Sunteți pe pagina 1din 3

Real-Time PCR

Real Time este o tehnic bazat pe revoluionara tehnic PCR


(descoperit de Kary Mullis n anul 1980) i reprezint nc un salt nainte
care a deschis o nou i puternic aplicaie pentru cercettorii din ntreaga
lume.
Real Time PCR reprezint un tip aparte de PCR care permite
vizualizarea amplificrii produilor de interes n timp real. Aceast metod se
bazeaz pe izolarea ARN i purificarea acestuia, urmat de transformarea
acestuia n ADN complementar, prin intermediul revers-transcripiei i n final
amplificarea ADN complementar.
Prima etap este reprezentat de extracia ARN prin diferite metode i
purificarea acestuia; ntruct, n urma extraciei se va obine pe lng ARN i
ADN, se vor utiliza ADN-aze pentru digestia ADN. Odat extras i purificat,
ARN va fi supus unei reacii de transformare n ADN complementar. Aceast
reacie presupune utilizarea unei enzime numite revers-transcriptaz, cu
ajutorul creia se va obine ADN complementar pe baza ARN iniial. Procesul
de transformare a ARN n ADN complementar poart numele de reverstranscripie.
ADNc va fi supus amplificrii PCR, utilizndu-se n aceast reacie i un
colorant, cel mai utilizat fiind SYBR Green, pentru detectarea n timp real a
amplificrii. Colorantul se va ataa n moleculele de ADN dublu catenar (ADN
complementar legat de primer) i va emite o fluorescen care va fi
detectat

i afiat, genernd o curb

ce va prezenta

o cretere

exponenial odat cu creterea numrului de cicluri.


Real Time PCR reprezint tot un tip de PCR, dar care conine o etap
premergtoare i anume trecerea de la ARN la ADN complementar.
Componentele reaciei sunt reprezentate de: ADN complementar
rezultat prin revers - transcripie, o pereche de primeri i un master mix, care
conine soluia tampon, dNTPs, polimeraz i un colorant (SYBR Green).

Principiul acestei reacii const n intercalarea unui colorant (SYBR


Green) la nivelul ADN dublu catenar, concomitent cu emiterea unei
fluorescene. ADN dublu catenar este reprezentat de catena de ADN
complementar la care se leag pe baz de complementaritate primeri
specifici utilizai pentru amplificare. Creterea numrului de copii ale ADN
int este direct proporional cu intensitatea fluorescenei. Graficul prezint
pe orizontal o valoare numit CT cycle treshold, iar aceast valoare
reprezint numrul de cicluri de amplificare la care curba fluorescenelor
ncepe s creasc (adic acel numr de cicluri la care intensitatea
fluorescenei este detectabil). Cu ct numrul de copii este mai mare cu
att fluorescena va fi mai crescut.

Tehnologia Real Time PCR prezint numeroase avantaje fa de cea


convenional: acuratee mai mare a rezultatelor obinute (efectuarea
deteciei se realizeaz n faza precoce a reaciei, respectiv n faza de cretere
exponenial a amplificrii, cand se produce o dublare exact a cantitii de
amplicon la fiecare ciclu; detecia n acest moment este optim n sensul c
rezultatele se coreleaz mai bine cu nivelul iniial al intei, comparativ cu
tehnica PCR convenional, unde detecia are loc n faza de platou.