apare
la 2960 i 2850 cm-1.
Imprecizia calculului se explic prin aceea c nu s-a inut cont i de influena
atomilor vecini legturii C-H. nlocuind H cu deuteriu frecvena de vibraie a legturii
C-D apare la valori mai mari ale lui ca la C-H, fapt ce servete la atribuirea
frecvenelor de vibraie C-H diverselor grupri prezente n molecul.
Calcule asemntoare celui de mai sus permit s se prevad urmtoarele
domenii de frecven pentru:
C
C
C
C
C
C
O
N
1300-800 cm-1
(7,7-12,5 m)
NO
1900-1500 cm-1
(5,3-6,7 m)
2300-2000 cm-1
(4,4-5,0 m)
22
Aparatura
Un spectrofotometru cu dublu fascicol, comport cinci pri principale:
1. Sursa de radiaii IR
Radiaiile IR se obin la temperatura de 1000-1800C. Sursa este constituit fie
dintr-un filament Nernst (oxizi de zirconiu, thoriu i ceriu fixai pe un liant), fie
baghet Globar (carbur de siliciu). Ambele sunt aduse la temperatura de lucru prin
trecerea unui curent electric.
Energia emis de o surs Globar este maxim n regiunea 5500-5000 cm-1 i
descrete spre numere de und mai mici (la 600 cm-1 descrete de 600 ori). Filamentul
Nernst emite maximum de energie spre 7100 cm-1 i scade de 1000 ori spre frecvene
mai coborte.
Radiaia ce pleac de la surs este mprit n dou fascicole: unul traverseaz
proba, cellalt substana de referin.
2. Compartimentul pentru probe
Compartimentul pentru probe cuprinde loca[ul cuvelor pentru proba de analizat
i de referin. Celulele (cuvele) sunt foarte diferite funcie de substana de analizat.
3. Fotometrul
Fotometrul este dispozitivul care realizeaz msurarea intensitii fascicolului
ce strbate proba comparativ cu a celui de referin.
Fascicolul de referin reflectat de un sistem de oglinzi, cade pe o oglind
turnant ce realizeaz un fascicol intermitent cu o frecven ntre 8 i 13 cicluri pe
secund, dup care trece printr-o fant i cade pe fotocelul.
Concomitent, fascicolul ce strbate proba cade printr-un sistem de oglinzi pe
aceeai oglin turnant i apoi prin aceeai fant, pe detector.
Se poate spune c cele dou radiaii au fost combinate ntr-un singur fascicol
modelat cu o frecven ce depinde de viteza de rotaie a oglinzii turnante. Cele dou
fascicole pot fi echilibrate cu ajutorul unui dispozitiv de atenuare, piptene, ce absoarbe
mai mult sau mai puin fascicolul de referin. Cu ajutorul unui servomecanism
atenuatorul echilibreaz cele dou fascicole; micarea acestuia este apoi nregistrat
funcie de lungimea de und, realizndu-se spectrul IR de absorbie.
4. Monocromatorul
23
Monocromatorul realizeaz separarea unei radiaii monocromatice folosind
prisme speciale, transparente la IR.
Astfel, o prism din NaCl este utilizabil satisfctor n domeniul 4000-650 cm-1,
cele din CaF2 numai n domeniul 4200-1300 cm-1, iar cele din KBr i CsBr sunt mai
indicate pentru domeniul 1100-385 cm-1.
n prezent, utilizarea reelelor de difracie este din ce n ce mai acceptat,
datorit numeroaselor avantaje.
Se spune c un aparat are o putere de rezoluie cu att mai mare cu ct separ un
domeniu de lungimi de und mai ngust. Cu ct fanta prin care trece fascicolul este mai
mic, rezoluia este mai mare. Nu se poate lucra ns cu fante foarte mici (nguste)
deoarece intensitatea radiaiei emise de surs scade, mai ales la lungimi de und mari.
La aparatele moderne, lrgimea fantei este reglat astfel nct intensitatea
fascicolului s rmn prectic constant.
5. Detectorul nregistratorul
Detectorul - nregistratorul (receptorul) este un dispozitiv ce furnizeaz datele
privind intensitatea fascicolului ce strbate proba. n general, se utilizeaz trei
tipuri de detectori: detectori termici, piroelectrici i fotoconductori. Se mai folosete
celula pneumatic sau celula Golay - bazat pe energia total care acioneaz asupra
detectorului, flexibil i foarte sensibil, util n domeniul 0,8-1000 m.
Detectorii termici folosesc efectul caloric al fascicolului de lumin. Se
utilizeaz termocuplul i bolometrul.
n cazul termocuplului, energia fascicolului nclzete lucul de sudur a dou
lame bimetalice, fora electromotoare ce ia natere fiind funcie de energia incident.
n cazul bolometrului, nclzirea are ca efect modificarea valorii unei rezistene,
modificare ce este dependent de energia incident.
Deci, orice modificare a intensitii fascicolului probei, comparativ cu cel de
referin, se traduce printr-un semnal electric care se nregistreaz.
Att termocuplul ct i bolometrul sunt utilizate pentru domeniul 0,8-400 m,
dar nu au sensibilitate prea mare.
Detectorii piroelectrici sunt confecionai din materiale dielectrice cu proprieti
termice i electrice speciale. Cel mai utilizat material este triglicin-sulfatul deuterat.
Celula fotoconductiv - semiconductor din PbS sau PbSe utilizat pentru
domeniul 0,7-3,3 m.
24
volatilizeaz i se realizeaz de fapt spectrul vaporilor. Pentru cele cu punctul de
fierbere mai ridicat, pentru a avea loc volatilizarea, celulele pot fi nclzite. n cazul
gazelor drumul optic poate atinge i 40 m.
2. Lichidele pot fi examinate n stare pur sau n soluie, folosind cuve speciale
cu grosimea ntre 0,005 mm i 0,1 mm, cantitatea de produs variind ntre 1 i 10 mg.
Dac se folosesc soluii, acestea se introduc n cuve cu grosimea de 0,1-1,00 mm;
concentraiile soluiilor pot fi de 0,05-10% (1-15 mg substan). Celula cu proba
martor conine solventul; are grosimea fix sau variabil i se plaseaz pe traiectoria
fascicolului de referin, fiind confecionat din acelai material i avnd aceeai
grosime cu cuva pentru prob. Materialul din care sunt confecionate cuvele trebuie s
fie transparent pentru lumina infraroie (clorur de sodiu, bromur de potasiu, fluorur
de litiu).
Soluiile i lichidele mai pot fi examinate i sub forma uni film ntre dou
ferestre.
Spectrul nregistrat n cazul soluiilor cuprinde att benzile de absorbie ale
substanei dizolvate ct i benzile caracteristice solventului. Din acest motiv, solvenii
utilizai pentru analiza IR trebuie s fie anhidri, transpareni n domeniul de lungimi de
und explorat i s nu formeze legturi de hidrogen cu substana de cercetat
n tabelul 5 sunt prezentai civa dintre solvenii mai utilizai cu indicarea
regiunilor transparente.
25
Pastilele sunt obinute prin comprimarea puternic a unui amestec omogen
obinut din 1 mg substan de analizat i 100 - 400 mg KBr anhidr, de puritate
spectral; amestecul se introduce ntr-o matri special i se comprim la o presiune
de cteva sute kg/cm2. Se nregistreaz spectrul IR fa de un comprimat preparat n
aceleai condiii ns fr substana de analizat.
Filmele depuse pe o plac se utilizeaz mai rar i numai pentru substanele care
pot fi topite i solidificate sau pentru cele care se dizolv ntr-un solvent nepolar, uor
volatil.
Indiferent de maniera n care se pregtete proba de analizat, aceasta trebuie s
fie anhidr.
26
Orice concluzie la care s-a ajuns, prin reperarea unei benzi a spectrului trebuie
confirmat prin examinarea acestei regiuni din spectru. De exemplu, dac constatm
existena unei benzi caracteristice - vibraie de alungire - pentru gruparea C=O din
funcia aldehid ( =1690 cm-1), trebuie s ne asigurm c exist n spectru i banda
caracteristic de alungire a legturii C-H din grupul CHO la 2750 cm-1 (3,63 ). La fel
atribuirea unei benzi carbonil dintr-un ester ( CO =1750 cm-1) trebuie s fie
confirmat prin observarea unei benzi intense situat ntre 1310 i 1100 cm -1 (7,6 - 9,1
m) corespunztoare alungirii legturii C-O a gruprii ester.
n foarte multe cazuri benzile sunt deplasate datorit formrii legturii de
hidrogen.
Regiunile mai importante pentru un examen preliminar sunt cele situate peste
1350 cm-1 (pn la 2000 cm-1) i cele cuprinse ntre 900 i 650 cm-1. Benzile
corespunztoare regiunilor intermediare sunt complexe.
Pentru a confirma structura unei substane, pe lng spectrele IR, se folosesc i
spectrele de mas, UV, RMN etc.
Moleculele cu un numr mare de atomi admit i un foarte mare numr de
vibraii normale, ceea ce face ca interpretarea spectrelor s fie dificil.
Pornind de la un numr foarte mare de spectre ale substanelor cunoscute, s-au
tras concluzii general valabile, spectrometria IR empiric fiind foarte util.
Nu exist doi compui organici cu spectrul IR identic i din acest motiv spectrul
IR a devenit un criteriu de identificare a fiecrei substane organice, asemntor cu
amprentele digitale la oameni. Domeniul de frecven sub 1500 cm-1, fiind caracteristic
fiecrei substane, a primit denumirea de regiune a amprentei digitale. Coincidena
acestei regiuni n spectrele a dou substane este o dovad a identitii lor.
Spectrele IR pot constitui i o dovad a puritii unei substane. Apariia unor
benzi suplimentare fa de spectrul substanei pure dovedete prezena unor impuriti.
Desigur, va fi ma uor decelat o singur impuritate dect mai multe nsumnd aceeai
concentraie.
Unele reacii chimice n care reactantul i produsul de reacie prezint benzi
caracteristice individuale se pot urmri comod i sigur cu ajutorul spectrelor IR
(dispare banda reactantului i apare cea a produsului de reacie).
n cazul cromatografiei pe coloan a unui amestec de produi, identificarea
diferitelor fraciuni se poate face i prin spectroscopie IR, mai ales dac produii sunt
incolori.
Toate tipurile de molecule, organice i anorganice, cu foarte mici excepii,
absorb n domeniul IR. Din acest motiv, spectrofotometria IR ofer posibiliti de
determinare pentru un numr mare de substane. Mai mult, datorit unicitii spectrului
IR, specificitatea acestei metode va fi atins sau depit de un numrm relativ mic de
alte metode analitice.
Specificitatea i-a gsit aplicaii mai ales n analiza amestecurilor de compui
organici foarte nrudii.
Analiza unui amestec de hidrocarburi
27
O aplicaie tipic a spectroscopiei cantitative IR este analiza unui amestec de
izomeri C8H10 ce conin o-xilen, m-xilen, p-xilen i etilbenzen.
Spectrele pentru aceti compui n domeniul 12 - 15 m, n ciclohexan
prezint benzi maxime (peak-uri) caracteristice individuale la 13,47 m, 13,01 m,
12,58 m i 14,36 m. Totui, datorit suprapunerii benzilor de absorbie,
absorbana unui amestec la oricare din aceste lungimi de und, nu este n ntregime
determinat de concentraia unui singur component. De aceea se determin
absorbanele molare pentru fiecare din aceti patru compui la cele patru lungimi de
und. Cu acestea pot fi scrise patru ecuaii care permit calcularea concentraiei fiecrei
specii, prin msurarea absorbanei amestecului la cele patru lungimi de und (vezi UVVIS).
Determinarea poluanilor din aer
Determinarea poluanilor din aer necesit metode sensibile, rapide i foarte
specifice pentru o mare varietate de compui chimici. Spectrofotometria IR
ndeplinete aceste cerine mai mult chiar dect alte metode analitice.
Proba de aer ce conine cinci specii chimice n concentraii cunoscute, a fost
analizat cu un instrument computerizat, utiliznd o celul gazoas de 20 m. Datele au
fost imprimate n 1 - 2 minute de la injectarea probei.
28
razele sunt reflectate, una este deplasat puin (defazat) fa de cealalt. nainte de a
trece prin prob, se produce interferena tuturor radiaiilor monocromatice din raz.
Astfel, prin prob trec simultan toate lungimile de und, iar interferena se modific n
timp prin deplasarea oglinzii cu o vitez liniar. Rezultatul absorbiei radiaiei de ctre
prob este un spectru obinut n timp, numit interferogram, ce reprezint intensitatea
absorbiei ca funcie de diferena de drum optic dintre cele dou raze. Folosind un
microprocesor, aceasta este convertit n domeniu de frecvene, cu ajutorul unei
operaii matematice numite transformare Fourier (de unde i numele de spectrometru
IR cu transformare Fourier); n urma acestui proces se obine un spectru infrarou
convenional.
Avantajul principal al unui instrument cu interferometru este faptul c se
proceseaz mai multe date simultan. Prin prob trec toate radiaiile odat, fa de
instrumentele clasice n care proba era expus succesiv cte unui domeniu ngust.
Oglind fix
Oglind mobil
S
Surs infrarou
Prob
Detector
Figura 2. Schema de baz a unui instrument cu interferometru
Acest proces conduce la creterea raportului semnal-zgomot i la obinerea n
cteva secunde a unui spectru cu o rezoluie comparabil sau chiar mai bun dect la
folosirea unei reele de difracie.
Principiile interferometrului i a transformrii Fourier sunt cunoscute de peste
un secol, dar aplicaiile practice au trebuit s atepte apariia tehnicilor digitale de
calcul cu ajutorul calculatorului.
29
Spectrometria de mas
Cnd detectorul (4) este o plac fotografic, care este impresionat mai mult
sau mai puin funcie de numrul ionilor, aparatul se numete spectrograf.
Aparatele moderne nregistreaz curentul ionic (proporional cu numrul de
ioni) sub form de spectru, funcie de masa ionilor i de abundena lor; asemenea
aparate se numesc spectrometre de mas.
Majoritatea spectrometrelor de mas realizeaz separarea ionilor pozitivi,
deoarece la bombardarea moleculelor de cercetat (cel mai adesea organice) cu un
fascicul de electroni se expulzeaz un electron din molecul formndu-se un ion
pozitiv.
Diferena esenial a spectrometriei de mas de celelalte metode spectrale
const n aceea c dup nregistrarea spectrului substanei cercetate, aceasta nu mai
poate fi recuperat, fiind transformat n ioni, pe cnd n celelalte metode au loc numai
modificri n starea fizic a substanei.
Schema unui spectrometru de mas cu focalizare magnetic este redat n
figura 1:
30
mv 2
(1)
2
unde:
mv 2
(2)
r
sau
H e =
mv
(3)
r
unde:
H - intensitatea cmpului magnetic (T - tesla); r - raza traiectoriei ionului (m).
Rezult c viteza are expresia:
31
v=
H e r
(4)
m
m H2 e2 r 2
(5)
2 m2
de unde rezult c:
m 2U
r 2 = 2A (7) i
e H
2 m U A = H 2 e r 2 (6)
sau
m
H2
= r2
(8)
e
2 UA
sau
m r2 H2
=
(9)
z
2 UA
Abundance
CAFEINA
194
2000000
1600000
1200000
109
800000
400000
0
M/Z ->
55 67
3842
40
82
165 179 196
80 94
122
124 137 150 164
60
80
100
120
140
160
180
200
Figura 2. Spectrul de mas al cafeinei
32
Aplicaii
Spectrometria de mas se poate folosi att n analiza calitativ ct i n cea
cantitativ.
Spectrometrele de mas se folosesc mult cuplate cu un gaz cromatograf pentru
detectarea i nregistrarea componentelor separate prin gaz cromatografie.
Tehnica mixt gaz cromatografie pe coloane capilare - spectrometrie de mas
(GC-MSD) ct si cromatografia de lichide de inalta performanta cu detector
spectrometru de masa a putut fi realizat practic datorit faptului c metodele necesit
cantiti mici de prob i de acelai ordin de mrime (de la miligrame la nanograme).
Spectrometria de mas folosete i la determinri de mase moleculare i
structuri ale substanelor organice necunoscute prin:
- furnizarea masei moleculare exacte;
- posibilitatea stabilirii unei formule brute;
- prin aducerea unei dovezi asupra existenei posibile a unor elemente
structural caracteristice (alturi de alte metode: RMN, IR etc.).
33
- picul de baz care reprezint etalonul de msurare a intensitii;
- picurile datorate contribuiilor izotopice.
De exemplu, n cazul hidrocarburilor saturate:
- ionii moleculari sunt instabili i prin pierderea unui ion de hidrogen se
formeaz ioni de carboniu primari cu formula general: [CnH2n+1]+ .
O reacie important de scindare a acestora este pierderea unei molecule de
etilen, dar se pot scinda radicali liberi alchil sau atomi de hidrogen.
R
R
CH 2
CH 2 CH 2
+
CH 2
CH 2
+
CH 2 + CH 2
CH 2 + CH 2
CH 2
H + R
CH 2
CH 2
+
CH 2
CH 2 CH
+
CH 2
Ionii cu sarcin electric se stabilizeaz prin mezomerie iar ionii carboniu trec
n ioni mai stabili.
Ionizarea moleculelor de analizat se poate face folosind ca reactiv un gaz
(metan, metilpropan sau amoniac) care introdui n camera de ionizare, n urma
bombardrii cu electroni, produc ioni moleculari, care, reacioneaz apoi cu
moleculele probei cu apariia ionilor de tip MH+ ; au loc reaciile:
Reactia primar:
CH4 +
e CH4+
+ e+
eelectron
ion
electronul din electronul
(ionizare)
rapid
molecular reactivul gaz
ncetinit
Reaciile secundare:
CH4+ CH3 + H
CH4+ + CH4
CH5+
+
CH3
(Autoprotonare)
ionul
reactant
+
+
CH3 + CH4 C2H5 + H2
Coliziune cu molecula din proba M :
M
+ CH5+
MH+
+
molecula
molecula
din prob
protonat
+
M
+
C2H5
MC2H5+
Daca M este de tipul RH:
RH
+
CH5+
R+ + CH4 + H2
CH4
(ionul M+1)
(ionul lui M+29)
(ionul M-1)
34
h
I(I + 1)
2
unde:
I - numr cuantic de spin.
Ca i n cazul electronului, nucleul n rotaie, fiind ncrcat, va reprezenta un
curent electric, care va crea un cmp magnetic (magnet elementar) a crui ax coincide
cu cea a spinului.
Comparnd protonul cu electronul vom constata c viteza de rotaie a
protonului este mult mai mic dect a electronului deoarece protonul are momentul de
inerie mult mai mare. Aceasta echivaleaz cu un curent elementar mult mai slab i
deci un moment magnetic mult mai mic. Unitatea de moment magnetic este
"magnetonul nuclear" - n - dat de relaia:
35
n =
h e0
= 5 10 24 gauss cm3
4 mpc
- magnetonul nuclear.
1
2
Pentru proton care are I = 1/2 exist doar dou orientri ( 2 +1 ) a cror
nclinare fa de axa cmpului este de aproximativ 54.
Orientarea n sensul cmpului magnetic este mai stabil (energie mai mic),
dect cea n contra cmpului (energie mai mare).
Diferena de energie ntre cele dou orientri este dependent de cmpul
magnetic exterior (H).
E = .g .H, unde:
n n
- magnetonul nuclear;
36
electromagnetic va putea fi absorbit de proton i prin urmare i va inversa spinul i
va trece din starea de energie joas n starea de energie nalt (figura 2).
sau
= 2 . = 2 .( n.gn.H) / h = H , = H / 2
E = h H / 2
unde:
- frecvena Larmor
- raportul giromagnetic
Frecvena de rezonan poate fi calculat i cu relaia:
= n H / h I, unde:
I = numrul cuantic de spin
innd cont c precesia Larmor se face cu o frecven egal cu a cuantelor de
radiaie electromagnetic absorbit, va reprezenta n acelai timp viteza unghiular
a precesiei.
Diferena de energie ntre cele dou orientri este foarte mic n cazul
protonului (comparativ cu electronul). De exemplu, n cmp magnetic de 14000 Gauss,
frecvena de rezonan corespunde la 60 MHz, unde cu frecvene n domeniul radio.
n general, la introducerea unei probe n cmpul magnetic exterior, tendina
tuturor nucleelor este de a se aranja n acelai sens cu cmpul. n momentul rezonanei,
protonii cu orientare paralel trec, ca urmare a absorbiei de energie, n orientare
antiparalel.
37
Cedarea energiei absorbite pentru restabilirea echilibrului iniial are loc prin
fenomene de relaxare: relaxare spin-reea _ energia este cedat reelei (probei) sub
form de cldur _ i relaxare spin-spin _ energia este cedat pentru modificarea
spinului.
Spectrul RMN, reprezint curba absorbiei de energie electromagnetic de ctre
compusul studiat n funcie de cmpul magnetic aplicat (sau frecven).
Spectrul RMN se realizeaz folosind un spectrometru RMN cu schema
prezentat n figura 3:
38
Spectroscopia RMN prezint importan major pentru chimia organic,
_
ajutnd la elucidarea structurii moleculelor, deoarece factorul giromagnetic _ gn i
deci frecvena de rezonan, depind n mare msur de vecintatea atomic a nucleului
respectiv.
Rezonana magnetic a protonului cu spinul 1/2 (I = 1/2) prezint importan
deosebit pentru studiul compuilor organici, deoarece majoritatea acestora prezint n
molecul i atomi de hidrogen. Faptul c izotopul C12, O16 i O18 nu au moment
magnetic de spin i deci nu dau fenomene de rezonan magnetic nuclear, prezint
un avantaj, uurnd interpretarea spectrelor RMN - protonice.
n prezent se execut spectroscopie RMN pentru F19, C13, P13 i N15 (toate cu
I = 1/2).
Deplasarea chimic
Protonul, n orice combinaie, se gsete nconjurat de un nor electronic ce
manifest o ecranare fa de cmpul magnetic exterior H0 datorit cmpului magnetic
He asociat curentului electric produs de electronul n micare.
Drept urmare asupra protonului nu acioneaz ntregul cmp magnetic aplicat,
cu alte cuvinte la o frecven dat a oscilatorului (undelor radio) semnalele de
rezonan a diferitelor categorii de protoni apar la cmpuri exterioare mai intense dect
cel corespunztor unui proton liber. La fel se ntmpl ntr-un cmp magnetic constant,
rezonana are loc la frecvene mai mici ale oscilatorului (unde radio).
Gradul de ecranare a protonului difer dup modul n care este legat protonul n
molecul. Spre exemplu, n molecula de etanol, protonul cel mai puin ecranat este cel
din gruparea OH, cel legat de oxigen; mai ecranai sunt cei din gruparea CH2 i mai
ecranai cei din gruparea CH3.
La frecven constant a oscilatorului, variind intensitatea cmpului magnetic
apare un semnal de rezonan mai nti pentru protonul din OH, apoi la o valoare mai
mare a cmpului pentru CH2 i n sfrit la o valoare i mai mare pentru CH3 ,
figura 4.
39
Diferena dintre intensitatea cmpului magnetic de rezonan (sau frecvena de
rezonan - Hz) i cea pentru protonul liber se numete deplasare chimic i se
consider fa de o linie arbitrar.
Diferenele de ecranare ale diferitelor categorii de protoni, funcie de modul de
legare n molecul sunt foarte mici.
Se exprim n ppm i se noteaz cu .
= (Hstandard - Hproton) / Hstandard;
= (
p).106/
standard
proton)
ppm = (
40
41
Aplicaiile RMN
Una din aplicaiile RMN a fost i este identificarea grupelor funcionale cum ar
fi OH n alcooli i fenoli, acizi carboxilici, protonii (hidrogenul) din olefine,
hidrogenul acetilenic, din amine, amide.
Deci, prin spectroscopia RMN a protonilor se poate realiza identificarea i
elucidarea structurii unor molecule organice, metal-organice i biochimice.
Un spectru RMN, ca i un spectru IR adesea este suficient pentru identificarea
unui compus organic.
Pentru o identificarea sigur i pentru a stabili o structur este necesar a se
corobora spectrele RMN cu alte determinri: spectre IR, UV, analiza elemental C, H,
N, spectre de mas etc.
n prezent pe lng spectroscopia RMN a protonilor se folosete i cea pentru
19
F (identificarea acestui element n compui cu fluor), C13 i N13.
n analiza cantitativ spectrosopia RMN poate fi folosit pentru faptul c exist
o proporionalitate ntre aria picurilor i numrul de nuclee responsabile pentru pic.
Dac, spre exemplu, se cunoate aria semnalului pe proton, aria unui pic poate
fi folosit pentru a stabili concentraia speciei respective.
Practic se folosete un standard intern, comparndu-se aria picului standard sau
a compuilor de analizat, cu condiia ca aria picului standard s nu depeasc nici
unul dintre picurile probei.
Pentru calibrare se folosesc cel mai mult derivai organici de silan, avnd
picurile protonilor cu localizare nalt.
Dezavantajul principal al analizei cantitative RMN este costul ridicat al
aparaturii i dificultatea analizei probelor complexe care se rezolv mai uor prin alte
tehnici.
Rezonana magnetic nuclear este n mod obinuit folosit pentru determinarea
structurii substanelor, dar exist i multe alte aplicaii importante ale sale.
Spectroscopia RMN de relaxare poate fi folosit pentru a evalua proporia
dintre faza solid i cea lichid din produse alimentare ce conin multe lipide, cum ar fi
margarinele. Metoda se bazeaz pe faptul c timpul de relaxare spin-spin al protonilor
din faza lichid este mai mare dect al celor din faza solid. Dac se nregistreaz
variaia intensitii semnalului protonilor n timp, se obin dou curbe, corespunztoare
celor dou faze. Prin extrapolarea acestor curbe se obin intensiti ale semnalului care
sunt proporionale cu cantitatea relativ de protoni din faza lichid i solid.
Aplicaiile RMN n medicin devin tot mai comune, de la simple studii
dinamice la diagnosticarea anormalitii esuturilor.
Studiul prin RMN-13P al sngelui i al fluidelor celulare permite monitorizarea
n timp real a pH-ului sanguin, tehnic necesar n cazul diabeticilor. Absena insulinei
poate conduce la nivele toxice ale aciditii intracelulare, caz n care o perfuzie cu
hidrogenocarbonat de sodiu poate ajuta la restabilirea pH-ului intracelular normal.
Monitorizarea are loc prin msurarea deplasrii chimice ntre semnalele fosforului
42
organic i a celui anorganic. Acest lucru este posibil deoarece semnalul RMN al
fosforului anorganic depinde mult de pH i se poate deplasa cu pn la 1 ppm pentru o
unitate de pH. Aria fiecrui pic se poate utiliza pentru a calcula concentraia relativ a
fiecrui compus organic (de exemplu ATP), i n consecin se poate evalua starea
metabolic a esuturilor.
Folosirea RMN-1H pentru scanarea corpului uman a devenit un fapt obinuit.
Intensitatea semnalelor RMN-1H depinde att de densitatea protonic ct i de timpul
de relaxare al acestora. n consecin, protonii din ap, proteine, lipide, carbohidrai i
alte substane ar trebui s prezinte semnale diferite. Totui, principalele specii care au
densiti de protoni suficient de mari pentru a da un semnal apreciabil sunt apa i
lipidele. Vecintile nucleelor care intr n rezonan dau acestora timpi de relaxare
diferii, i deci semnale diferite. n consecin se pot diferenia diferitele organe ale
corpului.
Imaginile obinute se numesc imagini de rezonan magnetic (s-a renunat la
termenul nuclear pentru a evita asocierea cu radiaiile nucleare) i arat asemntor
cu imaginile obinute cu ajutorul razelor X. Imaginile de rezonan magnetic se pot
achiziiona pentru un singur organ sau pentru tot corpul. Imaginile esuturilor moi se
pot realiza n orice plan, obinndu-se date complementare cu cele obinute prin raze X
pentru esuturile tari. Scanarea dureaz aproximativ 20 min, i de aceea subiectul
trebuie s pstreze nemicat zona ce va fi scanat n interiorul unui magnet cu
diametru mare.
Nu se cunosc efecte secundare asociate cu aceast tehnic, ceea ce nseamn c
o persoan (incluznd indivizii tineri i cei sensibili) poate fi scanat n mod regulat
pentru a monitoriza evoluia anumitor stri patologice cum ar fi cancerul sau scleroza
multipl.