1.

PRINCIPIILE I TEHNICA PENTRU ELISA DE TIP SANDWICH

ELISA
Dezvoltata din 1970
Metoda acceptata si utilizata pe scara larga
Mai multe tehnici :
Competitiva
De tip sandwich
Captura de anticorpi
Metode competitive
Unul din componentele reactiei imune este insolubil, celalalt este marcat enzimatic.
Analitul poate fi cuantificat pin capacitatea sa de a preveni formarea de complexe
intre reactivul insolubil si cel marcat .
Avantaje
-este necesara o singura etapa de incubare
-Nu apare efectul de prozona la cantitati foarte mari de analit
Dezavantaje:
-intervalul de concentratii pe care analitul poate fi cuantificat fara a
face dilutii este mic
-daca in proba sunt prezente si Ag si Ac (ex. In hepatita B) acestea nu
pot fi distinse intr-o singura etapa de reactive
Metode tip sandwich
acelasi component al reactiei imune (de exemplu Ac) este folosit in forma
insolubila si in forma marcata emzimatic; celalalt component al reactiei
imune (ex. Antigenul) formeaza o punte intre cei doi reactivi anterior
mentionanti
Sau metoda prin care un component (de obicei antigenul) este utilizat in
forma insolubila pentru a lega analitul din proba (anticorpul), care ulterior
este determinat prin aditia de Ac anti Ig (pentru aceeasi clasa ca si a Ac din
reactiv) sau de proteina A
Cuantificarea se poate face pe un interval mare de concentratii a
analitului.
Efectul de prozona poate fi evitat folosind etape de incubare secventiale
pentru proba si pentru reactivul marcat sau utilizand Ac monoclonali
FR si alti Ac IgM pot da rezultate fals pozitive.
Metode de tip sandwich cu inhibitie
Proba care contine analitul (de obicei Ac) este preincubata cu o cantitate fixa de
partener de reactie (Ag)
Cantitatea restanta de Ag este dterminata intr-un test de tip sandwich
Metoda complicata si cu interval de masurare limitat
Metoda permite detectarea concomitenta de Ag si Ac daca ambele dunt prezente
in proba
Metode de tip sandwich cu inhibitie
Proba care contine analitul (de obicei Ac) este preincubata cu o cantitate fixa de
partener de reactie (Ag)
Cantitatea restanta de Ag este dterminata intr-un test de tip sandwich
Metoda complicata si cu interval de masurare limitat
Metoda permite detectarea concomitenta de Ag si Ac daca ambele dunt prezente
in proba
Metode cu captura de Ac
Pentru detectarea Ac dintr-o anumita subclasa
Prima etapa proba este incubata cu anti IgM insolubil
Ulterior se adauga Ag marcat enzimatic urmat de Ac marcat enzimatic

 Nu prezinta interferente cu alte subclase de Ig sau cu FR

Se utilizeaza pentru diagnosticul infectiilor acute prin detectia IgM
Acest tip de test se poate folosi si pentru IgG sau IgA.
Trend-ul este de utilizare a metodelor cat mai simple si cu interval dinamic (de
linearitate) mare.
De aceea este de asteptat ca metodele competitive si cele de inhibitie tip
sandwich sa piarda teren in fata metodelor de tip sandwich si de captura de Ac
Caracteristicile testului
Utilizarea de Ac monoclonali a dus la imbunatatirea sistemelor ELISA
-sensibilitate mai mare- prin selectia de Ac cu afinitate extrem de mare, prin
reducerea reactiei de background permitand astfel si detectia unor concentratii
mici de analit
-specificitate mai mare- prin evitarea prezentei in reactivi de Ac cu reactivitate
pentru epitopi care nu apartin analitului cautat si prin selectarea de combinatii de
Ac monoclonali care sa creasca in plus specificitatea
-fiabilitate- de ex introducerea simultana marcajului, fazei solide si a probei fara
riscul efectului de prozona
-marcajul enzimatic - majoritatea sistemelor folosesc peroxidaza din hrean,
fosfataza alcalina sau B-D- galacozidaza; enzimele utilizate sunt aceleasi si in
prezent, dar s-au cautat noi metode de detective a acestor enzime:pentru
Fosfataza alcalina si galactozidaza se foloseste inca din anii 80 fluorimetria; pentru
peroxidaza de hrean sunt disponibile metode de detective in
chemiluminescenta;metodele fluorimetrice si luminometrice
au sensibilitate si un interval de masurare mai mare decat spectrometria
conventionala
-substratul utilizat este TMB, care confera sensibilitate mai mare si reduce riscurile
profesionale legate de alte substrate (ex OPD carcinogenic)
2. PRINCIPIUL I TEHNICA PENTRU REACIA DE FIXARE A COMPLEMENTULUI

Introdusa de Wasserman in 1909 pentru dg sifilis

Este usor si rapid de efectuat, necesarul de echipamente si reactivi este
redus; exista multe Ag disponibile pentru testare
Tendinta este sa se foloseasca teste mai sensibile si mai specifice EIA, RIA
RFC implica mai multe varibile
Au loc doua reactii Ag-Ac, dintre care una are rol doar de sistem indicator
Prima reactie: intre un Ag viral cunoscut si anticorpul specific, in prezenta
complementului -> complementul este fixat de complexele Ag-Ac
A doua reactie Ag-Ac este intre hematii de oaie si hemolizina; hematiile de
oaie sensibilizate se vor liza doar daca in amestecul de reactie este prezent
complementul
Antigenele utilizate in RFC sunt mai degraba un grup de Ag
Concentratia optima de ser hemolitic, complement si Ag trebuie
determinate prin titrare
Titrarea serului hemolitic si a complementului
Dilutii ale complementului cu diferente de 20% intre dilutii succesive de la
1:30 pana la 1: 279, apoi dilutii binare de la 1:400 la 1:3200
Controale:
Pentru celule: celule nesensibilizate
Pentru complement: complement la concentratii difertie si cellule
nesensibilizate

 Pentru serul hemolitic: celule sensibilizate la anumite concentratii de ser

hemolitic
Concentratia optima a serului hemolitic este dilutia la care da liza cea
mai accentuata cu dilutia cea mai mare de complement
O doza hemolitica de complement (HD50) este dilutia care da hemoliza la
o concentratie optima a serului hemolitic (vezi mai sus); pentru RFC se
folosesc 3x HD50
Titrarea Ag si Ac
Dilutii de 1:2 pana la 1:512 de Ag se titreaza fata de un control pozitiv
Controale
Pentru Ag- Ag la diferita concentratii, complement si celule sensibilizate
Pentru Ac- antiser la diferite concentratii, complement si cellule
sensibilizate
Re-titrarea complementului: doza optima de Ag este dilutia cea mai mare
care da o fixare de minimum 75% la cea mai mare dilutie de Ac
RFC
Serul hemolitic este utilizat la concentratia optima, complementul
la concentratia 3x HD50, iar fiecare Ag individual este utilizata in doza optima
Serul pacientului se inactiveaza 30 min la 56 grd C
Screeningul se face de obicei la o dilutie de 1:10; daca este pozitiv se
retesteaza pana la dil 1:80
Controale
-controlul serului- se folosesc doar ser si complement pentru a detecta
o posibila activitate anti- complement in serul de testat
-controlul antigenului- se folosesc doar Ag si complement pentru a detecta
reactii nespecifice intre Ag si complement
-retitrarea complementului- pentru a verifica daca complementul este utilizat
la concentratia optima
-controlul celulelor se utilizeaza doar celule
Toate controalele trebuie sa prezinte liza completa
La retitrarea complementului; citirea trebuie sa fie 0 in godeul 2 si 1-2 in
godeul 3
Titrul RFC este cea mai mare dilutie de ser de pacient care prezinta la citire
un rezultat de 34
Diagnosticul de infectie recenta: cresterea de min 4x a titrului sau un titru
de min 1:80
Avantaje RFC
Se poate face concomitent screening pentru un numar mare de infectii
virale sau bacteriene
Este ieftina
Dezavantaje
Nu este sensibila nu poate fi folosita pentru screening
Laborios
Frecvent nespecifica ex. reactivitate incrucisata intre HSV si VZV
3. PRINCIPIUL I TEHNICA PENTRU REACIILE DE AGLUTINARE I HEMAGLUTINARE

Aglutinarea bacteriilor sau a unor particule mbracate n antigen.

 Aglutinarea hematiilor sau a unor particule de latex pe care au fost fixate

antigenehemaglutinarea/ latex-aglutinarea. Antigenele solubile pot fi legate
de o faza solida, de exemplu prin absorbia lor pe hematii de oaie sau
particule de latex; fenomenul de aglutinare care astfel poate fi observat
macroscopic, se numete aglutinare pasiva.
O mare varietate de virusuri au capacitatea de a aglutina hematiile unor specii de
mamifere sau specii aviare
Virusuri cu proprietati hemaglutinante: influenza, parainfluenza,adenoviruss, rubella,
alphavirus, bunyavirus, flavivirus, picornavirus.
Daca sunt prezenti Ac anti virali, acestia vor preveni aglutinarea indusa de virus=
hemaglutinoinhibare
Specificitatea difera in functie de virus: ex pt virusul gripal A Ag responsabil pentru
hemaglutinare este acelasi cu Ag responsabil pentru adsorbtia virusului, ceea ce face
ca neutralizarea virusului sa
fie un proces cu specificitate mare pentru diferite tulpini de virus;pentru flaviviridae,
Ac folositi in HAI pot reactiona incrucisat si cu alte tulpini de flaviviridae
HAI este mai sensibila decat RFC, dar mai putin sensibila decat EIA,RIA
HAI este usor de realizat, reactivii si echipamentele sunt ieftine
Dilutii seriale din serul pacientului incubat cu o doza fixa de hemaglutinina virala;
apoi se adauga eritrocite aglutinabile
In prezenta anticorpilor, capacitatea virusului de a induce aglutinarea eritrocitelor
este inhibata
Interferente: prezenta de inhibitori nespecifici pentru hemaglutininele virale sau
autoaglutinarea eritrocitelor
HAI se foloseste pentru dg rubeola si gripa HAI pentru rubeola
Hematii de la pui de gaina sau gasca
Diluentul este albumina bovina tamponata cu veronal
Se folosesc 4 unitati hemaglutinante de Ag rubeola; concentratia de Ag se
determina prin titrari efectuate inaintea fiecarui test HAI,utilizand dilutii de Ag de la
1:2 la 1:1024; o unitate hemaglutinanta este cea mai mare dilutie de Ag la care
hemaglutinarea este completa
Dilutii ser de pacient de la 1:8 la 1:1024
Inhibitorii nespecifi ai hemaglutinarii se indeparteaza din serul de testat
prin pretratarea cu caolina, periodat de potasiu sau prin inactivarea prin
caldura
Hemaglutininele nespecifice din ser sunt indepartate prin adaugarea
inainte de testarede eritrocite la serul de testat- aceasta procedura poate
fi facuta pentru toate serurile de testat sau doar pentru serurile care au
prezentat la testari HAI anterioare aglutinare in godeurile de control
pentru ser ( in care se pun doar ser si hematii)
Se adauga 4 unitati hemaglutinante de Ag Rubella in fiecare godeu cu dilutii de ser,
mai putin pentru serul din godeurile de control
Se recomanda retitrarea Ag Rubella de la 4 unitati hemaglutinante pana la 0,25
unitati hemaglutinante
Se incubeaza placa la temperatura camerei 60 min
Se adauga 0,4% hematii de pui
Se incubeaza 60 min la 4 grd C
Se citeste
Controlul doar cu eritrocite trebuie sa prezinte buton la fundul godeului
Controlul serului trebuie sa prezinte absenta aglutinarii
Retitrarea hemaglutininelor trebuie sa prezinte agutinare la 4,2,1, unitati
O crestere de 4x a titrului intre serului recoltat in perioada acuta si cea de

convalescenta
Avantaje:
Usor de efectuat si ieftine
Dezavantaje
Mai putin sensibile decat RIA si EIA
Citirea poate fi subiectiva
Reactivii trebuie sa fie proaspeti ca sa nu apara aglutinari anormale care
fac dificila citirea