Revizuirea critica a metodelor de caracterizare a compuilor polifenolici n fructe i legume

Abstract
Compuii fenolici, omniprezeni n plante, sunt de un interes considerabil i au primit mai
mult atenie n ultimii ani, ca urmare a funciilor lor bioactive. Polifenolii sunt printre cele mai
dorite fitochimicale datorit activitii lor antioxidante. Aceste componente sunt cunoscute ca
plant secundar a metaboliilor i posed, de asemenea, proprieti antimicrobiene, antivirale i
antiinflamatorii, mpreun cu capacitatea lor antioxidant mare. S-au fcut multe eforturi pentru
a oferi o analiz extrem de sensibil si selectiva a metodelor de determinare i caracterizare a
polifenolilor .Scopul acestei lucrri este de a furniza informaii cu privire la cele mai recente
evoluii din cadrul investigaiei chimic a polifenolilor subliniind extracia, separarea i analiza
acestor compui prin cromatografie i tehnici spectrale.
Introducere
Compuii fenolici sunt metabolii secundari ale plantelor, care sunt determinani
importani n calitatea senzorial i nutritiv ale fructelor, legume i plantelor. (Tomas-Barberan,
Ferreres, & Gil, 2000; Lapornik, Prosek, & Golc, 2005). Aceti compui posed un inel aromatic
care poart una sau mai multe grupri hidroxil i structurile lor poate varia de la cea a unei
simple molecule fenolice cu cel al unei mase moleculare mare complex polimer (Balasundram,
Sundram, si Samman, 2006). Aceti compui, unul dintre cele mai largi grupari de fitochimicale,
au o important fiziologic i morfologic n plante. Ca un grup mare de substan e chimice
bioactive, ei au diverse funcii biologice. Fenoli pot aciona ca phytoalexini (Popa, Dumitru,
Volf, i Anghel, 2008), antifeedani, momeli pentru polenizatori, contribuind la pigmentarea
plantelor, antioxidani i ageni de protecie mpotriva luminii UV, printre altele (Naczk &
Shahidi, 2006). Aceste proprieti bioactive i aceti compui joac un rol important n creterea
plantelor i reproducerea lor, oferind o protecie eficient mpotriva agen ilor patogeni i
prdtori (Popa, Agache, Beleca, i Popa, 2002; Bravo, 1998), contribuind si la caracteristicile de
culoare i senzoriale ale fructelor i legumelor (Alasalvar, Grigor, Zhang, Quantick, &
Shahidi,2001).
n special, fenoli naturali au fost raportai ca avnd proprieti excelente n conservanii
alimentari (Valenzuela, Nieto, Cassels, & Speisky, 1992) precum i ca avnd un rol important de
protecie mpotriva unui numr de tulburri patologice, cum ar fi ateroscleroza, disfunctii
cerebrale i cancer (Gordon, 1996). Mai mult de att, polifenoli au multe aplica ii industriale, de
exemplu, ei pot fi folosii ca i colorani naturali si conservani pentru produsele alimentare, sau
n producerea de vopsele, hrtie, i cosmetice. Din aceste motive,un mare efort a fost fcut
pentru a caracteriza fenolii care apar n diferite esuturi vegetale (Pinelo, Del Fabbro, Manzocco,
Nunez, si Nicoli, 2005).
Scopul acestui studiu este de a prezenta valoroasele surse de polifenoli, principalele clase
de fenoli se gasesc in fructe, legume i alte plante, mpreun cu proprietatile lor bioactive.

Izolarea i tehnicile de caracterizare ale acestui compus bioactiv sunt cele mai importante etape
n aplicarea practic a polifenolilor. Lucrarea prezint diferite metode de separare i caracterizare
care au fost folosite in ultimii ani. Principalele avantaje precum limitarea fiecrei metode au fost
raportate n scopul de a stabili metodele cele mai fezabile pentru analiza polifenolilor.
2. Principalele clase de compui polifenolici
Compuii fenolici cuprind o mare varietate de molecule care au o structur de polifenoli
(de exemplu, mai multe grupri hidroxil pe inele aromatice), dar i molecule cu un inel fenolic,
cum ar fi acizii fenolici i alcoolii fenolici. Polifenolii sunt mpr iti n mai multe clase n func ie
de numrul de inele fenolice pe care le conin i elementele structurale de care se leaga aceste
inele. Principalele grupe de polifenoli (. Fig 1) sunt: flavonoidele, acizii fenolici, taninuri
(hidrolizabile i condensate), stilbene i lignani (D'Archivio et al., 2007).
2.1. Flavonoidele
Mai mult de 8000 de polyphenoli, dintre care peste 4000 de flavonoide au fost
identificate, iar numrul este n continu cretere (Harborne, Baxter, & Moss, 1999).
Flavonoidele pot fi clasificate n continuare n antociani, flavone, izoflavone, flavanone,
flavonoli i flavones (Tsao i Yang, 2003). Structurile chimice ale principalelor clase de
flavonoide sunt prezentate n Fig. 2. Flavonoidele sunt compui cu greutate molecular mic,
care const din cincisprezece atomi de carbon, dispui ntr-o configuraie C6-C3-C6. n esen
structura este format din dou inele aromatice, A i B, alturate printr-o punte de 3-carbon, de
obicei sub forma unui inel heterociclic, C. Inelul aromatic A este derivat din acetat / calea
malonat, n timp ce inelul B este derivat din fenilalanin prin calea shikimat (Merken &
Beecher, 2000). Variaiile modelele de substituie al inelului C duce la clase de flavonoide
majore, i anume, flavonoli, flavone, flavanone, flavanols (sau catechine), izoflavone,
flavanonols, i antocianidine (Hollman & Katan, 1999), dintre care flavonele i flavonoli sunt
cele mai diverse si aparte structuri(Harborne, Baxter, i Moss, 1999). Substitu iile inelelor A i B
dau natere la diferii compui din fiecare clas de flavonoide (Pietta, 2000). Aceste substitu ii
pot include oxigenarea, alchilarea, glicozilarea, acilarea, i sulfonarea (Balasundram, Sundram,
& Samman,2006).
Flavonoidele sunt antioxidanti deosebit de importani datorit potenialului redox ridicat,
ceea ce le permite s acioneze ca ageni de reducere, donatori de hidrogen, i de saturare de
oxigen singlet. In plus, ei au un potenial chelator de metal (Tsao & Yang, 2003). Flavonoidele
sunt cele mai des ntlnite fitochimicale, care de obicei, aceste substane chimice ajut la
protejarea plantelor de lumina UV, parazii fungice, ierbivore, ageni patogeni i a prejudiciului
de celule oxidative (Cook a & Samman, 1996).Fiind consumate regulat de oameni, flavonoidele
au fost asociate cu o reducere a incidenei de boli cum ar fi cancerul i bolile de inima (Beecher,
2003; Cook a- Samman, 1996; Liu, Cai, i Shao, 2008). n prezent, exist un mare interes n
cercetarea flavonoidelor, datorit posibilitii de mbuntire a sntii publice prin diet, n

cazul n care asistena medical preventiv poate fi promovat prin consumul de fructe i
legume. Flavonolii sunt o clas de flavonoide frecvent intalnite in multe fructe i legume,
coninutul lor variind foarte mult, n funcie de mai muli factori, cum ar fi condi iile de cre tere,
clim, depozitare i condiiile de gtit (Caridi et al., 2007).
Flavanonele sunt caracterizate prin prezena unui lan saturat cu trei carbon i un atom
de oxigen n C4. Ele sunt, n general glicozilate de un dizaharid n C7. Flavanone sunt prezente
n concentraii mari numai n citrice, dar ele sunt, de asemenea, gsite n roii i anumite plante
aromatice, cum ar fi menta. Principalele aglicone sunt naringenina n grapefruit, hesperetin n
portocale, i eriodictiol n lmi.
Isoflavonele au similariti structurale cu estrogenii, adic grupuri hidroxil din C7 i C4,
ca molecul estradiol. Acestea sunt fitochimicale care se gsesc n multe plante i alimente
derivate din plante, att n form (''agliconului "), nativ i n calitate de acetil-, sau malonyl-,
etc, b-glucozide. Efectele importante de sanatate care le-a fost atribuite, i aa s-a sugerat c
acestea trebuie utilizate pentru prevenirea sau vindecarea bolilor prevalente cum ar fi
ateroscleroza sau cancerul. Unele efecte fiziologice sunt atribuite similarit ii structurale la Bestradiols i sunt uneori denumite "" fitoestrogeni '' (Klejdus et al., 2007; D'Archivio et al.,
2007).
Antocianinele sunt pigmeni vacuolari solubili n ap, care pot aparea n rou, violet,
albastru sau n funcie de pH. Ele aparin unei clase primare de molecule numite flavonoide,
sintetizate pe cale fenilpropanoidic. Antocianinele apar n toate esuturile vegetale, inclusiv
frunze, tulpini, rdcini, flori i fructe.
Antocianidinele sunt structurile de baz ale antocianinilor. Antocianidinele (sau
agliconii) constau dintr-un inel aromatic. O legatur la un inel heterociclic C care conine oxigen,
care este de asemenea, legat printr-o legtur carbon-carbon cu un al treilea ciclu aromatic B
(Konczak & Zhang, 2004). Cnd antocianidinele se gsesc n forma lor glicozidic (legate la un
rest de zahr) sunt cunoscute ca antociani. Derivaii glicozidici ale celor trei antocianidine nonmetilate (pelargonidin-Pg, cianurare-Cy,-delfinidina Dp) sunt cel mai frecvent n natur, fiind gsit n
80% n frunze pigmentate, 69% n fructe i 50% n flori (Dey & Harborne, 1993).
ase antocianidine apar cel mai frecvent n plante: pelargonidina, cianidina, peonidina,
delfinidina, petunidina i malvidina, zaharuri de obicei legate de antocianidine sunt monozaharide
(glucoz, galactoz, ramnoz i arabinoz), i di- sau tri-zaharide formate prin combinarea celor patru
monozaharide (Biroul, Renard, Reich, Ginies, si Audergon, 2009). Mai mult dect att, muli antociani au
reziduuri de zahr acilat cu acizi aromatic sau alifatici (Mazza & Miniati, 1993). Antocianinele izolate
sunt foarte instabile i foarte susceptibile la degradare (Giusti & Wrolstad, 2003). Stabilitatea lor este
afectat de mai muli factori cum ar fi pH-ul, temperatura de depozitare, structura chimic, concentrarea,
lumin, oxigen, solveni, prezena de enzime, flavonoide, proteine i ioni metalici (Castaeda-Ovando et
al., 2009). Antocianinele, precum i ali fenoli, pot ac iona ca antioxidan i prin donarea de hidrogen la
radicali foarte reactivi, astfel prevenind n plus formarea de radicali (Iversen, 1999). Potenialul lor

antioxidant este dependent de numrul i dispunerea gruprile hidroxil i gradul de conjugare structurale,
precum i prezena atrgtoare de electroni-donori de electroni substituen i n structura inelului (Lapornik
et al., 2005).
Antocianinele posed proprieti farmacologice cunoscute i func iile biologice puternice, cum ar
fi anti-inflamatorii i activiti antioxidante (Kong, Chia, Goh, Chia, si Brouillard, 2003). Compu ii
fenolici, inclusiv antociani, flavonoide si acizii fenolici , sunt cunoscute a fi responsabile pentru
capacitile antioxidante n fructe, fructe cu un con inutfenolic mai mare, n general, arat capacit i
antioxidante puternice (Fang et al., 2009). n prezent, coloran ii alimentari sintetici au fost interzii in
multe ri din cauza toxicitii i carcinogenitii lor. Antocianinele, compu i naturali de culoare ob inute
din fructe i legume, pot fi considerate poteniali substitueni pentru coloran ii alimentari interzii: ei au,
de fapt, culori atractive luminoase, n timp ce solubilitate mare n ap a acestor compu i permit acestora
ncorporarea uoar n sistemele de alimentare apose (Kammerer, Carle, & Schieber, 2004). Mai mult
dect att, activitatea antioxidant legat de prevenirea unui numr de boli degenerative (Ames, Shigena,
i Hagen, 1993; Scalbert, Manach, Morand, Rmsy, si Jimnez, 2005) ofer avantaje suplimentare la
produsele alimentare vopsite cu aceste substane naturale (Bleve et al., 2008)
3.2. Buturi
Bauturile, cum ar fi sucurile de fructe, ceaiurile i vinurile sunt importante
surse de fenoli n alimentaia uman. n ultimele decenii, ceaiul verde a fost supus
la multe studii stiintifice si medicale pentru a determina beneficiile sale de
sntate, cu unele dovezi care sugereaza ca bautorii de ceai verde regulat, pot
avea anse mai mici de a dezvolta boli de inima si anumite tipuri de cancer.
Principali compui fenolici prezeni n ceai sunt catechinele. Coninutul lor este
destul de variat n funcie de tipul de materia prim utilizat i de tehnologia de
conservare. n general, ceaiul verde contine mai multi astfel de compui dect
ceaiul negru sau rosu, datorita aceasteia, prezinta de doua ori mai mare capacitate
antioxidanta (Sikora, Cielik, si Topolska, 2008).
Aa cum este acceptat de ctre comunitatea tiinific, vinul este unul
dintre cele mai importante surse de antioxidanti polifenolici dietetici inclusiv o mare
varietate de
flavonoide (flavonoli, flavan-3-ol i antociani) i compuii nonflavonoizi (acizi fenolici, alcooli fenolice, stilben, acidul hidroxicinamic), (Makris,
Boskou, & Andrikopoulos, 2007).
Profilul polifenolic din vinurile roii difer n mod esenial de vinurile albe din
cauza diferenelor de compoziie a strugurilor albi si rosii, i, de asemenea, ca
urmare a tehnologiei de vinificatie second-hand (Bravo, 1998; Alen-Ruiz, GarcaFalcn, Prez-Lamela,Martnez-Carballo, i SIMAL-Gndara, 2009). Vinul rosu a fost
considerat mai mult de protecie pentru sntate dect alte buturi
alcoolice(Gronbaek, Henriksen, si Becker, 1995;. Alen-Ruiz et al, 2009) ,posibil din
cauza polifenolilor pe care ii conine, ajutand la prevenirea bolilor oxidative legate
de stres.

Cafeaua ofera de asemenea o surs important de antioxidani dietetici.

Coninutul de compui fenolici n cafeaua prjit ajunge la 8%, din care acidul
clorogenic este dominant. O infuzie de 5 g de sol de cafea prjite poate conine
chiar aproximativ 140 mg din acest compus, care poate fi responsabil pentru
eventualul efect acru al acestei bauturi (Sikora et al., 2008). Klatsky, Morton,
Udaltsova, i Friedman (2006) au studiat corelaia dintre consumul de cafea ca o
surs alimentar de compui polifenolici i reducerea aparentelor riscurile de boala
Alzheimer, Parkinson, boli de inima, diabet zaharat de tip 2 i livercirrhosis.
Sucurile de fructe, cum ar fi grapefruit, portocale, suc de mere sunt, de
asemenea, abundente surse de compui fenolici naturali. n general, comercianti de
sucuri de fructe naturale furnizeaza vitamina C i o abunden de fitonutrienti. Cele
mai multe dintre datele disponibile privind coninutul fenolic din sucurile frecvent
consumate sunt pentru mostrele comerciale. Urmtorul tabel (tabelul 2) prevede
unele informaii despre coninutul total polifenolic (TPC) ale unor buturi.
4. Extracia
n ultimii ani, lucrarile n ceea ce privete extracia de compui fenolici care
se gsesc n produsele naturale au atras un interes special (Pinelo et al., 2005).
Extracia este un pas foarte important n izolare, identificare i utilizarea de compui
fenolici i nu exist nici o singura metoda de extracie standard. Extraciea cu
solvent (Baydar, Ozkan, & Sagdic, 2004; Bucic-Kojic, Planinic, Tomas, Bilic, si Velic,
2007) i extracia cu fluid supercritic (Bleve et al, 2008;. Fredj & Francois, 1990;
Nahar & Sarker, 2005; Palma & Taylor, 1999) sunt cele mai comune tehnici utilizate
pentru izolarea compuilor fenolici.
Un numr mare de articole din literatura de specialitate se concentreze pe
extracia i analiza polifenolilor din materiale vegetale derivate, inclusiv fructe,
legume, vinuri, cafea, ceai, plante aromatice, cereale i culturi de impulsuri, cum ar
fi fasole (Balasundram et al, 2006;. Luthria & Pastor-Corrales, 2006; Naczk &
Shahidi, 2006). Compuii fenolici au fost extrasi prin mcinare, uscarea sau
liofilizare fructelor, legumelor i plantelor aromatice sau numai prin nmuierea
ulterioara a plantelor proaspete cu extracie cu solveni (Merken & Beecher, 2000).
Aceste metodologii implic co-extracia substanelor non-fenolice, cum ar fi
zaharuri, acizi organici i proteine, care necesit procese de purificare ulterioare (de
exemplu extracie n faz solid, SPE) (Castaeda-Ovando et al., 2009). Extractia cu
solvent, n funcie de starea de biomas poate fi extracie lichid sau extracie solidlichid.
4.1. Extracia lichid-lichid
Extracia lichid-lichid este o operaiune de transfer de mas n care o soluie
lichid (feed) coninnd iniial una sau mai multe substane dizolvate este bine
amestecata cu un lichid nemiscibil sau aproape nemiscibil (solvent). Solventul

prezint afinitate prefereniala sau selectivitate fa de una sau mai multe din
componentele din furaj i are diferite densitati. Dou fluxuri rezulta din acest
contact: extractul, care este soluia bogat de solvent care conine substana
dizolvat, extrasul dorit, i rafinatul, soluia de alimentare rezidual care conine
puin substan dizolvat. (Mller, Berger, Blass, Sluyts, si Pfennig, 2008).
Extracia devine un instrument foarte util n cazul n care un solvent de extracie
adecvat este ales.
Pentru separarea compuilor fenolici, extracia lichid-lichid este utilizata
frecvent ca lichid industrial de subproduse, cum ar fi cele care rezult din industria
buturilor.
4.2. Solid-lichid
Extracie solid-lichid, sau scurgerea poate fi definita ca o mas a fenomenului
de transport n care solidul coninut ntr-o matrice solid migreaz ntr-un solvent
adus n contact cu matricea. Masa fenomenelor de transport poate fi mbuntit
prin modificri ale concentraiei degradeurilor, coeficieniilor de difuzie sau stratului
limit (Corrales, Fernndez Garca, Butz, si Tauscher, 2009). Este o operaie
extensiva folosita pentru a recupera mai multe componente importante din
alimente: zahrul din trestie sau sfecla, lipide din semine oleaginoase, proteine din
seminele meselor oleaginoase , fitochimicale din plante, hidrocoloizi funcionali din
alge i compui polifenolici din plante, fructe, legume, etc.
Eficiena extractiei este cunoscut a fi in funcie de condiiile de procesare.
Mai muli factori afecteaz concentraia componentelor dorite n extract:
temperatura, raportul lichid-solid, debit i dimensiunea particulei. De exemplu,
coninutul fenolic al extractiei carenei migdalelor sa dovedit a fi de trei ori mai
mare, atunci cnd un lot lichid-extracia solida a fost efectuat la 50 C n raport cu
cea la 25 . In functie de timp i raportul lichid-solid au fost raportate, de asemenea
a fi variabile semnificative (Hayouni, Abedrabba, Bouix, & Hamdi, 2007; Pinelo,
Rubilar, Sineiro, i Nunez, 2004; Rubilar, Pinelo, Franco, Sineiro, i Nunez, 2003).
Cele mai comune metode cu solveni de extracie sunt cele care folosesc
metanol acidifiat sau etanol ca extractant (Amr & Al-Tamimi, 2007; Awika, Rooney, si
Waniska, 2005; Caridi et al., 2007; Lapornik i colab., 2005). Dintre aceste metode,
extracia cu methanol este cea mai eficienta (Kapasakalidis, Rastall, si Gordon,
2006); de fapt, s-a constatat c, n extracia antocianilor din pulpa de struguri,
extracia cu metanol este de 20% mai eficienta dect cu etanol, i 73% mai
eficienta decat extragerea apei (Castaeda- Ovando et al., 2009) cu toate acestea,
industria etanolului n produsele alimentare este preferat datorit toxicitii de
metanol.
Printre extraciile etanolului si metanolului, o multitudine de ali solveni de
extracie au fost observati n literatur, unele dintre ele fiind prezentate n tabelul 3.

De obicei, procedura de extracie este secvenial i sistematica, elibereaz

compuii fenolici din formele lor respective. Cnd vorbim despre acizi fenolici (acizi
liberi sau legai), primul pas al procedurii implic de obicei, utilizarea unei solvent
organic apos pentru a extrage acizi solubili /fenoli extractabili f (gratuit, esteri
solubili i glicozide solubile) (Escarpa, Morales, & Gonzalez, 2002; Mattila &
Kumpulainen, 2002; Russell, Scobbie, Labat, Duncan, i Duthie, 2008).
Acizii fenolici exista, de asemenea, prin complexe legate ca insolubile, care
sunt cuplate la polimeri de peretele celular prin ester i legturi glicozidice i nu
sunt extractibile cu solveni organici. Acizii fenolici Bound sunt de obicei eliberati
prin hidroliza de baz, hidroliz acid sau ambele (Mattila & Kumpulainen, 2002).
Principalul pas n cele mai multe proceduri implic hidroliza bazic cu NaOH variind
la 2 la 10 M, folosind timpul de incubare pn la 16 ore, uneori sub azot (Popaet al.,
2008; Nardini i colab., 2002). Dup hidroliza de baz, hidroliza acid este uneori
efectuata pentru a elibera fenoli care au fost legati si nu au fost hidrolizati anterior
(Ross et al., 2009). Mattila i Kumpulainen (2002) au artat c hidroliza acid
elibereaza
cantiti semnificative de acid galic din zmeura rosie si capsuni
mpreun cu cantiti semnificative de acid protocatechuic din morcovi, pine
prajita, zmeura rosie, i cpuni. Cantiti substaniale din acidul galic din seminte
de mango sunt eliberate de hidroliza acidului n funcie de studile lui Soong i a lui
Barlow (2006). n alte cazuri (mere sau suc de mere i cartofi), hidroliza acid a fost
inutila ca hidroliza, baza a fost suficient de agresiva (Luthria & Pastor-Corrales,
2006; Mattila & Kumpulainen, 2002). Baza i acidul hidrolizate au fost testate pe
fructe mangosteen. Zadernowski, Czaplicki, i Naczk (2009) au artat c acizii
fenolici legati au fost acizii fenolici predominanti n fructele Mangosteen, in special
derivai de acid hidroxibenzoic. Acizii fenolici eliberati din esteri solubili ,formati din
41,4% (coaja) la 76,5% (tegument) din acizi fenolici totali prezenti n fructe.
Derivaii hidroxibenzoici cuprind de la 91,5% (crust) la 100% (aril) din acizii fenolici
identificati n aceast fraciune.
4.3. Extracia lichid supercritic
Extracia fluid supercritic (SFE) ar putea fi un alternativ punct de vedere
ecologic benefic pentru extracia cu solvent organic conventional de compui
biologici: metodele SFE sunt rapide, automatizate, selective i evita utilizarea unor
cantiti mari de solveni toxici. n plus, lipsa de lumin i aer n timpul extragerii
reduce procesele de degradare care pot aprea n timpul tehnicilor traditionale de
extracie (Bleve et al., 2008). Extracia fluid supercritic (SFE) se bazeaz pe faptul
c, aproape de punctul critic, solventul schimb proprietile sale rapide cu doar
uoare variaii de presiune (Palenzuela et al., 2004).
Fluidele supercritice (SCFs) sunt nlocuite cu solveni organici cum ar fi nhexan, diclormetan, cloroform, i alii care sunt utilizati n mod convenional n
extracia industrial, purificare, i operaiunile de recristalizare din cauza
reglementarii i presiunilor asupra mediului cu privire la hidrocarburi i de diminuare

a stratului emisiilor de ozon. SCF au puteri de solvatare similare cu solveni organici

lichizi, dar cu difuziviti mai mare, vscozitate mai mic, i suprafaa inferioar
tensionata.
De departe, fluidul critic mai utilizat a fost dioxidul de carbon supercritic (SCCO2), datorit efectului su benign asupra mediului, toxicitate redus,
inflamabilitatea i compatibilitate cu prelucrarea produselor alimentare. n plus, are
condiii critice modeste, poate fi separat cu uurin de substane dizolvate i este
ieftin. n extractia natural de produse i izolare, extracie fluid supercritic (SFE),
mai ales cu angajarea CO2 supercritic, a devenit metoda de alegere. Tehnologiile
moderne sofisticate permit reglarea precis a modificrilor de temperatur i
presiune, i astfel manipularea proprietatilor solvatare a CSA, care ajut extracia
de produse naturale ale unei game largi de polariti (Nahar & Sarker, 2005). Prin
adugarea unor modificatori pentru un SCF (cum ar fi methanol n CO2) polaritiile
pot fi modificate pentru obinerea selectiva a putererilor de separare. Prin urmare,
metoda dioxid de carbon supercritic (SC- CO2) este ideala pentru extracia de
produse naturale din materialele vegetale i sunt recomandate n special pentru
extracia compuilor termolabili, atunci cnd sunt necesare temperaturi sczute. In
plus, metodele SC-CO2 permit obinerea extractelor fara urme ramase de solvent i
fr a utiliza un aspirator, aa cum degradarea unor compui de expunere de lung
durat la mare temperaturi sau oxigen este evitat.
Cu toate acestea, studiile anterioare au artat c extracia antocianilor
utiliznd metoda SC-CO2 necesita presiuni mari i prezena unui co-solvent organic
(metanol, etanol), n procent ridicat din cauza polaritatii de antociani (Bleve et al.,
2008). Aceti factori preau s interzic utilizarea de SC-CO2 pentru extracia
acestor compui. Spre deosebire de aceasta, SC-CO2 a fost angajat, n schimb,
pentru purificarea unui antociani primar, extractul obinut din fructele rosii cu
extracie de solventi organici, pentru a mbunti proprietile sale fr a provoca
degradare termic sau chimic (Fredj colab., 1990). BLEVE i colab. (2008) au
descris o metod nou i inovatoare pentru purificarea antocianilor prin extractia
pieilor de struguri ca matrice de lichid (LM), prin folosirea CO2 n condiii subcritice
de lichid. Purificarea procesului CO2 n condiii optimizate a dat natere la o functie
dorita care conine antociani puri.
4.4. Alte metode de extractie
Extracia convenional ca nclzirea, fierberea, sau de reflux poat fi folosita
pentru a extrage compui fenolici naturali, totui, dezavantaje pot fi pierderea de
polifenoli din cauza ionizarii, hidrolizrii i oxidarii n timpul extraciei, precum i
timpul de extracie lung (Hui, Bo, i Shouzhuo, 2005).
In ultimii ani, diverse tehnici de extracie noi au fost dezvoltate pentru
extracia nutraceutice din plante, inclusiv extracie asistat de ultrasunete,
extracie asistat de microunde, extracie fluid supercritic i extracie de nalt

presiune hidrostatic (HHP) (Wang & Weller, 2006). Printre acestea, extractia
asistat pe ultrasunete este o alternativ ieftina, simpla i eficienta a tehnicilor de
extracie convenionale (Jing, Baoguo, Yanping, Yuan, i Xuehong, 2008). Aceast
metod descrie o procedur pentru extragerea compuilor organici nevolatili i
semivolatili din solide, cum ar fi solurile, nmoluri, i deeuri. Procesul
ultrasunetelor asigur un contact intim de matricea probei cu extragerea solventilor.
Procesul ultrasunetelor este adesea utilizat pentru a mbuntii extracia lipidelor,
proteine i compuilor fenolici din plante. Huang, Xue, Niu, Jia, i Wang (2009)
analizeaz o extracie asistat de ultrasunetele compuilor fenolici din Folium
eucommiae, care pare a fi mai eficient dect extraciile de nclzire, asistat cu
microunde, i extractia enzim-asistat .
Extracia de antociani din pieile de struguri a fost, de asemenea, realizat
folosind o baie de ultrasunete cu o frecven de 35 kHz pentru 30 min, urmat de
agitare la o temperatur de 70? C ntr-o baie de ap de 2,5 ore, conform Corrales i
colab. (2009).
Extracia cu ajutorul energiei microundelor este o zon n mare msur
neexplorata, prin utilizarea microundelor pentru a media extracia, este posibila
meninerea condiiilor blnde i se obine un efect superior de extracie.
Eliberare enzimatic a compuilor fenolici este o alta tehnic utila pentru
polifenolii naturale de extracie. Un procedeu pentru extracia enzimatica asistat a
polifenolilor din struguri, din turtele de msline a fost dezvoltat pe o scar de
laborator cu echipamente pilot (Maier, Goppert, Kammerer, Schieber, si Carle,
2008). Min i colab. (2006) au investigat capacitatea a trei enzime comerciale Ultraflo L, L Viscozyme, i o-Amilaza - pentru a induce eliberarea de acid ferulic din
Ipomoea batatas L. (cartofi dulci). Viteza de eliberare a acidului ferulic a fost optim
cnd a fost utilizat Ultraflo L (1,0%), comparativ cu alte enzime, n timp ce
Viscozyme L a fost cel mai eficient pentru eliberarea de acid vanilic i vanilin.
Astfel, aceste enzime pot fi utile pentru producerea de acid ferulic i pe scar larg
compui fenolici din tulpinile cartofilor dulci.
Presiune hidrostatic nalt (HHP) este o metod nou de a spori fenomenul
transportului in mas (Rastogi, Angersbach, si Knorr, 2003). Randamente mari de
extractive a cafeinei din cafea i un carotenoid superior coninut n piureul de
tomate au fost demonstrate cnd extraciile au fost asistate de presiune
hidrostatic ridicat (Sanchez-Moreno, Plaza, de Ancos, si Cano, 2004).
Mai recent, studiile efectuate de Shouqin, iunie i Changzhen (2005) au
demonstrat, de asemenea, beneficiile HHP pentru extracia de flavone din propolis,
n timp ce Corrales et al. (2009)a studiat extracia antocianilor din pieile de struguri
asistat de presiune hidrostatic ridicat. n timpul HHP extraciei asistat, bule de
aer prezente n esuturile de fructe sunt parial umplute cu lichid. Atunci cnd
presiunea este eliberat ulterior, aerul oclus n pori cauzeaz pagube in membrana

celulelor plantelor (Fernandez Garcia, Butz, si Tauscher, 2001). HHP poate provoca,
de asemenea deprotonarea grupurilor practicate i perturbarea podurilor de sare i
obligaiuni hidrofobe, care conduc la modificri conformaionale i denaturarea
proteinelor in membranele celulare mai puin i mai puin selective,
antrennd astfel compuii accesibili extractiv pn la echilibru (Corrales et al.,
2009).
5. Cuantificarea i separarea polifenolilor
Exist o cerere n cretere pentru determinarea metodei analitice a
polifenolilor (Liu i colab., 2008). n ciuda unui numr mare de investigaii,
separarea i cuantificarea diferitilor polifenoli rmne dificila, mai ales determinarea
simultan a polifenolilor de diferitele grupuri (Tsao & Yang, 2003).
5.1. Metodele spectrofotometrice utilizate n cuantificarea fenolilor totali i
clasele sale
Au fost dezvoltate mai multe metode spectrofotometrice pentru cuantificarea
fenolilor din plante. Aceste teste sunt bazate pe diferite principii i sunt utilizate
pentru a determina diferitele grupuri structurale prezente n compuii fenolici. Testul
Folin-Ciocalteu (Tsao & Yang, 2003; Lapornik, Prosek, i Golc, 2005) este larg utilizat
pentru determinarea numrului total de fenoli, n timp ce vanilina i
proanthocyanidina au fost folosite pentru a estima totalul proantocianidinelor
(Naczk & Shahidi, 2006).
Testele spectrofotometrice pentru cuantificarea antocianilor totali utiliznd
metoda diferenial a pH-ului se bazeaz pe caracteristica comportamentului lor n
condiii acide. Principiul acestei metode este scderea pH-ului extractiv, la valori
cuprinse ntre 0,5 i 0,8, care determin transformarea totala a antocianilor pentru a
da culoare roie cationilor flavilium (Lapornik et al., 2005).
Metodele spectrofotometrice preved informaii utile calitativ si cantitativ; de
fapt, spectroscopia este principala tehnic utilizat pentru cuantificarea diferitelor
clase de polifenoli datorit simplitii sale i costului mic. Giusti i Wrolstad (2003)
au publicat recenzii excelente ale principalelor metode utilizate n caracterizarea i
cuantificarea antocianilor prin UV-Vis.
Pe de alt parte, coninutul total de flavonoide poate fi determinat folosind o
metod colorimetric bazat pe complexarea compuilor fenolici cu Al (III) (Huang i
colab, 2009;. Naczk & Shahidi, 2006). Principalul dezavantaj al testelor
spectrofotometrice este faptul c acestea dau doar o estimare total a continutului
fenolic. Ea nu separ nici nu msoara cantitativ compuii individuali.
5.2. Tehnici cromatografice utilizate n separare analizei calitativa si
cantitativ

5.2.1. Cromatografie lichid de nalt performan (HPLC)

Printre diferitele metode disponibile, HPLC este preferat pentru separarea i
cuantificarea polifenolilor din fructe. Condiiile cromatografice ale metodelor HPLC
includ utilizarea aproape exclusiva, o coloan C18 cu faz invers; UV-Vis diod
matrice detectoare, i un sistem de solveni binar adaos de apa acidulata (solvent
A) i un solvent organic polar (solvent B). Faza reversa (RP) HPLC a devenit un
instrument analitic util pentru separarea i determinarea polifenolilor cu detecia
diferitelor sisteme, cum ar fi detector diod (DAD), masa sau spectrometria de
mas. Sakakibara, Honda, Nakagawa, Ashida i Kanazawa (2003), au determinat toti
polifenolii din produsele alimentare simultan cu HPLC-DAD i au construit o
bibliotec cuprinznd curbe de calibrare respective pentru 100 de produse chimice
standard. Suporturi variate i faze mobile sunt disponibile pentru analiza diferitelor
clase de polifenoli, cum ar fi antociani, procianidine, flavonone, flavonoli, flavan-3oli, procianidine, flavone i acizi fenolici. Introducerea fazei invers a coloanelor ar
mbuntii considerabil separarea HPLC a compuilor fenolici (Naczk & Shahidi,
2006).
Unele proceduri HPLC pentru determinarea unor clase de compui fenolici
sunt prezentate n tabelul 4.
Cu toate acestea,exista si dezavantaje n limita de detecie i sensibilitate,
metoda HPLC prezint limitri n special n complexul matricii, cum ar fi extracte de
plante brute si probe de mediu. Astfel, o preconcentrare iniial i purificare a
polifenolilor din matricea anterioara complex este
esenial pentru analiza
instrumentala prin HPLC. Scopul este de a simplifica preconcentrarea
cromatogramelor obinute astfel nct s poat fi identificate n mod fiabil i
cuantificate. Etapa critica de purificare a unei metode, eliminarea componentelor cu
potenial de interferen variaz n funcie de matricea vegetala de analizat.
Procedura include partiionarea lichidului cu un solvent nemiscibil i coloana
deschisa cromatografic pe coloan Sephadex LH-20, poliamid, Amberlite, prepHPLC i extracie n faz solid (SPE) folosind cartue disponibile.
Polifenolii pot fi de obicei purificati prin absorbie-desabsorbie procesele
utilizeaza sorbani extrem de eficienti, de care C18 i foarte reticulat stirendivinilbenzen (S-DVB) copolimerii sunt foarte populari (Liu i colab., 2008). Silva,
Pompeu, Larondelle, i Rogez (2007), au testat adsorbia de rasini macroporoase
pentru purificarea compuilor fenolici din extracte brute de frunze edulis .Au fost
folisite diferite tipuri de adsorbani (XAD-7, XAD-16, EXA-90 i EXA-118).
Michalkiewicz, Biesaga, iar Pyrzynska (2008) utilizau, de asemenea diferiti
sorbanti solizi, cum ar fi Bond Elut octadecil C18, Oasis HLB, Strata- X i Amberlit
XAD-2, pentru izolarea i preconcentrarea de acizi fenolici i unii flavonoizi din probe
de miere nainte de determinarea lor prin HPLC.

n alte studii, preconcentrarea a fost realizata prin metoda absorbiedesabsorbie cu o rin stiren-divinilbenzen (XAD-4) sau XAD-16, iar rezultatele au
demonstrat ca ambele rasini sunt capabile sa absoarba polifenolii cu succes (Li,
Wang, Ma, si Zhang, 2005; Liu i colab., 2008). Cu toate acestea, n majoritatea
lucrrilor pentru determinarea polifenoli, a fost folosita extractia n faz solid (SPE)
pentru purificare, iar substanele analizate au fost de obicei diluate cu metanol,
etanol sau forma lor apoasa (Lalaguna, 1993; Liu i colab., 2008; Michalkiewicz et
al., 2008).
Polifenolii cu mas molecular mai mica pot fi analizati prin HPLC n faz
invers sau coloane cu faz normal. Cu toate acestea, aceste tehnici sunt
consumatoare de timp i pot avea rezoluie slaba ca i lungime a lanului de polimer
i creterea diversitii structurale. Detectarea de compui cu greutate molecular,
precum i determinarea distribuiilor masei molecular, rmn provocri majore n
analiza polifenolilor (Fulcrand et al., 2008). Tehnicile de pectrometrie cromatografie
lichida in masa (LC-MS) sunt n prezent cea mai bun abordare analitic pentru
studierea polifenolilor din diferite resurse biologice, si sunt cele mai eficiente
instrumente n studierea structurii compuilor fenolici (Biroul et al., 2009).
5.2.2. HSCCC (High Speed Counter Current Chromatography)
Polifenolii sunt uneori dificil de separat n cromatografia clasica a lichidelor.
Cromatografia curentului Counter (CCC) utilizeaza un sistem lichid bifazic pentru a
separa componentele unui amestec. Un cmp centrifugal permite a utiliza o faz
staionar lichid ntr-un tub deschis. Diferena de densitate a fazei i cmpului
centrifugal sunt singurii parametrii care permit echilibrul ntre dou faze lichide.
Avantajul mare a tehnicii prin separare este capacitatea dual-mode a CCC. Rolul
fazelor pot fi comutate pe durata. Faza mobil devine staionare i invers. Apoi, nici
un material injectat nu poate fi lsat n maina (Berthod, Billardello, & Geoffroy,
1999). Cao, Wang, Pei, i Sun (2009) au aplicat dou metode de separare i
purificare de polifenoli din extractul de tescovin din mere, metode care au fost
stabilite prin combinaia de cromatografie pe gel cu contor de mare vitez in
cromatografia curenta (HSCCC) i respectiv extractie de solvent cu HSCCC.
Separarea optim a fost realizat pe o coloan Sephadex LH-20 utiliznd un
gradient de soluie apoas etanol ca solvent de eluare de la 0% la 100% n trepte de
10%. Analiza HPLC a indicat c polifenolii principali au existat n fraciuni eluate
ntre 40% i 50% etanol apos. Fraciunile de interes din coloan au fost separate
prin HSCCC cu hexan. Acidul acetat de etil-1% soluie apoas de solvent acetic (0,5:
9,5: 10, v / v / v). Fracionarea acetatului de etil din extractul tescovinei de mere,
urmat de separarea HSCCC direct prin acelai solvent, n raport de volum de 1: 9:
10, a produs, de asemenea, o bun separare a principalilor polifenoli.
Cromatografia curenta de mare viteza (HSCCC) folosind bobina centrifugala
de tip J a fost aplicata la analiza compoziiei de catechine din ceai i separarea altor
polifenoli legati de alimente. Separarea HSCCC a nou compui standard din

diferitele extracte de frunze de ceai comerciale a fost efectuat cu un sistem de

solvent bifazic format din ter-butil metil Ethernet acetonitril-0.1% acid
trifluoroacetic apos (TFA) (2: 2: 3, v / v / v) prin eluarea fazei organice superioare la
un debit de 2 ml / min. Compui principalelor extracte din ceaiul verde nonfermentat au fost dovediti a fi catechine monomerice, esterii galloylated i cofeina.
Pe lng aceti compui, pigmeni, cum ar fi oxidai teaflavins hidrofobe (TFS) i
thearubigins polare (TRS) au fost, de asemenea, separate i detectate din extracte
de ceai maroniu semi-fermentat i ceai negru fermentat. Mai mult dect att, mai
multe alimente legate de polifenoli, cum ar fi catechini oligomeri condensati
(procianidine), acizi fenolici i glicozide flavonol au fost clar separate n aceleai
condiii HSCCC. Aceste profiluri de separare de HSCCC furnizeaza informaii utile
despre diversitatea hidrofoba a acestori polifenoli bioactivi prezenti n diferite tipuri
de ceai i produse alimentare (Yanagidam colab., 2006). Cromatografia
contracurentului de mare vitez (HSCCC) pentru separarea polifenoli din frunzele de
ceai (Camellia sinensis L.) au fost, de asemenea, aplicate de Degenhardt,
Engelhardt, Lakenbrink, i Winterhalter (2000). Capacitatea de a izola HSCCC
polifenolii puri din amestecuri complexe de ceai pe o scar preparativa a fost
demonstrat pentru catechine, glicozide flavonol, proantocianidine, i strictinin din
ceaiul verde i negru.
5.2.3. Cromatografia fluidului supercritic (SFC)
Cromatografia fluidului supercritic (SFC) este o tehnica cromatografica relativ
recenta
utilizat n separarea i identificarea compuilor fenolici. Ceea ce
diferentiaza SFC de la alte tehnici cromatografice, cromatografia de gaze (GC) i
cromatografia mare a lichidelor de performan (HPLC) prin utilizarea unui fluid
supercritic ca faz mobil. Cromatografia fluidului supercritic este mai versatil dect
cromatografia lichid de nalt performan, mai rentabila, uor de utilizat, cu
rezolutie mai mare, i analiz mai rapid mai buna de ori decat cromatografia lichid
general. Metodele instrumentale care sunt necesare pentru cromatografia fluidului
supercritic este versatil, din cauza
compatibilitatilor sale multi-detector.
Kamangerpour, Ashraf-Khorassani, Taylor, McNair, i Chorida (2002) au folosit
cromatografia fluidului supercritic pentru separarea i identificarea a opt polifenoli
n extractia seminelor din struguri. Dioxidul de carbon modificat cu metanolul, care
a coninut mai puin de 1% (g / g) acid citric ca aditiv secundar, servit ca faz
mobil. Diferite componente n extract ar putea fi identificate prin timpul de retenie
i compararea spectrului ultraviolet cu un amestec sintetic de polifenoli.
5.3. Alte tehnici cromatografice
Alte tehnici cromatografice au fost, de asemenea, folosite pentru a purifica i
fenolii din alimente separate. Dintre acestea, cromatografie pe hrtie (PC) i
cromatografie n strat subire (TLC) sunt nc utilizate pe scar larg pentru
purificarea i izolarea antociani, flavonoli, taninuri condensate i acizi fenolici
folosind diferite sistemele de solveni (Naczk & Shahidi, 2006). Cu ani n urm,

dezvoltarea cromatografie de partiie ca metoda preparativ a permis sa se faca

progrese suplimentare n elucidarea polifenoli. Succesul cromatografiei preparativ
a sugerat c informaii utile pot fi obinute prin aplicarea metodelor de
cromatografie pe hrtie pentru a studia catechinele i alti polifenoli din ceai. Roberts
i Wood (1951) descriu identificarea provizorie a principalilor polifenolii din frunza
de ceai. Alte studii au artat c PC-ul Whatman No. 3 au fost folosite pentru
separarea antocianilor, folosind butanol / acid acetic / ap, cloroform / acid acetic /
ap, sau butanol / acid formic / ap posibil faze mobile (Jackman, bla, si Tung,
1987).
TLC este o tehnic cu aplicabilitate mare n domeniul plantelor, analiza
materialelolr i teste de stabilitate de extracte i produse finale. Punerea n aplicare
a unei metodologii standardizate modern a condus la o acceptare tot mai mare i
recunoaterea (CP) TLC ca o metod analitic competitiva. (CP) TLC are multe
avantaje, cum ar fi costuri mai mici, timp de analiz scurt, posibilitatea de detectare
multiple, i derivatizarea specific pe aceeai plac, etc. Separarea polifenolilor unul
de altul i de alte componente ale extractelor de plante poate fi realizat printr-un
numr mare de detehnici de dezvoltare(CP) TLC. Cea mai mare parte, extractia
plantei brute complexe este analizata pentru activitatea antioxidant sau pentru a
distinge componentele extracte din plante cu caracter antioxidant sau proprieti
radical-absorbante. (CP) TLC a fost utilizat pentru a determina capacitatea
individual antioxidant a compuilor int i ar putea fi un interes pentru chimica
de rutin sau de interes biologic, metoda oferind soluii la probleme analitice reale
(Cimpoiu, 2006). TLC pe plci de silicagel este util pentru separarea rapid i cu
cost putin i identificarea polifenolilor prezenti n vin. Analiza densiometric
cantitativ a polifenolilor din extractele de vin se face de obicei prin scanarea
plcilor TLC cu lumina UV la lungimi de und de 350-365 nm sau 250-260 nm
(Rastija & Medic'-aric', 2009).
Cromatografia de gaze este o alta tehnica care a fost angajata pentru
separarea i identificarea diferiilor compui fenolici. Cromatografia de gaze (GC)
metode dezvoltate pentru analiza de polifenoli necesit derivarea compuilor volatili
prin metilare, trifluoroacetilare, conversie la derivatii trimetili si detectarea masei
spectrometrice n modul de monitorizare selectiva de ioni (GC / MS-SIM), (Naczk &
Shahidi, 2006; Rastija & Medic'-aric', 2009; Zadernowski et al., 2009). Derivaii
trimetili de acizi fenolici din fructele mangosteen au fost identificati folosind
metodologia GC-MS dup cum este descris de ctre Zadernowski i colab. (2009).
GC are o capacitate mare de separare ,sensibilitate ridicat i selectivitate atunci
cand sunt combinate cu spectrometria de mas. Cu toate acestea, pregtirea
probelor pentru GC este foarte suprtoare, inclusiv eliminarea lipidelor din extract,
eliberare de fenoli din ester i legturi glicozidice, i derivarea pentru polifenolii
volatili mici (Liu i colab., 2008).
Cromatografia de partiie centrifugala (CPC) a fost, de asemenea, aplicat la
separarea i purificarea polifenolilor bioactivi din extractele brute de medicament,

lemn dulce, precum i taninuri oligomerice hidrolizabile extrase din Heterocentron

roseum. Separarea a fost realizat prin faz normal CPC folosind ca solvent
sistemul CHCI3-MeOH-H2O (Okuda, Yoshida, & Hatano, 1988).

6. Alte metode pentru separarea i cuantificarea polifenolilor

6.1. Electroforeza capilar (CE)
Electroforeza capilar (CE), este o tehnica alternativa a HPLC, adecvata n
special pentru separarea i cuantificarea redusa a greutatii molecular medie i
compuilor perceputi, separrile rezultate fiind de multe ori mai rapide i mai
eficiente dect separrile HPLC corespunztoare (Caridi et al., 2007; Frazier &
Papadopoulou, 2003). Electroforez capilar (CE) devine din ce n ce un instrument
versatil analitic pentru determinarea de rutin a unei game largi de compui fenolici
din diferite tipuri de probe, datorit eficienei mari de separare, mare putere de
rezoluie, timp scurt de analiz i consum redus de prob si reactivi. Pe de alt
parte, unul dintre cele mai importante limitri CE, n comparaie cu alte tehnici, cum
ar fi GC sau HPLC, sensibilitatea redus n ceea ce privete concentrarea solutiei, i
reproductibilitate rea comparativ cu tehnicile cromatografice care sunt cauzate de
ctre calea optica scurta de lungime a capilarului folosit ca celul de detectie i, de
asemenea, prin volumele mici care pot fi introduse n tubul capilar (in mod normal,
cateva nanoliters) (Molina-Mayo, Hernandez-Borges, Borges-Miquel, si RodriguezDelgado, 2007; Liu i colab., 2008).
Exist cteva exemple de CE utilizate pentru separarea i determinarea
nivelurilor de flavonoli care apar n mod natural n materialul vegetal (Caridi et al.,
2007; Chen, Zhang, & Ye, 2000; Vaher & Koel, 2003; Wang & Huang, 2004).
Folosirea CE n separarea antocianilor este o tehnica rara destul de recent
dezvoltata dar promitoare din cauza hidrosolubilitatii mare a acestor compui. CE
este o tehnic adecvat pentru separare, identificarea i cuantificarea antocianilor.
CE a fost, de asemenea, utilizat pentru a crea corelaii ntre coninut de antociani i
mbtrnirea vinului rosu (Saenz- Lopez, Fernandez-Zurbano, si Tena, 2004). CE cu
cuplarea ESI-MS a fost folosit pentru monitorizarea antocianilor i flavonoidelor din
vin (Castaeda-Ovando et al., 2009).
Cromatografia micelar capilar electrocinetica (MECC) are utilitate extinsa in
electroforeza capilar pentru separarea analiilor neutrii sub influena unui cmp
electric. Fracionarea pigmenilor monomeri i polimeri din masa molecular mare
prin cromatografia pe gel permeabil (GPC) au mbuntit analiza acestor compui
de CE (Rastija & Medic'-aric', 2009).

7. Metode spectrale utilizate n elucidarea structurii i caracterizarea

compuilor fenolici
7.1. Spectroscopia RMN
Spectroscopia RMN este utilizata in prezent mai mult i mai mult pentru
analiza alimentelor. Avantaje,cum ar fi simplitatea preparatului probei i procedurile
de msurare, stabilitatea instrumentala i uurina cu care spectrele poat fi
interpretate au contribuit la popularitatea n cretere a tehnicii. Standardele 1H, 13C
iar unghiul magic de nalt rezoluie filaterala (HR / MAS)a spectrelor RMN pot da o
sursa bogata de informaii cu privire la alimente chimice lichide i chiar alimente
semi-solide.
Spectrele RMN din probelor vegetale pot aciona n calitate de amprente
digitale care poate fi folosite pentru a compara, discrimina sau clasifica probele.
Variabile selectate (nlimile vrfurilor RMN sau integrale) care caracterizeaz
eantioanele n mod specific sunt de asemenea utilizate n loculi spectrelor intregi.
Tehnicile chemometrice sunt adesea folosite pentru a analiza datele cu informaiile
coninute n spectrele cu un grad ridicat de complexitate.
Prepararea probei alimentelor este de fapt simplu, n funcie de natura probei
(lichid, solid). n unele cazuri
precedente este nevoie de extracie sau de
fracionare n timp ce alte probe pot fi utilizate ca atare. Pentru nalt rezoluie 1H,
13C, 31P RMN de lichide apoase (sucuri de fructe, bere, vin, degazat etc.) probele
sunt adesea preparate simplu prin adugarea a 5-10% din D2O a lichidului (Le Gall
i Colquhoun, 2003). Solvenii deuterai prevd un semnal de stabilizare a cmpuiui
magnetic i permit optimizarea soluionarii vrfurilor RMN.
Probe solide (fructe, legume, ceai verde) sunt liofilizate in solutii i apoi se
extrag ntr-un solvent deuterat.
Alte probe, cum ar fi uleiurile sau cafeaua instant sunt pur i simplu dizolvate
la concentraia dorit ntr-un solvent deuterat adecvat. Ar trebui s fie urmate
procedurile standard pentru a asigura repetabilitatea i comparabilitatea la
prepararea unei serii de probe.
Un spectometru RMN nou de 500 MHz ar putea costa de 7-8 ori mai mult ca
un sistem HPLC / UV SDAD nou. Motivul de limitare este sensibilitatea relativ
sczuta a RMN n comparaie cu alte tehnici, cum ar fi HPLC sau GC. Cu toate
acestea, versatilitatea tehnicii nseamn c ,costul initial ridicat poate fi bine
nlocuit de o serie de avantaje al caror alte tehnici nu le pot furniza. Prima dintre ele
este, evident, puterea de elucidare structural a tehnicii. Cel de al doilea avantaj
este c RMN este, probabil, cea mai bun tehnic non-int de a vedea pe ecran
extractiile alimentare: toate principalele metabolite ( acizi grasi, aminoacizi i acizi
organici, zaharuri, compui aromatici) pot fi detectati ntr-un singur spectru cu
minim i fara distrugerea de probei preparate (Le Gall & Colquhoun, 2003).

Diferite tehnici RMN au fost folosite pentru elucidarea fenolilor structurali

compusi izolati din alimente fr separarea n componente individuale. Acestea
includ 1H i 13C RMN, homonucleu bidimensional (2D 1H-1H) corelat cu
spectroscopia RMN (COSY), heteronucleu chimic, schimbare de coresponden RMN
(C-H HECTOR), spectroscopie RMN total corelata (TOCSY), efect Overhauser nuclear
n cadrul laboratorului (NOESY) i cadru de referin (ROESY) (Naczk & Shahidi,
2006) rotativ. Pentru identificarea antioxidantilor kernel, 1H i 13C spectrele RMN au
fost obinute Zhang et al. (2009), folosind deuterat dimetil sulfoxid (DMSO-d6) sau
metanol (CD3OD) ca solveni. Prin urmare, rezonan magnetic nuclear (RMN) de
1H i 13 C ar deveni o tehnic preferat pentru identificarea antocianilor. RMN-ul a
fost, de asemenea, foarte util n identificarea produselor de reacie ale antocianilor
cu ali compui, cum ar fi derivai ai acidului cinamic, radicali peroxil, catechine i
flavonoli (Castaeda-Ovando i colab., 2009).
7.2. Spectrometria de mas (MS)
Spectrometria de mas (MS) este o tehnic analitic, care este, de
asemenea, utilizata pentru elucidarea structurilor chimice ale moleculelor, cum ar fi
peptide, polifenoli i ali compui chimici.
Spectrometria de mas, a avut i nc are, un rol foarte important pentru
cercetare i puterea sa de analiz relevanta pentru studiile structurale a compui
polifenolici. Principiul MS const n ionizarea compuilor chimici pentru a genera
molecule ncrcate sau moleculele fragmentate prin msurarea lor ca raport de
mase de incarcare (Sparkman, 2000). Sursele principale utilizate pentru a analiza
compuii fenolici sunt: bombardamentul cu atomi rapizi (FAB),
ionizarea
electrosprei (ESI), ionizarea presiunii atmosferice (API), inclusiv presiunea
atmosferic ionizata chimic (APCI), presiunea atmosferic foto-ionizata (APPI) i n
paralel cu apariia de electrospray, asistat de matricea de sorbie cu ionizarea
laser (MALDI). Analiza termosprei (TSP), a fost propusa, de asemenea, dar s-a
dovedit a fi inadecvata pentru analiza oligomerilor i polimerilor, din cauza
degradarii termice (Fulcrand et al., 2008).
Fluxul direct injectat prin ionizarea electrospreiului (ESI) spectrometriei
analizei de mas poate fi utilizat pentru stabilirea amprentelor digitale polifenolilor
complexelor extractate.
Matricea asistata a laserul cu desorbie ionica Timpul de zbor (MALDITOF)tehnica este potrivita pentru a determina prezena moleculelor cu greutate
molecular mai mare, cu mare precizie, i ea a fost aplicata cu succes pentru
studierea oligomerilor procyanidini la heptameri n modul reflector, i pn la
nonamer n modul liniar (Fulcrand et al., 2008).
Eterogenitatea structural a polifenolilor din extractele de afine si semine
de struguri, sorg i rodie a fost caracterizat prin MALDI-TOF MS. Polyphenolii au fost
izolati de lichidul cromatografic i supus la MALDI-TOF MS utiliznd trans-acidul

indoleacrylic ca matrice. Analiza spectrometric a dat informaii gradului de

polimerizare, substituie monomerica, i naturii obligaiunilor intermoleculare (Reed,
Krueger, & Vestling, 2005).
Tehnicile cromatografiei spectrometrice in mas (LC-MS) sunt n zilele noastre
cele mai bune analize abordate in studierea polifenolilor din probele vegetale, si
sunt instrumentele cele mai eficiente n studiul structurii antocianilor. Abordarea
MS / MS este un instrument foarte puternic care permite caracterizarea antocianilor
agliconici i fragmetul de zahr.
LC-MS permite caracterizarea unor structuri complexe, cum ar fi
procianidinele, proantocianidinele, prodelphinidinele i taninurile, oferind dovezi
experimentale pentru structuri care au fost numai ipotezate anterior (Flamini,
2003).
Nivelurile de resveratrol din vin, un polifenol important, cunoscuta pentru
efectele sale benefice, a fost determinat de SPME (n faz solid microextraction) i
LC-MS, prima abordare a condus la cele mai bune rezultate n ceea ce privete
sensibilitatea (Flamini, 2003).
7.3. Infrarou de apropiere (NIR)
Spectroscopia infraroului de apropiere (NIR) este un alt instrument analitic
nedistructi puternic, rapid, precis i care poate fi considerat ca o nlocuire a vechei
analize chimice. Hall, Robertson, i Scotter (1988) aplicat tehnica spectroscopie
NIR pentru a prezice coninutul de umiditate i coninutul Flavin din ceaiul negru.
Schulz, Engelhardt, Wengent, Drews, i Lapczynski (1999) au ncercat prin
spectroscopie NIR a prezice simultan prezena alcaloizilor i substane fenolice din
frunze de ceai verde. Studii suplimentare pe analiza cantitativ a capacitatatii totale
antioxidante a ceaiului verde folosind spectroscopia NIR, au fost efectuate de
Luypaert, Zhang, i Massart (2003). Chen, Zhao, Chaitep, i Guo (2008) de
asemenea, au raportat rezultatele analizei simultane a catechinei principale (CE,
epicatechina;
ECG,
epicatechina
-galat,
EGC,
epigallocatechin;
EGCG,
Epigallocatechin-galat) din ceaiul verde prin transformarea Fourier, apropiat de
reflexie n spectroscopia infraroie (FT-NIR) . Recent, a fost aplicata spectroscopia
NIR pentru analiza simultan a coninutului de aminoacizi liberi, cafeina, polifenoli
totali i amiloz din ceaiul verde (Chen i colab.,2008).
8. Concluzii
Compui fenolici sunt un grup diversificat de fitochimicale care sunt larg
distribuite n plante, cum ar fi fructele, legumele, ceai, ulei de msline, tutun i aa
mai departe.

n prezent, exist un interes n creterea n substane care prezint proprietati

antioxidante, care sunt furnizate pentru organismele umane n calitate de
componente alimentare sau farmaceutice preventive specifice.
n consecin, antioxidantii au devenit o parte esenial in tehnologia
conservare i de ngrijire a sntii contemporane.

de

Este bine cunoscut faptul c plantele care posed antioxidanti i proprieti

farmacologice sunt legati de prezena compusilor fenolici, n special acizi fenolici i
flavonoide.
Muli cercettori au sugerat c polifenolii pot juca un rol important in
prevenirea obezitatii, boala coronariana, cancerul de colon, tulburri
gastrointestinale i poate reduce, de asemenea, riscul dediabetului (Altiok, Baycin,
Bayraktar, i Ulku, n presa;. Jitaru et al,2005; Luthria & Pastor-Corrales, 2006; Ross
et al., 2009).
Polifenolii sunt de asemenea cunoscuti pentru capacitatea lor de a preveni
acizii grasi prin descompunerea oxidativa, i s ofere o aprare mpotriva stresului
oxidant, de ageni oxidani i radicali liberi (Slusarczyk, Hajnos, Skalicka-Wozniak, si
Matkowski, 2009).
Proprietile biologice ale polifenolilor i beneficiile acestora pentru sntate
au intensificat eforturile de cercetare pentru descoperirea i utilizarea metodelor de
extracie, separarea i identificare a acestor compui din surse naturale. Aceste
metode trebuie s fie cuprinztoare, rapide i bogate n informaii spectrale.
Aceasta lucrare ofera informatii cu privire la compui fenolici gsiti n resurse
vegetale, metode avansate care sunt utilizate pe scar larg pentru izolarea
fitochimicalelor bioactive, precum i alte proceduri care s permit progrese n
separarea i identificarea acestor compui. Aceast revizuire arat c tehnologia
necesar este disponibil pentru realizarea efectul dorit a obiectivele analizate
privind separarea i cuantificarea polifenolilor.