Sunteți pe pagina 1din 5

LUCRARE PRACTIC 7

METODE DE EVIDENIERE ALE NUCLEULUI I NUCLEOLULUI. EVIDENIEREA


ACIZILOR NUCLEICI PRIN TEHNICA CITOCHIMIC BRACHET
Nucleul este structura cea mai proeminent pe un preparat microscopic a
oricrei celule aflate n interfaz. Este centrul activitii celulare, depozitul acidului
dezoxiribonucleic cromozomial (ADN), i locul sintezei i procesrii acidului
ribonucleic (ARN).
NVELIUL NUCLEAR
nveliul nuclear este format din dou uniti membranare ce servesc ca i limit fizic
ntre citoplasm i nucleu (Fig. V-6).
A. Membrana nuclear extern se afl n contact cu citoplasma, este continu cu
reticulul endoplasmic rugos, i este mpodobit cu ribozomi i poliribozomi.
B. Membrana nuclear intern se afl n contact cu nucleoplasma i este acoperit
cu reeaua laminei nucleare.
C. Spaiul perinuclear este compartimentul dintre membranele nucleare interne i
externe. Este continuu cu spaiul cisternelor rediculului endoplasmatic.
1. Proteinele sintetizate de polizomi legai de membrana nuclear extern sunt
inserai n membran sau sunt translocate de-a lungul membranei n spaiul
perinuclear.
2. Acele proteine ce nu rmn asociate de nveliul nuclear urmeaz aceeai cale
ca i proteinele sintetizate pe reticulul endoplasmatic rugos (vezi Capitolul 3 I B 2).
NUCLEOLUL
Nucleolul (fig. III-2, III-3, V-4, V-5) este locul transcripiei ARN ribozomal (ARNr) i al
asamblrii subunitilor ribozomale.
A. Morfologie. Nucleolul este o structur intranuclear nemembranar ce se
coloreaz intens cu heatoxilin i colorani bazici.
1. Nucleolul este prezent doar n nucleul interfazic.
a. n mod obinuit, fiecare celul are doar unul sau doi nucleoli. Deoarece genele
ce codific ARNr sunt localizate pe 5 cromozomi diferii, exist posibilitatea
existenei a mai muli nucleoli. De obicei, ns, acetia fuzioneaz.
2. Prin microscopie electronic nucleolul apare ca o structur heterogen cu regiuni
fibrilare, granulare i palid colorate.
B. Regiunile funcionale. Sinteza de ARNr i asamblarea subunitilor ribozomale
are loc n regiuni distincte ale nucleolului. Ulterior asamblrii, subunitile ribozomale
mari i mici imature sufer maturarea n timpul transferrii lor n afara nucleului n
citoplasm prin complexele porului nuclear.
1. Regiunile fibrilare sunt situri ale transcripiei active ale ARNr din genele ARNr
(ARN ribozomal).
2. Regiunile granulare sunt situri de asamblare a ARNr, ARN 5S i proteine
ribozomale n subunitile ribozomale.
a. ARN 5S este transcris pe ADN n afara nucleolului.
b. Proteinele ribozomale sunt sintetizate n citoplasm pe polizomi liberi (vezi
Capitolul 3 VII A) i translocate n nucleu prin complexul porului nuclear.
3. Regiunile pal-colorate conin ADN ce nu este transcris n mod activ.
PORII NUCLEARI
Porii realizeaz canale pentru comunicarea direct ntre nucleoplasm i citoplasm.
Membranele interne i externe sunt continui n jurul inelului porului nuclear (Fig. V-8).
A. Structura. Un por nuclear este cilindric n exterior, cu un diametru exterior de 120140 nm i un canal intern cu un diametru de 9 nm. Porul cilindric ntinde distana
dintre membranele nucleare interne i externe.

1. Complexul porului nuclear este un ansamblu macromolecular cu o simetri


octogonal. Fiecare por este compus din mai mult de 100 proteine globulare cu o
mas molecular total estimat de 125 MD.
2. nveliul nuclear a unei celule tipice de mamifer conine ntre 3000 i 4000 de
pori nucleari. Acest numr este mai mare n celulele mai active transcripional.
B. Funcia. Una din cele mai importante funcii ale complexului porului nuclear este
aceea de transport selectiv al substanelor prin nveliul nuclear. Transportul prin por
este bidirecional. Moleculele exportate din nucleu spre citoplasm includ ARN de
transfer (ARNt), subunitile ribozomale i ARNm. Moleculele importate din citoplasm
n nucleoplasm includ ADN- i ARN-polimeraze, proteine reglatoare, proteine
ribozomale i histone.
1. Difuziunea pasiv. Porii nucleari sunt permeabili pentru ioni i molecule mici
cu raza moleculara n jur de 4,5 nm (echivalentul a aproximativ 60 kD). Proteinele
mai mari de 9 nm n diametru nu trec liber prin porul nuclear.
2. Transportul activ. Transportul moleculelor mari (> 9 nm n diametru) i a
complexelor macromoleculare prin complexul porului nuclear este un proces
mediat de receptor ce necesit ATP. Pentru a tranzita complexul porului
nuclear, proteinele trebuie s posede una sau mai multe secvene de localizare
nuclear (NLS) n secvena lor primar de aminoacizi (Fig. V-9).
a. NLS este o secven peptidic scurt de 4-8 aminoacizi de baz, ncrcai
pozitiv (ex. lizina, arginina, prolina). NLS poate fi localizat oriunde n protein i o
protein poate conine una sau mai multe NLS.
b. Mecanismul de transport (Fig. V-9)
(1) Din citoplasm n nucleu. Transportul proteinelor prin complexul porului
nuclear este un proces n dou etape.
(a) Ataarea. Proteinele ce posed o NLS se leag de proteine citosolice
specifice pentru a forma un complex. Apoi complexul se ataeaz de un
receptor de la periferia complexului porului nuclear.
(b) Translocarea
(i) Proteina ce conine NLS este transportat prin porul nuclear i
proteinele citosolice sunt eliberate napoi n citoplasm.
(ii) Translocarea este un proces dependent de ATP. O parte a energiei
obinut prin hidroliza ATP este folosit n dilatarea tranzitorie a porului
nuclear pentru a permite intrarea proteinelor transportate.
(2) Din nucleu spre citoplasm. Transportul ARN i a subunitilor
ribozomale n afara nucleului spre citoplasm este de asemenea un proces
selectiv. De asemenea transportul n aceast direcie pare s necesite un
receptor. Detaliile mecanismului nu sunt pe deplin cunoscute.
LAMINA NUCLEAR
Lamina nuclear (Fig. V-11) este o reea fibroas ce aliniaz suprafaa intern a
nveliului nuclear. Lamina, cu o grosime de 10-20 nm, determin structura i
stabilitatea nucleului interfazic i mediaz legarea cromatinei de nveliul nuclear. Este
ntrerupt de porii nucleari.
A. Compoziie. Matricea nuclear este compus din filamentele intermediare de tip
IV denumite laminele nucleare A, B i C (vezi Capitolul 4 IV A 3).
B. Rolul n mitoz. Lamina joac un rol major n fragmentarea rapid a nveliului
nuclear la nceputul mitozei i n reasamblare la sfritul mitozei (vezi Capitolul 4 IV D
3).
MATRICEA NUCLEAR
Aspectul organizat al nucleului este rezultatul existenei unei substructuri denumite
matrice nuclear. Aceasta este o reea fibroas ce conine aproximativ 10% din totalul
proteinelor nucleare, 30% din ARN-ul nuclear, 1-3% din ADN-ul total i 3% din
fosfolipidele nucleare.

A. Morfologia. Preparatele de matrice nuclear sunt obinute prin dizolvarea


nveliului nuclear, extrgnd ARN i proteinele asociate i prin digestia ADN-ului.
1. Vizualizate la microscopul electronic, astfel de preparate relev o reea fibroas
cu o form similar cu nucleul.
2. n interiorul reelei exist elemente reziduale ale nucleolului, fibrile asociate cu
complexe de pori nucleari i fibrile asociate cu lamina nuclear.
B. Funcia. Matricea nuclear se consider a determina structura i organizarea
compartimentului nuclear intern. Aceasta servete ca i o faz solid la care sunt
ataate complexele enzimatice responsabile pentru transcripia ARN i replicarea ADN.
EVIDENIEREA ACIZILOR NUCLEICI PRIN COLORAIA BRACHET
Pe seciuni histologice evidenierea acizilor nucleici este posibil prin utilizarea
unor metode biochimice de culoare. Astfel, metoda Brachet, utiliznd coloraia dubl cu
verde de metil i pironin pune n eviden structurile care conin acizi nucleici. ADN-ul
apare colorat n verde albastru prin verdele metil, iar ARN-ul apare colorat n rou prin
pironin.
Ribozomii, coninnd ARN, se gsesc fie liberi n citoplasm, fie fixai pe reticulul
endoplasmic, numrul lor determinnd bazofilia citoplasmei. De aceea unele celule
cum sunt hepatocitele, celulele acinoase din pancreas i glandele salivare (n zona lor
bazal), apar cu citoplasma bazofil.
Preparatul examinat : seciune prin ficat, colorare cu verde metil i pironin.
Hepatocitele prezint citoplasma de culoare roz-roie datorit ARN-ului ribozomal.
Nucleul hepatocitelor, cnd apare pe seciune, este colorat n albastru-verzui, datorit
ADN-ului nuclear, i conine 1 sau 2 nucleoli intens colorai n rou-violet (datorit
ARN-ului nucleolar)
Preparatul examinat : seciune prin pancreas. n celulele acinoase nucleul este
situat n treimea inferioar a celulei i are o coloraie albastr-verzuie (datorit ADNului nuclear). Conine un nucleol colorat n rou-violet (datorit ARN-ului nucleolar).
Zona bazofil a celulelor este intens colorat n rou-violet datorit prezenei n
cantitate mare a ribozomilor (ce conin ARN) n zona subnuclear i perinuclear.
FORME NUCLEARE
Nucleul joac un rol central n viaa celulei, fiind partea cea mai specializat
din celul. Nucleul conine genomul celulei, care const dintr-un numr definit de
molecule de ADN, fiecare din ele avnd structura caracteristic de dublu helix a ADNului. n plus nucleul conine echipamentul necesar pentru repararea genomului ,
pentru replicarea sa, pentru transcrierea sa i pentru prelucrarea ARN-ului.
Forma i mrimea nucleului difer n funcie de morfologia celulei. Poate fi
sferic n celulele cubice sau poliedrice, alungit n celulele fusiforme, discoidal n
celulele pavimentoase etc. Forma este legat de activitatea celular.
1. Nucleu excentric. Adipocite. Hipoderm. Piele. Coloraie HE.
2. Snge periferic. Coloraie MGG. Granulocite neutrofile (nucleu
segmentat)
Limfocite (nucleu sferic)
Granulocite eozinofile
(nucleu bilobat)
Monocite (nucleu reniform)
3. Nucleu poliploid. Megacariocite. Mduva hematogen. Coloraie
MGG.
4. Modificri nucleare n transformri maligne. Celule neoplazice.
Coloraie HF.

1. Nucleu excentric. Adipocite. Hipoderm. Piele. Coloraie HE.


Pe o seciune efectuat la nivelul pielii se identific cele trei straturi (epiderm,
derm i hipoderm), foliculi pilari, glande sebacee, etc. n hipoderm se gsesc grupuri
de celule adipoase, ncrcate cu lipide care ocup aproape toat citoplasma. Celulele
au form sferic, citoplasm necolorat (lipidele nu se coloreaz). Lipidele
intracitoplasmatice mping nucleul la periferie, turtind-ul, adipocitul cptnd astfel
aspectul de inel cu pecete.
2. Snge periferic. Coloraie MGG.
- Granulocite neutrofile (nucleu segmentat)
Pe un frotiu recoltat din sngele periferic se observ predominana celulelor
anucleate, respectiv a hematiilor. Din loc n loc se gsesc i elemente nucleate.
Leucocitele neutrofile (granulocitele neutrofile) sunt cele mai numeroase
leucocite, fiind prezente n snge n procent de 45-75%. Sunt celule globuloase, emit
pseudopode ceea ce le confer o mare mobilitate. Durata de via a neutrofilelor este
de 2-5 zile, ele persistnd n snge 6-12 ore. Au nucleu caracteristic, segmentat,
prezentnd 2-5 lobi nucleari legai ntre ei prin puni de cromatin. Aezarea lobilor n
neutrofil realizeaz forme diferite, asemntoare literelor din alfabet (C, E, U, V, S, Z,
Y). La sexul feminin aproximativ 3% din neutrofile prezint la unul din lobii nucleari
corpusculul Barr, ce reprezint cromatina sexual condensat a unuia din cei doi
cromozomi X. Corpusculul sexual apare la microscop ca o prelungire a lobului nuclear
sub forma unui b de tob.
Citoplasma neutrofilului este slab acidofil, colorat n roz palid. Gradul de
segmentare al nucleului corespunde cu vrsta celulei. n citoplasm se gsesc
numeroase granulaii fine.
- Limfocite (nucleu sferic)
Limfocitul este o celul sferic sau uor oval, se gsete n snge n proporie
de 25-45%. Nucleul limfocitului este mare,uor incizat, colorat n violet, ocupnd mare
parte din citoplasm care este redus la un inel perinuclear. Citoplasma este bazofil,
conine granulaii azurofile, organite celulare.
Durata de via n sngele periferic este diferit, fiind situat ntre cteva zile
i un an, dar unele limfocite pot atinge i vrsta de 5-25 ani. Limfocitele joac un rol
important n imunitate (limfocitele B i T)
- Granulocite eozinofile (nucleu bilobat)
Eozinofilul se gsete n sngele periferic n proporie de 1-5%, fiind printre
cele mai mari elemente din grupul granulocitelor segmentate. Celulele sunt sferice, cu
nucleu bilobat sau n desag. Se pot ntlni n sngele circulant i eozinofile cu
nucleu trilobat. Citoplasma este intens acidofil, conine organite celulare i granulaii
acidofile.
Durata de via a eozinofilelor este de 8-12 zile.
- Monocite (nucleu reniform)
Monocitele se gsesc n sngele periferic n proporie de 6-8%. Se mpart n
monocite mici-inactive i monocite mari-active. Sunt celule globuloase, cu citoplasm
abundent, bazofil, ce se coloreaz n albastru-cenuiu. Nucleul celulei este
nesegmentat, mare, deseori reniform. Monocitul mpreun cu macrofagul tisular joac
un rol important n aprarea organismului.
Durata de via n sngele circulant este de 10-60 ore.
3. Nucleu poliploid. Megacariocite (Mduva hematogen), Miocite
striate. Coloraie MGG, HE
Pe un frotiu recoltat de la nivelul mduvei hematogene se observ
predominana elementelor nucleate, printre care gsim i megacariocite. Sunt celule
mari, rotund-ovalare, cu un diametru de 40-150m. Nucleul este neregulat, lobulat, cu
aspect nmugurit, colorat violet. Citoplasma este slab bazofil, emite prelungiri, ceea
ce i confer un aspect ameboidal. Megacariocitul prezint fenomenul de

endopoliploidie, ce reprezint o diviziune celular special n cadrul creia celula i


dubleaz cantitatea de ADN la fiecare ciclu celular (2n, 4n,8n, 16n, 32n)
4. Modificri nucleare n transformri maligne. Celule neoplazice.
Coloraie HF.
Pe o seciune efectuat la nivelul unei tumori maligne se identific grupuri de
celule neoplazice de diferite mrimi i forme care prezint urmtoarele modificri:
1. inversarea raportului nucleu/citoplasm (normal<1, tumor>1)
2. nuclei pleomorfi, monstruoi, ce ocup aproape toat citoplasma, inegali ca
form i mrime, cu cromatin nuclear lax
3. nuclei denudai, membrana nuclear este incizat, margini neregulate,
crenelate, citoplasm redus
4. mitoze atipice
5. nucleoli modificai ca form i mrime
De desenat: pericarion neuron multipolar,
megacariocit (MRH), structura nucleului in ME

adipocite,

cel.

musculare

striate,

De studiat: neuroni multipolari (coarnele anterioare al mduvei spinrii), adipocite


(hipoderm), miocite striate (limba), frotiuri sanguine, mduva hematogen (os
spongios), hepatocite (ficat), cel. epiteliale (vezica urinar).