Sunteți pe pagina 1din 4

PURIFICAREA CELULELOR I A PRILOR COMPONENTE

Studiile referitoare la componentele celulare necesit izolarea celulelor din contextul lor
tisular, precum i separarea componentelor subcelulare dup criterii bine stabilite. De
exemplu, elementele figurate ale sngelui (hematii, leucocite) posed densiti diferite
datorit faptului c eritrocitele sunt anucleate; separarea acestor dou tipuri celulare se
face foarte simplu prin centrifugare de densitate la echilibru.
Studiul anatomiei celulare i mai ales a componentelor subcelulare alturi de studiul
biochimic al celulei presupune desfacerea celulelor n elementele componente urmat de
separarea sau caracterizarea acestora
CITOMETRIA DE FLUX (flow cytometry)
Reprezint o metod de separare i caracterizare a populaiilor celulare dintr-o suspensie
pe baza proprietilor optice (dispersia luminii sau fluorescena indus). Este un
instrument de lucru adresat n special tehnicilor imunologice care presupun separarea
unor subseturi celulare derivate mai ales din snge. Citometria de flux mai este denumit
i sortare celular activat prin fluorescen (FACS fluorescence activated cell
sorting). Ca i aplicaii clinice subliniem implicarea acestei metode n clasificarea
leucemiilor sau limfoamelor precum i n prognosticul infectrii HIV.
Un flow-citometru poate identifica diferitele tipuri de celule prin msurarea cantitii de
lumin dispersat sau a cantitii de fluorescen emis, n timpul n care aceste celule n
soluie traverseaz un spaiu iradiat cu un fascicul laser. Astfel, dintr-un amestec celular
se pot separa celule cu caracteristici asemntoare (fig. 5-34 Lodish)

FRACIONAREA CELULAR
Definiie
Este o tehnic bazat pe caracteristicile structurilor subcelulare (form, dimensiune,
densitate) care reuete s le diferenieze astfel permind separarea lor. Celulele pot fi
dezmembrate prin:
- oc osmotic
- ultrasonicare
- filtrare prin site mici
Dac celula este dezmembrat ntr-o manier delicat, fiecare din organitele sale poate fi
izolat. Procesul de dezmembrare celular se numete omogenizare iar procesul ulterior
de izolare a organitelor se numete fracionare. Izolarea organitelor necesit tehnici de
chimie fizic mergnd de la strecurare prin site simple, la sedimentarea gravitaional sau
precipitare diferenial sau la ultracentrifugare sau marcare fluorescent a fragmentelor n
gradiente de densitate generate pe computer.
Scop
Izolarea componentelor celulare sau subcelulare, a complexelor macromoleculare acizilor
nucleici sau enzimelor n scopul definirii rolului lor individual n celule.
Individualizarea componentelor celulare permite meninerea lor ntr-o stare de
funcionare, n condiii prestabilite, fr a necesita prezena unei celule sau a unui grup de

celule. Aceste sisteme de studiu, acelulare, sunt utilizate n toate sistemele experimentale
de investigare a rolului organitelor celulare.
Omogenizarea
Primul pas n vederea fracionrii este izolarea celulelor i obinerea unui eantion pur.
Celulele izolate (cele din snge sau din culturi de celule) pot fi separate pe baza formei
sau a unor markeri de suprafa (ncrcare electric, antigene sau enzime de suprafa).
Celulele din context tisular trebuie separate de celulele vecine, eliberate din jonciuni prin
activitate mecanic sau enzimatic. Dezagregarea jonciunilor de tip desmosomal sau
jonciunilor strnse se poate realiza cu chelatori (eliminatori) de Ca, Mg alturi de fore
mecanice. Tehnicile de omogenizare cuprind:
- tehnici bazate pe alterarea osmotic a mediului n care sunt celulele
- tehnici bazate pe fore mecanice mojarare, blender, compresiune/expansiune,
ultrasonicare
Aceste tehnici determin ruperea majoritii membranelor celulare cu formarea ulterioar
de microvezicule nchise. Dac tehnica este bine executat, organite ca mitocondriile,
nucleul, complexul Golgi sau lizozomii rmn intacte. Disrupia reticolului
endoplasmatic rugos determin formarea unor microvezicule cu coninut variabil, numite
microsomi. Suspensia celular este redus la un omogenat (sau extract) care conine
diferite compartimente veziculare cu coninut variabil, ncrcare i densitate diferite.
Fracionarea
Reprezint tehnica de separare a elementelor dintr-un omogenat.
Dup omogenizarea celulelor, diferitele componente pot fi separate. Pentru unele
materiale (snge integral, celule n suspensie) aceasta se poate realiza prin sedimentare
gravitaional. n aceast tehnic, separarea are loc prin diferenele naturale de form i
dimensiune (densitate) dintre celule. Hematiile sunt mai dense dect leucocitele, astfel
nct separarea determin depunerea unui strat de hematii la fundul eprubetei de
sedimentare, urmat superior de un strat de leucocite
Centrifugarea reprezint cea mai folosit tehnic de fracionare a componentelor celulare
utiliznd fora centrifug. Tehnicile care folosesc recipiente de centrifugare de volum mai
mare i incinte frigorifice sunt tehnici preparative; tehnicile care folosesc viteze de
centrifugare mari n recipiente mici sunt tehnici analitice. O centrifug de peste
20.000RPM este o ultracentrifug. Organitele pot fi separate ntr-o centrifug prin variate
metode. Particulele se comport diferit sub aciunea forei centrifuge: particulele n
suspensie pot fi separate fie prin sedimentare de vitez fie prin sedimentare de echilibru.
Sedimentarea de vitez se mai numete i centrifugare zonal i are avantajul unei
centrifugri la vitez redus pentru o perioad scurt de timp dar confer separri
incomplete. Sedimentarea de echilibru se mai numete izopicnic sau de echilibru la
densitate i necesit viteze mari de centrifugare pentru perioade mai lungi de timp, avnd
avantajul unei separri complete.
Sedimentarea gravitaional
Reprezint o metod de separare grosier a componentelor unui omogenat. Separarea are
loc n funcie de criteriile dimensiune i densitate. Componentele mai mari se mic cel
mai repede sub aciunea forei centrifuge i se vor depune primele la nivelul fundului
eprubetei de centrifugare. La viteze relativ mici, componentele mari ca nucleii sau

fragmentele celulare formeaz un depozit (pelet). O vitez superioar de centrifugare


determin formarea unui pelet din mitocondrii. Ultimele componente care sedimenteaz
la viteze foarte mari sunt elementele reticulului endoplasmatic i ribozomii. Peletul poate
fi extras dup fiecare treapt de centrifugare. Deoarece separarea nu este de mare finee,
peletul extras poate fi resuspendat i recentrifugat de cteva ori pentru a obine un eantin
pur
Sedimentarea de vitez
Este o metod de rafinare a sedimentrii gravitaionale. Se bazeaz pe criteriile
dimensiune i form a particulelor de separat. Particulele din soluia centrifugat sunt
accelerate i ating o vitez final; aceast vitez final este determinat n parte de
dimensiuni, greutate, densitate i forma particulelor ca i de viscozitatea mediului n care
se desfoar procedura i de fora centrifug generat. Viteza final este denumit viteza
de sedimentare a particulei i poate fi utilizat pentru msurarea dimensiunii, greutii sau
densitii particulei.
Practic, separarea are loc prin centrifugarea unui omogenat dispus ca un strat la suprafaa
unei soluii saline din tubul de centrifugare. Deoarece un preparat mai dens (omogenatul)
are tendina de a se amesteca n soluia de sedimentare, aceast soluie este amplasat
ntr-o soluie de sucroz care este astfel preparat nct concentraia acesteia descrete de
la fundul spre gtul tubului de centrifugare. Se creeaz un gradient de densitate care
rafineaz sedimentarea de vitez i permite separarea diferitelor componente ale
omogenatului sub form de benzi. Aceste benzi se menin datorit gradientului de
densitate. Din aceste benzi de sedimentare se pot extrage individual componentele
celulare. Rata de sedimentare (poziia final a fiecrui component) depinde de forma i
dimensiunile particulelor i este caracterizat de un coeficient de sedimentare (s).
Centrifugele moderne care ating viteze de rotaie de 80.000 rpm (rotaii pe minut)
dezvolt fore de 500.000G, fore care pot determina separarea unor molecule minuscule,
cum ar fi ARNt sau enzimele.
Addenda
Coeficientul de difuziune
Cnd o particul atinge viteza final, este afectat de difuziune, de obicei n direcia
opus deplasrii sale determinat de fora centrifug. Este o micare de tip brownian i
poate fi statutat matematic ca o constant coeficientul de difuziune reprezentnd
gradul de mprtiere a moleculei n timp. Este exprimat n uniti Fick. 1 Fick = 10-7
cm2/sec. Exist o relaie direct ntre coeficientul de difuziune a unei particule i
diametrul su. Ambele sunt raportate la coeficientul de sedimentare al particulei.
Coeficientul de sedimentare este determinat de formula
S = 1/2r x dr/dt unde
- este viteza angular a rotorului exprimat n radiani/sec i este egal cu 0,10472 x
RPM
- r = distana dintre particul i centru de rotaie (mm)
- dr/dt = rata deplasrii particulelor (cm/sec)
Valoarea coeficientului de sedimentare pentru o particul poate fi determinat prin
msurarea timpului de deplasare (vitez i distan) a unei particule ntr-un mediu de

viscozitate cunoscut. Cel mai simplu este s calculm distana de deplasare a


particulelor pentru o centrifug cu o for cunoscut.
Sedimentarea la echilibru
Este o tehnic de separare a componentelor dintr-un omogenat pe baza densitii de
flotare. n acest caz, nu mai conteaz parametrii dimensiune i form.
Dac o prob conine mai multe particule diferite, cu diferite densiti i dimensiuni, ele
vor fi separate pe baza acestor parametri. Particulele mai mari vor ajunge la baza tubului
de centrifugare mai repede dect cele mai mici. Dac fora centrifug este crescut
progresiv, timpul de separare poate scdea.
Gradientul de concentraie din tubul de centrifugare (gradient de sucroz sau clorur de
cesiu) este mult mai accentuat dect pentru sedimentarea de vitez. Prin centrifugare,
componentele celulare se deplaseaz spre fundul tubului de centrifugare i se opresc i
floteaz n momentul n care ajung ntr-un strat unde densitatea este echivalent cu
densitatea proprie. La finalul centrifugrii se formeaz benzi din care cea mai apropiat
de fundul centrifugii este compus din elemente cu densitatea de flotare cea mai mare.
Metoda este util pentru separarea unor componente asemntoare care incorporeaz sau
nu (experimental) izotopi grei.