Genetica microorganismelor şi inginerie genetică microbiană

Note de curs şi tehnici de laborator

CAP. 1.3.2. TRANSFORMAREA BACTERIANĂ

Lumea organismelor procariote se caracterizează printr-un flux genetic extrem de activ şi

continuu pe “orizontală” (între organisme aparţinând aceleiaşi generaţii; în contrast, fluxul de gene pe
“verticală” reprezintă transferul de material genetic de la ascendenţi la descendenţi). Până în prezent
se cunosc 3 tipuri principale de procese prin care este realizat acest transfer de gene pe orizontală
între organisme procariote: transformarea, conjugarea şi transducţia (alături de variante derivate din
acestea – transfecţie, sexducţie).
Transformarea genetică a organismelor procariotelor reprezintă procesul prin care o celulă
bacteriană incorporează ADN extracelular liber (cromosomal sau plasmidial) şi menţine stabil
informaţia genetică respectivă, exprimând-o. Astfel, transformarea bacteriană constituie un mecanism
de transfer genetic orizontal, care depinde de funcţionarea mai multor gene localizate pe cromosomul
bacterian şi care a fost evidenţiat şi în medii naturale (N.A.Brisson et al 1988).
Bacteriile reprezintă singurele organisme capabile de transformare genetică naturală.
Necesităţile celor 3 mecanisme de transfer genetic (conjugare, transfomare, transducţie) sunt
diferite :
- spre deosebire de conjugare, transformarea nu necesită o celulă donor vie;
- transformarea necesită ca celula receptor să fie într-o stare fiziologică activă, capabilă de a
prelua ADN, stare denumită competenţă.
Deci, în transformare se definesc:
ADN exogen (exogenot) = ADN transformant (plasmidial sau cromosomal)
celula receptor (ce conţine ADN endogenot)
Există diverse variante tehnice de transformare bacteriană artificială (in vitro):
- tratarea celulelor receptor cu CaCl2 (sau alţi cationi bivalenţi), agenţi chelatori sau enzime ce atacă
peretele celular (muraminidaze);
- fuziunea celulelor/protoplaştilor receptor cu ADN împachetat în liposomi;
- expunerea celulelor receptor la curent electric (electrotransformare, electroporare);
- bombardarea celulelor receptor cu particule foarte mici (de aur, tungsten etc) pe care este adsorbit
ADN.

Starea de competenţă genetică a celulelor bacteriene

Competenţa genetică reprezintă o stare fiziologică tranzitorie ce-i permite celulei bacteriene să
preia ADN liber din mediul înconjurător. Competenţa este întâlnită la foarte mulţi taxoni bacterieni, ceea
ce implică o origine evolutivă veche.
La marea majoritate a bacteriilor, competenţa genetică reprezintă un proces de tip inductibil
(excepţie face genul Neisseria la care competenţa este constitutivă). Din analizele efectuate s-a
constatat că la marea majoritate a bacteriilor starea de competenţă genetică variază în cursul diferitelor
faze ale ciclului de multiplicare celulară (M.Lorenz et al 1994), de exemplu:
- la genuri ca Azotobacter, Staphyloccocus, Streptococcus competenţa este maximă în tot
timpul fazei de creştere logaritmică (faza log);
- la genuri ca Bacillus, Pseudomonas, Methylobacterium competenţa este maximă la trecerea
de la faza log la faza staţionară.

Într-o populaţie bacteriană, proporţia celulelor capabile să preia ADN poate fi estimată din
frecvenţa de transformare:
- în genuri ca Pseudomonas şi Streptomyces, proporţia celulelor transformate este foarte mică
(< 5%);
- la populaţiile de Bacillus subtilis, această proporţie ajunge până la 10-25%
- la speciile din genul Azotobacter - 100%
Starea de competenţă este controlată genetic şi poate fi anulată prin mutaţie. Competenţa este
corelată cu modificari ale peretelui celular: sunt antrenate alterări de suprafaţă, mai ales în zonele de
crestere a peretelui celular, ceea ce duce la demascarea “receptorilor” de ADN.

Etapele transformării genetice a bacteriilor

Principalele etape ale transformării genetice a bacteriilor sunt :
1. Legarea (adsorbţia) ADN transformant la celula receptor: reversibilă şi, apoi, ireversibilă;
2. Înglobarea (internalizarea) ADN transformant în celula receptor;
3. Eclipsa: ADN exogen internalizat în celula receptor nu se exprimă;
4. Transformantii: ADN exogen se exprimă în celulele receptor.

1
 Cap. 1-3-2 Transformarea bacteriană

Legarea ADN (M.Lorenz et al 1994)

Marea majoritate a bacteriilor leagă preferenţial ADN d.c., dar există şi câteva excepţii: Bacillus subtilis
şi Haemophilus influenzae la pH 5.0 leagă şi ADN m.c., iar Neisseria gonorrhoeae poate lega şi ADN
m.c. chiar la pH neutru.
Din punct de vedere al specificităţii de legare (la o anumită secvenţă ADN) a ADN transformant, au fost
descrise 2 tipuri de tulpini bacteriene :
(a) tulpini bacteriene (aparţînând de exemplu genurilor Bacillus, Streptoccocus) la care legarea
ADN exogen nu se realizează situs-specific şi, ca urmare, bacteriile din aceste genuri pot incorpora şi
ADN provenit de la specii bacteriene îndepărtate filogenetic.
- la Bacillus există aproximativ 50 de situsuri de legare ADN/celulă competentă;
- la Streptoccocus există circa 70 de situsuri de legare ADN/celulă competentă.
(b) tulpini bacteriene (aparţînând de exemplu genurilor Haemophilus, Neisseria) la care
receptorii pentru ADN prezenţi pe suprafaţa celulelor receptor leagă ADN exogen într-o manieră situs-
specifică. Din această cauza, aceste specii bacteriene nu pot fi transformate decât cu ADN înrudit.
- la Haemophilus există 8 situsuri celulare de legare a ADN exogen; receptorii pentru ADN
leagă o secvenţă de 11 pb flancată de regiuni A-T; în cromosomul de Haemophilus influenzae există
aproximativ 600 de copii ale acestei secvenţei de 11 bp;
- la Neisseria există 10 situsuri celulare de legare a ADN exogen, iar receptorii pentru ADN
recunosc o secvenţă de 10 bp; în cromosomul de Neisseria, această secvenţă este întâlnită în repetări
inverse la nivelul terminatorilor de transcriere.

In prima fază a legării ADN, acesta este sensibil la DNaza I, fapt pentru care această fază poartă
denumirea de adsorbţie reversibilă. Ulterior, se trece laetapa de adsorbţie ireversibilă, în care ADN
exogen nu mai este sensibil la această enzimă.

Înglobarea (internalizarea) ADN (B.Dreisekelmann 1994)

Au fost identificate mecanisme diferite pentru internalizarea ADN transformant, la bacteriile Gram-
pozitive faţă de cele Gram-negative.
La bacteriile Gram-pozitive există un set de proteine (denumite proteine Com) ce constituie aparatul
de internalizare a ADN transformant (Fig.1.30.):
- o endonucleaza degradează una din catene, deci în celulă intră ADN m.c., în direcţia 3′ → 5′ (cu
capul 3’ inainte);
- Com C este o proteină localizată în membrana celulară şi care este necesară pentru procesarea
unor componente ale aparatului proteic de translocare a ADN exogen prin membrană;
- Com G formeaza o familie de proteine codificate de un operon cu 7 ORF-uri; Com G1 este o
ATPaza; proteinele Com G formeaza un canal proteic transmembranar;
- Com F sunt tot o familie de proteine codificate de un operon cu 3 ORF-uri, dintre care ORF 1
codifică o ADN-translocază ADN-dependentă
- Com E sunt codificate de un operon cu 3 ORF-uri:
Com E1 traversează peretele celular având capul NH3+ la exteriorul celulei şi are rol în legarea
ADN la suprafaţa celulei receptor;
Com E2-E3 traversează peretele celular fără a iesi în afara celulei şi are rolul de a transloca
ADN prin peretele celulei bacteriene

Fig.1.30. Internalizarea ADN transformant (modelul

canalului proteic) la bacterii Gram-pozitive.

La bacteriile Gram-pozitive a fost propus şi

un alt model pentru înglobarea ADN exogen
în timpul transformării. Conform acestui
model, ADN exogen ar fi internalizat prin
intermediul unui canal neproteic format din
PHB (polihidroxibutirat), polifosfaţi şi Ca++
(ionii de Ca++ ar forma interiorul canalului);
diametrul interior al canalului ar fi de 2.4 nm,
ceea ce ar permite trecerea ADN m.c., dar
nu şi d.c.

2
Genetica microorganismelor şi inginerie genetică microbiană
Note de curs şi tehnici de laborator

Inglobarea ADN transformant la bacteriile

Gram-negative (Lorenz, 1994)

La bacteriile din genul Haemophilus, în timpul

dezvoltării stării de competenţă, apar nişte
extensii membranare, denumite
TRANSFORMASOMI, ce au o înălţime de 35 nm,
un diametru de 20 nm şi sunt în număr de 10-
12/celulă. Transformasomii se găsesc la locurile
de adeziune între membrana externă şi cea
internă şi sunt alcătuiţi, în principal, din
componente ale membranei externe. In
transformasomi, ADN-ul transformant este protejat
împotriva acţiunii DNazelor. Din interiorul
transformasomilor, ADN transformant va intra în
citoplasmă printr-un por de aproximativ 5 nm
diametru. In timpul translocării, una din catene va
fi degradată de către o endonuclează şi în interior
va intra o singură catenă (Fig.1.31.).
ADN plasmidial este procesat şi translocat într-o
manieră similară cu ADN cromosomal.

Fig.1.31. Internalizarea ADN transformant la Haemophilus

influenzae prin intermediul transformasomilor (dupa
Lorenz, 1994).

In general, eficienţa transformării (număr transformanţi per g ADN) cu ADN plasmidial este mai mică
decât cu ADN cromosomal.
Dupa faza de eclipsă în care nu este exprimat, ADN internalizat va participa la următoarele fenomene:
- ADN transformant cromosomal va participa la procese de recombinare genetică cu ADN-ul
cromosomului gazdă;
- ADN transformant plasmidial poate participa la 2 tipuri de procese:
- 2 molecule mono-catenare vor hibridiza şi vor reforma molecula dublu-catenară;
- va fi iniţiată sinteza replicativă a catenei complementare pornind de la oriV,
reformându-se şi în acest caz structura dublu-catenară