ECOLOGIA PATOGENILOR AGROECOSISTEMELOR

Fitopatogenii, mai ales n zonele temperate, au un ciclu de via discontinuu, o faz cu

activitate intens este succedat de o laten n care, datorit condiiilor neprielnice, i reduc
total activitatea metabolic sau se transform n diferite forme de rezisten pn la apariia
condiiilor favorabile.
Factorii ecologici care acioneaz asupra fitopatogenilor sunt:
- nutriia mineral a plantelor (metabolismului unei plante poate fi modificat ca urmare a
influenei ngrmintelor i microelementelor);
-pH-ul;
- temperatura;
- umiditatea etc.
1. INFLUENA SUBSTRATULUI DE CRETERE ASUPRA UNOR AGENI
FITOPATOGENI
LUCRAREA PRACTIC NR.1: Pentru a se pune n eviden influena substratului
nutritiv asupra creterii i dezvoltrii la ciupercile fitopatogene, va fi montat o experien, dup
cum urmeaz:
Cte un izolat fungic apartinnd speciilor Alternaria sp. i Botrytis cinerea va fi cultivat
pe mai multe medii de cultur cu compoziie diferit (tabelul 1).
Tabelul 1
Compoziia mediilor de cultur ce pot fi utilizate pentru a determina influena substratului
de cretere asupra unor ageni fitopatogeni
Nr.
Mediul de cultur
Compoziie mediu Pt. 100ml de mediu
crt.
de cultur
1
PDA
39g PDA
3,9g PDA
1000ml ap
100ml ap
2
Mal-Agar (MA)
20g extract de mal 2g extract de mal
20g agar
2g agar
1000ml ap
100ml ap
3
Mal-Dextroz-Pepton-Agar
15-20g extract de
2g extract de mal
(MDPA)
mal
2g dextroz
20g dextroz
0,1 g pepton
1g pepton
2g agar
20g agar
100ml ap
1000ml ap
4
Ap-Agar (AA)
15-25g agar
2g agar
1000ml ap de
100ml ap de robinet
robinet
5
Corn Meal Agar (CMA)
17g CMA
1,7g CMA
1000ml ap
100ml ap
Lima Bean Agar (LBA)
23g LMA
2,3g LMA
1000ml ap
100ml ap
6
Sabouraud
30-40g dextroz
3-4g dextroz
10g pepton
1g pepton
15-20g agar
2g agar
1000ml ap
100ml ap distilat
distilat
7
Fin de porumb-Agar (FP-A) 50g fin de mlai 5g fin de mlai
20g agar
2g agar
1000ml ap
100ml ap
1

Metod: incubare pe diferite medii de cultur (in punct central)

Mod de lucru: Dup topire mediile de cultur se repartizeaz n vase Petri
(diametrul = 5 cm), n medie 5ml/ vas. Vasele Petri, astfel pregtite, sunt nsmnate
central cu inoculul patogen, reprezentat de discuri miceliene cu diametrul = 8mm,
prelevate de la periferia culturilor pure, n vrst de o sptmn, i apoi sunt introduse n
termostat la 24 0C.
Atenie! Discul micelian va fi depus pe mediul de cultura cu partea cu miceliu n
jos.
Influena substratului de cretere asupra creterii miceliene a izolatului patogen
testat se estimeaz n comparaie cu un martor stabilit la nceperea experienei (mediu
PDA).
Observaiile se efectueaz la 3, 5 i 7 zile de la nsmnare, experiena se poate
considera ncheiat i mai devreme de 7 zile, n momentul n care la una din variante
miceliul s-a dezvoltat n tot vasul.
Pentru fiecare izolat patogen i pentru fiecare mediu de cultur se realizeaz cte 3
repetiii.
De exemplu: Pentru 2 izolate fungice i 4 medii de cultur, experiena se
monteaz n 24 vase Petri (2 izolate patogene x 4 medii de cultur x 3 repetiii = 24 vase
Petri).
Observaii: creterea micelian (diametrul coloniei); morfologia coloniei (miceliu
aerian/ras; prezen/absen de spori...etc)
Rezultate: cretere micelian, rata de cretere/zi
Interpretarea rezultatelor
Influena compoziei mediului de cultur asupra creterii i dezvoltrii agenilor
patogeni se evalueaz prin msurarea creterii miceliene (diametrul coloniilor).
Diametrele medii ale celor 3 repetiii sunt comparate cu cele ale martorului (un mediu
standard), calculndu-se astfel procentul de inhibare a creterii miceliene (sau) dup
formula:
IC [%] inhibare a creterii = (Dmt - Dvar) / Dmt x 100, unde:
Dmt = diametrul coloniei miceliene a martorului;
Dvar = diametrul coloniei miceliene a variantei test.
2. INFLUENA TEMPERATURII ASUPRA CRETERII UNOR AGENI
FITOPATOGENI
LUCRAREA PRACTIC NR.2: Pentru a se pune n eviden influena temperaturii
asupra creterii i dezvoltrii la ciupercile fitopatogene, va fi montat o experien, dup cum
urmeaz:
Cte un izolat fungic apartinnd speciilor Alternaria sp. i Botrytis cinerea va fi cultivat
pe mediile de cultur (PDA, MA, AA, CMA), n condiii diferite de temperatur (respectiv la
30C, 150C i 240C).
2

Metod: incubare pe diferite medii de cultur (in punct central) i n condiii

diferite de temperatur
Mod de lucru (similar celui de la lucrarea practic nr.1) : Dup topire mediile
de cultur se repartizeaz n vase Petri (diametrul = 5 cm), n medie 5ml/ vas. Vasele
Petri, astfel pregtite, sunt nsmnate central cu inoculul patogen, reprezentat de discuri
miceliene cu diametrul = 8mm, prelevate de la periferia culturilor pure, n vrst de o
sptmn, i apoi sunt introduse n termostat la 30C, 150C i, respectiv, 240C .
Atenie! Discul micelian va fi depus pe mediul de cultura cu partea cu miceliu n
jos.
Influena temperaturii asupra creterii miceliene a izolatului patogen testat se
estimeaz n comparaie cu rezultatele obinute n experiena nr.1 (incubarea i creterea
la 24oC, to optim de dezvolatare a ciupercilor fitopatogene).
Observaiile se efectueaz la 3, 5 i 7 zile de la nsmnare, experiena se poate
considera ncheiat i mai devreme de 7 zile, n momentul n care la una din variante
miceliul s-a dezvoltat n tot vasul.
Pentru fiecare izolat patogen, pentru fiecare mediu de cultur i pentru fiecare
temperatur se realizeaz cte 3 repetiii.
De exemplu: Pentru 2 izolate fungice, 4 medii de cultur i 3 valori ale
temperaturii, experiena se monteaz n 72 vase Petri (2 izolate patogene x 4 medii de
cultur x 3 valori temperatur x 3 repetiii = 72 vase Petri). 24 vase Petri nsmnate sunt
cele din experiena nr 1.
Prin urmare, pentru experiena 1 i 2 vom pregti cte 100ml mediu de cultur
(PDA, MA, AA, CMA).
Mod de calcul: Total 72 vase Petri : 4 medii de cultur x 5 ml mediu/vas = 90ml
mediu + o marj de 10%
Observaii: creterea micelian (diametrul coloniei); morfologia coloniei (miceliu
aerian/ras; prezen/absen de spori...etc)
Rezultate: cretere micelian, rata de cretere/zi
Interpretarea rezultatelor
Influena compoziei mediului de cultur asupra creterii i dezvoltrii agenilor
patogeni se evalueaz prin msurarea creterii miceliene (diametrul coloniilor).
Diametrele medii ale celor 3 repetiii sunt comparate cu cele ale martorului (un mediu
standard) la o temperatur de 240C, calculndu-se astfel procentul de inhibare a creterii
miceliene (sau) dup formula:
IC [%] inhibare a creterii = (Dmt - Dvar) / Dmt x 100, unde:
Dmt = diametrul coloniei miceliene a martorului;
Dvar = diametrul coloniei miceliene a variantei test.

STRESSUL OSMOTIC I STRESSUL OXIDATIV LA CIUPERCILE

FITOPATOGENE
In timpul ciclului lor evolutiv, ciupercile fitopatogene sunt confruntate cu diferite tipuri
de stress, ca de exemplu, stressul osmotic i stressul oxidativ i pentru a coloniza cu succes
planta gazd ele trebuie s-i dezvolte rspunsuri de adaptare eficace.
Stressul osmotic este, de obicei, indus de mediul extern sau de substane xenobiote n
timp ce stressul oxidativ este generat n principal n timpul interaciunii patogen-plant gazd. Ca
rspuns la aceste dou tipuri de stress, ciupercile dezvolt mecanisme de protecie care implic,
n principal, sinteza i acumularea de polioli (alcooli, precum glicerolul). Pe de o parte, glicerolul
constituie un osmoprotector implicat n rspunsul ciupercilor la stressul osmotic.

3. INFLUENA STRESSULUI OSMOTIC

MICELIENE A UNOR AGENI FITOPATOGENI

ASUPRA

CRETERII

LUCRAREA PRACTIC NR.3: Pentru a se pune n eviden influena stressului osmotic

asupra creterii i dezvoltrii la ciupercile fitopatogene, va fi montat o experien, dup cum
urmeaz:
Cte un izolat fungic apartinnd speciilor Alternaria sp. i Botrytis cinerea va fi cultivat
pe mediul de cultur PDA n care se include o substan test generatoare de stress osmotic, la o
temperatur optim de cretere de 240C.
Molecule test generatoare de stress osmotic: NaCl, sorbitol
Concentraii test:

NaCl: 2 4 [%] solutie stoc 10%

Sorbitol: 0.4 -0.8 [M] solutie stoc 5M

Metod: includerea moleculelor test generatoare de stress osmotic n mediul de

cultur PDA
Mod de lucru: se pregtesc solutii stoc (concentraia 10% sau 5M). Se stabilesc
concentraiile ce urmeaz a fi testate i se calculeaz ct din soluia stoc trebuie
ncorporat n mediul de cultur (rcit, n prealabil, la 45 0C) pentru a se obine
concentraiile respective. Dup omogenizare mediul se repartizeaz n vase Petri
(diametrul = 5 cm), n medie 5ml/ vas. Vasele Petri, astfel pregtite, sunt nsmnate
central cu inoculul patogen, reprezentat de discuri miceliene cu diametrul = 8mm,
prelevate de la periferia culturilor pure, n vrst de o sptmn, i apoi sunt introduse n
termostat la 24 0C.
Atenie! Discul micelian va fi depus pe mediul de cultura cu partea cu miceliu n
jos.
Pentru fiecare molecul test, pentru fiecare izolat patogen i pentru fiecare
concentraie se realizeaz cte 3 repetiii.
Calcul: 2 izolate fungice, 2 molecule test a cte 2 concentraii, i n 3 repetiii
rezult c experiena se monteaz n 24 vase Petri. A nu se uita varianta martor cu 3
repetiii pentru fiecare izolat fungic, respectiv 6 vase Petri. Total: 30 vase Petri.
Mediu de cultur PDA : 30 vase Petri x 5 ml/ vas = 150 ml
4

Efectul moleculelor test generatoare de stress osmotic asupra creterii miceliene a

izolatului patogen testat se estimeaz n comparaie cu un martor cultivat pe mediu PDA.
Observaiile se efectueaz la 3, 5 i 7 zile de la nsmnare, experiena se poate
considera ncheiat i mai devreme de 7 zile, n momentul n care la varianta martor
miceliul s-a dezvoltat n tot vasul.
Observaii: creterea micelian (diametrul coloniei)
Rezultate: inhibarea creterii miceliene [%]

Materiale necesare:
Pentru calculul volumului de soluie stoc ce trebuie ncorporat n mediul de
cultur PDA, se va folosi formula:

Ci xVi = Cf x Vf
Ex. Concentraia soluiei stoc este 10%, concentraia ce urmeaz a fi testat este
2%, iar volumul de mediu ce trebuie obinut este de 30 ml.
10% x Vi = 2% x 30ml
Vi = 2% x 30ml / 10% = 6ml n conc. 10% va fi ncorporat n 24 ml mediu de
cultur PDA
V mediu de cultur =Vf - V molecul test (6ml) = 30ml 6ml = 24 ml
TABEL CENTRALIZATOR
Tulpina
patogen

Molecula
test

Alternaria
Botrytis

NaCl

Conc.
Sol.
stoc
10%

Total ml 10%
NaCl
Sorbitol
5M
Total ml 5M
sorbitol

Concentraia Vol.
Necesar
(ml)
2%
6ml
4%
12ml

Nr.
vase
Petri
6
6

Mediu
MA
ml
24
18

18ml

0,4M
0,8M
-

2,4ml
4,8ml
7,2ml

6
6
-

27,6
25,2
-

Interpretarea rezultatelor
Aciunea moleculelor test generatoare de stres osmotic se evalueaz prin
msurarea creterii miceliene (diametrul coloniilor). Diametrele medii ale celor 3 repetiii
sunt comparate cu cele ale martorului, calculndu-se astfel procentul de inhibare a
creterii miceliene dup formula:
IC [%] inhibare a creterii = (Dmt - Dvar) / Dmt x 100, unde:
Dmt = diametrul coloniei miceliene a martorului;
Dvar = diametrul coloniei miceliene a variantei test.
5

Rezultatele se exprim sub forma concentraiei care inhib 50% din creterea
micelian (CI 50) prin regresia liniar a valorilor inhibrii creterii miceliene (% din
martor) la valorile concentraiilor testate. Aceast concentraie este un indicator care
permite aprecierea gradului de sensibilitate/rezisten al unui izolat fa de o substan
activ i este calculat pa baza valorilor medii, nefcnd obiectul unor teste statistice.
Ex.

4. INFLUENA STRESSULUI OXIDATIV ASUPRA CRETERII MICELIENE A

UNOR AGENI FITOPATOGENI
LUCRAREA PRACTIC NR.4: Pentru a se pune n eviden influena stressului
oxidativ asupra creterii i dezvoltrii la ciupercile fitopatogene, va fi montat o experien, dup
cum urmeaz:
Cte un izolat fungic apartinnd speciilor Alternaria sp. i Botrytis cinerea va fi cultivat
pe mediul de cultur PDA n care se include o substan test generatoare de stress oxidativ, la o
temperatur optim de cretere de 240C.
Molecule test generatoare de stress oxidativ:
menadiona (menadione sodium bisulfite MSB)
apa oxigenat (H2O2)
Concentraii test:

menadiona: 0,25 - 1 [mM] solutie stoc 100mM

apa oxigenat: 0,75 -1,5 [%] solutie stoc 3%

Metod: includerea moleculelor test generatoare de stress oxidativ n mediul de

cultur PDA
Mod de lucru: se pregtesc solutii stoc (concentraia 10mM (atenie la
transformri) sau 3%). Se stabilesc concentraiile ce urmeaz a fi testate i se calculeaz
ct din soluia stoc trebuie ncorporat n mediul de cultur (rcit, n prealabil, la 45 0C)
pentru a se obine concentraiile respective. Dup omogenizare mediul se repartizeaz n
vase Petri (diametrul = 5 cm), n medie 5ml/ vas. Vasele Petri, astfel pregtite, sunt
nsmnate central cu inoculul patogen, reprezentat de discuri miceliene cu diametrul =
8mm, prelevate de la periferia culturilor pure, n vrst de o sptmn, i apoi sunt
introduse n termostat la 24 0C.
Atenie! Discul micelian va fi depus pe mediul de cultura cu partea cu miceliu n
jos.
Efectul moleculelor test generatoare de stress oxidativ asupra creterii miceliene a
izolatului patogen testat se estimeaz n comparaie cu un martor cultivat pe mediu PDA.
Observaiile se efectueaz la 3, 5 i 7 zile de la nsmnare, experiena se poate
considera ncheiat i mai devreme de 7 zile, n momentul n care la varianta martor
miceliul s-a dezvoltat n tot vasul.
6

Pentru fiecare molecul test, pentru fiecare izolat patogen i pentru fiecare
concentraie se realizeaz cte 3 repetiii.
Calcul: 2 izolate fungice, 2 molecule test a cte 2 concentraii, i n 3 repetiii
rezult c experiena se monteaz n 24 vase Petri. A nu se uita varianta martor cu 3
repetiii pentru fiecare izolat fungic, respectiv 6 vase Petri. Total: 30 vase Petri.
n cazul nostru putem folosi martorul din experiena precedent.
Mediu de cultur PDA : 24 vase Petri x 5 ml/ vas = 120 ml
Total mediu de cultur PDA (pt. cele 4 experiene): 100ml +150ml+120ml =
370ml, vom pregati 400ml
Pentru calculul volumului de soluie stoc ce trebuie ncorporat n mediul de
cultur PDA, se va folosi formula:

Ci xVi = Cf x Vf
Ex. Concentraia soluiei stoc este 10mM, concentraia ce urmeaz a fi testat este
1mM, iar volumul de mediu ce trebuie obinut este de 30 ml.
10mM x Vi = 1 mM x 30ml
Vi = 1mM x 30ml / 10mM = 3ml n conc. 10mM va fi ncorporat n 27 ml mediu
de cultur PDA
Avem nevoie de 3, 75 ml menadion 10mM (dar noi vom prepara 5 ml).

100mM x Vi = 10 mM x 5ml
Vi = 10mM x 5ml / 100mM = 0,5ml n conc. 100mM vor fi adugai peste 4,5 ml
ap steril n vederea obinerii celor 5 ml menadion n conc.- de 10mM.
Pentru experien vom pregti 10 ml menadion 10mM (9ml ap steril + 1ml menadion
100 mM).
Observaii: creterea micelian (diametrul coloniei)
Rezultate: inhibarea creterii miceliene [%]

Tabel centralizator
Tulpina
Molecula
patogen
test
Alternaria
Botrytis

Conc.
Concentraia Vol.
Sol. stoc
Necesar
(ml)
10mM
0,25 mM
0,75ml
1 mM
3ml

menadiona

Total

ml 10mM

menadiona
apa oxigenat

3%

Total ml apa 3%

Nr.
vase
Petri
6
6

Mediu
MA
ml
29,25ml
27ml

3,75ml

0,75%
1,5%
-

7,5ml
15ml
22,5ml

6
6
-

22,5
15
-

oxigenat
Structura raportului
7

1. scop
2. material i metod (material biologic fungic, material biologic vegetal, molecule test,
concentraii)
3. rezultate obinute (grafice sau tabele)
4. discuii (interpretarea rezultatelor)
5. concluzii
6. Bibliografie
Rezultate
Rezultate privind influena substratului nutritiv asupra creterii miceliene a unor ageni
fitopatogeni
Data nsmnrii:
Data notrilor:
Mediul de
cultura

Compoziie

Patogen test

Cretere miceliana
[mm]

Rata cretere
[mm/zi]

Rezultate privind influena temperaturii i a substratului nutritiv asupra creterii miceliene a unor
ageni fitopatogeni
Mediul de
cultura

Compoziie

Patogen test

Temperatura

Cretere
miceliana
[mm]

Rezultate privind influena stressului osmotic asupra creterii miceliene a

fitopatogeni

Tulpina
patogen

Molecula
test

Concentraia Diametrul

Alternaria

NaCl

1%
2%
4%
8%
0,4M
0,8M

Sorbitol

coloniei
[mm]

Rata cretere
[mm/zi]

unor ageni

Inhibare
cretere
micelian
[%]

Martor
Botrytis

NaCl

1%
8

Sorbitol

2%
4%
8%
0,4M
0,8M

Martor

Inhibare cretere micelian ICm [%]

ICm [%] = (D colonie martor D colonie varianta test)/D colonie martor x 100
Unde D = diametrul coloniei
Rezultate privind influena stressului osmotic asupra creterii miceliene a
fitopatogeni

Tulpina
patogen

Molecula
test

Concentraia Diametrul
coloniei
[mm]

unor ageni

Inhibare
cretere
micelian
[%]

Alternaria

Martor
Botrytis

Martor