Sunteți pe pagina 1din 111

SUMAR

INTRODUCERE
CAPITOLUL I. ASPECTE PRIVIND INTERACIUNEA GAZD-PARAZIT:
Helianthus annuus L.- Orobanche cumana Wallr.
1.1. Floarea-soarelui cultur oleaginoas i plant gazd
1.2. Lupoaia parazit al florii-soarelui
1.2.1. Taxonomia, rspndirea i impactul economic al speciilor de Orobanche
1.2.2. Biologia parazitului Orobanche cumana
1.2.3. Ciclul de via i etapele parazitismului la speciile de Orobanche
1.2.4. Efectul parazitismului Orobanche asupra plantei-gazd
1.2.5. Metode de control a lupoaiei
1.3. Tipurile de rezisten i mecanismele reaciei de rspuns a plantelor fa de agentul patogen
1.3.1. Rezistena nespecific i indus
1.3.2. Rezistena specific gazdei.
1.3.3. Mecanisme fiziologo-biochimice de rezisten a florii-soarelui la lupoaie
1.4. Aspecte genetice ale rezistenei plantelor fa de agentul patogen
1.4.1. Rezistena plantelor mediat de genele R- i reacia de hipersensibilitate
1.4.2. Genetica rezistenei florii-soarelui fa de lupoaie

CAPITOLUL II. OBIECTUL I METODELE DE CERCETARE


2.1.

Obiectul de studiu i condiiile de cultivare

2.2. Metodele de cercetare


2.2.1. Determinarea indicilor morfo-fiziologici
2.2.1. Determinarea prezenei peroxidului de hidrogen
2.2.2. Metoda gazometric de determinare a activitii catalazei
2.2.3. Izolarea proteinelor sumare
2.2.4. Determinarea calitativ a proteinelor prin SDS-PAGE
2.2.5. Metoda spectrofotometric de determinare a acizilor nucleici
2.2.6. Izolarea ADN-lui
2.2.7. Tehnica PCR de identificare a unor gene de rezisten
2.2.8. Analiza statistic a datelor

CAPITOLUL III. REZULTATE I DISCUII


VARIAIA PARAMETRILOR MORFO-FIZIOLOGICI LA PLANTELE DE
FLOAREA-SOARELUI LA INTERACIUNE CU PARAZITUL LUPOAIA
3.1. Studiul parametrilor morfo-fiziologici, acumularea pigmenilor asimilatori i evaluarea gradului
de infecie n procesul de interaciune a florii-soarelui cu lupoaia din regiuni geografice
diferite
3.2. Influena temperaturii asupra gradului de infecie al lupoaie la unele genotipuri de floareasoarelui
3.3. Dinamica dezvoltrii parazitului pe sistemul radicular a plantei-gazd
3.4. Evidenierea gradului de infecie la unele genotipuri din colecia laboratorului

CAPITOLUL

IV.

DIFERITOR

ASPECTE
GENOTIPURI

BIOCHIMICE
DE

ALE

INTERACIUNII

FLOAREA-SOARELUI

CU

OROBANCHE CUMANA WALLR


4.1. Aspecte ale statutului oxido-reductor la unele genotipuri de floarea-soarelui atacate de
lupoaie
4.2. Aspecte moleculare ale metabolismului proteic n patosistemul Helianthus annuus l.
Orobanche cumana wallr
4.2.1. Analiza proteinelor la nivelul sistemului radicular
4.2.1.1. Varietatea spectrului polipeptidic la diverse genotipuri de floarea soarelui n
cadrul familiei Xenia la nivelul rdcinilor
4.2.1.2 Impactul patogenului Orobanche cumana asupra metabolismului proteic la
nivelul sistemului radicular a genotipurilor familiei Xenia
4.2.1.3. Varietatea spectrului polipeptidic la diverse genotipuri de floarea soarelui n
cadrul familiei Valentino la nivelul sistemului radicular
4.2.1.4. Impactul patogenului Orobanche cumana asupra metabolismului proteic la
nivelul sistemului radicular a genotipurilor care formeaz hibridul Valentino
4.2.1.5. Identificarea proteinelor asociate cu patogenez la diverse genotipuri de floareasoarelui
4.2.2. Modificarea spectrului polipeptidic la nivelul sistemului foliar la diverse genotipuri de
floarea soarelui sub aciunea stresului biotic
4.2.2.1Varietatea spectrului polipeptidic a genotipurilor hibridului Xenia i liniilor
parentale ale acestuia la nivelul sistemului foliar

4.2.2.2. Impactul patogenului Orobanche cumana asupra metabolismului proteic la


nivelul sistemului foliar a genotipurilor hibridului Xenia i liniilor parentale ale
acestuia
4.2.2.3. Varietatea spectrului polipeptidic la diverse genotipuri de floarea soarelui n
cadrul familiei Valentino la nivelul sistemului foliar
4.2.2.4. Impactul patogenului Orobanche cumana asupra metabolismului proteic la
nivelul sistemului foliar a genotipurilor familiei Valentino

CAPITOLUL V. DETERMINISMUL GENETIC A REZISTENII UNOR


GENOTIPURI DE FLOAREA-SOARELUI LA LUPOAIE
5.1. Analiza cantitativ a acizilor nucleici
5.2. Evidenierea marcherului genetic asociat cu genei Or5 ce confer rezisten
la rasa E de lupoaie la unele genotipuri de floarea-soarelui

CONCLUZII

INTRODUCERE
Actualitatea temei. Floarea-soarelui reprezint una din principalele plante oleaginoase
cultivate n Republica Moldova, avnd o importan major la nivel att naional, ct i mondial.
Aceast cultur are un spectru larg de utilizare, rezolvnd problema aprovizionrii cu ulei vegetal i
aducnd o mare contribuie n obinerea produselor alimentare vitaminizate, a substanelor fosfoorganice i minerale. ns, recolta culturilor agricole n agrocenozelor din Republica Moldova,
inlusiv cea a florii-soarelui, sufer pierderi considerabile din cauza aciunii nefaste a unor factori de
natur abiotici i biotici. Floarea-soarelui este atacat de diferii ageni patogeni, ceea ce
actualizeaz problema crerii i selectrii hibrizilor rezisteni la factorii biotici. Pierderi anuale
cauzate de boli, pe plan mondial se ridic la circa 33% din volumul produciei poteniale ( Burzo I.
Toma S., 1999).

Unul din factorii limitativi ai produciei de floarea-soarelui n Republica Moldova este


parazitul lupoaia (Orobanche cumana Wallr.), n special zonele centrale i de sud-est ( Siminel V.
1998),

ct i n regiunea Mediteranean i Europa de Est (Alonso, L. C. 1996, Blbl, A.,1991, Dominguez,

J., 1996, Shindrova, P. 1994).

Deoarece lupoaia este un parazit angiosperm, lipsit de clorofil, care

depinde n totalitate de planta gazd, utiliznd apa, substanele minerale i organice ale floriisoarelui i absorbia acestor substane reduc nu doar producia de semine, dar de asemenea i
coninutul uleiului (Szoko G., 1973), atacurile creia sunt deseori devastatoare i pagubele produse de
ctre parazit pot duce la scderea produciei cu peste 50% (Aimovi M., 1988, Bucuceanu M. 1998,
Dominguez, J., 1996).

Controlul acestui parazit este destul de dificil, fiind studiate i implementate diverse metode
de combatere a lupoaiei, inclusiv mecanice, biologice i chimice, unde selecia i ameliorarea
culturilor de floarea-soarelui cu rezisten genetic se consider cea mai efectiv, economic i fiind
o soluie ecologic n acelai timp. Totui, utilizarea formelor rezistente genetic este urmat de
apariia de rase noi de lupoaie, mai virulente, care nving barierele existente de rezisten (Dominguez
J 1999).

Elucidarea mecanismelor fiziologo-biochimice i genetice legate de relaiile existente dintre

planta-gazd i parazit, ar contribui la facilitarea procesului de selecie a formelor rezistente, ce


reprezint la momentul actual una din preocuprile de baz a cercettorilor din domeniul culturii
florii-soarelui.
Reieind din aceste considerente scopul prezentei lucrri const n elucidarea particularitilor
morfo-fiziologice, biochimice i genetice care caracterizeaz interaciunea dintre planta-gazd i
parazit n baza modelului floarea-soarelui i lupoaie.

Obiectivele de cercetare

studiul indicilor morfo-fiziologici i biochimici ai genotipurilor de floarea-soarelui n


norm i afectate de lupoaie;

evaluarea gradului de infecie la unele genotipuri de floarea-soarelui cultivate pe


teritoriul Republicii Moldova, sub influena diferitor regimuri de temperatur;

analiza spectrului polipeptidic a proteinelor sumare solubile la diverse genotipuri homoi heterozigote de floarea-soarelui infectate cu lupoaie;

identificarea markerului genetic de tip SCAR asociat cu prezena genei Or5 ce confer
rezisten la rasa E de lupoaie la 53 genotipuri de floarea-soarelui (linii materne, paterne
i hibrizi).

CAPITOLUL I. ASPECTE PRIVIND INTERACIUNEA GAZD-PARAZIT:


Helianthus annuus L.- Orobanche cumana Wallr.
Problema originii i a evoluiei parazitismului n general, ct i n cazuri particulare
constituie obiectul multor cercetri. Interaciunea florii-soarelui i lupoaiei reprezint o form de
interrelaii aprut pe parcursul evoluiei acestor dou specii, reprezentnd un important model de
studiu de tipul gazd-parazit. Elucidarea mecanismelor care stau la baza acestei interaciuni poart
att un caracter fundamental, ct i unul aplicativ.

1.1. Floarea-soarelui cultur oleaginoas i plant gazd


Floarea-soarelui (Helianthus annuus L., 2n=34) este o plant anual a familiei Asteraceae
(Schilling & Heiser, 1981), originar din America de Nord. Alogam, entomofil i alloploid (2n=34)
aprut n urma ncrucirii a unei specii din genului Vigniera (n=8) cu o specie a genului
Helianthus (n=9) nc neindentificat (Heiser, 1961).
De menionat c floarea-soarelui este o plant oleaginoas de mare importan economic i
alimentar. Prin coninutul seminelor n substane grase (33-56 %) i calitatea deosebit a uleiului
rezultat n urma extraciei, aceasta reprezint una dintre principalele productoare de grsimi
vegetale, utilizate n alimentaiei. Ca surs de ulei vegetal, pe plan mondial, floarea-soarelui ocup
locul al patrulea, dup soia, palmier i rapi ( Roman Gh., 2006). Valoarea alimentar ridicat a
uleiului de floarea-soarelui, se datoreaz coninutului bogat n acizi grai nesaturai, reprezentai
preponderent de acidul linoleic (44-75%) i acidul oleic (14-43%), ct i prezenei reduse a acidului
linolenic (0,2%), componente care-i confer stabilitate i capacitate ndelungat de pstrare,
superioare altor uleiuri vegetale. Funcia nutritiv a uleiului de floarea-soarelui este sporit de
prezena unor provitamine a vitaminelor liposolubile A, D, E, a vitaminelor B 4, B8, K i fosfatidelor.
Uleiul mai conine steroli, aproximativ 0,04%, precum i tocoferoli - fraciune antioxidant a
uleiului vegetal, cca. 0,07% (Vrnceanu i colab., 1974).
Datorit nsuirilor biochimice valoroase, uleiul de floarea-soarelui este folosit frecvent n
scop alimentar, n industria margarinei i a conservelor. De asemenea, produsul este folosit i n
industrie, pentru producerea lacurilor speciale i a rinilor, precum i n pictur. Reziduurile
rezultate n urma procesului de rafinare, se folosesc la fabricarea spunurilor, la obinerea cerurilor,
fosfatidelor, lecitinei i tocoferolilor. Fosfatidele i lecitina extrase din uleiul de floarea-soarelui,
sunt utilizate n industria alimentar, panificaie, patiserie, n prepararea ciocolatei i a mezelurilor
(Brnaure V.,1991, Popescu V, 1996).

Turtele rezultate n urma procesului de extracie a uleiului (aproximativ 300 kg/t smn),
constituie o surs valoroas de proteine pentru rumegtoare, iepuri, porci i psri ( Vrnceanu i colab.,
6

1974).

Turtele conin protein brut (ntre 33,7 i 47,8 %) i aminoacizi eseniali, cu valori apropiate

cu cele de la soia (Hera., 1989), excepie fcnd aminoacidul lizina, care se gsete n cantiti mai
mici. Valoarea energetic a turtelor este corelat cu gradul de decorticare a seminelor. Seminele
mai puin bogate n ulei, se folosesc direct n consum, ntregi sau decorticate, ct i pentru halva.
Tulpinile pot fi folosite ca surs de cldur (local), pentru fabricarea plcilor antifonice sau
obinerea carbonatului de calciu (Roman Gh., 2006).
Floarea-soarelui este o excelent plant melifer i poate avea i aplicaii medicinale. Din
florile ligulate (care conin quercitrin, anticianin, colin, betain, xantofil, etc.), se obine un
extract alcoolic care se folosete n combaterea malariei, iar tinctura - n afeciuni pulmonare
(Blteanu Gh.,1993). Din achene, dat fiind coninutul n fitin, lecitin, colesterin, se prepar produse
indicate n profolaxia dezenteriei, febrei tifoide i pentru vindecarea rnilor supurate. n medicina
popular, uleiul se folosete pentru macerarea plantelor utilizate n tratarea unor rni i arsuri ( Hera
i colab., 1989).

n ultima perioada se discut tot mai mult folosirea uleiurilor vegetale ca biocarburani
(Vrnceanu A.V., 200, Roman Gh., 2006 ). Uleiul din floarea-soarelui, utilizat ca carburant posed
avantajul c este uor de pstrat, este stabil, nu este periculos, este puin poluant, nu are risc foarte
mare de inflamare i are un indice de evaporare aproape de zero. Uleiul din floarea soarelui conine
ntre 10-15% oxigen, ceea ce duce la ameliorarea combustiei i la diminuarea nivelului polurii
(Roman Gh., 2006).
Datorit valorii nutritive nalte i capacitii nalte de rezisten la verile secetoase, pentru
Republica Moldova, floarea-soarelui reprezint una din culturile de baz i cea mai important surs
de ulei vegetal. Acest lucru este reflectat n faptul c recolta din anul 2008 a depit cu 40% nivelul
preconizat. Astfel, recolta pe ar a constituit 430 mii tone, ceea ce este cu 120 mii tone mai mult
dect s-a prevzut. n anul 2007, recolta de floarea-soarelui a fost grav afectat de secet i a
constituit 156 mii tone, de dou ori mai puin ca n 2006, unde aceasta a constituit 379 mii tone iar
n 2005 287,5 mii tone respectiv (sursa www.maia.gov.md)
n acelai timp, n afar de factorii abiotici, cultura de floarea-soarelui este una din cele mai
des afectate de boli, atacul crora constituind una din cauzele importante ale reducerii
productivitii, att n ara noast ct i n alte ri care cultiv aceast plant pe suprafee
nsemnate. Rspndirea i intensificarea culturii florii-soarelui pe glob ntr-un timp foarte scurt a
fost nsoit de creterea evident a frecvenii i agresivitii patogenilor, n timp ce patrimoniul
genetic al florii-soarelui cultivate a rmas la fel de srac n factorii de rezisten ca i la nceputul
cultivrii (Vrnceanu i colab., 1974).
Cele mai devastatoare boli sunt provocate de atacul ciupercilor fitopatogene cum sunt:
Plasmopara helianthi (mana), Sclerotinia sclerotiorum (putregaiul alb), Botrytis cinerea (putregaiul
7

cenuiu) i de fanerogama parazit lupoaia (Orobanche cumana). Pe lng acestea, o serie de boli
ca ptarea neagr (Phoma sp), rugina (Puccinia helianthi), vetejirea (Verticillium dahliae),
putrezirea rdcinilor i tulpinilor (Macrophomina phaseoli), pot constitui un pericol potenial,
semnalate tot mai des n culturile de floarea-soarelui ( Vrnceanu i colab. 1978). Reieind din numrul
publicaiilor de la Conferinele Internaionale consacrate florii-soarelui (ediiile din 1992, 1996,
2000 i 2004), s-a constatat c Sclerotinia sclerotiorum afecteaz cel mai des, urmat de
Plasmopara helianthi i Orobanche cumana (Vear F. 2004).
La moment, intens studiate maladii a florii-soarelui sunt putregaiul alb, mana, fomopsis
precum i lupoaia. Ultimul atrage o atenie tot mai mare n ultimul timp, fapt datorat de pagubele
economice importante pe care acesta le aduce rilor care cultiv floarea-soarelui. Pn n prezent,
lupoaia rmne un parazit important al florii-soarelui n principalele zone de cultur din
Comunitatea Statelor Independente. Astfel, amplitudinea pagubelor produse de parazitarea cu
lupoaie variaz foarte mult, de la scderi nesemnificative de producie pn la 90% pierderi, n
funcie de intensitatea atacului. Astfel, Acimovic (1983 b) a artat c la un atac slab, producia
scade cu 5-20%, iar la un atac mediu - 20-50% respectiv (Acimovic (1983 b).

1.2. Lupoaia - parazit al florii-soarelui


Capacitatea plantelor de a parazita pe alte plante a aprut independent n cursul evoluiei
angiospermelor i aproximativ 1% din toate plantele cu flori, n prezent, sunt catalogate ca plante
parazite (Wrobel and Yoder, 2001). Din totalul de 277 de genuri i 4100 de specii de plante cu flori
parazite (Press & Graves, 1995), doar circa 25 de genuri au un impact negativ asupra plantelor de
cultur i respectiv, considerate patogene (Nickrent and Musselman, 2004). Multe din aceste specii
au o importana pentru botaniti i ecologi ( Kuit, 1969), precum sunt Rafflesia spp.
sau Viscum spp. ns, printre acestea, patru genuri sunt considerate cele mai periculoase i aduc
cele mai semnificative daune: Cuscuta, Arceuthobium, Striga, precum i Orobanche.
1.2.1. Taxonomia, rspndirea i impactul economic al speciilor de Orobanche
Genul Orobanche se atribuie la familia Orobanchaceae (, 1986). n acest gen sunt
incluse circa 100 de specii (Roman et al ., 2002). Genul se mparte n 4 secii, dintre care seciile
Trionychon i Osproleon (cunoscut i ca secia Orobanche) includ specii care provoac cele mai
mari pagube economice (Pieterse, 1979).
Genul Orobanche L., n comparaie cu alte genuri din fam. Orobanchaeae, se caracterizeaz
printr-o complexitate i o diversitate genetic mare a speciilor. Aceasta se explic prin faptul c
speciile genului Orobanche L. paraziteaz att pe plantele din flora slbatic, ct i pe plantele de

cultur i buruiene. Cu ct este mai mare numrul de plante-gazd cu att sunt mai variate speciile
de plante parazite (Roman et al ., 2002).
n cadrul seciei Trionychon principale specii sunt Orobanche aegyptiaca Pers. i O. ramosa
L. care din punct de vedere morfologic, sunt foarte asemntoare, paraziteaz pe aceleai plante, au
tulpini ramificate i au acelai numr de cromozomi (2n=24).
Secia Orobanche Wallr. cuprinde aproximativ 50 specii, printre care speciile Orobanche
cernua Loefl. (2n=24, 38), O. cumana Wallr., O. crenata Forsk. i O. reticulata Wallr. sunt
cunoscute ca fanerogame parazite pe floarea-soarelui i alte culturi agricole, posednd tulpini
neramificate i 38 cromozomi (Schneeweiss M., Palomeque T., 2004). Dei O. cernua i O. cumana sunt
foarte apropiate, acestea au fost catalogate ca specii aparte (Katzir, 1996, Paran et al., 1997, Joel et al.,
1996, 1998, Pujadas & Thalouarn 1998).

Orobanche cernua se ntlnete n special n Spania, n

provinciile Cienca i Malaga (Diay-Celayeta, 1974; Gonzales-Torres et. al., 1980; Gonzales-Carrascosa, 1992;
Melero-Vara i colab., 1996).

Pentru sistematizarea speciilor de lupoaie pot fi utilizate diferite metode, precum cele
morfologice (Musselman, 1986), microscopie electronic a gruncioarelor de polen ( Abu Sbaih et al.,
1994),

metodele chimiotaxonomice de msurare a coninutului de compui fenolici (Andary, 1994;

Georguieva and Edreva, 1994)

i a acizilor grai (Velasco et al., 2000) a seminelor de Orobanche.

ns, aceste metode sunt insuficiente pentru efectuarea unei sistematici mai aprofundate,
inclusiv la nivel de taxoni inferiori speciei, pentru care pot fi aplicate metodele de biologie
molecular. n literatura de specialitate este puin informaie privind variabilitatea genetic n baza
markerilor moleculari, reprezentai de izoenzime i markerii ADN. Verkleij et al. (1986, 1989,
1991) a folosit izoenzime pentru a studia variabilitatea genetic n populaiile din cadrul speciilor
O. crenata i O. aegyptiaca rspndite n Siria i n Spania, iar Paran et al. (1997) a folosit
secvenele polimorfice amplificate ADN (markerii RAPD) pentru a studia variabilitatea din cadrul
i dintre principale specii de lupoaie din Israel. De asemenea, metoda RAPD a fost utilizat pentru
studiul variabilitii genetice a 20 de specii din genul Orobanche. n urma reaciilor PCR cu
utilizarea a cinci primeri arbitrari au fost identificai 202 ampliconi i identificai markeri specifici
de specie (B. Romn, C. Alfaro, A. M. Torres, 2003).
Cercetarea i cunoaterea evoluiei din cadrul populaiilor de lupoaie este crucial pentru
organizarea unor programe eficiente de ameliorare a plantelor la rezisten. Din aceast perspectiv,
variabilitatea genetic a populaiilor de O. cumana din Bulgaria, Romnia, Turcia i Spania, este
studiat folosind

RAPD markeri . S-a stabilit c aceast plant parazit este autogam i se

caracterizeaz printr-o variabilitate intrapopulaional mic, iar structura genetic a populaiilor din
zone geografice diferite este foarte omogen. Populaiile sunt foarte bine structurate i organizate n
dou grupe distincte. Din prima grup fac parte populaiile din rile Euroei de Sud-Est Bulgaria,
9

Romnia i Turcia, n a doua grup sunt incluse populaiile din Spania, ce au o origine monofiletic.
Aceste rezultate sunt puse n discuie i prezint interes n contextul utilizrii markerilor RAPD
pentru a determina tipul raselor de lupoaie din cadrul populaiilor de O. cumana. (Gagne et al., 1998)
Speciile genului Orobanche cauzeaz pagube mari de recolt i reduc semnificativ calitatea
produciei la un spectru larg de culturi dicotiledonate (Nickrent et al. 1998; Molau, 1995; Riches and Parker,
1993; Keyes et al., 2001).

Pagubele provocate de aceti patogeni variaz ntre 5 i 95% ( Mesa-Garca &

Garca-Torres, 1986; Bayaa et al., 2000; Sauerborn, 1991).

Spectrul gazdelor lupoaiei este larg. Speciile Orobanche paraziteaz doar plantele
dicotiledonate, din familiile Solanacae (tomatul, tutunul, cartoful, ptlgeaua vnt), Fabaceae
(bobul, mazrea, lintea, lucern, trifoi), Cucurbitaceae (castravetele, pepenele galben, pepenele
verde,bostanul i dovleacul), Compositae (lptuca, floarea-soarelui), Cruciferae (varza, mutarul,
rapia) i Umbelliferae (morcovul, elina, pstrnacul), ns, principala plant-gazd a lupoaiei
rmne a fi floarea-soarelui (Parker and Riches, 1993).
Orobanche sunt nite plante lipsite de clorofil i n totalitate depind de metabolismul
carbonului i azotului, regimul de ap a gazdei (Joel et al., 2006). Unele specii sunt ngust specializate
n spectrul de gazde, aa ca O. cumana ce paraziteaz floarea-soarelui i O. creanata ce paraziteaz
doar legumele pe cnd altele, ca de exemplu O. aegyptiaca i O. ramosa posed un spectru variat de
gazde (Parker & Riches, 1993; Press & Graves, 1995).
Actualmente, reprezentanii genului Orobanche se ntlnesc n 58 de ri, n special cele din
Europa de Est, n rile bazinului Mrii Mediteraneene, n Orientul Mijlociu, n Africa de Nord i de
Est, n Asia de Vest i Sud (Joel et al ., 2006; Shindrova et al., 1998; Parker and Ritches, 1993; Alonso et.al.,
1996).

n Orientul Mijlociu i Asia, O. aegyptiaca (rasa Egiptean) atac fasolele, cruciferele,

solanaceele, asteraceile etc. (Parker & Riches, 1993). O. foetida rspndit n zona Mediteranian
paraziteaz un spectru larg de plante erbacee din genurile Anthyllis, Astragalus, Ebenus, Lotus,
Medicago, Ononis, Scorpiurus i Trifolium (Pujadas-Salv, 1999; 2002). n Tunis, acest parazit
provoac pagube de 66-83% (Kharrat et al., 1992; Kharrat, 1999), atacnd Lathyrus odoratus, L. sativus,
Trifolium alexandrinum, Medicago truncatula and V. sativa ssp. amphicarpa (Kharrat, 2002). Alte
specii de Orobanche, precum O. minor provoac pagube mai mici, atacnd
doar leguminoasele cultivate n Oregon, SUA (Osterbauer & Rehms, 2002; Eizenberg
et al., 2004b)

n bazinul Mrii Mediteraniene i Asia de Vest cca. 16 mln. ha, care reprezint aproximativ
1,2 % din suprafaa total de pmnt arabil din lume, sunt atacate de speciile genului Orobanche
(Sauerborn et al., 2002). Dup Garcia-Torres et al. (1994), speciile de Orobanche au infectat
aproximativ 100 mii ha i 350 mii ha n regiunile centrale i de sud ale Spaniei, respectiv.

10

n afar de Spania, lupoaia a provocat importante pagube i n alte regiuni. Astfel, n fosta
Iugoslavia, n urma atacurilor semnturilor de floarea-soarelui de ctre O. cumana, suprafaa
cultivat de floarea-soarelui s-a redus cu 37% (Sauerborn et al., 2002).
Reducerea recoltei cauzat de Orobanche depinde de severitatea infectrii semnturilor cu
aceti fitopatogeni i poate varia de la 5 % pn la 100%, unde Orobanche cumana Wallr., O.
ramosa L., O. aegyptiaca L. i O. crenata Forssk. cauzeaz nsemnate pagube n fitotehnie (Linke et
al.,1989; Bulbul et al.1991; Barker et al., 1996; Dominques et.al., 1996; Blamey et al., 1997; Hibberd et al., 1999).

Cel mai mare interes prezint ns O. cumana care produce semnificative daune. Una dintre
primele descrieri a O. cumana ca specie a fost efectuat de Wallroth (1825), colectat de la plantele
din zonele de deert a Asiei de sud-vest i n Europa sud-est. Iniial, O. cumana parazita exclusiv
Artemisia ssp. (Venko & Bozoukovv, 1994), ns dup introducerea culturii florii-soarelui n Europa,
lupoaia a fost depistat pentru prima data parazitnd aceast cultur n nord-estul Bulgariei, n anul
1935 (Encheneva & Shindrova, 1994). n Rusia, lupoaia (Orobanche cumana Wallr.) a fost descris pentru
prima dat, la sfritul secolului XX. Din regiunile sudice ale Rusiei i Ucrainei, adiacente Marii
Negre, parazitul s-a extins, odat cu rspndirea culturii florii-soarelui i n celelalte ri riverane
Romnia i Turcia. n Romnia, Orobanche cumana Wallr. a fost semnalat pentru prima dat atacnd
culturile de floarea-soarelui n anii 1940-1941, de ctre Svulescu i colab. (Dumitra i esan (1988).
1.2.2. Biologia parazitului Orobanche cumana Wallr
Orobanche cumana Wallr. reprezint o plant anual, lipsit de clorofil, holoparazit ce se
reproduce prin semine. Tulpinile sunt robuste, nalte de 40-65 cm i groase de 5-8 mm, la baz
puin ngroate, sub forma unui bulb, neramificate, de culoare glbuie, glanduloase, striate,
acoperite cu frunze transformate n scuame. Acestea din urm se dezvolt la suprafaa solului n
jurul plantelor parazite, solitare sau n mnunchi (fig.1.). Inflorescena este un spic sau racem
alungit, cilindric de 15-30 x 2,5-3 cm, uneori dens la vrf, cu flori erecte-patente, cu cte o bractee
egal cu floare. Caliciul de 7-9 mm este prevzut cu dou lacinii bidinate sau ntregi, glbui sau
albastre. Corola de 19-22 mm lungime, este ngustat la mijloc, la baz puin umflat, spre vrf
recurbat, liliachie, scurt-glandulos-proas sau glabrescent. Staminele de 6-10 mm lungime, 4 la
numr, sunt fixate puin mai jos de mijlocul tubului corolei, cu filamente glabre i antere obovate,
glabre sau puin proase la baz. Anterele sunt albe, de 1,4-1,6 mm lungime. Ovarul este ovoidal,
iar stilul recurbat. Florile de lupoaie sunt protogine, adic gineceul se matureaz naintea
androceului astfel nct autopolenizarea este exclus, aceasta fcndu-se numai cu ajutorul
insectelor. Fructul reprezint o capsul de 8-10 mm lungime i conine cte 1500-2000 semine
mici (masa a 1000 semine fiind 0,001 g), cu dimensiuni de 0,35-0,45 mm, elipsoidale, cenuii
nchise, cu suprafaa reticulat. O singur plant de lupoaie produce pn la 60-80 mii semine.
11

Seminele rmase n sol i pstreaz facultatea germinativ timp de 5-8 ani (Buia, 1961; Iliescu,
1974; Dumitra i Sean, 1988, Kukin, 1982, Pujadas-Silva A.J. 2000).

Fig. 1. Lupoaia (Orobanche cumana Wallr) (Nickrent and Musselman, 2004)


1.2.3. Ciclul de via i etapele parazitismului la speciile de Orobanche
Ciclul de via a Orobanche este specializat la parazitism i necesit o interaciune strns cu
planta gazd. Specificul interaciunii i relaia dintre planta-parazit i planta-gazd este determinat
de schimbul i recunoaterea semnalelor moleculare de ctre parteneri(Boone et al., 1995).
Ontogeneza O. cumana poate fi divizat n dou etape bine separate att n timp ct i n
spaiu: subteran i aerian (; Rispail et al., 2007, Echevarria-Zomeno., 2006). Faza subteran a dezvoltrii
parazitului se caracterizeaz prin cteva stadii principale de interaciune cu planta-gazd:
germinarea, inducerea haustoriei, penetrarea gazdei i maturizarea parazitului (Estabrook and Yoder,
1998 Echevarria-Zomeno., 2006).

n endospermul seminelor de lupoaie exist un centru celular care particip la iniierea


germinrii i la reglarea procesului de cretere a germenului. ( Teryokhin, 1992). Pentru germinare,
seminele de lupoaie necesit un semnal al prezenei gazdei, reprezentat de compui chimici, numii
factori de germinare, care sunt secretai de ctre rdcinile plantei atacate ( Boone., 1995; Easterbrook
and Yoder, 1998; Bouwmeester, 2003).

rdcinile

plantelor-gazd

Cea mai comun clas de substane produse de


care

stimuleaz

germinarea

seminelor

de

Orobanche i alte specii de plante parazite, sunt strigolactonele (Wigchert and


Zwanenburg, 1999).

Primul factor de germinare SXSg, a fost izolat de la genul Striga i reprezint o

dihidrochinon, rapid autooxidat ntr-o chinon activ, numit sorgoleone (Fate and Lynn, 1996).
De asemenea, germinarea seminelor de lupoaie este favorizat de terenurile srace, uoare i
uscate, cu pH-ul neutru sau slab acid i umiditate nefavorabil. n terenurile cu stratul fertil
adnc i umed, parazitul se dezvolt, dar plantele parazitate, fiind mai viguroase, sufer
mai puin (Georgieva i Bozoukov, 1995). Maric i Masierevic (1988) consider ca secreiile rdcinilor
12

de floarea-soarelui conin unii acizi care contribuie la schimbarea reaciei pH-lui solului, (pH sub
6,5) favoriznd astfel dezvoltarea parazitului Orabanche cumana.
ns, pe lng stimulatori, exist i factori biologici i chimici care contribuie la inhibarea
germinrii seminelor de lupoaie. Astfel, Al-Menoufi i col. (1996) au constat c extractele de
radicel de schinduf (Trigonella phoenum graecum), lupin (Lupinus termis), coriandru
(Coriandrum sativum) i rapi slbatic (Brassica rapa) reduc semnificativ efectul stimulatorului
sintetic GR24 (Al-Menoufi i col. 1996). Peroxidul de hidrogen, hipocloritul de sodiu i sulful
muiabil, de asemenea diminueaz germinaia seminelor de Orobanche spp (Al-Menoufi i colab. 1996).
Dup germinarea seminelor de lupoaie se formeaz un filament subire, a crui
extremitate radicular, venind n contact cu rdcina plantei-gazd, se ngroa, lund forma
unui bulb cu suprafaa prevzut cu o serie de proeminene, care apoi ader la rdcin.
Acest organ ataat se numete apresorium (Musselman and Dickison, 1975; Stewart and Press, 1990).
Toate plantele parazite dezvolt haustorium organ multicelular, care invadeaz
esuturile plantei-gazd i reprezint o punte dintre parazit i plant (Kuijt, 1969; Musselman and
Dickison, 1975; Stewart and Press, 1990; Press and Graves, 1995; Riopel and Timko, 1995).

Astfel, la

urmtoarea etap, Orobanche dezvolt un haustorium (con de ptrundere)


care strbate, n punctul de contact cu rdcina gazdei, zona cortical pn la fasciculele
libero-lemnoase. Orobanche spp. sunt holoparazii care atac la nivel de rdcin,
conectndu-se la sistemul vascular al gazdei prin haustorii care le permit
obinerea apei, nutrienilor organici (Press & Graves, 1995; Hibberd et al., 1999 ),
hormonilor (Suzuki et al., 1994), toxinelor (Rank et al., 2004), precum i altor
componente necesare modului parazitar de trai, inclusiv a genelor ( Mower et al.,
2004).

Pentru dezvoltarea haustorului este necesar prezena altei clase de substane sintetizate de
ctre planta-gazd factori de inducere a haustoriei HIFs (de la haustorial inducing factor) (fig.2
nr.2). De menionat c majoritatea HIFs sunt de natur fenoli (MacQueen, 1984 ; Smith et al., 1996).
Primii derivai ai HIFs sunt xenognosin A (fig.3 nr.3) i xenognosin B (fig.3 nr.4), izolai din
extractele foliare ale Astragalus gummifer (Lynn et al., 1981). Ulterior, din rdcinile de sorg a fost
izolat un alt factor, factorul dimitilbenzochinon (DMBQ) (fig.3 nr.7) (Chang and Lynn, 1986).
n afar de compuii menionai mai sus, n procesul de formare a haustorilor particip
flavonoizi, -hidroxiacizi, kinone i citokinine (Lynn

i Chang, 1990)

(fig.2.). Primele trei grupe sunt

fenoli structural nrudii, derivai dintr-un component comun Phe (Smith

i al., 1996)

ce sugereaz c

aceste molecule induc haustoria printr-un mecanism redox comun (Smith i al., 1996).

13

Fig. 3. Semnale implicate n interaciunea plant-parazit


(Lynn and Chang, 1990; Easterbrook and Yoder, 1998 )
Componenii activi ce induc dezvoltarea haustorului. Inhibitorii reduc activitatea HIF a DMBQ.
1. SXSg; 2. resorcinol; 3. xenognosin A; 4. xenognosin B; 5. formononetin; 6. ferulic acid;
7. DMBQ; 8. tetrafluorbenzoquinone; 9 benzoquinone; 10. dihidroquinone; 11. CPBQ; 12. zeatin.

Timp de o or dup aplicarea HIF, la rdcinile parazite se ncepe expansiunea radial i


diviziunea celular care are loc n celulele corticale n apropierea vrfului rdcinii. Elongarea
celulelor se oprete dup ce radicelele ajung la esutul plantei-gazd, apoi de-a lungul esutului se
acumuleaz amidon cu secreii mucilaginoase. Stratul extern al radicelei se difereniaz apoi ntr-un
strat de celule papilate care reprezint un substrat adeziv pentru formarea unor coronie n jurul
celulelor apicale, ce rmn nepapilate, din care se formeaz partea central a conului de ptrundere
(Joel and Losner-Goshen, 1994). Ataarea parazitului la gazd este uurat prin producerea a unei
substane mucilaginoase de periorii haustoriei (Baird i Riopel, 1983), ce provoac degradarea
enzimatic a esuturilor sub aciunea substanelor ca : pectin-metilesterazele, poligalacturonazele i
endocelulazele (Shomer-Ilan, 1993; Ben-Hod., 1993, Losner-Goshen, 1998). Dup ataare, celulele conului
de ptrundere a haustorului cresc printre celulele epidermale i cortexul plantei-gazd. Apoi,
parazitul formeaz conexiuni cu sistemul vascular al gazdei prin haustoriu, care reprezint o punte
pentru consumul de ap i elemente nutritive. Parazitul capteaz resursele plantei-gazd prin
stabilirea unui potenial osmotic sczut n raport cu gazda, prin biosinteza unor astfel de alcooli
polihidrici cum ar fi manitolul (Harloff and Wegmann, 1993; Robert et al., 1999). Dup conexiunea cu
14

gazda, parazitul crete rapid i dezvolt rdcini care de asemenea sunt capabile s formeze noi
haustori (Keyes, 2001; Joel., 2006), care creeaz un deficit mare de ap i substane
nutritive pentru plant. n partea superioar a bulbului se dezvolt un mugure acoperit
de solzi, care apoi se alungete i strbate solul ieind la suprafa, formnd tulpina florifer a
parazitului pe care se vor forma capsule cu semine ( Pancenco, 1975; Pancenco i Antonova, 1978, Sukno
1999).

(Fig. 3.).

Fig. 3. Ciclul de via a speciilor de Orobanche (Rispail et al., 2007)

Din momentul ptrunderii filamentului parazitului, rezultat n urma germinrii seminelor, n


tegumentul rdcinii plantei-gazd, pn la apariia tulpinii florifere la suprafaa solului, decurg
circa dou luni, timp n care planta-gazd este epuizat, iar ca planta parazit s poat fi vzut
(Vrnceanu 1974, Pujadas-Silva A.J. 2000).
n condiii de cmp, plantele de lupoaie apar la suprafaa solului, de obicei dup nceputul
nfloritului plantei-gazd. n cazul unui atac puternic, o singur plant de floarea-soarelui poate fi
parazitat n acelai timp de 40-60 plante de lupoaie sau mai multe (Vrnceanu 1974, Peresipkin 1986).
nflorirea lupoaiei (anteza) are loc n lunile iunie-august (Pujadas-Silva A.J. 2000). n dependen
de condiiile climaterice, ciclului de via subteran a Orobanche cumana este de la 30 pn la 100
de zile. Ciclul total de via de la germinarea seminelor pn la producerea de semine este de 3-7
luni (Pujadas-Silva A.J. 2000).
1.2.4. Efectul parazitismului Orobanche asupra plantei-gazd
Planta parazit acioneaz asupra plantei-gazd din momentul stabilirii unui contact cu
aceasta. Efectele parazitismului Orobanche asupra gazdei pot fi foarte diferite, variind de la
15

cauzarea rnilor nesemnificative a esuturilor vegetale pn la moartea plantei. ns, n general,


efectele vizibile ale parazitului asupra gazdei sunt urmtoarele:

ofilirea plantei,

reducerea dimensiunii plantelor,

micorarea recoltei i

reducerea calitii produsului(Hurtado, 2004).

De regul, trei factori principali determin impactul parazitismului Orobanche asupra


plantei-gazd:
1) dimensiunea parazitului;
2) viteza de cretere i activitatea metabolic a parazitului;
3) stadiul de dezvoltare a plantei n momentul atacului (Hurtado, 2004).
Observaiile fiziologice asupra specificului relaiei dintre parazit-gazd demonstreaz c
parazitismul Orobanche produce diferite efecte asupra statutului de nutriie al plantei-gazd. Astfel,
n relaia O. ramosa tutun, epuizarea rezervelor de potasiu n planta-gazd este considerat un
factor responsabil pentru leziunea plantei (Ernst, 1986). Alte studii au demonstrat o reducere
considerabil a coninutului de potasiu i fosfor i o cretere a coninutului de calciu n plantele
atacate de Orobanche (Abou-Raya et al., 1973). n plantele de morcov (Daucus carota) atacate de O.
crenata, se atest o reducere de cca. 1/3 a coninutului total de zaharoz ( Schaffer et al., 1991). Stewart
i Press (1990) au presupus c parazitismul Orobanche are un impact negativ asupra capacitii
plantei de a absorbi apa din sol, fapt care duce la nchiderea stomatelor, respectiv, parazitismul
Orobanche are un impact indirect i asupra capacitii plantelor-gazd pentru a fotosinteza ( Stewart i
Press; 1990).

ns, n condiii de secet, plantele parazitate se ofilesc, deoarece lupoaia determin o

intensificare a transpiraiei i o diminuare a reaciilor de oxido-reducere ( Iliescu, 1974). Astfel,


schimbrile din statutul de nutriie cauzate de plantele parazite sunt considerate a fi responsabile de
o reducere, n mediu, cu 30 % a ratei de cretere a plantelor (Iliescu, 1974).
Concluzionnd, plantele de floarea-soarelui parazitate de lupoaie, stagneaz n dezvoltare,
rmn pipernicite, cu tulpini subiri i formeaz capitule mici, cu majoritatea seminelor seci. Dac
atacul se manifest timpuriu, plantele nu formeaz calatidii sau, dac i formeaz, acesta sunt mici,
degenerate. Cnd atacul se produce n stadiul de dezvoltare mai avansat, simptomele sunt slab
vizibile, gravitatea simptomelor este dependent de intensitatea atacului (Vranceanu, 1974).
1.2.5. Metode de control a lupoaiei

16

Floarea-soarelui reprezint una din principalele plante oleaginoase cultivate n Republica


Moldova, care este atacat de lupoaie, considerat unul dintre cei mai principali duntori ai
produciei de floarea-soarelui n regiunea Mediteranean i Europa de Est (Parker C.1994).
Un spectru larg de metode au fost testate pentru controlul plantelor din genul Orobanche. ns,
controlul acestui parazit este destul de dificil, deoarece cteva mii semine produse de o singur
plant de lupoaie, pot fi uor dispersate de vnt, ap, sol, animale, oameni sau utilaje ( Skoric D. 1988,
Parker C. 1994).

O alternativ este utilizarea culturilor rezistente la lupoaie, astfel nct i n zilele

noastre continu cercetrile n vederea depistrii i introducerii genelor rezistente la acest patogen
n materialul de ameliorare (Parker C.1994)
Astfel, n dependen de ciclul de dezvoltare a parazitului se folosesc anumite metode de
combatere (tabelul 1).
Tabelul 1.
Metodele de control pe parcursul ciclului de viata a lupoaiei (Kebread, Murdoch, 2001)
Etapele ciclului de dezvoltare a lupoaiei
Dispersarea seminelor
Supravieuirea seminelor n sol
Germinarea seminelor
Creterea radicelelor spre rdcina gazdei
Penetrarea gazdei
Ataarea funcionala la gazd
Creterea subteran a tuberculilor

Producerea seminelor

Metodele corespunztoare de control


Carantin
Afumarea (Fumizarea)
Solarizare
Rotaia recoltei (gazda fals)
Stimulatori ai germinrii
Inhibitori ai germinrii
Fertilizarea cu azot
Rezistena recoltei
Rezistena recoltei
Erbicide: - glifost
- sulfoniluraza
Culturi capcane
Pulverizarea cu pictura
Plivire manual
Ardere
Control biologic

Carantina reprezint o msur de evitare a ptrunderii animalelor pe cmpurile infectate, unde


erbivorele domestice reprezentnd un agent de dispersare a seminelor de lupoaie. Timpul de
reinere a seminelor n tractul digestiv poate s varieze de la 15 ore pn la 120 ore, n dependen
de specia mamiferului (Jacobson i al., 1987). Utilizarea n cmp a ngrmintelor proaspete, care
conin semine viabile reprezint un alt mijloc de rspndire a Orobanche. De regul,
ngrmintele sunt transformate n granule sau pastile, prelucrarea termic a crora determin
degradarea unui procent mare de semine (Joel., 1988), dei unele semine ar putea supravieui, fiind
mai rezistente la ocul termic (zer, 1979).

17

Afumarea (fumizarea) const n eliminarea depozitelor de semine prin arderea resturilor de


plante i distrugerea seminelor de la suprafaa solului folosind substane chimice (metil bromid,
sodium metham, diazomet etc.). Preventiv, solul trebuie sa fie umectat timp de 10-14 zile pentru a
asigura imbibiia seminelor. Solul se acoper cu plastic fotodegradabil timp de 48 ore dup
rspndirea produsului chimic. Acest tip de aplicare distruge de la 50-100% de semine depozitate
(Parker & Riches, 1993; Goldwasser., 1994). ns, aceast metod este foarte costisitoare, iar substanele
chimice pot prezenta un pericol potenial pentru mediul nconjurtor (Goldwasser., 1994).
Solarizarea este o metod care se bazeaz pe acoperirea solului umed cu o pelicul de
polietilen n timpul sezonului cald al anului. Datorita acestei pelicule, are loc captarea razelor
solare i nclzirea solului pn la nivelul care este letal pentru buruienele i seminele acestora
(Stapleton J.J., Devay J.E., 1986). Temperatura de 48-57C (Jacobson., 1980) distruge seminele de
Orobanche aflate n stare de imbibiie n partea superioara a solului pn la 5 cm (Sprich., 1990).
Solarizarea este o tehnic de control, dar nu una de eradicare. Costul filmului este mare i
aceast tehnic poate fi utilizat n lunile calde ale anului (Foy et al., 1989; Jacobsohn et al., 1980).
Solarizarea ar putea fi mai efectiv dac se va combina cu adugarea compuilor de azot. S-a
observat c plantele ce paraziteaz pe rdcini se dezvolt mai abundent n soluri srace, nefertile.
Ataarea parazitului se petrece pe un fon sczut de substane nutritive, iar adugarea nitrailor sau a
altor compui azotai pentru fertilizarea solului inhib dezvoltarea parazitului (Jain & Foy, 1992).
Acelai efect a fost observat n cmp, dup aplicarea compuilor amoniacali (Van Hezewilik i colab.,
1991).

ns, principalul mijloc de lupt mpotriva buruienilor din cultura florii-soarelui l constituie
metodele agrotehnice. Una din aceste metode este rotaia culturilor agricole. n cazul floriisoarelui, datorit sensibilitii sale pronunate la boli, monocultura este practic exclus (Sin i colab.,
1986).

Crearea hibrizilor de floarea-soarelui rezisteni la complexul de rase de lupoaie i la

principalii patogeni, Plasmopora halstedii, Diaporthe helianthi, i Phomopsis precum i tehnica


modern de care dispune astzi agricultura privind combaterea chimic a buruienilor, bolilor i
duntorilor i folosirea ngrmintelor i a irigaiei, au permis s se renune la rotaia de 8-10 ani
(Vrnceanu 2000), considerat obligatorie n trecut (Semihnenko i cb., 1960). Vrnceanu (1974) i Sin i
colab., (1976) au artat c introducerea n producie a hibrizilor rezisteni la man i la lupoaie nu
va justifica renunarea la rotaia florii-soarelui de cel puin 4 ani, avnd n vederea posibilitatea
apariiei unei rase noi de man sau lupoaie, sau ali parazii (Vrnceanu, 1974 i Sin i colab., 1976).
Stimularea germinaiei seminelor de Orobanche poate fi realizat i de alte culturi culturi
capcane. O astfel de cultur a servit Brassica campestis care a redus rezervele de semine de O.
aegyptica aproximativ cu 30% (Acharya i cb. 2002). Folosirea Trifolium alexandrium ca o cultur

18

capcan a redus apariia O. crenata n cultura de fasole cu 92% peste 3 ani i cu 98% peste 4 ani
respectiv (Al-Menoufi, 1991).
Aplicarea erbicidelor (glifosat, imazetapir, acetoclor) reprezint o metod chimic de
combatere a Orobanche (Foy et al., 1989). Controlul chimic selectiv al lupoaiei prin aplicarea
erbicidelor este efectiv doar n cazuri limitate, atunci cnd semnturile sunt suficient de tolerante la
aciunea compuii chimici ai erbicidelor (Garcia-Torres et al., 1988; Foy et al., 1989). Majoritatea
erbicidelor, folosite pentru combaterea lupoaiei, nu posed o selectivitate i exercit o aciune
negativ asupra plantelor de cultur (Foy et al., 1989). n unele situaii, erbicidele n proporii mici ar
permite controlul de lupoaie, dar ar exista un risc al dezvoltrii rezistenei la unele erbicide care au
fost aplicate anterior. Crearea unor soiuri i hibrizi de plante de cultur rezistente la erbicide din
clasa glifosate, clorsurfuron i imidazoline, ar crea oportuniti excelente pentru controlul speciilor
de Orobanche (Joel et al., 1995 ; Gressel et al., 1996).
Utilizarea erbicidelor se efectueaz nainte de semnat, preemergent (Garcia-Torres 1988, 1992,
1995a),

sau la diferite etape de dezvoltare a plantei gazde postemergent (Lolas 1986, Americanos, 1991,

Tingrui 1996),

iar n unele cazuri pentru combaterea lupoaie se trateaz i seminele de floarea-

soarelui (Garcia-Torres 1995 b, 1996).


Dar pn n prezent, nici unul din aceste procedee agrotehnice nu sunt justificate economic i
sunt foarte laborioase. Combaterea biologic reprezint o metoda mult mai efectiva de control a
Orobanche cu utilizarea micoerbicidelor sau insectelor care n acelai timp este i o metod
ecologic (Sauerborn, 1998).
Un exemplu de micoerbicid este ciuperca Ulocladium atrum care a fost folosit experimental
pentru controlul O. crenata la fasole n Siria (Linke i colab., 1992). Un interes prezint genul Fuzarium
(F. lateritum, F. arthrosporiodes i F. oxysporum), care tot mai larg se ntrebuineaz n combaterea
lupoaiei (Bozukov & Kouzmanova, 1994, Bedi, 1994; Thomas, 1998Cohen., 2002, Jupp, 2001, D. Muller-Stover,
2004).

Phytomyza orobanchia este o insect, ale crei larve paraziteaz pe tulpini i pe capsule de O.
ramosa i alte specii din genul Orobanche, reducnd astfel producia de semine, mai ales ca ciclul
de dezvoltare a acestei diptere este foarte scut i pe parcursul dezvoltrii lupoaiei se dezvolt trei
generaii. (Norambuena i cb., 2001).n Siria, tratarea semnturilor cu Phytomyza orobanchia a redus
producerea seminelor de lupoaie cu 30%. ns, eficiena aplicrii Phytomyza orobanchia depinde
de factorii climaterici i de absena n mediu a rpitorilor naturali ai insectei (Sauerborn, 1998).
Pentru un control i mai efectiv, unii cercettori propun aplicarea mijloacelor biologice n
combinaie cu mijloacele chimice. Un astfel de studiu a fost efectuat de D. Muller-Stover i colab.
(2005), care au aplicat Fusarium oxysporum n combinaie cu esterul S-metilic al acidului benzol
(1,2,3) tiadiazol-7-carbotionic (BTH).
19

Dat fiind faptul c O. cumana paraziteaz pe un spectru larg de plante de cultur i produce
un numr mare de semine mici cu o facultate germinativ foarte bun i care se rspndesc n
spaiu foarte uor, combaterea parazitului prin folosirea asolamentelor sau msurilor de carantin
este foarte dificil (Ish-Shalom-Gordon et al., 1993; Parker and Riches, 1993; Ruso et al., 1996; Sukno et al., 1999;
Roman et al., 2001).

Metodele de combatere a lupoaiei utilizate la momentul actual nu permit eradicarea totala a


parazitului, plus la aceasta unele dintre ele sunt duntoare mediului nconjurtor. O alternativ este
utilizarea culturilor rezistente la lupoaie, reprezentnd o metod efectiv, economic i o soluie
ecologic (Sackston, 1992; Ruso et al., Parker C. 19941996; Sukno et al., 1999; Lu et al., 2000; Echevarra-Zomeno
et.al., 2006).

1.3. Tipurile de rezisten i mecanismele reaciei de rspuns


a plantelor fa de agentul patogen
Dei plantele nu posed beneficiile unui sistem de anticorpi circulator, caracteristic regnul
animal, acestea n cursul evoluiei i-au creat un sistem de aprare de o eficacitate nalt, capabil s
reziste la atacul potenialilor invadatori (Mysore and Ryu 2004; Chisholm et al. 2006; Jones and Dangl 2006 ).
Aceast rezistena reprezint un proces complex multifactorial, ce depinde de o serie de factori,
precum:
a) specia, varietatea i populaia din care face parte planta-gazd;
b) specia i rasa sau populaia parazitului;
c) factorii de mediu abiotici sau biotici (Cubero et al., 1994).
Strategia potenial de aprare a plantei-gazd contra plantelor parazite include mecanisme
care blocheaz stadiile de dezvoltate ale parazitului precum: germinarea, formarea apresoriumului i
ataamentul; inducia haustorului, penetrarea esuturilor vegetale de ctre parazit i conectarea
acestuia la sistemul vascular, dezvoltarea, rsrirea, creterea i nflorirea ( Jorrin, 1999 ; Serghini, 2001).
La plantele rezistente aceste mecanisme funcioneaz la stadiile timpurii de dezvoltare ale
antofitelor (Lane, 1997; Goldwasser, 1999). Dei bazele moleculare ale rezistenei plantelor la antofite
nc rmn a fi elucidate, totui n literatura de specialitate au fost descrise cteva mecanisme,
grupate n dou categorii mari pre-haustoriale i post-haustoriale (Lozano-Baena, 2007).
n ultimul timp, se acord o atenie mare studierii aspectelor citologice ale rezistenei
plantelor la antofite (Dorr 1994; Antonova and Ter Borg, 1996 ; Gowda., 1999; Goldwasser., 2000 ; Labrousse.,
2001; Zehhar., 2003; Perez-de-Luque., 2005b, 2006a, 2006b).

Au fost studiate barierele fizice (lignificarea

esuturilor) care mpiedic penetrarea rdcinilor de nut, bob, mazre, mzriche, rapia, morcov,
floarea-soarelui de ctre speciile Orobanche O. crenata, O. aegyptiaca, O. cumana, O.ramosa.
20

Mecanismele defensive pre-haustoriale depistate n cortex (Echevarra-Zomeno., 2006 ; Perez-de-Luque.,


2006a, 2007b)

sau n endodermis (Perez-de-Luque, 2005b, 2005c, 2006a, 2007b) previn ptrunderea

haustorului n cilindrul central. Dac totui haustorul ptrunde n cilindrul central, se declaneaz un
mecanism defensiv post-haustorial cum ar fi acumularea unui strat de clei vegetal (mucilage) (Perezde-Luque et al., 2005a, 2006b).

Un mecanism defensiv post-haustorial al plantelor la atacul plantelor-parazite este


producerea i acumularea de fitoalexine (Goldwasser , 1999; Serghini, 2001; Perez-de-Luque., 2005a;
Echevarra-Zomeno., 2006 ; Lozano-Baena., 2007).

Secretarea de fitoalexine la floarea-soarelui precede

inducia haustorului, are loc n perioada de formare a apresoriumului pe rdcini i se ncheie dup
distrugerea acestuia.
S-a stabilit c att la atacul de microorganisme patogene, ct i la cel al Orobanche, la plante
se declaneaz n mare parte mecanisme similare de aprare (Joel and Portnoy, 1998; Westwood et al.,
1998; Goldwasser et al., 1999)

aa ca: sinteza i secretarea de ctre planta-gazd a inhibitorilor de

germinare i dezvoltare a antofitelor (Serghini., 2001); creterea coninutului de fitoalexine (compui


fenolici) n rdcinile plantelor-gazd (Wegmann, 1991; Lane , 1997; Westwood, 1998; Serghinit, 2001;
Eizenberg., 2001; Lozano-Baena, 2007);

necotizarea celulelor n jurul locului de ptrundere a haustorului,

fapt care previne dezvoltarea ulterioar a acestuia ( Dorr., 1994; Lane,1997; Goldwasser, 1997; Goldwasser.,
1999);

depozitarea carbohidrailor i fenolilor pe peretele celular, lignificarea vaselor xilemei sau a

endodermisului, formarea unui strat ncapsulat pe parenchima cortical ( Drr, 1994; Antonova, 1994 ;
Ish-Shalom Gordon, 1994 ; Goldwasser, 1999 ; Labrousse., 2001; Perez-de-Luque, 2005c, 2006b);

inducia de

proteine PR- (Hammond-Kosack and Jones, 1996; Joel and Portnoy, 1998; Castillejo, 2004); creterea activitii
unor enzime specifice, ca de exemplu a peroxidazei (Goldwasser, 1999; Prez-de-Luque., 2005a);
depozitarea calusului i producerea de forme active de oxigen (Perez-de-Luque et al., 2006a).
Reacia plantei-gazd la atacul agenilor patogeni se clasific dup cteva criterii. Unul din
aceste criterii, frecvent menionat n literatura de specialitate este criteriul funcional, conform
cruia rezistena poate fi nespecific i specific (Day, 1974).
1.3.1. Rezistena nespecific i indus
Rezistena nespecific (nonhost resistance) mai este numit general sau constitutiv i se
manifest n mod egal fa de toate rasele sau biotipurile agentului patogen. Acest tip de rezisten
este cea mai comun, general, durabil i stabil form de rezisten (Heath 2000; Thordal-Christensen
2003; Jones and Takemoto 2004)

i se clasific n dou tipuri:

tipul I, fr simptome vizibile i

21

tipul II, asociat cu reacia hipersensibil, ca rezultat a aciunii moleculelor asociate cu


patogenul PAMP (pathogen-associated molecular pattern) (Mysore and Ryu 2004).

Rezistena nespecific cuprinde o varietate de mecanisme, unele dintre care sunt preformate,
iar altele sunt induse (Dangl and Jones 2001; Thordal-Christensen 2003; Jones and Takemoto 2004; Mysore and
Ryu 2004; Chisholm et al. 2006).

Mecanismele de aprare preformate sunt determinate att de barierele mecanice asigurate de


epiderm, cuticul, deschiderile naturale, peretele celular i citoscheletul, ct i de compui
antimicrobieni existeni deja n plant (Heath 2000; Dixon 2001; Agrios 2005; Nrnberger and Lipka 2005;
Halkier and Gershenzon 2006).

n calitate de compui antifungici/antimicrobieni servesc o varietate

mare de metabolii secundari cu masa molecular mica aa ca: saponinele, fenolii, acizi ciclici
hidroxaminici, glicozidele, izoflavonoidele (Dixon 2001; Mysore and Ryu 2004; Nrnberger 2004).
Metaboliii respectivi sunt prezeni n plantele sntoase n form activ ( Papadopoulou et al. 1999) sau
sub form de derivaii inactivi, care sufer transformri ca rspuns imediat la atacul patogenului
(Halkier and Gershenson 2006). Odat ce agentul patogen sau elicitorii acestuia au ptruns n apoplastul
celulelor, planta-gazd iniiaz un rspuns imediat de aprare mediat de PAMP ca mecanism de
baza a rezistenii (Mysore and Ryu 2004; Nrnberger et al. 2004;Nrnberger and Lipka 2005; Zipfel and Felix 2005;
Melotto et al. 2006).

Mecanismele de aprare indus (rezistena indus) se manifest att la nivel structural, prin
formarea unor structuri histologice ca: suberul, tilozele, ligninele i gomele, ct i la nivelul
biochimic prin: schimbarea pH-ului sucului celular (n mediu acid), modificarea presiunii osmotice,
chimiotropismului, sinteza alcaloizilor, heteroauxinelor, fitoncidelor, fenolilor etc. Mecanismele
rezistenei induse a plantelor au rol de a recunoate, neutraliza, imobiliza sau degrada agentul
fitopatogen (Prvu 1988)
1.3.2. Rezistena specific gazdei.
Rezistena specific a gazdei este rezistena genotipurilor, limitat la o specie particular de
patogeni, strns asociat cu recunoaterea dup mecanismul gen pentru gen i nsoit de
reacia de hipersensibilitate (Dangl and Jones 2001; Martin et al. 2003; Nimchuk et al. 2003; Alfano and Collmer
2004;Mysore and Ryu 2004).

Rezistena specific la rndul su poate fi de tip local i rezistena

sistemic dobndit (Ryals et al. 1996).


Rezistena local
Rezistena local se asociaz cu un ir de procedee fiziologice i biochimice aa ca: stresul
oxidativ, inducerea fluxului de ioni de H+, K+, Ca2+, Cl- prin membrana plasmatic, fosforilarea i
defosforilarea proteinelor, biosinteza proteinelor implicate n producerea moleculelor de
22

semnalizare aa ca acidul salicilic, acidul jasmonic, etilena, la fel i acumularea de proteine PR- i a
unor metabolii secundari de aprare (Dixon. 1994;Glazebrook and Ausubel 1994; Dangl, 1996; HammondKosack and Jones 1997; Jab. 1997; Ligterinkl. 1997; Heo. 1999; Asai. 2002; Cheng. 2002).

Stresul oxidativ i rspunsul imun hipersensibil


Stabilirea unui echilibru de via dintre patogen i planta-gazd nu este chiar att de
simpl, ntruct planta n procesul de evoluie i-a format capacitatea de a recunoate
patogenul i de a rspunde la prezena acestuia prin stres oxidativ (Levine et al., 1994 ; ,
, 2001; Duca et al., 2007 )

sau prin iniierea unui rspuns imun hipersensibil (HR,

hypersensitive response).
Stresul oxidativ este rezultatul formrii n esuturile atacate de ctre patogen a formelor
active de oxigen (FAO) sau specii reactive ale oxigenului (SRO) aa ca: H2O2, radicali OH- i O2-.
n condiii normale, SRO sunt rapid eliminate de sistemul enzimatic a celulelor ce permite
astfel meninerea unei homeostaziei-redox normale (Apel and Hirt 2004). ns, la dereglarea acestei
homeostazii, producerea de SRO se accelereaz (Lamb and Dixon 1997; Apel and Hirt 2004). n celulele
vegetale, FAO se formeaz i pe ci metabolice alternative, astfel producerea H2O2 n apoplast poate
fi mediat de peroxidazele peretelui celular, oxalat oxidazele sau aminooxidazele (Apel and Hirt 2004;
Mittler et al. 2004).

Formele active ale oxigenului sunt att nite compui toxici capabili s localizeze infecia
prin moartea celulelor infectate, ct i nite transductori de semnale. Astfel, superoxid-anionul (O2-)
i H2O2 activeaz transcripia i respectiv expresia genelor de rezisten ( Levine et al., 1994; Tenhaken et
al., 1995).

SRO stimuleaz producerea acidului ascorbic, -tocoferolului i a carotenoizilor ( Gille and

Siegler, 1995),

activeaz genele care codific enzime antioxidante protectoare glutation-S-

transferaza i glutation peroxidaza (Levine et al., 1994; Tenhaken et al., 1995), superoxiddismutaza i
catalaza (Larson, 1995), particip la ntrirea peretelui celular prin inducerea sintezei de glicoproteine
bogate n hidroxiprolin, de celuloz i de lignin; n sinteza de proteine implicate n patogenez,
difuzia H2O2 n celulele vecine focarului de infecie activeaz producia de acid salicilic i
declaneaz rspunsul de aprare sistemic (Sharma 1996).
O alt reacie de rspuns la creterea concentraiei de SRO n esuturile plantei este sinteza
proteinelor de oc, care protejeaz sistemul enzimatic celular mpotriva proceselor oxidative
(Burdon, 1993; Orozco and Glijin, 2006).
Deci, rspunsul hipersensibil este o form de moarte celular programat, o consecin a
reprogramrii metabolismului n celulele nconjurate de infecie pentru a stopa rspndirea
patogenului (Lamb et al., 1989). Planta reacioneaz la anumii markeri organici ai celulei
23

microorganismului (acizi grai, fragmente de membrane celulare) sau la peptide specifice


caracteristice pentru anumite rase de patogeni. n ultimul, caz inducia reaciei HR este
controlat de gene specifice de avirulen i rezisten. Hipersensibilitatea nu este un mecanism
izolat, el fiind nsoit de o cascad de evenimente ca: variaia potenialului membranar; acidificarea
mediului intracelular, influx de Ca2+ i H+ (activate de ATP-aze) corelat cu un eflux de Na + i o
deschidere a canalelor pentru Cl- ; eliberarea de specii active de oxigen (anionii O2- ,OH- i H2O2) i
activarea secvenelor implicate n producerea lor (activare de kinaze, fosfataze, fosfolipaze) ( Dangl
J., 1994); se induce

activarea proteinelor G (Low P. 1995) i a peroxidazelor (Nrnberger T., 1994).


Rezistena sistemic dobndit

Rezistena sistemic dobndit (SAR - systemic acquired resistance) sau imunitatea


dobndit reprezint o reacie de aprare a plantelor, care determin o rezisten la infeciile repetate
ale unui spectru larg de patogeni (Uknes et a., 1992; ., 2000). Ptrunderea patogenului n
esutul plantei reprezint un semnal pentru apariia unei reacii de tip SAR. Condiia esenial a
apariiei reaciei - SAR este formarea necrozelor n rezultatul atacului patogenului. Reacia SAR
este asemntoare cu rspunsul hipersensibil, ns viteza desfurrii reaciei - SAR i spectrul
patogenilor la care planta devine rezistent este mai mare (Uknes et a., 1992).
Acest tip de rezisten se manifest prin sporirea rezistenei plantei la infectarea repetat cu
patogeni micotici, bacterieni, virali i insecte-fitofage. Durata SAR dup infectarea primar
constituie de la cteva sptmni pn la cteva luni ( ., 2000).
Imunitatea sistemic dobndit a plantelor este determinat de expresia unui ir de gene
specifice, denumite SAR- gene. Expresia genelor specifice SAR ca rspuns la infecia cu ciuperci,
bacterii i virusuri a fost identificat la diferite specii dicotiledonate, ns gradul de expresie, ct i
homologia dintre genele corespunztoare la diferite specii de plante este diferit. De exemplu, la
castravete, gena care codific PR-1 se expreseaz slab, n timp ce la tutun i arabidopsis aceast
protein SAR- specific este principal. Acest lucru i-a i permis cercettorilor s delimiteze
reacia-SAR din ntregul arsenal al reaciilor chimice de aprare a plantelor (Ryals et al., 1996).
Cercetrile reaciei -SAR se realizeaz pe dou modele vegetale tutun (Nicotiana
tabacum) i arabidopsis (Arabidopsis thaliana). Analiza proteinelor implicate n reacia - SAR arat
c multe dintre ele fac parte din grupul de proteine PR- ( Ryals et al., 1996), caracteristice pentru
rspunsul hipersensibil. La tutun, de exemplu, n grupul proteinelor SAR intr urmtoarele proteine
PR-: PR-1, (PR-1a, PR-1b, PR-1c), -1,3-glucanaze, (PR-2a, PR-2b, PR-2c, PR-Q), chitinazele din
clasa II i III (PR-3a i PR-3b), tevein-proteinele (PR-4a i PR-4b), tomatin-proteinele (PR-5a, PR-

24

5b) (Hammond-Kosack KE, Jones J.,1996). La Arabidopsis, proteinele SAR- sunt: PR-1, PR-2 i PR-5
(Ryals et al., 1996).

Inductorii reaciei - SAR


n prezent, reaciei SAR i se atribuie un set de cai de transducere a semnalelor, care se
declaneaz la aciunea patogenului i sunt realizate de molecule de semnalizare (inductori) aa ca
acidul salicilic (AS), acidul jasmonic (AJ), etilena (ET), H2O2, NO i acid adscizic (Apel and Hirt
2004; Gfeller and Farmer 2004; Durrant and Dong 2004; Mittleret al. 2004; Dolledonne 2005; Lorenzo and Solano
2005; Torres and Dangl 2005; van Loon et al. 2006).

Acidul salicilic (AS) joac un rol principal n inducia imunitii sistemice (Durner et al., 1997).
AS reprezint un inductor chimic al rezistenei plantelor la bolile provocate de ctre ciuperci,
bacterii, virusuri i al sintezei proteinelor PR- la multe specii de plante (Reymond and Farmer, 1998;
Sudha and Ravishankar, 2002; Kusumoto, 2007).

Tratarea exogen a plantelor cu AS sau cu analogii

acestuia activeaz genele HR i SAR. Astfel, plantele transgenice de tutun cu gena nahG, al crei
produs este responsabil pentru transformarea AS n catehol inactiv sunt lipsite de capacitatea de
imunizare (Ryals, 1996 ; , 2000; Hurtado, 2004). n contrast, plantele de tutun transgenic cu genele
bacteriene ICS (isochorismate synthase) i PIL (piruvat-liazele) la care se sintetizeaz n cantiti
mari AS manifest o rezisten nalt la diferii patogeni ( Verberne et al., 2000). Aplicarea exogen a
analogilor sintetici AS ca BTH (S-metil benzo[1,2,3] tiadiazol-7 - carbothioic) de asemenea induc
reacia-SAR (Friedrich, 1996).
Infectarea plantei de ctre un patogen incompatibil induce acumularea de AS att n
esuturile infectate, ct i n cele neinfectate. AS provoac sinteza local a diferitelor substane
antimicrobiene (fitoalexine, fenoli, proteine PR-) i stimuleaz ntrirea pereilor celulari. Surplusul
de AS este transformat ntr-un conjugat neactiv al AS cu glucoz, care la infectarea repetat a
plantei se hidrolizeaz pn la AS liber. Creterea coninutului de AS activeaz genele specifice
SAR i determin dezvoltarea imunitii sistemice ( ., 2000)
Acidul jasmonic (AJ) reprezint un inductor suplimentar al reaciei -SAR, induce rezistena
mpotriva insectelor (McCorn., 1997) i patogenilor (Thomma., 1998; Wang., 2002; Lorenzo, 2003; Dong,
1998).

AJ i derivaii acestuia induc sinteza sisteminei i a inhibitorilor proteazelor serinice.

Controlul nemijlocit al expresiei genelor inhibitoare de proteaze este realizat de ctre peptidul
sistemina, iar expresia genei sisteminei se afl sub controlul acidului jasmonic ( Farmer and Ryan,
1990).

25

Jasmonaii sunt compui volatili, capabili s declaneze reacii de aprare att n esuturile
vecine ale plantei infectate, ct i n plantele vecine intacte. Astfel, acidul jasmonic este capabil s
asigure un contact dintre indivizii din cadrul unei populaii. Jasmonaii fiind responsabili pentru
gradul de rezisten a plantelor la fitofagi nu reprezint unicele molecule semnal al reaciei -SAR
ntruct nu exercit o influen asupra expresiei unui ir de HR i SAR gene. Ambii inductori AS
i jasmonaii regleaz procese metabolice distincte i funcioneaz n plante paralel (Reymond and
Farmer, 1998; Thomma et al., 1998).

Etilena (ET) de asemenea este implicat n rspunsul imun, dei rolul acesteia variaz n
funcie de tipul patogenului i specia de plant ( Wang., 2002). n general, ET se consider a fi
implicat n perceperea atacului unui patogen i inducerea expresiei genelor asociate cu aprarea
(Dong 1998; Wang. 2002) i fiind caracteristic doar pentru anumite interaciuni gazd-parazit (van Loon,
2006). n

plus, unii patogeni sunt capabili sa produc ET ca un factor virulent, ce sporete

capacitatea parazitului de a coloniza esuturile gazdei (Chagu, 2006). Interaciunea dintre AJ i ET a


fost demonstrat n cursul mecanismelor de aprare a plantei la atacul patogenilor ( Penninckx., 1998).
Unul din produsele finale ale cii de transducere AJ/ET n cursul atacului de patogeni este un
polipeptid cu mas molecular mic, cu proprieti antifungice i un coninut nalt de cistein
(Penninckx et al., 1996).
1.3.3. Mecanisme fiziologo-biochimice de rezisten a florii-soarelui la lupoaie
La floarea-soarelui de asemenea au fost identificate unele din mecanismele de aprare care
blocheaz dezvoltarea lupoaiei la diferite stadii (Dorr , 1994; Jorrin., 1999; Serghini, 2001; Eizenberg, 2001;
Labrousse, 2001; Echevarra-Zomeno, 2006).

Sinteza, acumularea i secreia compuilor chimici este un

mecanism important de protecie a plantelor mpotriva microorganismelor, insectelor, buruienilor i


plantelor parazite (Rice, 1974 ; Murray, 1982 ; Wilson and Rice, 1968; Wegmann., 1991; Urdangarin., 1999 ).
Astfel, s-a stabilit c 7-hidroxil cumarinele (scopoletina i ayapina) florii-soarelui au un rol
defensiv mpotriva O. cumana prevenind germinarea i inducia haustorului. Cumarinele sunt
metabolii secundari polifuncionali (Jorrin and Prats, 1999), din grupul fitoalexinelor (Tal and Robeson,
1986),

ele pot aciona ca compui alelochimici atunci cnd mpiedic germinarea seminelor de

lupoaie sau ca fitoalexine atunci cnd stopeaz ptrunderea haustorului i conectarea acestuia de
sistemul vascular al plantei (Khadija Serghini i al., 2001).
Un rol important n procesul de consolidare a peretelui celular la atacul plantelor parazite l
au peroxidazele i proteinele PR- (Hammond-Kosack and Jones, 1996). Cercetrile efectuate de Antonova
i Ter Borg (1995) au demonstrat c la rasele mai virulente de O. cumana se atest un nivel sczut
de peroxidaz n celulele rdcinii parazitului (Antonova i Ter Borg (1995). Acesta posibil se explic
26

prin faptul c peroxidaza secretat de ctre planta-parazit poate fi folosit de floarea-soarelui


pentru polimerizarea compuilor fenolici n lignin i respectiv la lignificarea peretelui celular
(Mayer et al., 1997). Aadar, coninutul sczut de peroxidaza la rasele mai agresive de lupoaie
reprezint un factor care faciliteaz ptrunderea haustorului n esutul vegetal al plantei-gazd
(Goldwasser et al., 1999).

Alt mecanism de protecie care mpiedic ptrunderea haustorului n cortex i dezvoltarea


ulterioar a plantei parazite este rspunsul hipersensibil asociat de moartea programat a celulelor
infectate (Lamb et al., 1989). Acesta a fost studiat, la floarea-soarelui atacat de Orobanche cumana
(Drr et al., 1994),

precum i la mzrichea (Vicia athropurpurea) atacat de O. aegyptiaca (Goldwasser

et al., 1997)

Aadar, au fost studiate i analizate trei mecanisme principale de rezisten a florii-soarelui


la lupoaie (Fernandez-Martinez., 2008):
1) producerea deficient de ctre rdcinile plantei-gazd a stimulatorilor de germinare a seminelor
de Orobanche;
2) existena barierelor mecanice sau chimice care stopeaz ptrunderea haustorului n rdcina
plantei-gazd (lignificarea sau rspunsul imun hipersensibil);
3) acumularea de compui toxici (fenoli) care opresc creterea i dezvoltarea haustorului i
conectarea acestuia cu sistemul vascular al plantei-gazd.

1.4. Aspecte genetice ale rezistenei plantelor fa de agentul patogen


Unul din factorii primordiali care condiioneaz rezistena plantelor fa de agenii patogeni
este cel genetic. Plantele definite ca rezistente sunt cele a cror expresie genetic reduce sau previne
dezvoltarea agenilor patogeni. Din punct de vedere genetic, rezistena poate fi: oligogenic,
poligenic i citoplasmatic (Prvu 1988 ).
Rezistena oligogenic (vertical) este determinat de o singur gen sau de cteva gene
majore. Acest tip de rezisten asigur o protecie total i complet a plantelor mpotriva atacului
unei rase a agentului patogen (Van der Plank, 1963).
Rezistena poligenic (orizontal, nespecific) este general i se manifest n mod egal fa
de toate rasele agentului patogen. Aceast rezisten este determinat de un numr mare de gene
minore, care sunt nespecializate, au efect individual slab i acioneaz aditiv. Rezistena orizontal
nu asigur o protecie complet a plantelor fa de atacul agenilor patogeni, n schimb este durabil
i stabil. Acest tip de rezisten nu dispare ca urmare a schimbrilor ce apar n populaia agentului
patogen (Van der Plank, 1975).
Rezistena citoplasmatic este determinat de materialul genetic (citoplasmogene) care se
conine n citoplasma celulei (Pirvu 1988).
27

Echilibrul gazd-parazit se menine indiferent de schimbarea factorilor de mediu, deoarece


ambele organisme se adapteaz concomitent la noile condiii ecologice. De altfel, genele pentru
rezisten ale plantei gazd i cele pentru virulen ale patogenului evolueaz mpreun i formeaz
constelaii de gene bine conturate (Dangl and Jones, 2001).
Conceptul de rezisten mediat de genele de rezisten R- (de la R-resistance) a fost introdus
de ctre Flor n 1956 (Hurtado, 2004), n rezultatul studierii aspectelor genetice a interaciunii dintre
planta de in i ciuperca Uredinales. Conform ipotezei gen pentru gen plantele au capacitatea
de a produce proteine R-, care recunosc factori specifici ai patogenului (efectori) codificai de ctre
genele avr- patogenului (Lamb, 1989; Dangl and Jones, 2001), deci fiecrei gene pentru susceptibilitate
sau rezisten din planta gazd i corespunde o gen pentru virulen sau avirulen din parazit. n
mod obinuit, genele pentru rezisten ale plantei gazd sunt dominante (R) i acelea pentru
susceptibilitate sunt recesive (r). Genele responsabile de avirulena patogenului sunt dominante (A)
i cele care determin virulena (a) sunt recesive (Flor, 1956).
Conform ipotezei gen pentru gen, sunt posibile patru combinaii de gene n interaciunea
gazd-parazit. Combinaiile de gene R-a, r-A i r-a determin reacii compatibile, ntr-o singur
combinaie de gene R-A, rezult o reacie incompatibil n sistemul gazd-parazit i nu se produce
infecia (Prvu 1988 ).
1.4.1. Rezistena plantelor mediat de genele R- i reacia de hipersensibilitate
n interaciune gazd-parazit, rezistena plantelor cultivate se refer la modelul gen pentru
gen (Flor 1971; Staskawicz, 1995), rezistena fiind determinat de o singur gen R-, produsul creia
direct sau indirect interacioneaz cu elicitori specifici sintetizai de genele de avirulen a
patogenului (Flor 1971; Hammond-Kosack and Jones 1997; Nimchuk 2003). Rezistena condiionat de genele
R- este specific, unde majoritatea acestora recunosc una, mai rar dou, molecule specifice
codificate de genele avr- ale patogenului (Nimchuk et al., 2003).
Funciile tuturor genelor R- i aspectele genetice ale interaciunii R-avr nc nu sunt pe deplin
elucidate, ns se presupune c proteinele R- nu recunosc moleculele de virulen ale patogenului
direct, ci schimbrile care au loc n celulele plantei-gazd cauzate de patogen (produsele activitii
enzimatice ale avr-proteinelor). Aceast presupunere guard hypothesis dei nu are suficiente
probe, reprezint un gid n interpretarea rezultatelor experimentelor (Dangl and Jones, 2001).
Genele de rezisten prezint o structur foarte bine conservat n cadrul diverselor specii de
plante i sunt clasificate n trei clase, n funcie de structura domeniilor pe care le codeaz.
Majoritatea genelor de rezisten codific domenii bogate n leucin ( Gebhardt 1997, Hammond-Kosack
and Jones 1997).

28

Cercetrile genetice au demonstrat c familiile de gene R- reprezint o parte considerabil din


genomul plantelor (Nimchuk et al., 2003). Se estimeaz c genomul de Arabidopsis are cca. 125 de
gene de tip R-, iar la plantele de orez, cca. 600 de gene R-(Dangl and Jones, 2001).
Cea mai numeroas clas de gene R- codific proteinele NBS-LRR (nucleotide-binding site
plus a leucinerich repeat sequence), care sunt proteine de tipul receptorilor, caracterizate prin
prezena unui situs N-terminal de legare a nucleotidelor (NBS), secven care are rol de a lega ATP
i/sau GTP n diverse protein-kinaze i captul C-terminal, care este o secven structural specific
alctuit din 20-30 aminoacizi de leucin (LRR). Structurile de tipul LRR particip la interaciuni
de tip protein-protein (Kobe, Deisenhofer 1995, Jones 1996).
Un grup aparte a acestei clase sunt proteinele NBS-LRR- cu un domen distinct N-terminal
omolog cu domeniile Toll la drozofil i cu gena receptorului la mamifere interleucin (IL) -1 (TIR)
(Nimchuk et al. 2003).

Genele NBS-LRR sunt capabile s produc mai muli transcripi n cadrul

fenomenului de splicing alternativ i respectiv, s codifice diferite tipuri de proteine-NBS-LRR.


Varietatea de transcripi sintetizai de ctre genele TIR-NBS-LRR tipul N a fost identificat la tutun
n cadrul infectrii cu virusul mozaicului de tutun TMV (- tobacco mosaic virus) (Dinesh-Kumar,
Baker, 2000).

O alt clas de gene R- codific proteine extracitoplasmatice bogate n leucin LRR (a


leucinerich repeat sequence), structur ce are un rol important n interaciunile de tip enziminhibitor (Dixon 1994, Jones 1994). Ca exemplu pot servi gena Cf2 ce confer rezistena toatelor fa de
Cladosporium fulvum (Dixon 1994) i gena Xa21, de la orez, ce confer toleran la Xanthomonas
oryzae (Song 1995). Un alt grup, sunt genele RPS2 i RPM1 de la Arabidopsis, ce conin domenii de
tip leucin-zipper (Alber T., 1992).
Un rol n transmiterea informaiilor primite de plante are loc prin cascade de transducie
(fosforilare i desfosforilare), n care sunt implicate genele pto i fen. Familia de gene pto i fen
joac au Gena Pto confer rezisten tomatelor fa de Pseudomonas syringae (Martin 1993), iar gena
Fen confer sensibilitate la insecticidul Fentihon ( Hammond-Kosack and Jones 1997).
Genele R- nu sunt localizate pe cromozomi la ntmplare (, , 2001). Sunt
cunoscute trei tipuri de amplasare:

singular dialel - ocup un singur locus, cu dou alele, unde genele R- controleaz
susceptibilitatea i rezistena plantelor. Rezistena, de regul, se transmite prin ereditate ca
un caracter dominant

singular polialel posed un locus cu mai multe alele codominante, alelele multiple
determinnd rezistena la diferite specii i rase de patogeni;

29

nlnuit - un numr mare de locusuri di- i polialelice nlnuite, aceste locusuri alctuiesc
clustere de gene similare fenotipic care determin rezistena la una sau cteva boli ( ,
, 2001).

Clusterii de gene nlnuite se formeaz n urma crossing-overului intragenic i intergenic la


moleculele de ADN care au secvene repetitive drepte (bd - bd) sau invertate (bd dba). n urma crossing-overului inegal, la un genitor are loc deleia unui sector cromozomal, iar
la al doilea genitor are loc duplicarea sectorului cromozomal i prin urmare din o gen se formeaz
dou gene nlnuite. Cel mai mare interes l prezint sectorul LRR al proteinelor R- cu secvene
nalt repetitive. Datorit mutaiilor genice, mutaiilor structural cromozomale (deleii i inversii),
sectorul -LRR se caracterizeaz printr-o mare variabilitate genetic (Ellis and Dodds, 2000). S-a
demonstrat experimental c mutaiile care modific reacia la infectarea cu rase avirulente de
patogeni sunt cartate n sectorul -LRR (Dangl and Jones, 2001).
O caracteristic vizibil a interaciunii de tip R-Avr este reacia hipersensibil (HR) care
este nsoit de un stress oxidativ i intensificarea expresiei genelor implicate n aprare sau genele
asociate cu patogenii PR- (de la pathogene related genes) care blocheaz rspndirea patogenului
n plante (Goodman and Novacky 1994; Staskawicz, 1995; Dangl, 1996; Hammond-Kosack and Jones 1997; Lamb
and Dixon 1997; Rubiales et al., 2003b; Prez-de-Luque et al., 2005c).

Proteinele codificate de

genele PR- posed un grad nalt de similaritate structural, pe cnd majoritatea proteinelor de tip
Avr- arat o omologie redus sau lipsa acesteia (Schornack, 2006).
Aplicarea metodelor proteomicii a relevat faptul c n urma atacului plantelor cu Orobanche,
n afar de expresia genelor PR- (Joel and Portnoy, 1998), n urma atacului sunt expresate o serie de
gene i accelerate mecanisme fizioloice ca reacie de rspuns, precum este gena ce codific enzima
chitinaza (Castillejo et al., 2004; Vieira Dos Santos et al., 2003.), majorarea activitii peroxidazei i
coninutului de compui fenolici (Serghini et al., 2001; Echevarra-Zomeo et al., 2006;
Goldwasser et al., 1999; Prez-de-Luque et al., 2005a),

inducerea sintezei fitoalexinelor (Serghini et al.,

2001), liagnificarea (Goldwasser et al., 1999; Prez-de-Luque et al., 2005b), expresia pronunat a genei 1,3-endoglucanaza (Alejandro Prez-de-Luque et al.,.), sinteza liazelor, ciclazelor i reductaza 3hidroxi-3-metilglutaril CoA (HGMR), determinat de expresia genei hmg2 (Amanda
A. Griffitts et al.,.; Westwood et al., 1998),

compui care determin majorarea rezistenei fa de

patogen.
Majorarea activitii unor enzime specifice a fost relatat i la utilizarea plantei-model
Medicago truncatula infectat cu Orobanche i analiza proteinelor n gel 2D i MALDI-TOF mass
spectrometrie a atestat sinteza n planta gazd a enzimelor metabolismului carbohidrailor,
proteinkinazelor, chitinazei, ascorbatperoxidazei etc. (M.A. Castillejo, E. Dumas-Gaudot.....).

30

Mecanismele de aprare ale plantei n faa potenialelor patogeni sunt de o mare complexitate.
Pentru amorsarea unui singur mecanism este necesar activitatea sau biosinteza de novo a mai
multor enzime, care la rndul lor genereaz producerea sau unei multitudini de metabolii. n plus
un singur metabolit poate fi utilizat de mai multe ci metabolice, a cror int final nu induce
acelai tip de rspuns de aprare. Planta are capacitatea de a activa mecanismul de aprare optim.
Rspunsul de aprare este influenat de stadiul fiziologic al plantei, de tipul agresorului, de
intensitatea i durata atacului i nu n ultimul rnd de condiiile din mediul nconjurtor ( Ni-Lazr
M., 1998).

1.4.2. Genetica rezistenei florii-soarelui fa de lupoaie


n procesul evoluiei apar rase virulente noi de lupoaie, care infecteaz soiurile i hibrizii de
floarea-soarelui. Selecia formelor de floarea-soarelui rezistente la lupoaie a constituit o preocupare
de baz nc de la nceputul secolului XX, cnd n 1928, formele cultivate de floarea-soarelui
rezistente la rasa de lupoaie A (Kruglik A-41 i Saratovsky 169) au fost atacate de ctre o ras
nou de lupoaie, foarte virulent de tip B (Pustovoit, 1976; Parker and Riches, 1993).
ns, elucidarea existenei factorilor genetici de rezisten la lupoaie n cadrul genomului
florii-soarelui cultivate a uurat munca amelioratorilor n obinerea formelor mai rezistente de
floarea-soarelui. Identificarea determinismului genetic al mecanismelor de rezisten la factorii
biotici i abiotici, precum i elaborarea markerilor moleculari utili n selectarea formelor rezistente
la plante de cultur constituie o problem actual.
Primele surse bibliografice privind existena unui substrat genetic al rezistenei genetice a
soiurilor locale de florea-soarelui fa de Orobanche au fost identificate n Rusia, n anul 1916
(Pustovoit, 1966; Parker and Riches, 1993),

iar primul studiu genetic al rezistenei la lupoaie i stabilirea

dominanei imunitii n F1 i segregarea mendelian n F2 a fost efectuat n 1921, de ctre Placek,


care a concluzionat asupra tipului monogenic de rezisten la rasa A de lupoaie (Placek, 1921). Deja
ctre anul 1935, au fost create soiurile Jdanov 8281 i Jdanov 8885 rezistente la rasa B, pentru ca
apoi, gena de rezisten la rasa B s fie transferat la formele de floarea-soarelui cu coninut
ridicat de ulei Peredovik i VNIIMK 1646 (Melero-Vara et al., 1989; Fernandez-Martinez et al., 2000).
ns, la nceputul anilor 60 ai sec. XX, plantele ce posed genele de rezisten la rasele A
i B au fost atacate de ctre o ras nou a lupoaiei, rasa E, care reprezint un complex de la 17
pn la 22 de subrase foarte virulente (Petrov, 1968; Melero-Vara et al., 1989). Problema s-a complicat,
cnd n anul 1995, n Spania a fost identificat o ras nou de lupoaie virulent, rasa F (Alonso et
al., 1996 ; Dominguez, 1999),

rezistena fa de care a fost depistat att la formele cultivate, ct i la

cele slbatice de floarea-soarelui (Sukno et al., 1999; Fernandez-Martinez et al., 2000; Rodriguez-Ojeda et al.,

31

2001).

De asemenea, recent a fost descoperit o ras i mai virulent (G ), care atac formele de

floarea-soarelui rezistente la rasa F (Molinero-Ruiz and Melero-Vara, 2005).


Motenirea monogenetic i dominant a rezistenei fa de rasele de lupoaie a fost atestat
n majoritatea studiilor genetice (Pogorletsky i Geshele 1976; Vrnceanu i al. 1980; Sukno i al. 1999 ).
Pacureanu (2004), de asemenea, susine c rezistena la rasa F n Romnia este determinat de
aciunea unei singure gene dominante (Pacureanu 2004).
Dup Vrnceanu (1980; 1986), se disting 5 rase fiziologice ale lupoaiei (notate de A la E) i
respectiv 5 gene dominante de rezisten fa de acestea (Or1, Or2, Or3, Or4, i Or5). Analiza
populaiilor segregante de floarea-soarelui a demonstrat faptul c genele (Or1 - Or5) sunt sau alelice
sau strns nlnuite (Vranceanu et al., 1980, Ish-Shalom-Gordon et al., 1993; Sukno et al., 1998, 1999; FernandezMartinez , 2000).

Rase virulente noi de lupoaie care atac plantele de floarea-soarelui ce posed genele

Or1-Or5, n afar de Romnia (Pacureanu et al., 2004), au fost identificate n Bulgaria


(Shindrova, 2006) i n Turcia (Kaya et al., 2004).
n contrast cu rezistena derivat din sursele cultivate, rezistena la rasa F a populaiei BR4, derivat din speciile slbatice este controlat de gena dominant Or6 (Perez-Vich et al., 2002). ns,
cercetrile ulterioare au indicat o dominan incomplet a genei Or6 i prezen a altei gene Or7, a
crei expresie depinde de mediu (Perez-Vich et al. 2002, 2004a; Velasco et al., 2006).
Unele cercetri explic o motenire mai complex a caracterului, incluznd dou gene
dominante (Dominguez, 1996b), una sau dou gene recesive (Ramaiah, 1987, Rodriguez-Ojeda et al., 2001;
Akhtouch et al., 2002),

epistazie recesiv dubl (Kirichenco i al. 1987), interaciune aditiv a genelor

minore (Pogorlekii i Gheele, 1975), gene cu interaciune complimentar ( Krohin, 1980), dou gene Or
necumulative (Ciriaev, 1987), citoplasmogene (Paleev, 1983) sau chiar motenirea cantitativ (Pustovoit,
1966)

sau de natur poligenic, cu o heritabilitate foarte redus (Cubero, 1994;

Rubiales, 2003).
Folosind metode moleculare au fost cartate genele rezistenei florii-soarelui la rasele E i
F de lupoaie. Gena Or5 care determin rezistena la rasa E a fost cartat n regiunea telomeric
a grupului de linkaj (LG-3) a hrii genetice de floarea-soarelui ( Lu et al., 2000; Tang et al., 2003; PerezVich et al., 2004b).

Analiza locilor de tip QTL (de la quantitative trait loci) a artat c variabilitatea

fenotipic a rezistenei la rasa E este determinat de un locus major QTL (ce corespunde cu gena
Or5) asociat sau cu rezistena sau cu susceptibilitatea plantei, n timp ce rezistena la rasa F este
controlat de cteva locusuri QTL cu efecte moderate, asociate cu numrul de tulpini de lupoaie pe
planta-gazd (Perez-Vich et al., 2004b). La plantele leguminoase, mazre i bob, de asemenea, au fost
detectate genele QTL de rezistena la Orobanche (Roman et al., 2002; Valderrama et al., 2004). Aceste
rezultate sugereaz faptul c rezistena florii-soarelui la lupoaie are o component calitativ
(responsabil sau de prezena sau de absena lupoaiei) i cantitativ (controleaz severitatea atacului
32

de lupoaie numrul de tulpini pe planta-gazd). Doar cartarea genelor QTL pe hrile genetice, este
insuficient pentru o selecie molecular rapid i eficient (Rispail et al., 2006).
Identificarea markerlor SCAR (sequenced characterized amplified region) i SSR (simple
sequence repeat) linkai cu gena Or5 care determin rezistena florii-soarelui la rasa E de O.
cumana reprezint o direcie nou de perspectiv (Lu et al., 2000).
n afar de identificarea genelor care confer rezistena fa de lupoaie, un alt obiectiv
const n identificarea procedeelor de transmitere a acestor caractere de la un genotip la altul. O
surs important de obinere a noilor forme de floarea-soarelui ce posed rezisten la lupoaie
reprezint formele slbatice, n special Helianthus tuberosus L. (Pustovoit, 1966 ; Vranceanu et al., 1980).
Astfel, au fost create forme rezistente la Orobanche n rezultatul introgresiei genelor de rezisten
de la Helianthus tuberosus L. la floarea-soarelui de cultur n fosta URSS i Romnia (Pustovoit,
1966 ; Vranceanu et al., 1980).

n Spania, Ruso et al. (1996) i Fernandez-Martinez et al. (2000) au

identificat la 29 de specii perene slbatice de floarea-soarelui forme cu un grad nalt de rezisten la


rasele de lupoaie E i F (Ruso et al. (1996) i Fernandez-Martinez et al. (2000). Rezistena la lupoaie a
fost depistat la speciile slbatice de floarea-soarelui i n alte ri ( Pogorletsky and Geshele, 1976;
Christov., 1996; kori, 1988).

Aceste evaluri demonstreaz c speciile slbatice de Helianthus

reprezint o surs bogat de gene de rezistena la noi rase virulente de lupoaie. Transferul de gene
ale rezistenei la lupoaie de la speciile slbatice anuale de floarea-soarelui la formele cultivate se
realizeaz prin ncruciri i back-crossuri, ct i cu utilizarea culturii in vitro, dublarea numrului
de cromozomi n F1 i crearea de amfidiploizi (Jan and Fernandez-Martinez, 2002).
******
Aadar, n rezultatul infectrii plantei de ctre un patogen biotrof se induce un ir de reacii
de aprare, de diferit natur. Acestea la rndul su sunt implicate n mrirea rezistenei plantelor la
infectarea curent sau ulterioar. Un rol important n imunizarea plantelor i revin unor semnale
specifice, care se formeaz la infectarea primar a plantei i care sunt capabile s imunizeze
esuturile care nu contacteaz cu patogenul, precum i factorul genetic, determinat de genele de
rezisten i reacia de hipersensibilitate.

33

CAPITOLUL II. OBIECTUL I METODELE DE CERCETARE


Investigaiile efectuate n scopul elucidrii particularitilor morfo-fiziologice, biochimice
i genetice care caracterizeaz interaciunea dintre planta-gazd i parazit au fost realizate pe
parcursul anilor 2006-2009 n cadrul laboratorului Securitate Biologic din Centrul de
Cercetare tiine ale vieii, catedra Biologie Vegetal, Universitatea de Stat din Moldova i
Centrul de Biologie Molecular a Universitii Academiei de tiine a Moldovei.

2.1. Obiectul de studiu i condiiile de cultivare


n calitate de obiecte de cercetare au servit doi hibrizi de floarea-soarelui
(Valentino i Xenia) i formele parentale ale acestora. Materialul semincer a fost
oferit de Centrul de Cercetri tiinifice AMG-MAGROSELECT SRL, or. Soroca, n
persoana D-lui Rotaru T., dr. hab. n biologie.
Analizei au fost supui un ir de caractere morfologice i fiziologice pentru
determinarea formelor rezistente la lupoaie (Orobanche cumana Wallr.).
Studiile anterioare a acestor hibrizi i formelor parentale lor ( A. Cpn,
2006),

au relevat c indicii morfofiziologici cercetai (tabelul 2.1.) s-au

caracterizat prin specificitate genotipic ce variau pe parcursul ontogenezei.


Analiza comparativ a indicilor morfologici studiai la hibrizii de prima
generaie (Xenia F1, Valentino F1) au demonstrat ca n majoritatea cazurilor
genotipurile hibride se caracterizau prin valori superioare fa de formele
parentale.
Tabelul 2.1.
Indici morfologici ai familiilor Xenia i Valentino n faza de nflorire
Nr.
ord
1.
2.

Indici morfologici

nlimea tulpinii n faza de nflorire i


maturitate (cm)
Diametrul tulpinii n faza de nflorire

136/
140
2,2

Familia Xenia

87/
88
1,6

F1
169/
175
3

Familia Valentino
F1

152/
153
1,9

120/
121
1,8

180/
183
2,2

34

3.
4.
5.
6.
7.

(cm)
Numrul de frunze
Lungimea frunzei (cm)
Limea frunzei (cm)
Suprafaa foliar (cm2)
Durata ciclului de dezvoltare (zile)

28,3
20
18,9
4981
117

27,5
19
16,5
4168
107

29,5
20
19,1
5655
126

29,8
13,2
12,8
2216
119

39,9
15,3
14,1
4223
105

32,3
16,7
15,9
4089
127

Un alt indice important care a fost cercetat anterior la aceste genotipuri a


fost indicele productivitii, producia de semine fiind determinat de
urmtoarele componente: diametrul calatidiului, numrul de semine, masa a
1000 semine, coninutul procentual de miez n smn.
Din cercetrile recente (A. Cpn, 2006) s-a constatat ca hibrizii de prima
generaie

se

caracterizeaz

prin

valori

superioare

ale

diametrului

inflorescenei, iar masa a 1000 semine i coninutul procentual de miez la


aceti hibrizi au luat valori intermediare n comparaie cu formele parentale
(tabelul 2.2.).
Tabelul 2.2.
Indicii productivitii familiei Xenia i Valentino
Nr.
ord
1.
2.
3.

Indicii productivitii
Diametrul inflorescenei (cm)
Masa a 1000 semine (g)
Coninutul de miez (%)

Familia Xenia

F1

17,52
54,63
77,02

15,25
79,25
62,68

19,64
51,33
78,22

Familia Valentino

F1
15,44
67,53
82,46

14,20
44,26
76,48

18,15
56,2
79,89

Pentru evidenierea genei de rezisten Or5 au fost testate 54 de


genotipuri: 27 linii necunoscute, 11 linii ASC, 10 hibrizi (Alcazar, Drofa, Favorit,
Olea, Oxana, Performer, Turbo, Valentino, Vitalia, Xenia) i formele parentale a
hibrizilor Drofa,Valentino i Xenia.
Cultivarea i infectarea florii-soarelui in vivo.
Hibrizii Valentino i Xenia i formele parentale lor n primul an de studiu au
fost infectate cu trei populaii de lupoaie din diferite regiuni geografice:
Moldova, Rostov i Volgograd. Agentul patogen a fost oferit cu amabilitate de
D-lui Rotaru T., dr. hab. n biologie - CC MAGROSELECT, or. Soroca.
Inocularea artificial a plantelor a fost efectuat n vase de vegetaie, n
care s-a introdus mixtura de sol (nisip : turb, 1:1, v/v) uniform infectat cu
semine de lupoaie (la 200 g amestec s-a adugat 30-40 mg semine) [Pancenko
1975]. Amestecul de sol a fost udat cu 100 ml ap i vasele au fost lsate 7 zile
pentru precondiionarea seminelor de lupoaiei, dup care au fost plantate
seminele de floarea-soarelui germinate timp de 2 zile. Dup 14-15 zile de
35

cultivare plantulele au fost transferate n vase mai mari (cu volum de

). Vasele

au fost expuse n camera de cultivare, la temperatura de 23-25C, fotoperiodicitatea de 14-16 ore,


umiditatea de 60%.
n anul doi de cercetare, s-a studiat interrelaiile gazd - parazit - temperatur la aceeai genotipuri
de floarea-soarelui. Genotipurile respective/date au fost infectate cu lupoaiei autohton, colectat de

la plantele infectate de floarea-soarelui n vara anului 2006 din centrul Republicii Moldova.
Seminele de lupoaie au fost separate de inflorescenele uscate i pstrate la ntuneric la temperatura
camerei. Infectarea s-a efectuat conform recomandrilor [Pancenko 1975]. Vasele au fost expuse n
camera de cultivare. Plantele au fost crescute la dou regimuri diferite de temperaturi: la
temperatura medie de 15/14 C (aer/sol) cu fotoperioada de 12-14 i 28/25 C (aer/sol) cu
fotoperioada de 14-16 ore i umiditatea de 60%. Temperatura aerului i a solului a fost msurat
zilnic. Materialul a fost analizat dup o sptmn din momentul apariiei lupoaiei la suprafaa
solului.
n anul trei de studiu au fost testate 27 de genotipuri fiind infectate dup metoda Pancenko,
1975. o parte din plantule la faza vegetativ de dou frunze adevrate s-a extras
ADN pentru evidenierea genei Or5, iar celelalte au fost cultivate timp de 60
zile pentru a determina gradul de infecie/atac.

2.2. Metode de cercetare


2.2.1. Determinarea indicilor morfo-fiziologici
Parametrii morfo-fiziologici: nlimea plantelor, volumul sistemului radicular, suprafaa
foliar, coninutul pigmenilor asimilatori au fost analizate conform metodelor clasice
[Boldor O. 1983, Duca M., Savca E., Port A, 2001].
Materialul biologic a fost colectat i analizat dup 8-9 sptmni de la semnat.
Rdcinile plantelor de floarea-soarelui au fost splate i analizate la binocular MBS-9.
Ataamentele parazitului de pe rdcinile plantei-gaze au fost numrate i clasificate n
conformitate cu Labrousse P. 2001.
2.2.2. Determinarea prezenei peroxidului de hidrogen.
Ca substrat pentru identificarea vizual a H2O2 n frunze a servit 3,3-diaminobenzidin (DAB).
Limbul foliar mpreun cu peiolul s-a detaat de la plant cu bisturiul i a fost incubat n soluie de
1mg/ml DAB, pH 3,8, timp de 8 ore la lumin, la 25C. Apoi frunzele au fost fierte 2-3 min n
etanol 96%. Acest tratament a decolorat frunzele, cu excepia zonelor brune, unde a avut loc
polimerizarea peroxidului cu DAB (Orozco-Cardenas M., Ryan C. 1999). Pentru analiz au fost
luate frunzele etajului superior al plantei.

36

2.2.3. Metoda gazometric de determinare a activitii catalazei.


n cadrul analizei au fost luate 0,3 g material vegetal, majorat cu CaCO 3 pentru crearea
mediului bazic (pH 7,7), la care s-a adugat ap n scopul obinerii unei mase omogene. Amestecul
se transfer n braul mare al vasului de reacie, iar n braul mic se adug 5 ml H 2O2 de 3%. Vasul
se unete la gazometru, soluiile din vas se amestec timp de 3 min. Se determin volumul O 2
degajat (ml O2/1g/min ) ( .. 1982).
2.2.4. Izolarea proteinelor sumare
Proteinele totale au fost izolate din rdcinile i frunzele de floarea-soarelui
Extracia proteinelor solubile destinate studiului prin intermediul electroforezei
unidimensionale s-a realizat la temperatura camerei, n soluie-tampon: Tris-HCl
0.628 mM, pH=8.0 (1g prob : 5 ml), acid ascorbic 0.03%, EDTA 1 mM. Iniial
materialul vegetal s-a macerat cu 1 ml de soluie tampon pn la obinerea
unei mase omogene. Omogenatul se transfer cantitativ n eprubet pentru
centrifugare i se agitat timp de 30 min, fiind apoi centrifugat 15 min pe o
centrifug tip MPW-310 (Polonia) la o turaie de 10000 rotaii/min.
Supernatantul se colecteaz, iar sedimentul se mai splat de dou ori cu
extragent proteic. Precipitarea proteinelor a fost realizat cu acid tricloracetic
50%, pn la concentraia final de 5% i lsate la rece (+4; -1C) timp de 60
min. Sedimentul obinut s-a centrifugat i splat cu etanol 70% (ce coninea
Tris-OH), aceton 80%, etanol 96%, eter. Precipitatul obinut a fost uscat n
curent de aer i dizolvat (n raport de 10:1) n soluie tampon Tris-HCl (pH=6,8)
coninnd SDS 4,24%, zaharoz (cca 20%), -mercaptoetanol de 6% (v/v),
albastru de bromfenol 0,004% (Reva V., Ciobanu V.,2001, Duca M., Savca E., Port A,
2001).
2.2.5. Determinarea calitativ a proteinelor prin SDS-PAGE
Electroforeza reprezint o metod analitic de separare a particulelor sau a ansamblurilor de
particule ncrcate electric sub aciunea cmpului electric. Metoda se bazeaz pe fenomene fizicochimice de deplasare sau de migrare difereniat a diferitor specii de particule ntr-un cmp electric.
n prezena de SDS are loc separarea proteinelor n gel de poliacrilamid conform maselor
moleculare, conform tehnicii descrise de Laemmli (1970). Electroforeza s-a realizat n sistemul de
tampoane Laemmli n plci verticale n gel de poliacrilamid (GPAA) cu grosimea 1mm n condiii
denaturate n prezena SDS.

37

La electroforeza discontinue se folosesc tampoane cu compoziie i valori ale pH-lui diferite.


Purttorul este alctuit din dou straturi de gel (gel de separare i gel de concentrare) care se
deosebesc dup dimensiunile porilor. n timpul electroforezei are loc concentrarea substanelor, apoi
separarea lor. n calitate de gel de separare (12,5%) s-a folosit soluia apoas cu urmtoarea
componen: Tris-HCl 25mM, glicin 192 M, SDS 0,1% acrilamid i bisacrilamid incluznd
4ml tampon Tris-Hcl 1,88M (pH=8,8), 5 ml acrilamid (48,7%) bisacrilamid (1,3%), 2ml SDS
(1%), 5 ml TEMED (48%), 2ml H2O distilat, 2 ml PSA (0,5%). Gelul de concentrare(5%) se
pregtete cu o or nainte de aplicarea probelor proteice utilizndu-se 0,6 ml soluie tampon TrisHCl 0,638M (pH=6,8); 0,3 ml acrilamid (50%); 0,75 ml TEMED (48%); 0,3ml SDS (1%); 0,4 ml
H2O; 0,6 ml PSA (0,5%).
Electroforeza s-a desfurat timp de circa 3 ore, lucrndu-se la 15mA i 80V pn cnd
probele (n godeuri fiind introduse 7-10l) strbat gelul de concentrare i la 30 mA, 180 V pn n
momentul cnd frontul colorantului a ajuns la 1 cm de marginea inferioar a gelului de separare.
Dup deconectarea cuvei aparatului de electroforez (Himifil AVG-2, Estonia) de la
sursa de curent continuu, s-a detaat i dezasamblat matria, iar gelul separat a fost supus operaiilor
de fixare, colorare, decolorare i fotografiere.
Fixarea gelului dup electroforez s-a efectuat cu ajutorul unei soluii constituit din
izopropanol, acid acetic i ap n raport de 25 : 10 : 65, timp de 2 ore. Pentru evidenierea
postelectroforetic s-a folosit colorantul Coomassie G-250 (10mg G-250 + 223,1 ml H 2O distilat +
26,9 ml 32,5% HClO4), timp de 45-60 min. ndeprtarea excesului de colorant din gel (decolorarea)
pentru vizualizarea pilipeptidelor pe un fon clar i transparent, s-a realizat prin splri succesive cu
o soluie de acid acetic de 7%.
Masele moleculare ale proteinelor sumare au fost determinate dup curba
de etalonare folosind proteinele standard: albumina seric bovin 68.0 kDa,
ovalbumina 45.0 kDa, chimotripsinogenul A 25.0 kDa, ribonucleaza 13.4
kDa. n baza electroforezei obinute n fiecare caz s-a relevat cu o curb etalon n coordonatele Rf
i Ln Mr cu ajutorul creia s-au determinat logaritmii maselor moleculare relative ale fraciilor
separate n funcie de indicele mobilitii electroforetice (Reva V., Ciobanu V.,2001).
2.2.6. Metoda specrofotometric de determinare a acizilor nucleici
Materialul de cercetare (1 - 0,5 g) omogenizat se transfer cantitativ cu 5-10 ml sol. HClO 4
de 0,2N ntr-o eprubet de centrifugare, se centrifugheaz 10 min 8000 rot/min. Precipitatul obinut
se purific cu sol. HClO4 de 0,2N i se centrifugheaz. Precipitatul se spal succesiv cu amestec de
alcool i aceton (1:1), i eter i se usuc ntr-un exicator sub vid [17]. La precipitatul uscat se
adaug KOH 0,5N i se efectueaz hidroliza la 37C o or. Suspensia rcit se centrifugheaz 10
38

min 8000 rot/min. Supernatantul se colecteaz ntr-o eprubet, iar precipitatul se spal cu KOH
0,5N centrifugndu-se de fiecare dat. n supernatantul colectat se adaug cu pictura HClO 4
concentrat pn la concentraia final de 5% i se las la rece 20-30 min. ADN-ul cade n precipitat,
iar ARN-ul rmne n supernatant. Probele se centrifugheaz 15 min la 8000 rot/min. Suprnatantul
se colecteaz ntr-un balon de 50 ml, iar precipitatul se spal de dou ori cu 10 ml HClO 4 5%.
Balonul se unete un la un refrigerent, se pune la baia de ap (+ 70C) pentru 15 min. Soluia se
rcete, se filtreaz printr-un filtru de sticl nr.4, se msoar volumul total al supernatantului i se
folosete pentru determinarea ARN-lui la spectrofotometru la =270 nm i =290 nm. Martor
servete HClO4 5%. Precipitatul ce conine ADN se suspend n 10-15 ml n soluie HClO 4 5%, se
introduce ntr-un balon cu refrigerent i se hidrolizeaz la baia de ap (+90C) timp de 30 min.,
dup rcire se centrifugheaz. Supernatantul se colecteaz ntr-o eprubet gradat i se determin
densitatea optic la =270 nm i =290 nm (M. Duca, E. Savca, A. Port.2001).
Concentraia acizilor nucleici se determin dup urmtoarele formule.
CAN= (( E270-E290) 10,3)/190
CAN - concentraia acizilor nucleici (mg/ml); E - densitatea optic a hidrolizatului.
C- concentraia acizilor nucleici,10,3 coeficientul de corecie
Pentru a transforma concentraia fosforului nucleic n concentraia acizilor nucleici, se
folosete coeficientul de corecie care este egal cu 10,1 pentru ADN; 10,5 pentru ARN i 10,3
pentru suma AN.
CARN= (( E270-E290)10,5V)/190m
CADN= (( E270-E290)10,1V)/190m
V- volumul total al hidrolizatului (ml)
M masa materialului (g)
2.2.7. Izolarea ADN-lui
n scopul realizrii analizei SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) a fost izolat
AND total din plantulele de floarea-soarelui. Din materialul vegetal omogenizat n azot lichid a fost
extras ADN-ul cu soluie-tampon 2xCTAB(cetyltrimethyl ammonium bromide) (500 ml 2x CTAB:
10 g CTAB, 140 ml 5M NaCl, 50 ml Tris stock (1M, pH 8,0), 20 ml EDTA stock (0,5 M, pH 8,0),
10g PVP (polivinilpirolidon)). Probele au fost incubate la 65C timp de 60 min. ADN-ul a fost
extras din omogenat cu cloroform:alcool izoamilic n raport de 24:1 i precipitat cu izopropanol.
Operaiile de purificare a ADN-ul au fost realizate cu etanol 76% rece. Sedimentul de ADN obinut
a fost dizolvat n 50 l ap bidistilat sau TE i pstrat la 20C ( Doyle JJ and Doyle JL, 1990). Analiza
39

cantitativ i calitativ a ADN-ului a fost realizat prin electroforez n gel de agaroz.


Electroforeza n gel de agaroz s-a realizat n sistem tampon continuu Tris-acetat. Gelul de agaroz
de 1% conine: pentru 100ml - 1g agaroza, 2 ml 50xTAE (Tris-acetat 0.004 M; EDTA 0.001 M), 98
ml ap distilat autoclavat, soluia se fierbe timp de 30 sec. La soluia rcit (45-50 C) se adaog 2
l bromur de etidiu 0,5 mg/ml. Electroforeza ADN-lui a fost realizat n gel de cca. 3mm grosime
sub o tensiune de 80 V n soluie tampon de migrare 1x TAE . Vizualizarea gelului a fost efectuat n
raze ultraviolete.
2.2.8. Tehnica PCR de identificare a unor gene de rezisten
Metoda PCR (K. Mullis, 1983) permite amplificarea selectiv a fragmentelor din molecula
de ADN cu participarea ADN-polimerazei care folosete una din catene ca matri pentru sinteza
unei catene complementare noi. Amplificarea s-a efectuat cu primerii specifici SCAR - RTS05:
sens

5-TGGTCGCAGATGGACGTGTGGGTG-3),

antisens 5- GTCGCAGAGAGTGAGAGAGAGTGT-3), (Alpha DNA, Canada).


Reacia de amplificare s-a realizat n volum de 30l, ce coninea ap distilat, 10X PCR
tampon, MgCl2 25mM, amestec de nucleotide dNTP (2 mM), Taq-polimeraza 5u/l (Rusia), primer
50 pmol 2,2 l, AND 1-2 l. Amplificarea a fost efectuat utiliznd un termociclu automat
(Corbett, Australia) cu urmtoarele condiii: I. denaturarea: 94C - 4 min, (un ciclu); II. 30 cicluri, 1.
denaturarea: 93C - 1 min, 2. renaturarea: 63C - 1 min, 3. elongarea: 72C 2 min; III. elongarea
specific: 72C - 6 min. Electroforeza produilor de amplificare (10 l) s-a realizat n gel de agaroz
de 1,4% n soluia tampon TAE la 93 V n camera de electroforez Biocom (Rusia). Gelul a fost
vizualizat n camera UV i fotografiat.
Pentru determinarea maselor moleculare relative ale produselor de amplificare au fost utilizate
probe cu martori - 100 bp DNA Ladder, Fermentas, USA.
Ampliconii obinui au fost supui restriciei Taq I, mixul de reacie coninea:
Componentele

Volumul l/reacie

Tampon enzima 10 x
Taq I (10u/ l)
H2Od autoclavat

0,2
0,1
4,7

Sol. ampliconi
Volumul final

10
15

Volumul final
pentru 50 probe
10
5
235

Restricia a fost efectuat utiliznd termociclu automat (Corbett, Australia) la temperatura de


65 C cu o durat de 12 ore. Electroforeza produilor de restricie s-a realizat n gel de agaroz de
1,4% n soluia tampon TAE la 80 V. Gelul a fost vizualizat n camera UV i fotografiat. Mrimea
40

fragmentelor de ADN restrictate au fost comparate cu marcherul standard (100pb DNA ladder,
Fermentas, USA).
2.2.9. Analiza statistic a datelor
Prelucrarea statistico-matematic a datelor experimentale s-a efectuat prin metoda standard
[, 1985]. S-au calculat urmtorii parametri statistici: X media aritmetic; baterea
medie ptratic; V variaia (%); m x eroarea experienei; Smx% eroarea total.

CAPITOLUL III. VARIAIA PARAMETRILOR MORFO-FIZIOLOGICI LA PLANTELE


DE FLOAREA-SOARELUI LA INTERACIUNE CU PARAZITUL LUPOAIA
Creterea plantelor reprezint criteriul de baz ce caracterizeaz receptivitatea plantelor la
aciunea agenilor patogeni. Pn n prezent rmn ns neelucidate mecanismele legate de relaiile
existente dintre planta-gazd i parazit, cercetri, care ar contribui la facilitarea procesului de
selecie a formelor rezistente. Analiza indicilor de cretere deschide perspective pentru determinarea
momentelor critice ale aciunii factorilor de stres i elaborarea metodelor de diagnosticare a
plantelor rezistente la factorii nevaforabili, ceea ce ar permite evaluarea posibilitilor poteniale ale
genotipurilor. Din aceste considerente ne-am propus s realizm analiza diferitor
caractere pe parcursul creterii i dezvoltrii a acestei culturi.
3.1. Studiul parametrilor morfo-fiziologici, acumularea pigmenilor asimilatori i evaluarea
gradului de infecie n procesul de interaciune a florii-soarelui cu lupoaia
41

din regiuni geografice diferite


Aciunea lupoaiei asupra florii-soarelui se manifest prin diminuarea reaciilor oxidoreductoare, intensificarea intensitii transpiraiei, plantele se rein n cretere, deseori rmn mici,
cu tulpini subiri i calatidii sterile [ Iliescu, H., 1974. Vrnceanu, A.V 2000].
Majoritatea datelor existente caracterizeaz particularitile morfologice i biologice ale
lupoaiei, factorii care contribuie la inhibarea germinrii seminelor de lupoaie, ameliorarea
condiiilor de cultivare i diverse metode de obinere a varietilor rezistente la lupoaie [Pieterse,
A.H., 1996, Teryokohin, E.S, 1996, Zhelev, N., 1987], ns un interes prezint modificrile morfofiziologice la genotipurile de floarea-soarelui infectate cu lupoaie.
n cadrul primelor investigaii s-a studiat interaciunea florii-soarelui cu trei populaii de
lupoaie, din diferite regiuni geografice (Moldova, Rostov i Volgograd). Seminele de lupoaie fiind
oferite cu amabilitate de ctre dl. Rotaru T. Magroselect, Soroca.
Potrivit datelor obinute n cadrul cercetrilor noastre s-a constatat c infestarea cu cele trei
populaii de lupoaie a provocat modificarea parametrilor morfologici studiai (nlimea plantei,
volumul sistemului radicular, suprafaa foliar). Astfel analiza nlimii plantelor infectate (tab. 3.1.)
a relevat c genotipurile homozigote materne a hibrizilor Xenia i Valentino au valorile indicelui
cercetat cuprinse ntre 30,12 - 51,00 cm, la genotipurile paterne 26,38 - 44,36 cm. Valorile
genotipului heterozigot Xenia variaz ntre 35,67 - 51,45 cm, iar la genotipul heterozigot Valentino
37,63 - 48,00 cm. Cele mai mici valori ale nlimii se atest n varianta Rostov i Volgograd, mai
puin afectate au fost plantele din varianta Moldova la care s-au obinut cele mai nalte valori ale
parametrului studiat (fig.3.1). Din aceste considerente putem constata c plantele de floarea-soarelui
sunt mai tolerante la infecia cu lupoaia de origine autohton, dect la infectarea cu lupoaie din
regiunea Rostov i Volgograd.
Tabelul 3. 1.
Infulena O. cumana Wallr. asupra parametrilor morfofiziologici
ale plantelor de floarea-soarelui (media la o plant).

nalimea,
cm/plant
51,00 8,90

Volumul radicular,
cm3/plant
1,17 0,65

36,63 4,17

1,87 0,18

F1

51,45 5,15

0,98 0,35

45,10 3,25

0,73 0,40

44,36 7,85

1,68 0,84

F1

48,00 8,76

1,03 0,38

39,20 2,88

0,73 0,44

F1

26,38 3,23
35,67 2,25

0,88 0,23
0,47 0,13

Xenia

Genotipul

Xenia Valentino

Moldova
Rostov

Orobanche cumana Wallr.

Varianta

42

Valentino
Xenia
Valentino

Volgograd

30,12 2,33

0,68 0,17

35,08 3,99

0,60 0,14

F1

37,63 2,46

0,85 0,27

37,98 7,48

0,36 0,14

30,02 2,73

1,06 0,44

F1

36,63 3,10

0,38 0,19

46,03 5,79

0,73 0,27

34,40 4,34

0,27 0,08

F1

39,53 2,97

0,45 0,18

Hibridul Xenia capt valori apropiate liniei homozigote materne, n toate cele trei variante,
pe cnd la familia Valentino n varianta Moldova i Rostov genotipul heterozigot depete
aproximativ cu 10 % genotipurile homozigote parentale, cu excepia variantei Volgograd, unde
genotipul heterozigot are valori intermediare formelor parentale (Valentino - 46,03 cm, Valentino
- 34,40 cm, Valentino F1 - 39,53 cm, fig. 2.).

Figura 3.1. Influena lupoaiei asupra nlimii plantelor de floarea-soarelui

ntruct lupoaia paraziteaz planta-gazd la nivelul rdcinii, un interes deosebit reprezint


gradul de influen a acesteia asupra volumului sistemului radicular (tabelul 3.1, fig.3.2). S-a
constatat c valoarea acestui indice se modific n dependen de originea lupoaiei i mai puin de
genotipul studiat. Astfel, se observ c sistemul radicular este mai bine dezvoltat n varianta
Moldova, indiferent de genotip, (ex. Xenia - 1,17 cm 3, Xenia - 1,07 cm3, Xenia F1 - 0,98 cm3),
dect n varianta Rostov (ex. Xenia - 0,73 cm 3, Xenia - 0,88 cm3, Xenia F1 - 0,47 cm3) sau
Volgograd (ex. Xenia - 0,36 cm3, Xenia -1,06 cm3, Xenia F1 - 0,38 cm3) (tab.1.)
Volumul sistemului radicular la genotipurile materne, n variantele studiate, cuprinde valori de
la 0,36 - 1,17 cm3, la genotipul patern de la 0,27 - 1,87 cm 3. Se constat c genotipul patern Xenia
n toate variantele precutate are valori ale volumului sistemului radicular mai mare n comparaie
43

cu genotipul homozigot matern i heterozigot, pe cnd nlimea la acest genotip este mai mic n
comparaie cu celelalte, aceasta ns reprezint o specificitate de genotip i nu o adaptare la factorul
biotic.
Linia matern Valentino n cele trei variante are valori ale volumului sistemului radicular
apropiate, pe cnd la linia patern acestea variaz, fiind cea mai mare n varianta Moldova - 1,68
cm3 i cea mai mic n varianta Volgograd - 0,27 cm3. Un efect asemntor se observ i n cazul

volumul sistemului radicular (cm3)

volumul sistemului radicular (cm3)

hibridului de prima generaie Xenia.

Figura 3.2. Influena lupoaiei asupra volumului sistemului radicular la plantele de floarea-soarelui

Genotipul heterozigot Xenia n cele trei variante are valori apropiate cu genotipul matern,
asemenea legitate se observ i la analiza nlimii plantelor.
Reacia de rspuns a genotipurilor studiate de floarea-soarelui la aciunea lupoaiei de diferit
origine se manifest i prin modificarea suprafeei foliare.
Analiza suprafeei foliare n variantele studiate denot cele mai mici valori n varianta
Moldova, ceea ce este indirect indicilor nlimii si volumului sistemului radicular. S-ar putea de
presupus ca la atacul lupoaiei din regiunea Rostov i Volgograd plantele manifest un mecanism de
adaptare i aprare prin mrirea suprafeei foliare pentru suplinirea pierderilor substanelor
organice.
Datele prezentate n figura 3.3 relateaz c hibridul Valentino i formele lui parentale sunt mai
sensibile la atacul patogenului, indiferent de proveniena lui, deoarece la toate variantele studiate

44

are loc diminuarea suprafeei foliare constituind valori de 19,3 - 30,04 cm 2 (excepie fcnd linia

suprafaa foliar (cm2)

suprafaa foliar (cm2)

matern - 46,78 cm2).

Figura 3.3. Influena varietilor de lupoaie asupra suprafeei foliare la familia Xenia i Valentino

Variabilitatea rezistenei florii-soarelui la lupoaie a fost relevat i n plan comparativ. Astfel,


o corelaie direct dintre ritmul creterii plantelor n nlime i suprafaa lor foliar a fost depistat
la hibridul Valentino i liniile parentale n variantele cu utilizarea lupoaiei de provenien Rostov i
Volgograd, iar la hibridul Xenia i liniile lui parentale aceast legitate se pstreaz numai n cazul
cultivrii plantelor pe fon cu lupoaia din Rostov.
Rezultatele obinute ne permit s afirmm c lupoaia de origine Rostov i Volgograd sunt mai
virulente comparativ cu lupoaia autohton, reprimnd creterea plantelor, dezvoltarea sistemului
radicular i modific suprafaa foliar a plantelor.
Afeciunea lupoaiei s-a manifestat nu doar prin modificri ale valorilor volumului sistemului
radicular i suprafeei foliare, ci i a coninutului de pigmeni asimilatori n frunze (tabelul3.2).
Dup cum era de ateptat, n toate cazurile analizate coninutul clorofilei a este mai mare dect
clorofila b. Coninutul pigmenilor, la genotipurile infectate cu populaia de lupoaie din Moldova
au valori mai ridicate (n majoritatea cazurilor) n comparaie cu cele infectate cu populaia de
lupoaie din Volgograd i Rostov. La majoritatea variantelor studiate hibrizii au un coninut mai
sporit de clorofil comparativ cu liniile parentale.

45

Tabelul 3.2.
Modificarea coninutului de pigmeni asimilatori n frunzele diferitor genotipuri de floaresoarelui sub influena O. cumana Wallr. (mg/g masa verde)
Varianta

Moldova

Xenia

Valentino

Xenia
Rostov

Orobanche cumana Wallr

Clorofila

Genotipul

Valentino

Volgograd

Xenia

Valentino

Carotenoizi

"a"

a+b

a/b

0,67 0,0053

0,57 0,0028

1,24

1,182

0,005 0,0011

0,65 0,0049

0,63 0,0039

1,29

1,037

0,004 0,0011

F1

0,62 0,0017

0,50 0,0007

1,12

1,241

0,005 0,0007

1,01 0,0036

0,81 0,0007

1,82

1,21

0,006 0,0007

0,56 0,0011

0,42 0,0007

0,9

1,33

0,007 0,0013

F1

1,01 0,0017

0,92 0,0013

1,92

1,101

0,084 0,0091

0,63 0,0120

0,43 0,0085

1,06

1,46

0,002 0,0007

0,56 0,0086

0,48 0,0079

1,04

1,16

0,004 0,0007

F1

0,81 0,0017

0,79 0,0017

1,60

1,033

0,058 0,0035

0,42 0,0064

0,36 0,0020

0,78

1,16

0,004 0,0011

0,35 0,0030

0,34 0,0028

0,69

1,015

0,026 0,0079

F1

0,68 0,0023

0,40 0,0357

1,07

1,7

0,002 0,0007

0,77 0,0023

0,55 0,0543

1,31

1,403

0,007 0,0007

0,52 0,0017

0,38 0,0011

0,90

1,36

0,002 0,0017

F1

0,67 0,0277

0,46 0,0082

1,13

1,45

0,002 0,0011

0,82 0,0047

0,37 0,0020

1,19

2,02

0,005 0,0011

0,82 0,0024

0,73 0,0017

1,55

1,135

0,004 0,0007

F1

0,49 0,0075

0,32 0,0046

0,81

1,53

0,002 0,0007

Totodat, agentul patogen modific n mare msur coninutul clorofilei a n timp ce


coninutul clorofilei b se menine la un nivel nalt, despre ce ne indic i coraportul clorofilei
a/b (0,99 - 1,70). Acest fenomen denot o utilizare mai complet de ctre plante a razelor cu
lungime de und scurt. Posibil aceste modificri ale coninutului clorofilei b conduce la
adaptarea plantelor la factorul patogen i la stabilitatea coninutului clorofilei sumare.
Referitor la acumularea pigmenilor carotenoizi putem meniona c acetia nu sufer
schimbri cantitative semnificative prin valori mici, excepie fcnd doar hibridul Valentino - 0,084
mg/g (Moldova), linia patern - 0,026 mg/g (Rostov) i hibridul Xenia - 0,054 mg/g (Rostov).
Astfel din datele obinute rezult c aciunea lupoaiei asupra componenei calitative i
cantitative a pigmenilor asimilatori s-a manifestat mai mult prin modificarea coninutului clorofilei
a i mai puin a clorofilei b i carotenoizilor.
Astfel, lupoaia reprim creterea plantelor i dezvoltarea sistemului radicular, i modific
suprafaa foliar a plantelor, de asemenea induce unele modificri n metabolismul pigmenilor

46

asimilatori. Dup indicii morfofiziologici studiai s-a relevat c populaiile de lupoaia din regiunea
Rostov i Volgograd sunt mai virulente comparativ cu cea autohton.
La urmtoarea etap s-a studiat gradul de ataca a populaiilor de lupoaie.
n urma investigaiilor efectuate s-a remarcat c nici unul dintre genotipurile studiate nu a
manifestat o imunitate total la atacul parazitului, la toate genotipurile s-au depistat cel puin cteva
ataamente de lupoaie.
Prima populaie de lupoaie care a aprut la suprafaa solului a fost populaia din Volgograd la
5 sptmni de la semnare, la hibrizii Valentino i Xenia, dup 6 sptmni a rsrit lupoaia din
Rostov ( Xenia ), iar la a 7-tea sptmn populaia din Moldova (Valentino ).
Analiznd detaliat rdcinile de floarea-soarelui s-a evideniat diferite stadii de dezvoltare a
lupoaie (fig.3.3.): ataamente, tuberculi, lstari subterani i lstari aerieni, numrul crora se indic
n tabelul 3.
A

a
b

Fig.3.3. Diferite stadii de dezvoltare ale Orobanche cumana Wallr.:


A i B faza de lstari aerieni, C, Da- tuberculi necrotizai, Db lstari subterani.

De regul ataamentele, tuberculii i lstarii au o coloraie galben pal, datorit lipsei de


clorofil, dar printre acestea au fost observai parazii de culoare brun roietic. Lupoaia
necrotizat are un haustoriu rou-brun indicnd prezena compuilor fenolici n organ (foto 1.). Aa
fenomen a fost descris la interaciunea Vicia sp i O. aegyptica [Goldwasser Y., Hershenhorn J 1999] i
ntre floarea-soarelui i O. cumana [Dorr I, Staack A., 1994]. Acumularea acestor compui (flavonoide)
ca mecanism de rezisten, duce la dereglarea transportului direct al auxinelor [Jacobs M., Rubery P.H
1988]

schimbnd echilibrul hormonal al parazitului i provocnd astfel necrotizarea.


47

Necrotizarea parazitului la populaia Volgograd nu s-a observat (0%), n schimb la populaia


din Rostov ea este prezent ntr-un numr destul de mare (19,4%) comparativ cu populaia din
Moldova (8,3%).
La floarea-soarelui se atest/relev dou mecanisme ce asigur rezistena la lupoaie. Aceasta
fiind caracterizat printr-un numr sczut de ataamente sau printr-un numr mare de necroze ale
parazitului [Labrousse P., Arnaud M.C 2001]. Unele necroze apar dup 6 sptmni ce se explic printr-o
strns competiie ntre populaia parazitului. Aceasta este n concordan cu ipoteza lui Hibberd i
colab. (1998) care postuleaz c fiecare gazd are o cantitate limitat de asimilate disponibile i
cum numrul de parazii crete, competiia pentru asimilate micoreaz dimensiunile lor individuale
[Labrousse P., Arnaud M.C 2001].
Generaliznd datele obinute constatm c cel mai mare grad de infecie se atest la aciunea
populaiei din Volgograd, dup care urmeaz populaia din Rostov i n cele din urm cea din
Moldova. Genotipul heterozigot Xenia i formele parentale ale acestuia sunt mai puin afectate de
populaia de lupoaie din Moldova dect hibridul Valentino i liniile lui parentale (tabelul 3.3.),
acelai efect s-a observat i la infecia cu populaia Volgograd i Rostov
Tabelul 3.
Numrul de ataamente pe rdcinile genotipurilor de floarea-soarelui

aerieniNr. lstarilor

1
1n
3(1n)
2(1n)
1
8(3n)
16(6n)

subteraniNr. lstarilor

11(1n)
1n
2
2
12(3n)
17(3n)
45(8n)

Nr. tuberculelor

2
5
2
3
6
6
24

Orobanche cumana
Volgograd

AerieniNr. lstarilor

Nr. lstarilor
subterani

Xenia
2
Xenia
2 (1n)
1
2
Xenia F1
2
Valentino
1
1
1
Valebtino
4
1n
1
Valentino F1
5
1

16(1n)
4(1n)
4
n Oronanche cumana necrotizat

Orobanche cumana
Rostov
Nr. Tuberculelor

AerieniNr. lstarilor

subteraniNr. lstarilor

Genotip

Nr. tuberculelor

Orobanche cumana
Moldova

1
1
2
7
11

13
2
6
4
15
32
72

1
4
3
8
9
9
34

3
1
3
3
2
2
14

3
1
6
4
8
7
29

7
6
12
15
19
18
77

Linia matern a hibridului Valentino este mai rezistent dect linia patern, ceea ce se observa
la toate populaiile cercetate, n special la populaia din Moldova.
n cadrul populaiei autohtone i Volgograd, hibridul Valentino a fost la nivelul rezistenei a
unuia din prini i anume a formei paterne. (fig. 3.4)

48

Populaia de O. cumana din Moldova

Populaia de O. cumana din Rostov

Populaia de O. cumana din Volgograd

Figura 3.4. Numrul de Orobanche cumana la genotipurile de floarea-soarelui infectate cu diferite


populaii de lupoaie, (X familia Xenia, V familia Valentino).

Analiznd manifestrile gradului de infecie dintre formele parentale i hibrid constatm o


dependen de genotip, ct i de originea populaiei, i anume n unele cazuri hibridul se manifesta
asemenea formei paterne (ex. Valentino populaia Volgograd, Valentino populaia Moldova). n
cel de-al doilea caz hibridul fie depete ambele linii parentale (Valentino populaia Rostov, Xenia
populaia Volgograd), fie este mult mai inferior acestora (Xenia populaia Moldova). n cel de al
treilea caz hibridul are o manifestare intermediar formelor parentale (Xenia populaia Rostov).
n baza cercetrilor efectuate putem conchide c populaia de lupoaie din Volgograd a avut cel
mai nalt grad de infecie, fiind cea mai virulent, comparativ cu populaiile din Rostov i Moldova.
S-a constat c hibridul Xenia i liniile parentale ale acestuia au manifestat un gard de rezisten mai
nalt (au fost mai puin afectate) n comparaie cu hibridul Valentino i formele lui parentale, la
toate cele trei populaii (Moldova, Rostov, Volgograd) de lupoaie cercetate. Cercetrile efectuate au
pus n eviden dependena gradului de infecie de genotip, ct i de originea parazitului, de

49

asemenea s-a constatat c hibridul se manifesta fie ca una dintre liniile parentale sau intermediar
acestor forme.
3.2. Influena temperaturii asupra gradului de infecie al lupoaie la unele genotipuri de
floarea-soarelui
E cunoscut faptul c factorii abiotici, i nu n ultimul rnd temperatura, reprezint indicele
cheie ce influeneaz interaciunea gazd-parazit [Sauerborn J,1989]. Procesele morfologice la floareasoarelui depind, n mare msur de reacia de rspunsul a plantei la condiiile nefavorabile ale
mediului i de capacitatea de adaptare la factorii de stres. Unul dintre factorii de stres, la etapa
iniial de dezvoltare a plantelor este temperatura care influeneaz creterea i dezvoltarea att a
plantelor de cultur, ct i a paraziilor acestora. n acest context s-a studiat interrelaiile gazd parazit - temperatur la unele genotipuri de floarea-soarelui.
Studiul influenei temperaturii asupra gradului de infecie s-a efectuat n dou variante
experimentale care substanial se deosebesc dup condiiile de cretere i dezvoltare. Astfel, prima
experien (varianta I) a fost realizat la temperatura medie (Tm) a aerului de 15C, variind ntre
10-18C, Tm a solului - 13C, cu o variaie ntre 8-17C; cea de-a doua experien (varianta II) s-a
efectuat la Tm a aerului de 28C, variind de la 23-31C, iar Tm a solului - 25C, variind ntre 2130C (fig.1.).
Plantele crescute n condiiile variantei I au fost cultivate i au atins fazele preconizate n
experiment timp de 11 sptmni (77 zile), pe cnd cele din varianta II - 6 sptmni (42 zile). n
ambele cazuri plantele au atins faza de 4 - 5 frunzulie adevrate. Primele genotipuri de floareasoarelui, care au rsrit la suprafaa solului n varianta I au fost hibridul Xenia i linia a acestuia
(la a 2 zi de la plantare), apoi a rsrit hibridul Valentino (la a 3 zi), Valentino (la a 4 zi),
Valentino (la a 5 zi) i Xenia (dup 7 zile).
n cazul variantei II, cu temperatura medie a aerului de 28 C toate plantele au rsrit n
primele trei zile din momentul plantrii, genotipurile hibride (Xenia i Valentino) ca i n cazul
variantei I au aprut printre primele.
Temperaturile joase, deci, au determinat att ntrzierea germinrii i rsririi genotipurilor
de floarea-soarelui studiate, ct i apariia primei perechi de frunze adevrate. Astfel la varianta I
faza primei perechi de frunze adevrate s-a evideniat dup 15-25 zile, n dependen de genotip, n
timp ce la varianta II - la 8-10 zile, iar faza de butonizare s-a atestat doar la hibridul Valentino dup
11 sptmni de cretere i dezvoltare, la varianta II dup 6 sptmni la hibrizii Valentino i
Xenia (fig.3.5.).

50

14

21

28

35

42

49

56

63

70

77

14

21

28

35

42

Fig 3. 5. Condiiile model ale experimentului: A varianta I, B varianta II


- rsrirea platulelor,
- faza I pereche de frunzulie,
- apariia lupoaiei la suprafa,
- faza de butonizare

Variaia temperaturii i infecia cu lupoaie au determinat modificarea indicilor morfologici.


S-a constatat c genotipurile cercetate, supuse stresului biotic stagneaz n dezvoltare, rmn
pipernicite, cu tulpini subiri i formeaz capitule mici.
Datele din literatur relev c n cazul unui atac timpuriu, plantele nu formeaz calatidii sau,
dac formeaz, acestea sunt mici, degenerate cu majoritatea seminelor seci. Cnd atacul se produce
n stadiul de dezvoltare mai avansat, simptomele sunt slab vizibile, gravitatea acestora fiind
dependent de intensitatea atacului [Vrnceanu A.V.,1986].

51

nlimea plantelor poate servi drept un parametru al intensitii proceselor de cretere (28,
278 ab), un interes prezentnd variaia parametrului dat n ontogenez la aciunea factorilor
nefavorabili.
Studiul nlimea plantelor infectate i martor n varianta I (Tm = 15 C) a variat pe parcursul
ontogenezei. Astfel la hibridul Xenia i formele parentale a acestuia aciunea stesului biotic n
primele zile (14 zile) s-a manifestat printr-o cretere uoar a valorilor nlimii (fig. 3.6.). O dat
cu creterea i dezvoltarea plantelor se constat o reacie diferit a genotipurilor. La forma matern
n majoritatea cazurilor se atest o scdere a valorii parametrului studiat, pe cnd la plantele liniei
paterne se observ o cretere comparativ cu martorul. Genotipul heterozigot are o manifestare
diferita a caracterului dat. Dupa 3-4 saptamani de cultivare acesta a avut o valoare mai mic fa de
martor, ns dup 40 de zile se constat valori la nivelul martorului. Hibridul Xenia pe parcursul
fazelor ontogenetice n condiii normale, ct i la infecie posed valori similare liniei materne, iar
la forma patern se atest valorile cele mai mici ale nlimii plantelor.
nlimea plantei, cm

Fig. 3.6. Dinamica nlimii plantelor de floarea soarelui cultivate pe fond infectat i neinfectat
la Tm de 15 C, Xenia , Xenia , Xenia F1

Analiza n dinamic a nlimii plantelor de floarea-soarelui n cazul variantei II (Tm = 28 C)


a scos n eviden un tablou similar la hibridul Xenia i formele parentale. Valorile indicelui fiind
mai mici la plantele infectate (fig.3.7.).
Studiul comparativ a genotipurilor date a relevant c hibridul de prima generaie cultivat n
condiii normale depete ambele forme parentale, totodat la genotipurile infectate la primele
etape de cretere i dezvoltare (7-21 zile) hibridul F 1 depete nesemnificativ forma matern, pe
cnd ncepnd cu a 28 zi de cultivare pe fond infectat la genotipul dat se constat o scdere a
nlimii plantelor (cu 1-3cm). Parametrului studiat la linia patern asemenea variantei I are valori
mai mici n comparaie cu hibridul i forma matern, att n cultivat n condiii normale, ct i la
aciunea agentului patogen.

52

nlimea plantei, cm

Fig.3.7 . Dinamica nlimii plantelor de floarea soarelui cultivate pe fond infectat i neinfectat
la Tm de 28 C, Xenia , Xenia , Xenia F1

Analiza valorilor nlimii la hibridului Valentino i la formele parentale a permis s constatm


c n varianta I la aceste genotipuri infecia a determinat intensificarea creterii plantelor pe
parcursul etapelor cercetate. Un interes prezentnd genotipul heterozigot care la primele etape (1428 zile) avea valori mai mici comparativ cu martorul, ns n a doua jumtate a perioadei de studiu a
depit martorul cu 2-6 cm (fig.3.8.). nlimea plantelor genotipului hibrid Valentino prevaleaz
formele parentale, aceasta atestndu-se la plantele martor ct i la aciunea stresului. Parametrul
cercetat a variat mai mult la liniile parentale att la infecie, ct i la plantele neinfectate. Astfel,
linia matern a avut o amplitud mai mic n perioada de 7-42 zile, depind forma patern la
etapele urmtoare. La infecie la etapele incipiente i tardive de cultivare (7-21, 56-70 zile) forma
matern a avut valori a nlimii plantei mai mari comparativ cu linia patern, n intervalul 28-49
zile linia patern a depit nesemnificativ genotipul matern.
nlimea plantei, cm

Fig.3.8 . Dinamica nlimii plantelor de floarea soarelui cultivate pe fond infectat i neinfectat
la Tm de 28 C, Valentino , Valentino , Valentino F1

53

Infecia n varianta II a provocat o cretere a nlimii la liniile parentale pe parcursul fazelor


ontogenetice, cu o mic excepie, la forma patern la etapele tardive se observ o inhibare/ncetinire
a proceselor de cretere (fig.3.9.). Genotipul hibrid contrar variante I capt valori mai mici fa de
martor, ns depete formele parentale att la plantele infectate, ct i la martor. Genotipurile
homozigote infectate au o reacie diametral opus n comparaie cu martorul. Astfel, la plantele
liniei materne martor valorile acestui indice au fost mai mici dect la linia patern, pe cnd la
infecie genotipul patern a avut valori mai mici
nlimea plantei, cm

Fig. 3.9 . Dinamica nlimii plantelor de floarea soarelui cultivate pe fond infectat i neinfectat
la Tm de 28 C, Valentino , Valentino , Valentino F1

La momentul demontrii experienei s-a constatat pstrarea legitii observate pe parcursul


fazelor ontogenetice. Astfel, n varianta I s-a observat la unele genotipuri o diminuare a nlimii
plantelor atacate de parazit, cum ar fi hibridul Xenia i forma matern a acestuia, ce au dimensiuni
mai joase cu 2 6 cm fa de martor, excepie fcnd doar linia patern, la care nlimea plantelor a
fost la nivelul martorului (tabelul 3.4).
Tabelul 3.4.
Variaia nlimii plantelor de floarea - soarelui la interaciunea gazd - parazit temperatur

Valentino

Xenia

Genotipul

Varianta I
nlimea plantelor, cm

Varianta II

martor

infectat

% fa
de
martor

36,95 1,46

34,75 1,46

12,82 4,70

F1

nlimea plantelor, cm
martor

infectat

% fa
de
martor

94,1

38,76 2,57

32,71 4,64*

84,4

13,89 2,5

108,3

24,91 3,89

13,88 2,55**

55,7

37,44 3,25

31,35 3,4*

83,7

40,83 2,01

31,0 2,84*

75,9

34,5 4,58

33,35 4,26

96,7

26,71 3,38

30,58 3,39

114,5

23,64 3,24

25,13 3,13

106,3

33,45 2,98

29,12 2,48*

87,1

F1

39,8 2,41

41,95 2,33

105,4

44,94 2,16

37,73 1,51*

83,9

* - diferena este statistic autentic cu un prag de semnificaie de 95%

54

** - diferena este statistic autentic cu un prag de semnificaie de 99%

Aceast legitate se observ i n cazul variantei II, atestndu-se diminuarea creterii


plantelor cu 16 54% n comparaie cu martorul, mai evident fiind la linia patern (cu 11,03 cm).
Hibridul Valentino i formele parentale ale acestuia se caracterizeaz prin valori mai stabile
ale nlimii n varianta I, iar n unele cazuri se observ o majorare nesemnificativ cu 1,5 2 cm la
varianta infectat. Spre deosebire de linia patern i hibrid nlimea plantelor la linia matern
rmne la nivelul martorului, n timp ce n cazul variantei II la aceast linie se observ o cretere a
plantelor n nlime depind martorul cu 4 cm, dar aceast majorare se ncadreaz n limitele
semnificative ale diferenei. Totodat menionm c linia patern i hibridul pe fon infectat, se
caracterizeaz printr-o scdere vdit a creterii plantelor n nlime cu 4,5-7 cm n comparaie cu
martorul. Aceast diminuare, coreleaz cu dezvoltare intensiv a ataamentelor de lupoaie pe
sistemul radicular a acestor genotipuri (fig. 3.11.).
Productivitatea plantelor depinde, n mare msur de numrul de frunze a plantelor i de
suprafaa foliara, deoarece plantele ce nu ating o suprafa optimal sunt mai puin productive.
Influena temperaturii i a parazitului asupra numrului de frunze nu s-a manifestat vdit
(tabelul 3.5). Numrul de frunze la o plant se afl n limitele 6-9 i variaz mai mult n dependen
de genotip i mai puin de factorii studiai.
Tabelul 3.5.
Variaia numrului de frunze la diferite genotipuri de floareasoarelui la interaciunea
gazd - parazit - temperatura
Varianta I

Valentino

Xenia

Genotip

Varianta II

martor

infectat

%faa
de
martor

8,1 0,33

7,54 0,64

93,08

9,33 0,83

8,50 1,21

91,1

6,25 2,02

6,88 0,61

110,04

8,60 0,78

7,80 1,30

90,7

F1

8,45 0,85

8,09 0,29

95,74

9,50 1,10

8,54 0,88

100,5

9,0 1,24

7,0 0,72

77,8

7,4 1,78

8,00 1,24

108,1

7,1 0,67

7,16 0,56

100,1

8,75 0,61

7,69 0,41

87,9

F1

9,1 0,76

9,45 0,53

103,85

8,92 0,65

7,85 066

88,0

Numrul de frunze

martor

infectat

% faa
de
martor

Numrul de frunze

O micorare mai pronunat la actiunea lupoaiei se relev n cazul variantei II, unde la toate
genotipurile cu excepia liniei materne (Valentino), se constat o cretere nesemnificativ. La
varianta I majoritatea genotipurilor se menin la nivelul martorului, pe cnd la celelalte se observ o
micorare. ns nu ntotdeauna numrul de frunze asigur o suprafa foliar optimal, ci suprafaa
fiecrei frunze n parte poate dezvolta un aparat foliar productiv. Determinnd suprafaa foliara
55

(fig.3.10.), am constatat ca acest parametru se schimb esenial sub influena temperaturii i a


lupoaiei.

Varianta I

Varianta II

Fig. 3.10. Modificarea suprafeei foliare (cm la o planta) la diferite genotipuri de floarea-soarelui la
interaciunea gazd - parazit temperatur.

Astfel, la hibridul Xenia i linia matern a acestuia din varianta I, suprafaa foliar a
plantelor infectate scade cu 29-39%, excepie fcnd linia patern, avnd suprafaa foliara mai
sporit cu 36,5% fa de martor. Aceast legitate nsa, nu se depisteaz n condiiile de cultivare la
varianta II, observndu-se o diminuare a suprafeei foliare a plantelor infectate cu lupoaie, cu 12,435%. Excepie prezint hibridul F1 care rmne la nivelul martorului.
Hibridul Valentino i linia lui matern se caracterizeaz printr-o scdere vdit a suprafeei
foliar cu 30 37% faa de martor, fiind influenat att de temperatur, ct i de lupoaie, ceea ce nu
se relev la linia patern avnd valori la nivelul martorului. n cazul variantei II la plantele infectate
cu lupoaie se relev o diminuare semnificativ a suprafeei foliare la toate genotipurile cercetate cu
circa 38% fa de martor, cu excepia hibridului Xenia, la care acest parametru se menine la nivelul
martorului.
Temperatura influeneaz att creterea i dezvoltarea florii-soarelui, ct i dezvoltarea
paraziilor acesteia. Numeroase raporturi au artat c germinarea seminelor de lupoaie este
accelerat de temperaturi ridicate, cu creterea ulterioar a nivelului de infecie, n timp ce
temperaturile joase rein dezvoltarea parazitului.[ Foy C.,1992, Kasasian L.,1973, Sauerborn J., 1989,Van
Hezewijk M.J,1989],

care s-au constatat i n cazul experienei noastre.

Astfel n varianta I apariia parazitului la suprafaa solului nu s-a observat pe parcursul


creterii plantelor timp de 11 sptmni, fiind doar depistat numai pe sistemul radicular. n varianta
II lupoaia a aprut la suprafaa solului la cea de-a 4 sptmn (dup 31 zile) la hibridul Xenia, mai
trziu la linia patern a acestuia i la linia matern a hibridului Valentino.
Temperatura optim de germinarea a O. cumana este de 20 C (4), iar dup Sauerbon (1989)
germinarea i ataarea parazitului are loc n intervalul de 20/10 25/15 C(zi/noapte), pe cnd la
56

linia inbrid HA-89 s-a observat un grad de atac mare la temperatura de 15 C i scade odat cu
creterea acesteia [Sukno S, 2001]. Deci populaiile de O. cumana sunt capabile s infecteze floareasoarelui ntr-un spectru larg de temperaturi, pn la 27C, variind n dependen de genotipul floriisoarelui, ct i de populaia de lupoaie.
Rezultatele cercetrilor nu au scos n eviden o legitate strict ntre temperatur genotip infecie. Astfel, n varianta I, la dou dintre liniile parentale studiate (Xenia i Valentino) s-a
constatat o creterea a gradului de infecie, iar la celelalte dou linii (Xenia i Valentino) o
diminuare, pe cnd la varianta II s-a observat o reacie invers a liniilor parentale. La hibrizi, gradul
de infecie n variantele studiate, s-a meninut la nivelul limitei semnificative a diferenei, ceea ce
denot o labilitate i adaptare a genotipurilor heterozigote la condiiile mediului. Cu toate acestea
comparnd ntre ei formele hibride s-a constatat c Valentino F 1 este mai sensibil la atacul
parazitului (fig. 3.11.) fiind atestat cel mai mare grad de infecie ceea ce s-a relevat i n studiile
anterioare [Popescu V.,2007].

Xenia

Xenia

Xenia F1

Valentino

Valentino

Valentino F1

Fig. 3.11. Influena temperaturii asupra dezvoltrii ataamentelor de lupoaie la diferite genotipuri de
floarea-soarelui.

n ceea ce privete cota procentul de infecie al genotipurilor studiate, s-a constata c la


temperaturile nalte aceasta crete cu 8-33% la ambele variante cu excepia liniei materne Valentino
la care se atest o scdere cu 40%.
Deci, din datele obinute rezult c temperatura are un rol primordial n interrelaia planta
gazd parazit. Temperaturile joase rein dezvoltarea parazitului, astfel nct acesta nu afecteaz
planta gazd, n timp ce temperaturile nalte grbesc creterea i dezvoltarea parazitului i respectiv
diminuarea indicilor morfo-fiziologici precutai.
Rezultatele cercetrilor au scos n eviden c gradul de infecie, la hibrizii Xenia i
Valentino n variantele studiate, s-a meninut la nivelul limitei semnificative a diferenei, ceea ce
denot o labilitate i adaptare a genotipurilor heterozigote la condiiile mediului. Totodat
comparnd aceste genotipuri hibride s-a constatat c Valentino F1 este mai sensibil la atacul
parazitului, fiind atestate cele mai multe ataamente pe rdcini.
57

3.3. Dinamica dezvoltrii parazitului pe sistemul radicular a plantei-gazd


Studiul n dinamic a parazitului lupoaia la hibrizi Xenia i Valentino i formele parentale s-a
realizat n intervalul de 15-60 zile. Primele ataamente s-au constatat la 15 zile la liniile parentale
ale ambilor hibrizi, lipsind la genotipurile heterozigote (tabelul3.6), iar cele mai multe atestndu-se
la linia matern Valentino.
Tabelul 3.6.
Evaluarea gradului de atac la diferite etape de dezvoltare a plantei-gazd
Genotip
Xenia
Xenia
Xenia F1
Valentino
Valentino
Valentino F1

Numrul de ataamente de lupoaia per plant


dup 20 zile
dup 30 zile
dup 40 zile
dup 50 zile
1,5 0,72
9,6 3,74
11,3 2,64
15,0 2,00
0,2 0,01
2,0 0,90
4,0 1,02
5,0 1,50
0,2 0,02
12,8 4,74
23,5 6,70
11,1 3,00
1,0 0,32
6,6 0,51
11,0 4,0 0
30,4 1,00
0,68 0,09
10,7 2,28
13,4 3,66
25,3 2,00
0,2 0,05
9,2 2,35
15,2 3,88
43,7 6,00

dup 15 zile
0,17 0,04
0,16 0,01
0
0,5 0,05
0,4 0,03
0

dup 60 zile
13,3 2,00
8,0 2,00
13,1 2,70
26,0 6,60
14,6 2,40
20,0 2,60

Creterea i dezvoltarea parazitului s-a evaluat periodic, din 10 n 10 zile. Analiza n dinamic
a parazitului ne-a permis s constatm c numrul acestuia crete constant pn la perioada de 50
zile de cultivare, apoi la urmtoarea etap, descrete cu 11,0-54,2 % la toate genotipurile studiate,
cu excepia hibridului Xenia i forma patern a acestuia, la care s-a observat o evoluie diferit a
agentului patogen (fig. 3.12). Astfel, la genotipul patern Xenia s-a atestat o cretere numeric a
lupoaiei pe parcursul ntregii perioade de studiu, pe cnd la genotipul heterozigot maximul de
ataamente s-a constata/relevat dup 40 de zile de cultivare (23,5 ataamente/plant) micorndu-se
brusc la urmtoarele etape (11,3-13,3 ataamente/plant)(fig.3.12 a).

Fig. 3.12. Dinamica creterii i dezvoltrii lupoaiei pe sistemul radicular la floarea-soarelui

Comparnd rezultatele obinute, observm ca cele mai multe ataamente au fost prezente la
formele heterozigote pe parcursul etapelor precutate, cu o mic excepie, dup dou luni de
58

cultivare linia matern Valentino a depit genotipul heterozigot cu 30 % (fig.3.12b). Menionm ca


formele parentale a hibrizilor cercetai n mediu au fost mai puin atacai de parazit.
Analiznd detaliat sistemul radicular s-a observat prezena necrozelor. Acestea au aprut la
ultima etap de studiu, dup 60 zile de cultivare, constatndu-se la ambele genotipuri heterozigote
(0,6-0,63 necroze/plant) i la una din formele parentale a acestor hibrizi, la linia matern a
hibridului Xenia (0,2 necroze/plant) i linia patern a hibridului Valentino (0,7 necroze/plant).
Apariia necrozelor dup 8 sptmni conform ipotezei Hibberd (1998) este determinat de o
strns competiie ntre populaia parazitului i nu reprezint o reacie de aprare a plantei-gazd.
Reieind din rezultatele obinute putem afirma ca majoritatea genotipurilor studiate sunt
susceptibile la atacul parazitului, iar linia patern a hibridului Xenia care pe parcursul perioadei de
cercetare a avut cele mai puine ataamente de lupoaie, dar nu foarte puine, ar putea fi considerat
tolerant.
3.4. Evidenierea gradului de infecie la unele genotipuri din colecia laboratorului
Evaluarea gradului de infecie/atac s-a efectual la un ir de genotipuri din colecia
laboratorului: 15 linii materne (forme a hibrizilor Xenia, Valentino, Drofa, Performerc i 11 linii
numerotate convenional ASC1-ASC11), 3 linii paterne (formele a hibrizilor Xenia, Valentino,
Drofa), 10 hibrizi dintre care cinci de origine autohton (Drofa, Olea, Oxana, Vitalia, Xenia), patru
de origine Romnia (Alcazar, Favorit, Performer, Turbo) i unul de Iugoslavia (Valentino). Plantele
de floarea-soarelui au fost cultivate n vase de vegetaie, n aer liber (afar) timp de dou luni (60
zile). Pe parcurs s-a notat genotipurile la care lupoaia a aprut cel mai devreme la suprafaa solului
ct i s-a dus evidena numeric a parazitului pe parcursul creterii i dezvoltrii plantei-gazd.
Astfel, lupoaia la suprafaa solului s-a observat la a 45 zi de cultivare la linia ASC 3, urmat mai
trziu de hibrizii Performer, Vitalia i Oxana, iar cel mai tardiv s-a constatat la a 55 zi la genotipul
ASC 11. Rsrirea lupoaiei s-a atesta la toate genotipurile studiate, iar numrul acestora a fost n
dependen de genotip. Observaiile efectuate au fost apreciate n baza metodei Pustovoit ( Aydin,
1996)

sub form de frecven atacului (F,%), intensitate atacului (I) i rata atacului/gradul de atac

(RA) (tabelul 3.7).


Plantele ce posed o frecvena a atacului de 0-10 % i respectiv o rata a atacului de la 0-1 sunt
considerate genotipuri rezistente (Vrnceanu A.V., 1980). Plantele ce capt o frecven de 10-20% sunt
acceptate ca fiind tolerante (Kaya Y., 2004).

59

Tabelul 3.7.
Evidenierea lupoaiei la suprafaa solului dup 60 zile de cultivare
Genotip

F1

ASC 1
ASC 2
ASC 3
ASC 4
ASC 5
ASC 6
ASC 7
ASC 8
ASC 9
ASC 10
ASC 11
Drofa
Performer
Valentino
Xenia
Drofa
Valentino
Xenia
Drofa
Olea
Oxana,
Performer
Vitalia
Xenia
Alcazar
Favorit
Turbo
Valentino

Nr. plantelor de
floarea-soarelui
11
10
12
11
12
9
14
9
8
11
8
12
10
10
10
7
10
8
13
9
10
9
12
9
9
12
11
10

Lupoaia rsrit
la suprafa
1
5
6
11
5
2
16
8
11
13
3
14
9
4
2
27
7
1
19
20
22
18
15
5
7
9
5
14

Plante cu
lupoaie
1
3
4
9
4
2
8
5
7
7
2
8
6
4
2
7
5
1
8
8
10
8
9
4
6
5
4
7

F, %

RA

9,1
30,0
33,3
81,8
33,3
22,2
57,1
55,6
87,5
63,6
25,0
66,7
60,0
40,0
20,0
100
50,0
12,5
61,5
88,9
100
88,9
75,0
44,4
66,7
41,7
36,4
70,0

1
1,6
1,5
1,2
1,3
1,0
2,0
1,6
1,6
1,9
1,5
1,8
1,5
1,0
1,0
3,9
1,4
1,0
2,4
2,5
2,2
2,3
1,7
1,3
1,2
1,8
1,3
2

0,09
0,5
0,5
1,0
0,4
0,2
1,1
0,9
1,4
1,2
0,4
1,2
0,9
0,4
0,2
3,9
0,7
0,1
1,5
2,2
2,2
2,0
1,3
0,6
0,8
0,8
0,5
1,4

Rezultatele afiate n tabelul 6 ne permit s-a afirmm ca din 28 de genotipuri studiate doar
linia ASC 1 se consider a fi rezistent la lupoaia, iar linia patern Xenia tolerant, restul 26 de
genotipuri sunt susceptibile la parazitul dat. Tot odat genotipul matern a hibridului Xenia ce posed
o valoare a frecvenii atacului de 20% se afla la limita plantelor tolerante i susceptibile.
Un interes a prezentat i evaluarea gradului de atac la nivelul sistemului radicular la
genotipurile studiate. Numrul de ataamente de lupoaie pe rdcinile de floarea-soarelui a variat de
la 0,36 la 26. (tabelul 3.8).
Analiza detaliat a sistemului radicular i a ataamentelor ne permite s constatm c 22
genotipuri din cele 28 au fost infectate 100%, adic pe fiecare plant a genotipurilor respective au
fost depistate cel puin cteva ataamente de lupoaie. Pentru 5 genotipuri (ASC2, ASC5, hibrizii:
Alcazar, Favorit, Turbo) procentul dat a variat de la 50 89% i doar un singur genotip a avut 27%
(ASC1 din 11 plante doar la 3 sau observat un numr mic de ataamente).

60

Tabelul 3.8.
Evaluarea gradului de infecie la nivelul sistemului radicular dup 60 zile de cultivare
pe fond infectat
Nr. plantelor de
% de plante
Gradul de atac*
floarea-soarelui
infectate
ASC 1
11
27.3
0.36 0.20
ASC 2
10
50
2,6 1.37
ASC 3
12
100
17.92 1.47
ASC 4
11
100
21.82 2.27
ASC 5
12
83.3
11.42 3.01
ASC 6
9
100
9.11 1.57
ASC 7
14
100
22.07 3.31
ASC 8
9
100
18.78 2.79
ASC 9
8
100
15.00 3.89
ASC 10
11
100
18.27 1.64
ASC 11
8
100
19.25 2.78
Drofa
12
100
14.50 1.72
Performer
10
100
15.30 2.76
Valentino
8
100
26.00 6.64
Xenia
10
100
13.30 2.02
Drofa
7
100
22.57 1.87
Valentino
10
100
13.90 2.42
Xenia
8
100
8.00 5.00
Drofa
13
100
15.92 2.59
Olea
9
100
15.00 2.03
Oxana,
10
100
20.50 0.99
Performer
9
100
21.33 3.00
Vitalia
12
100
15.75 1.66
F1
Xenia
9
100
13.10 2.66
Alcazar
9
88.9
1.88 0.56
Favorit
12
66.7
1.58 0.42
Turbo
11
63.6
0.82 0.26
Valentino
10
100
20.30 2.57
* numrul mediu de ataamente per plante de floarea-soarelui
** numrul mediu de ataamente necrotizate per plant
Genotip

Necroze**
0
0
0.33
0.27
0
0.11
1.21
0.55
0
0.55
0
0.08
0.10
0
0.20
0.29
0.70
0
0.33
0
0.50
0.11
1.92
0.63
0
0
0
0.60

Studiul genotipurilor cercetate au scos n eviden un grad de atac diferit. Astfel, n cadrul
liniilor androsterile indicele dat a variat de la 0,36 26 ataamente per plant. Cele mai puine
atestndu-se linia ASC1, fiind cea mai puin afectat de agentul patogen, iar cele mai multe s-au
constata la linia materna a hibridului Valentino. La formele paterne acesta a variat ntre 8,0-22,6
ataamente/plant, iar la hibrizi a avut valori cuprinse ntre 0,8 i 21.3 ataamente per plant, cele
mai puine constatndu-se la hibrizii Alcazar (1,9), Favotit (1,6) i Turbo (0,8), iar maxim
atestndu-se la hibridul Performer (21,3)(fig.3.13.).

61

Fig. 3.13. Gradul de infecia a genotipurilor de floarea-soarelui dup 60 zile de cultivare

ncepnd cu anii 80 sec XX, la I.C.C.P.T. Fundulea a fost dezvoltat un program intensiv de
creare de hibrizi cu rezisten corespunztoare la atacul noilor rase de lupoaie. O atenie deosebit a
fost acordat lucrrilor de introducere a genei Or6 n genotipul celor mai valoroase linii
cosangvinizate. Hibrizii comerciali Turbo, Favorit i Alcazar, care posed gena Or6 n linia mam,
prezint rezisten complet la toate rasele de Orobanche cumana din Romnia precum i la
spectrul de rase Orobanche cernua existent n Spania.(Vrnceanu AV., 2000) Hibridul Performer
conform acelorai surse nu posed gene de rezisten la lupoaie.
Rezultatele obinute de noi au fost similare/asemntoare cu datelor din literatur. Totodat
valoarea nalt a F% (mai mare de 20%, tabelelul 3.7) la hibrizii rezisteni genetici (Turbo, Favorit
i Alcazar) ne face sa presupunem ca materialul iniial (linia matern) al acestor hibrizi nu a fost pur
si ca rezultat s-a obinut o frecven nalt a infeciei caracteristic genotipurilor susceptibile, fie
lupoaie utilizat corespunde rasei F.
n studiul nostru s-au cercetat trei hibrizi (Drofa, Valentino i Xenia) i liniile parentale ale
acestora. Analiza gradului de atac a hibrizilor respectivi i formele parentale lor a relevat ca hibridul
are valori foarte apropiate cu unul dintre prini . Astfel, hibridul Drofa (15,9) se aseamn cu linia
matern (14,5); hibridul Valentino (20,3) forma matern (26,0); hibridul Xenia (13,1) linia
matern (13,3). Reieind din rezultatele date putem afirma ca caracterul dat se transmite de la
genotipul homozigot matern.

62

CAPITOLUL IV. ASPECTE BIOCHIMICE ALE INTERACIUNII DIFERITOR


GENOTIPURI DE FLOAREA-SOARELUI CU OROBANCHE CUMANA WALLR
4.1. Aspecte ale statutului oxido-reductor la unele genotipuri de floarea-soarelui atacate
de lupoaie
Infectarea plantelor de floarea-soarelui cu lupoaie, prin penetrarea de ctre parazit a celulelor
din sistemul radicular, provoac un efect de stres. Celulele rspund la semnalele mecanice sau
chimice din peretele celular prin modificarea diferitor indici ai metabolismului celular [ Goldwasser Y
1999, Joel D.M

1998, Perez-de-Luque A.,2005, Serghini K., 2001] i difuzeaz aceste semnale, preponderent

la nivel de plasmodesme n tot corpul plantei.


Una dintre reaciile primare ale plantelor la aciunea factorilor externi este stresul oxidativ
sau explozia oxidativ, determinat de modificarea potenialului electrochimic membranar i de
aciune [Duca M, A. Port A 1995], care poate fi monitorizat prin cuantificarea potenialului redox, a
metaboliilor asociai cu stresul oxidativ (peroxidul de hidrogen, glutationului etc.), a enzimelor
metabolismului oxidativ (catalaza, peroxidaza etc.) i a proteinelor de oc [Cassells A.C 2001].
Rezultatele obinute de noi n cadrul analizei semicantitative a H 2O2 prin colorare cu ajutorul
DAB a atestat prezena acestuia n frunze att n condiii normale, ct i n urma atacului, ns n
concentraii diferite. Astfel, la familia Xenia, acumularea excesiv a H2O2 s-a depistat la toate
genotipurile att n norm ct i pe fon de infecie. Prezena peroxidului s-a manifestat cel mai
pronunat la forma patern i hibrid, indicnd astfel o specificitate de genotip (fig.4.1.1).

control

F1

F1

infectat

Fig. 4.1.1. Acumularea peroxidului de hidrogen la familia Xenia


(sgeile arat zonele ntunecate unde a avut loc acumularea peroxidului)

O vdit reacie de rspuns la atacul patogenului a fost atestat la familia Valentino, unde la
control, H2O2 practic nu este prezent, pe cnd la plantele afectate de lupoaie, s-a atestat o

63

acumulare excesiv a acestuia la toate genotipurile familiei, dovad a reaciei de rspuns la atacul
lupoaiei (fig. 4.1.2.).

F1

infectat

control

ntruct orice

F1

Fig. 4.1.2. Acumularea peroxidului de hidrogen familia Valentino


(sgeile
arat
zonele
ntunecate
unde a avut
loc acumularea
peroxidului)
reacie de
stres
provoac
acumularea
excesiv
a peroxidului
de hidrogen,

ca una

dintre reaciile primare de rspuns [Apel K 2004, Orozco-Cardenas M 2001] i reieind din faptul, c
planta parazit - lupoaia produce cantiti mari de antioxidani [ Viron C 1998] considerm demonstrat
rolul sistemului redox n interaciunea parazit-gazd [Chamnongpol S 1998, Mittler R 1999]. Deoarece
familia Xenia pune n eviden un nivel sporit de toleran fa de lupoaie, comparativ cu celelalte
genotipuri cercetate, putem considera c concentraiile sporite ale peroxidului, constatat la
genotipurile care alctuiesc aceast familie se asociaz cu majorarea rezistenei fa de patogeni.
Infectarea florii-soarelui cu acest parazit intensific puternic acumularea H2O2 la locul infeciei,
fiind determinat de un complex de mecanisme de reglare a coninutului acestora [Hung S.H. 2005],
dar nu este clar dac acumularea H 2O2 este declanat de planta gazd, de parazit, sau de ambele
organisme [Sauerbon J.2002].
Reglarea i autoreglarea coninutului SRO n plante se realizeaz la nivel de mecanisme
enzimatice

(aciunea

superoxiddismutazei,

catalazei,

(antioxidanii, glutationul), care contribuie la

peroxidazei

etc.)

neenzimatice

meninerea echilibrului oxido-reductor i

homeostaziei celulare [Hung S.H 2005].


Rezultatele cercetrilor asupra activitii catalazei (CAT, EC 1.11.1.6.), una dintre cele mai
rspndite enzime din clasa Oxidoreductazelor, cu funcie de protecie a celulelor contra SRO a
demonstrat, c activitatea CAT n frunzele genotipurilor infectate de floarea-soarelui scade fa de
control.
n frunze se expreseaz gena cat1, care codific una dintre formele izoenzimatice ale
catalazei (CAT-1), activ n primele etape ontogenetice ale plantei [Schultes N. P 1994]. Deoarece la
genotipurile de floarea-soarelui analizate a fost atestat acumularea SRO, s-a presupus c activitatea
64

CAT este redus din cauza supresiei genei cat1 [ Chamnongpol S 1998], ntruct se cunoate c n urma
majorrii SRO n celulele supuse stresului, scade activitatea enzimei [ . 2001] ceea ce sa observat la plantele studiate n condiii normale i infectate.
Astfel activitatea CAT variaz ntre 17,89-83,67 ml O2/1g m.v., cele mai mari valori ale
activitii enzimei n frunze la familia Xenia s-au constatat la linia matern, valorile obinute la linia
paterna si hibrid fiind la nivelul genotipului matern. Pe fundal de infecie, activitatea CAT scade la
toate genotipurile familie Xenia cu 76,43% la linia matern, 34,65% la linia patern i 20,86% la
hibrid (fig.4.1.1.).
Activitatea CAT la genotipurile, care alctuiesc familia Valentino atest valori mai mici fa de
familia Xenia n condiii normale, rezultatele fiind confirmate i de prezena redus a H 2O2 (foto. 2),
excepie fcnd hibridul care are valori de 83,67 ml O2/1g m.v. La genotipurile parentale activitatea
enzimei, variaz nesemnificativ ntre 50,0-45,89 ml O2/1g m.v. Pe fon de infecie, se atest o
scdere a activitatea catalazei, cu excepia genotipului matern unde s-a observat o cretere
nesennificativ, pe cnd la hibrid - se atest o diminuare cu 49,11% a CAT.

XENIA

VALENTINO

Fig. 4.1.1. Activitatea catalazei n frunzele plantelor de floarea-soarelui

( ** - p<0,01, *- p<0,05)
XENIA

ntruct lupoaia este un rizoparazit, percepia (la nivelul receptorilor) i transmiterea


semnalelor (preponderent prin xilem i floem) ca rezultat al infectrii se iniiaz la nivelul
sistemului radicular. Din aceste considerente s-a studiat activitatea catalazei n rdcinile plantelor
de floarea-soarelui n condiii normale de cretere i pe fundal de infecie cu lupoaie. Am constatat,
c activitatea enzimei este mai redus comparativ cu datele obinute la nivelul frunzelor i variaz
n limitele de 3,56-15,78 ml O2/1g m.v. Cele mai mari valori, s-au obinut la genotipul patern al
familiei Xenia. Pe fon de infecie se observ o diminuare nesemnificativ a activitii CAT la linia
matern i hibrid i semnificativ (cu 19,01% ) - la linia patern (fig. 4.1.2).
65

XENIA

VALENTIO
Fig. 4.1.2. Activitatea catalazei n rdcina plantelor de NO
floarea-soarelui
NOB
( ** - p<0,01, *- p<0,05)
Diminuarea activitii catalazei n frunze n condiii de infectare coreleaz cu cea din rdcin,
doar n cazul genotipurilor familie Xenia, pe cnd la genotipurile din familia Valentino s-a atestat
fenomen invers, observndu-se o majorare semnificativ a activitii enzimei n sistemul radicular
la genotipurile infectate (21,95-93,60%). Sporirea activitii CAT poate fi explicat prin acumularea
excesiva a SRO n plant, n special la locul infeciei, acumularea dat fiind declanat att de
planta gazd, ct i de parazit [Sauerbon J 2002]. Totodat am stabilit c valorile parametrului studiat
la genotipurile infectate nu se deosebesc semnificativ (Valentino 8,0 ml O2/1g m.v., Valentino
8,17 ml O2/1g m.v., Valentino F1 - 8,11 ml O2/1g m.v.,).
Astfel, rezultatele obinute ne demonstreaz c familia Valentino este susceptibila la atacul
lupoaiei.
4. 2. Aspecte moleculare ale metabolismului proteic n patosistemul Helianthus annuus l.
Orobanche cumana wallr
Rezistena plantelor reprezint o particularitate biologic complex, poligenic asigurat de
mecanisme moleculare i fiziologice specifice i nespecifice cu caracter adaptiv, direcionate spre
asigurarea desfurrii normale a proceselor vitale n condiiile nefavorabile ale mediului extern.
n aspect morfologic, rezistena la Orobanche cumana este caracterizat de numrul redus de
ataamente per plant, ca rezultat al mecanismelor pasive i active ale genotipurilor: existena
formaiunilor periferice care pot constitui obstacole n calea ptrunderii agentului patogen (stratul
de cuticul, suber, particularitile epidermei etc.) i particularitile chimico-fiziologice ale
rezistenei pasive (aciditatea sucului celular, valoarea presiunii osmotice, substanele existente n
sucul celular antibiotice, fenoli i derivaii lor, alcaloizi, fitohormoni, uleiuri volatile, etc.). n
aspect molecular, un rol important revine rezistenei active determinat de reacia de

66

hipersensibilitate care cuprinde totalitatea modificrilor morfologice i fiziologice ce provoac


moartea prematur (necrotizarea) a esutului infectat /Prvu; Vranceanu, 2000/.
Plantele n cursul evoluiei au elaborat ca rspuns la atacul patogenilor o varietate de
mecanisme de aprare (Bowles DJ, 1990, Bol J, 1990, Linthorst HJ, 1991). Interaciunea gazd-parazit,
de obicei, provoac o cascad de schimbri metabolice, n funcie de nivelul de rezisten al
plantelor infectate stabilind un echilibru funcional dintre plant i agresor. Conform datelor din
literatur, plantele rezistente la lupoaie n stadiile timpurii de dezvoltare a parazitului manifest
mecanisme alternative de aprare, care se manifest prin reducerea capacitii de germinare a
patogenului, necrotizarea esutului la locul infeciei sau inhibarea procesului de formare a
tuberculelor (Rubiales et al. 2004)
n procesul dezvoltrii ontogenetice, rezistena plantelor se modific, n cadrul limitelor normei de
reacie, n funcie de vrsta plantelor i a organelor, ct i de condiiile externe ce acioneaz la
diferite faze ale perioadei de vegetaie, rezistena plantelor fiind corelat cu acumularea local sau
sistemic a unor compui proteici (Jean-luc Jung, Bernard Fritig, 1997; M. Castillejo 2004, 2007).
Atacul patogenului afecteaz esenial metabolismul celular al plantelor, cauznd modificri
calitative i cantitative notabile n complexul proteic, schimbri ce reflect intensitatea rspunsului
defensiv al genotipurilor.
n scopul evidenierii particularitilor biochimice ale interaciunii gazd-parazit s-a realizat
SDS-electroforeza proteinelor sumare la plantele neinfestate i infestate, n cadrul a dou familii de
floarea-soarelui (Xenia i Valentino), genotipuri ce se deosebesc dup sensibilitatea la lupoaie.
Analiza SDS-PAGE a proteinelor extrase din rdcinile a ase genotipuri de floarea-soarelui a
relevat prezena n gel aproximativ a 30 de componeni proteici cu masele moleculare cuprinse n
diapazonul 10.0-120.0 kDa, dintre care 14 fracii polipeptidice au fost polimorfe.

4.2.1. Analiza spectrului polipeptidic la nivelul sistemului radicular


4.2.1.1. Varietatea spectrului polipeptidic la diverse genotipuri de floarea soarelui n cadrul
familiei Xenia la nivelul rdcinilor
Rezultatele obinute la analiza proteinelor sumare din rdcinile plantelor martor n cadrul
familiei Xenia (genotipului hibrid i liniile parentale ale acestuia), au pus n eviden prezena a
unui numr diferit de fracii polipeptidice n funcie de genotip. Astfel, la 15-20 zile de cultivare s-a
atestat prezena a 29-34 de benzi polipeptidice, numrul acestora crescnd la 30 de zile de cultivare
(32-40 benzi), iar la a 40 zi s-a observat o diminuare a numrului de fracii polipeptidice, urmat de
o cretere a acestora la 50-60 de zile (30-34 fracii polipeptidice). Pe parcursul perioadei de cretere,
cu excepia perioadei de 30 i 40 de zile, la genotipul matern s-a atestat prezena celor mai multe
67

benzi polipeptidice (30-34 benzi), 29 polipeptide la forma patern i 31-32 fracii la hibridul de
prima generaie, modificri substaniale atestndu-se la etapa de dezvoltare de 30 zile (fig. 1).
n spectrele polipeptidice ale tuturor genotipurilor studiate au fost prezente proteine comune
cu o pondere mare, medie i mic n funcie de intensitatea benzilor proteice.
Polipeptidele ce predomin n spectrul electroforetic la toate etapele de dezvoltare analizate
sunt reprezentate de fraciile cu Mr 82.4, 58.0, 55.3 i 39 kDa proteine abundente.
Grupul de polipeptide cu o intensitate medie variaz numeric de la o etap la alta cu o medie
de 12 fracii polipeptidice, numrul minim fiind atestate la 15 zile (opt fracii polipeptidice 76.5,
48.8, 44.2, 36.2, 28.5, 23.1, 16.5, 15.1 kDa), iar maxim la 40 de zile (16 benzi polipeptidice 87.0,
84.5, 76.5, 68.5, 48.8, 44.2, 36.2, 28.5, 26.2, 23.1, 16.5, 15.7, 15.1, 13.4, 12.7, 12.1 kDa), comune
pentru toate spectrele polipeptidice fiind benzile cu Mr: 48.8, 44.2, 36.2, 28.5, 23.1, 16.5 i 15.1
kDa.
Fraciile proteice de intensitate joas a colorantului sunt reprezentate de benzile cu greutatea
molecular mare 120.0-105.7 kDa, ct i de cele cu greutatea molecular mic 31-29, 26-24, 1917.5, 11.5-10 kDa.
Analiza comparativ a profilului proteic al plantelor neinfestate de floarea-soarelui n cadrul
familiei Xenia la cele ase etape de studiu a relevat deosebiri nesemnificative n paternul
polipeptidic al genotipurilor cercetate la a 15 zi de cultivare. Diferene, atestatdu-se totui, la
nivelul fraciilor cu mas molecular relativ mare (84.5-120kDa) i mic (10-13.4kDa) care sunt
slab evideniate sau practic lipsesc la unele genotipuri.
Spectrele polipeptidice ale genotipurilor homozigote i a celui heterozigot au pus n eviden
nivele de omologie nalt i heterogenitate destul de redus pe parcursul tuturor etapelor studiate, cu
excepia unor mici deosebiri ce apar n timpul creterii i dezvoltrii plantelor, ncepnd cu cea de-a
20-a zi de cultivare, cnd polipeptidele cu masa molecular mare se evideniaz mai bine. Astfel, la
forma matern au fost puse n eviden componenii proteici cu masa molecular 105.7 i 111.1
kDa, care lipsesc la linia patern i fraciile cu masa molecular 84.5 i 87 kDa care de asemenea,
sunt mai accentuate la genotipul matern, comparativ cu cel patern.
O particularitate individual a manifestat linia patern la a 30 zi, la care s-a atestat prezenta
polipeptidului de 33.5 kDa ce reprezint un polipeptid specific genotipului dat. La acest genotip s-a
constatat de asemenea, lipsa fraciilor cu Mr 20, 32.8 i 76.5 kDa, prezente ns n cantiti egale la
genotipul matern i hibridul F1 (fig 4.2.1.).
Totodat, la genotipul patern s-a atestat o intensificare semnificativ a benzii de 21 kDa, care
la linia matern se evideniaz slab. Caracteristic etapei date este, c majoritatea polipeptidelor
comune liniilor parentale sunt mai accentuate la genotipul matern comparativ cu linia patern, cu

68

excepia polipeptidelor de 12.1 -13.4 kDa, care sunt mai exprimate la genotipul patern i se
evideniaz cel mai bine la a 40 zi de cultivare.
Paternul electroforetic al genotipului heterozigot cuprinde o serie de polipeptide evideniate
att la linia matern, ct i la cea patern, manifestnd o similitudine mai apropiat cu forma
matern, polipeptide specifice neatestndu-se la nici una dintre etapele precutate. De menionat
ns c benzile polipeptidice cu masa molecular 12.1 i 21 kDa au fost motenite de la forma
patern, fiind specifice doar pentru genotipul dat. (fig 4.2.1).
kDa
76.5

68
45

33.5
32.8

25
21
20
18

13.4

Fig.4.2.1. Electroforeza proteinelor sumare extrase din rdcinele genotipurilor familiei Xenia cultivate n
condiii normale dup 30 zile de cultivare
M marcher, 1 Xenia , 2 Xenia , 3 Xenia F1

Diferenele dintre genotipul heterozigot i formele parentale n norm au purtat i un caracter


cantitativ, reflectndu-se prin intensificarea benzilor electroforetice. Astfel profilul polipeptidic al
hibridului Xenia a relevat prezena a 14 fracii comune cu liniile parentale la toate etapele cercetate:
trei compui de o intensitate slab a colorantului cu Mr: 18.0, 24.3, 30.4 kDa, apte de o intensitate
medie: 15.1, 16.5, 23.1, 28.5, 36.2, 44.2, 48.8 kDa i patru fracii majore dup dimensiunea zonei i
a intensitii colorantului - 39, 55.3, 58.0, 82.4 kDa.
Polipeptide specifice la genotipurile familiei Xenia au fost atestate la diferite etape de
dezvoltarea a plantelor de floarea-soarelui, ns majoritatea dintre acestea au fost evideniate la
etapele mai avansate de cultivare. Astfel, la etapa formrii primei perechi de frunze adevrate (dup
20 zile de cultivare) polipeptide specifice s-au observat la genotipul patern fiind reprezentate de
componenii proteici cu masa molecular mare de 105.7 i 111.1 kDa. Plantele cultivate timp de 30
zile s-au caracterizat prin prezena benzilor specifice cu masa molecular variat, la genotipul
patern s-a depistat polipeptidul cu masa molecular 33,5 kDa, iar la linia matern i hibridul F1
69

fraciile polipeptidice cu Mr 20, 32,8, 76,5 kDa. Analiza profilului electroforetic a plantelor
cultivate un timp mai ndelungat (40-60 zile) nu a scos n eviden prezena unor benzi specifice.
De menionat c intensitatea coloraiei majoritii fraciilor polipeptidice n cazul analizei
plantelor martor, a fost mai accentuat la hibrid, ceea ce indic asupra intensitii proceselor de
sintez mai accelerat a compuilor proteici la forma heterozigot.
Astfel, tabloul electroforetic al proteinelor, extrase din rdcinile plantelor martor n cadrul
familiei Xenia a pus n eviden polipeptide comune pentru genotipurile homo i heterozigote, ct i
polipeptide specifice pentru fiecare genotip reprezentate de polipeptidele cu Mr 105.7 i 111.1 kDa
la genotipul matern, 33,5 kDa pentru linia patern i 20, 32,8, 76,5 kDa la linia matern i hibridul
F1.
4.2.1.2. Impactul patogenului Orobanche cumana asupra metabolismului proteic la nivelul
sistemului radicular a genotipurilor familiei Xenia
n scopul cercetrii reaciei de rspuns a plantei-gazde la atacul parazitului, fraciile proteice
extrase din rdcinile plantelor crescute n condiii de stres biotic, au fost supuse SDSelectroforezei.
Diferene calitative vdite ntre profilul polipeptidic ale genotipurilor infestate i neinfestate n
funcie de genotip, rspunsul defensiv a plantei-gazd i durata stresului biotic sunt evideniate in
figura .
Infecia cu lupoaie modific nesemnificativ numrul de benzi polipeptidice a genotipurilor
studiate, diferene importante atestndu-se ns, la nivelul intensitii benzilor prezente n gel.
Totui, la unele etape de infestare s-a observat creterea sau descreterea numeric a polipeptidelor
evideniate. Majorarea numrului de benzi, atestndu-se la 20 i la 60 zile de la infecie, iar
diminuarea - la 15, 30-50 zile. De menionat, c pe fond de infecie de lung durat (40-50 zile)
genotipul matern Xenia menine numrul de benzi constant, la nivelul martorului, ceea ce probabil,
denot o plasticitate ecologic mai larg a genotipului respectiv.
n ceea ce privete grupul de proteine reprezentative, cu pondere mare, la genotipurile
infectate s-au evideniat aceleai polipeptide ca i la plantele martor cu Mr 39, 55.3, 58.0 i 82.4
kDa, coninutul lor variind n dependen de perioada de infecie.
Cele mai semnificative modificri n spectrul polipeptidic a genotipurilor studiate parazitul
lupoaia a provocat la etapa incipient de infestare. Aceste modificri au constat n apariia unor
polipeptide noi cu Mr 68.5 i 76.5 kDa la genotipul patern, intensificarea unor benzi polipeptidice la
genotipul matern (15.1, 16.5, 28.5, 32.8, 36.2, 44.2, 48.8, 76.5 kDa), patern (15.1, 26.8, 36.2, 44.2
kDa) i hibrid (26.8 i 28.5, 68.5 kDa), schimbri mai accentuate constatndu-se n cazul
genotipului matern. Menionm c intensificarea benzii ce corespunde polipeptidului cu Mr 26.8
70

kDa este caracteristic att pentru hibrid ct i pentru genotipurile parentale i reprezint o reacie
comun a genotipurilor la aciunea stresului biotic. Polipeptidul dat, conform datelor din literatur,
corespunde osmotinei (26 kDa), protein cu rol important n adaptarea plantelor la stresul osmotic
(182, 184). Aceast protein poate fi indus i la tratarea plantelor cu acid abscizic (ABA), iar unii
izomeri la aciunea stresului biotic (125).
Concomitent cu intensificarea unor benzi polipeptidice patogenul a cauzat i diminuarea
intensitii fraciilor polipeptidice cu masa molecular medie i mic n special la hibridul F 1 (15.1,
16.5, 36.2, 44.2, 48.8 kDa).
La etapele mai avansate de cultivare a plantelor (30-40 zile), similar etapei incipiente a
stresului biotic, la linia patern pe fond de infecie s-a atestat intensificarea sintezei componenilor
cu masa molecular 65.8 i 76.5 kDa, polipeptidul cu Mr 76.5 kDa nefiind depistat la genotipul
neinfestat, n timp ce polipeptidul cu Mr 68.5 kDa se evideniaz bine la plantele martor a liniei
paterne i slab pe fond de infecie. (fig. 4.2.2.)
De specificat c polipeptidul respectiv (68.5 kDa), depistat la etapa incipient doar la
plantulele neinfestate a liniei materne, la aceast etap se expreseaz i la plantele infestate,
intensificndu-se slab.
kDa

Xenia

Xenia

Xenia F1

76.5
68.5

15 zdi
30 zdi
40 zdi
1

Fig.4.2.2. Evidenierea polipeptidelor cu masa molecular 68.5 i 76.5 kDa la liniile parentale i hibridului Xenia
martor i infectate cu Orobanche cumana
1 Xenia martor, 2 Xenia infectat, 3 - Xenia martor, 4 - Xenia infectat, 5 - Xenia F1 martor, 6 - Xenia F1
infectat, zdi zile dup infecie

Analiza comparativ a datelor obinute la etapa de ataare i formarea primelor tuberculi (20
zile de stres biotic) a demonstrat c spectrul polipeptidic a liniei materne nu sufer modificri
eseniale comparativ cu martorul, constatndu-se doar, diminuarea fraciilor polipeptidice cu masa
molecular medie i mic (15.1-36.2 kDa), n timp ce la genotipul patern se observ intensificarea a
treisprezece benzi polipeptidice cu masele moleculare cuprinse ntre 87 i 15,1 kDa. La hibridul
Xenia similar etapei precedente predomin diminuarea coninutului fraciilor polipeptidice cu masa
molecular medie i mic.

71

La a 30 zi de infecie, asemenea etapelor anterioare, la genotipul matern se atest


intensificarea benzilor polipeptidice cu masa molecular relativ medie i mic (16.5, 23.1, 26.8,
34.4, 44.2, 76.5 kDa), pe cnd la linia patern se constat diminuarea coninutului benzilor
polipeptidice (12.1, 15.1, 23.1, 24.3, 26.8, 34.4, 48.8, 68.5, 87.0 kDa). Hibridul F1 pe parcursul celor
trei etape analizate, a avut un rspuns asemntor la atacul patogenului, reacie caracterizat prin
diminuarea fraciilor polipeptidice cu Mr medie i mic (16.5, 20.0, 23.1, 24.3, 26.8, 44.2 kDa).
Un interes deosebit prezint polipeptidul cu masa molecular de 35.5 kDa intensificarea
biosintezei cruia se observ la forma matern ncepnd cu etapa dat la atacul parazitului, iar dup
40-60 zile intensificarea fraciei se atest i la hibrid (fig 4.2.3). Datele existente n literatura de
specialitate denot c polipeptidul menionat corespunde, conform masei moleculare, cu una dintre
PR2-proteine (-1,3-gucanaza), depistat la tomate i tutun (Lawrence C. B., Joosten M. H. A. J, 1996,
Helen S. Coventry and Ian A. Dubery 2001). Unele studii relateaz c masa molecular a PR2-

proteinelor, asociate cu patogeneza, variaz n funcie de specia plantelor. Astfel, la Capsicum


annuum L. s-a depistat PR2 cu masa molecular 34 kDa (Young Jin Kim and Byung Kook Hwang
1997), la gru 33 kDa ( J. Jayaraj, S. Muthukrishnan 2004), la tutun 35 kDa ( Helen S. Coventry
2001), la fasole 36 kDa (F. Mohamed, O. P. Sehgal 1996), la trandafir 37 kDa (Y. Suo and
D.W.M. Leung 2002), sinteza proteinelor fiind indus de aciunea diferitor ageni patogeni: virusul

mozaicului tutunului, bacterii, fungi, ct i la aciunea exogen a anumitor substane chimice (F.
Mohamed, O. P. Sehgal, 1996; Young Jin Kim and Byung Kook Hwang, 1997; Helen S. Coventry and Ian A.
Dubery, 2001)
Xenia

Xenia

Xenia F1

35.5 kDa

20-30 zdi
40-60 zdi

Fig. 4.2.3. Evidenierea fraciei polipeptidice cu masa molecular 35.5 kDa la plantele martor i
infectate de floarea-soarelui la diferite etape de dezvoltare
1 Xenia martor, 2 Xenia infectat, 3 - Xenia martor, 4 - Xenia infectat, 5 - Xenia F1
martor, 6 - Xenia F1 infectat, zdi zile dup infecie

Modificri substaniale suport i polipeptidul cu masa molecular 21.0 kDa prezent n spectrul
electroforetic a plantelor neinfectate ale genotipul patern i la hibridul F 1. Atacul parazitului
cauzeaz dispariia polipeptidului la etapa dat la genotipul menionat, evideniindu-se pe fond de
infecie foarte slab doar la genotipul matern, pe cnd la a 40 zi, fracia dat se constat la hibridul
Xenia i liniile parentale att n norm ct i la aciunea patogenului avnd un coninut mai mare la
hibrid pe fond de infecie. Coninutul acestui polipeptid se reduce considerabil n plantele infestate
la a 50-60 zi de cultivare (fig.4.2.4.).
72

Xenia

Xenia

Xenia F1
30 zdi

kDa
21
20

40 zdi
50-60 zdi
1

Fig.4.2.4. Evidenierea polipeptidelor cu masa molecular 20 i 21 kDa la plantele martor i


infectate de floarea-soarelui la diferite etape de dezvoltare
1 Xenia martor, 2 Xenia infectat, 3 - Xenia martor, 4 - Xenia infectat, 5 - Xenia F1
martor, 6 - Xenia F1 infectat, zdi zile dup infecie.

Modificrile coninutului polipeptidului cu Mr 21 kDa pot fi corelate cu severitatea i durata


stresului biotic i reprezint un rspuns general al genotipurilor la atacul patogenului. Intensificarea
biosintezei polipeptidul cu Mr 21 kDa s-a constatat i n cazul infeciei virotice la Phaseolus
vulgaris, reprezentnd conform analizelor serologice o -gucanaz (F. Mohamed, O. P. Sehgal, 1996).
PR proteine similare au fost sintetizate n frunzele de fasole Pinto infectate cu diferii virui ce
provoac dereglri notabile n metabolismul celular, manifestate la nivel fenotipic, valoarea
coninutul unor PR proteine fiind dependent de gravitatea leziunii i nefiind dependent de tipul
virusului. Autorii au concluzionat c PR proteinele nu posed un rol activ n localizarea i
inactivarea infeciei virale, sinteza acestora reprezentnd o reacie de ajustare a metabolismului la
aciunea stresului endogen (F. Mohamed, O. P. Sehgal, 1996).
La aceast etap de analiz (30 zile de infecie), deosebiri cantitative s-au atestat i la nivelul
benzilor polipeptidice cuprinse n intervalul 15.1-16.5 kDa, coninutul crora nu s-a modificat n
plantele infestate la etapele anterioare, dar care sufer schimbri la etapele urmtoare. Astfel
ncepnd cu a 30 zi de cultivare se intensific biosinteza polipeptidului cu Mr 16.5 kDa la liniile
parentale a hibridului Xenia, iar de la a 40 zi i la genotipul heterozigot. Dup 50-60 zile de
cultivare se observ diminuarea coninutului acestui polipeptid la forma patern i hibrid, iar
genotipul matern menine un coninut relativ sporit a acestei fracii.
n ceea ce privete polipeptidele cu Mr 15.1 i 15.7 kDa intensificarea coloraiei benzilor se
constat la genotipul matern att la a 40, ct i la a 60 zi de cultivare, iar la hibridul F 1 doar la a 40
zi. La linia patern se atest diminuarea coninutului acestor benzi polipeptidice la etapele tardive
de infecie. (fig4.2.5).
n baza analizei datelor din literatura de specialitate, polipeptidele menionate corespund,
conform masei moleculare, cu PR1-proteine (Mr17 kDa) evideniat la floarea-soarelui la tratrea
cu acidul salicilic (Jean-luc Jung, Bernard Fritig, 1993), asemenea PR protein a fost indus de virusul
mozaic la tutun i fasole (Helen S. Coventry and Ian A. Dubery, 2001; F. Mohamed, O. P. Sehgal, 1996).
73

Izolarea proteinei cu masa molecular 16 kDa din plantele de floarea-soarelui a permis unor autori
(Guidici, 2000) de a stabili rolul acestui component n majorarea rezistenei plantelor la atacul
fungilor prin inhibarea ascosporilor de Sclerotinia sclerotiorum.
kDa

Xenia

Xenia

Xenia F1

16.5
15.7
15.1

30 zdi
40 zdi
60 zdi
1

Fig.4.2.5. Evidenierea polipeptidelor cu masa molecular 15.1, 15.7 i 16.5 kDa la plantele martor i
infectate de floarea-soarelui la diferite etape de dezvoltare
1 Xenia martor, 2 Xenia infectat, 3 - Xenia martor, 4 - Xenia infectat, 5 - Xenia F1 martor, 6
- Xenia F1 infectat, zdi zile dup infecie

Analiza comparativ a spectrului electroforetic a genotipurilor neinfestate i atacate de parazit


la 40 zile dup infecie a demonstrat un rspuns similar al genotipurilor la atacul patogenului cu
etapele anterioare. Ca i n cazurile precedente, linia matern s-a caracterizat prin intensificri
majore a mai multor benzi polipeptidice cu Mr 12.1, 12.7, 13.4, 15.1, 15.7, 16.5, 23.1, 26.2, 28.5,
35.5, 48.8, 55.3, 58.0, 68.5, 84.5, 87.0, kDa, n special a fraciilor polipeptidice cu mase moleculare
12.1- 13.4 kDa i 20 kDa care se intensific doar la etapa dat la linia matern pe fond de infecie
(fig 4.2.6). Banda ce corespunde polipeptidului cu Mr 20 kDa fiind expresat la linia matern i la a
50-60 zi i slab evideniat la hibrid (fig 4.2.4).

kDa

Xenia

Xenia

Xenia F1

13.4
12.7
12,1

40 zdi
1

Fig.4.2.6. Evidenierea polipeptidelor cu masa molecular mic 12.1-13.4 kDa


la plantele martor i infectate defloarea-soarelui la diferite etape de dezvoltare
1 Xenia martor, 2 Xenia infectat, 3 -.Xenia martor, 4 - Xenia infectat,
5 - Xenia F1 martor, 6 - Xenia F1 infectat, zdi zile dup infecie

La a 60 zi de cultivare spectrul electroforetic ale genotipurilor studiate nu au prezentat


diferene calitative semnificative, manifestarea rspunsului plantelor la infecia parazitului la nivelul
paternului polipeptidic avnd un caracter nespecific, comun tuturor genotipurilor.
Analiza tuturor spectrelor polipeptidice permite s generalizm c atacul parazitului a
determinat intensificarea fraciilor polipeptidice la genotipul matern la majoritatea etapelor studiate.
La genotipul patern factorul biotic a provocat micorarea intensitii coloraiei benzilor
74

polipeptidice, ceea ce indic asupra intensificrii metabolismului catabolic, o reacie similar


atestndu-se i la hibridul din prima generaie, la care pe parcursul creterii i dezvoltrii n condiii
de mediu infectat s-a constatat diminuarea n intensitate a fraciilor cu masa molecular relativ
medie i mic.
De asemenea atacul parazitului la anumite etape a determinat accelerarea apariiei (15 zile)
sau dispariiei (30 zile) a unor benzi polipepticice, aceste polipeptide (76.5, 68.5 i 21,0 kDa) fiind
evideniate la etapele mai avansate att la martor ct i la plantele cultivate pe fond de infecie.
Toate aceste transformri reflect intensitatea rspunsului defensiv a genotipurilor cercetate.

4.2.1.3. Varietatea spectrului polipeptidic la diverse genotipuri de floarea soarelui n cadrul


familiei Valentino la nivelul sistemului radicular
Studiul proteinelor sumare extrase din rdcinile liniilor parentale i hibridului Valentino au
pus n eviden un spectru general de fracii polipeptidice specifice i nespecifice.
n complexul polipeptidic al genotipurilor martor cercetate la diverse etape de dezvoltare s-au
observat deosebiri eseniale n numrul de fraii polipeptidice. Numrul fraciilor polipeptidice a
variat n dependen de etapa de dezvoltare a plantelor. Astfel, la toate genotipurile, la 15-20 zile de
cultivare s-au constatat 29-33 fracii polipeptidice, la 30 de zile s-a atestat o cretere (34-38 benzi),
pe cnd la 40 de zile numrul fraciilor s-a micorat fiind de 24-26 benzi polipeptidice, urmat de o
cretere la etapele de 50-60 zile (29-32). De menionat c dup 15, 20, 50 i 60 de zile de cultivare,
la genotipul matern numrul de benzi a variat de la 29-33, la linia patern de la 30-33, iar la hibridul
F1 de la 30-32. n cazul etapelor de 30 i 40 zile, numite de noi etape critice, n baza analizei
modificrilor spectrului polipeptidic, corelate cu numrului de ataamente per plant, care crete
brusc, la genotipul matern s-au constatat 36 benzi (la 30 zile) i 24 de benzi polipeptidice (la 40
zile), la forma patern 38 i respectiv 25, iar la genotipul hibrid 34 i 26 fraii polipeptidice.
Astfel, variaia numeric a fraciilor polipeptidice, depistate n gelul electroforetic, a fost
semnificativ n dependen de etapa de dezvoltare i nesemnificativ n cadrul genotipurilor, cel
mai mare numr de benzi fiind depistate la 30 zile, iar cel mai mic la 40 de zile.
Analiza rezultatelor a permis gruparea polipeptidelor identificate n funcie de grosimea i
intensitatea benzilor. Asemntor rezultatelor obinute n cazul familiei Xenia, polipeptidele ce
predomin n spectrul electroforetic, la toate etapele de dezvoltare, sunt reprezentate de fraciile cu
Mr 82.4, 58.0, 55.3 i 39 kDa. Grupul de polipeptide cu o intensitate medie variaz numeric n
funcie de etapa de cultivare cu o medie de 12-13 fracii polipeptidice, numrul minim fiind atestat
la 15 i 60 zile (11 fracii), iar maxim la 30 de zile - 16 benzi polipeptidice (87.0, 84.5, 76.5, 68.5,
48.8, 44.2, 36.2, 28.5, 26.2, 23.1, 20.0, 16.5, 15.7, 15.1, 13.4, 12.7 kDa). Comune pentru toate
75

spectrele polipeptidice ale genotipurilor cercetate au fost benzile cu masele moleculare de 68.5,
48.8, 36.2, 26.8, 23.1, 16.5, 15.7 i 15.1 kDa. Fraciile proteice de intensitate joas a colorantului
sunt reprezentate de benzile cu greutatea molecular mare 120.0-105.7 kDa, ct i de cele cu
greutatea molecular mic 31-29, 26-24, 19-17.5, 11.5-10 kDa.
De menionat c spectrele polipeptidic ale genotipurilor homozigote sunt foarte asemntoare
pe parcursul etapelor studiate, cu mici excepii ce apar pe parcursul creterii i dezvoltrii plantelor,
iar spectrul electroforetic al hibridului include polipeptide evideniate n spectrele polipeptidice
ale ambelor forme parentale.
n general, profilului proteic al plantelor neinfestate de floarea-soarelui la a 15 zi de cultivare
a relevat diferene nesemnificative n cadrul genotipurilor. Deferene, totui, s-au atestat la nivelul
benzii cu Mr 12,7 kDa i 13,4 kDa prima expresat intens la linia patern, a doua la linia matern
i prezente ambele n cantiti egale la forma heterozigot.
La a 20 zi de cultivare n spectrul electroforetic al genotipurilor studiate se constat
intensificarea fraciilor cu mas molecular relativ mare (84.5 -120 kDa) i mic (10 - 13.4kDa)
vizualizate slab la etapa precedent. La ambele genotipuri homozigote au fost evideniate bine
polipeptidele cu Mr 84.5 i 87 kDa. Totui, forma patern a prezentat un spectru mai expresiv
comparativ cu celelalte genotipuri prin abundena polipeptidului cu Mr 15.1, 15.7, 16.5, 18.0, 24.3,
36.2, 105.7 kDa care se atest slab la linia matern i hibridul F1.
Analiza electroforeogramelor la a 30-40 zi de cultivare a relevat prezena fraciei polipeptidice
cu masa molecular 73.5 kDa la genotipul patern i la forma heterozigot i absena acesteia la
genotipul matern. Totodat, la genotipul matern s-a observat prezena fraciei polipeptidice cu Mr
32.8 kDa, care nu s-a depistat la etapele date la forma patern (fig.4.2.7.), dar se evideniaz la acest
genotip la etapele mai avansate de cultivare (50-60 zile). Prezena polipeptidul dat s-a constat i la
genotipul heterozigot dup 50-60 zile de cultivare. Menionm c, la etapa de 40 zile spectrele
polipeptidice ale formei paterne i formei heterozigote au fost aproximativ de aceiai intensitate a
benzilor, coloraia unor polipeptide fiind mai intens comparativ cu forma matern (Mr 13.4, 15.1,
15.7, 18, 21, 28.5, 36.2, 84,2, 87,0 kDa). Caracteristic formei heterozigote pentru perioada de 40
zile, este prezena unui polipeptid cu masa molecular relativ 12,1 kDa, evideniat i la forma
patern a hibridului Xenia, intensificarea cruia se atest pe fond de infecie la formele homozigote
ale familiei Valentino, iar la hibrid nu sufer modificri cantitative.
Astfel, profilul electroforetic al genotipului heterozigot la etapele analizate cuprinde
polipeptide evideniate i la formele parentale. Cu toate acestea, inem s evideniem polipeptidele
cu Mr 12,1 kDa i 13,4 kDa prezente n cantiti net superioare la forma heterozigot comparativ cu
genotipurile parentale. Caracteristic hibridului din prima generaie este i accentuarea polipeptidele
cu masa molecular relativ medie i mic la majoritatea etapelor precutate.
76

kDa
68

73.5

45
32.8

25

13.4

Fig. 4.2.7. Electroforeza proteinelor sumare extrase din rdcinele genotipurilor familiei Valentino
cultivate n condiii normale
M marcher, 1 Valentino , 2 Valentino , 3 - Valentino F1

Dup 50 zile de cultivare, un interes prezint polipeptidul cu masa molecular 18 kDa care se
intensific vdit la formele parentale i fraciile cu Mr mare (105.7-120 kDa) intensitatea crora
scade comparativ cu etapele precedente.
La 60 de zile nu se atest modificri notabile n spectrele polipeptidice n cadrul genotipurilor
analizate.
Analiza spectrelor electroforetice a relevat prezena a 15 fracii comune la hibridul Valentino
i liniile parentale la toate etapele precuate: trei compui de o intensitate slab a colorantului cu
Mr: 18.0, 24.3, 30.4 kDa, opt de o intensitate medie: 15.1, 15.7, 16.5, 23.1, 26.8, 36.2, 48.8,68.5,
kDa i patru fracii majore dup dimensiunea zonei i a intensitii colorantului - 39, 55.3, 58.0 i
82.4 kDa, polipeptidele distinctive fiind reprezentate de componenii cu Mr 73,5 kDa - pentru linia
patern, 32,8 kDa - pentru linia matern i 12,1 kDa pentru forma hibrid.
Un interes deosebit l prezint polipeptidele specifice cu Mr 32,8 i 12,1 kDa, care conform
datelor din literatur reprezint proteine/polipeptide sintetizate ca rspuns la aciunea factorilor
biotici i abiotici. Astfel la unele plante de cultur aa ca floarea-soarelui, tomate, tutun, fasole a
fost identificat o protein cu masa molecular n jurul valorii de 32-33 kDa, ca fiind o chitinaz
din clasa III (Harry van Keulen, 2007, Joosten J., 2002; Helen S. Coventry 2001; F. Mohamed, O. P. Sehgal
1996), iar polipeptidul de 12 kDa ca fiind un inhibitor de proteaze cu rol activ n inhibarea creterii

i dezvoltrii fungilor patogene (Joshi B., 1998)

77

La majoritatea etapelor de studiu profilul electroforetic al liniei paterne a fost mai expresiv
dup intensitatea benzilor, comparativ cu linia matern i hibridul F1
Studiul profilurilor electroforetice a proteinelor sumare extrase din rdcinile liniilor parentale
i hibridului Valentino au pus n eviden un spectru general de fracii polipeptidice specifice i
nespecifice cu un diapazon de greuti moleculare similar liniilor parentale i hibridului Xenia
analizate anterior (fig. 4.2.8.).
Analiza comparativ a spectrelor electroforetice a genotipurilor familiei Xenia i Valentino a
permis evidenierea componenilor proteici pentru genotipurile materne, paterne ct i pentru
hibrizii cercetai. Paternul electroforetic a liniei materne a genotipului Xenia a prezentat un numr
mai mare de benzi polipeptidice comparativ cu linia matern a hibridului Valentino. La forma
matern a hibridului Xenia au fost vizualizate benzi cu expresivitate accentuat (Mr 28.5, 24.3,
21.0, 18.0 kDa) slab evideniate la genotipul matern Valentino, iar la linia matern a hibridului
Valentino fraciile cu masa molecular 35.5 i 32.8 kDa, slab expresate la genotipul omolog.

F1
kDa

kDa

87.0

68
45

44.2
35.5
32.8
28.5

25

23.1
21.0
20.0
18.0
16.5
15.7
15.1
13.4
12.7
12.1

13.4

Fig.4.2.8. Electroforeza proteinelor sumare extrase din rdcinele genotipurilor familiei


Xenia i Valentino cultivate n condiii normale (40 zile)
M marcher, 1 Xenia , 2 Valentino , 3 Xenia , 4 Valentino , 5- Xenia F1
6 Valentino F1

De asemenea profilul electroforetic a liniei paterne a hibridului Xenia a prezentat un numr de


benzi cu intensitate mai mare/pronunat comparativ cu linia patern a hibridului Valentino fiind
evideniate un coninut mai nalt a polipeptidelor cu masa molecular medie i mic (28.5, 23.1,

78

21.0, 16.5, 15.7, 15.1, 13.4, 12.7, 12.1 kDa), iar la forma patern Valentino doar polipeptidul cu Mr
35.5 kDa prezente n abunden i slab expresate la omologul su.
n cadrul hibrizilor din prima generaie diferenele dintre paternele polipeptidice au fost mai
mici, atestndu-se deosebiri cantitative doar la nivelul polipeptidelor cu masa 44.2, 28.5, 23.1, 21.0
kDa. O diversitate mai mare n ce privete intensitatea benzilor prezente n gel la aceast etap de
dezvoltare se constat la genotipurile paterne, n timp ce genotipul matern i hibrizii s-au deosebit
mai puin.
Menionm c la genotipurile familie Xenia polipeptidele cu masa molecular medie i mic
se evideniaz mai accentuat comparativ cu genotipurile homozigote a hibridului Valentino. ntre ei
hibrizii analizai au manifestat diferene n special la nivelul polipeptidelor cu Mr medii 28.5-16.5
kDa
Din cele spuse mai sus putem conchide c formele paterne se deosebesc cel mai mult la etapa
dat de dezvoltare. Liniile homozigote ale familie Xenia se deosebesc mai mult de formele
homozigote a familie Valentino prin manifestarea accentuat a mai multor benzi polipeptidice, n
timp ce liniile parentale a familie Valentino se deosebesc de omologii si doar prin intensificarea
doar a unei benzi polipeptidice (- 32.8 kDa, - 35.5 kDa). n cadrul hibrizilor deosebirile au fost
mai puine eseniale, stabilindu-se aceleai tendine de intensificare a benzilor la forma Xenia n
special la nivelul polipeptidelor cu masa molecular medie.
4.2.1.4. Impactul patogenului Orobanche cumana asupra metabolismului proteic la nivelul
sistemului radicular a genotipurilor care formeaz hibridul Valentino
Aciunea patogen a lupoaiei, i n cazul acestor genotipuri, s-a manifestat prin unele
schimbri calitative i cantitative n spectrele polipeptidice ale plantelor infectate.
Atacul parazitului a cauzat micorarea numrului de benzi n profilul proteic al genotipului
matern la majoritatea etapelor analizate. Aceeai legitate se observ i la linia patern i hibridul F 1
la 15, 20, 50 i 60 zile de infecie, cu excepia perioadei de 30 zile cnd se constat o majorare
nesemnificativ a numrului de fracii proteice prezente n gel i de 40 zile cnd genotipurile
infectate au avut acelai numr de benzi ca i plantele neinfectate.
Influena lupoaiei asupra spectrului polipeptidic la nivel cantitativ s-a manifestat prin
accentuarea i diminuarea intensitii unor fracii polipeptidice.
Intensificarea benzilor cu masa molecular 24.3 i 87 kDa s-a atestat la etapa incipient de
infestare (15 zile), fiind caracteristic genotipului matern, iar la forma patern i hibrid s-a observat
diminuarea intensitii fraciilor polipeptidice cu masa molecular mare i mic n raport cu
martorul.
79

La 20 zile de la infecie se relev un tablou similar etapei precedente, infecia nu a provocat


modificri eseniale n spectrul electroforetic al genotipurilor studiate. Totui, un interes prezint
fracia de 24.3 kDa coninutul creia crete nesemnificativ pe fond de infecie n cazul liniei
materne i semnificativ la hibridul F1, iar la etapa urmtoare (30 zile) scade la aceste genotipuri i
rmne neschimbat la linia patern (fig 4.2.9.)
Valentino Valentino Valentino F1

kDa
24.3
23.1

20 zdi
30 zdi
1

Fig. 4.2.9. Evidenierea polipeptidelor cu masa molecular 24.3 i 23.1 kDa la plantele martor i infectate
defloarea-soarelui la diferite etape de dezvoltare
1 Valentino martor, 2 Valentino infectat, 3 - Valentino martor, 4 - Valentino infectat,
5 - Valentino F1 martor, 6 - Valentino F1 infectat, zdi zile dup infecie

Stresul biotic cu durata de 30 zile determin apariia unei benzi specifice cu Mr 111,1 kDa n
spectrul polipeptidic al genotipului patern, aceeai reacie se constat i la hibridul Valentino la cea
de a 40 zi de cultivare pe sol infectat (fig 4.2.10). Aceasta indic asupra gradualitii temporale a
reaciei genotipurilor respective la atacul patogenului. Forma matern se caracterizeaz prin lipsa
polipeptidului menionat la ambele perioade de studiu.

kDa
111.1
105.7

Valentino Valentino Valentino F1

30 zdi
40 zdi
1

Fig. 4.2.10. Evidenierea polipeptidelor cu masa molecular 111.1 i 105.7 kDa la plantele martor i
infectate de floarea-soarelui la diferite etape de dezvoltare
1 Valentino martor, 2 Valentino infectat, 3 - Valentino martor, 4 - Valentino infectat,
5 - Valentino F1 martor, 6 - Valentino F1 infectat, zdi zile dup infecie

Menionm intensificarea substanial a coloraiei polipeptidului cu Mr 35.5 kDa la linia


patern i hibrid dup 30 zile de infecie. Polipeptidul dat reprezentnd o PR2-protein cu rol
defensiv la atacul patogenilor (Helen S. Coventry 2001). Probabil sinteza abundent a polipeptidului
dat reprezint o reacie defensiv a genotipurilor respective la atacul patogenului (fig 4.2.11.), dat
fiind faptul c genotipurile sus-numite au fost mai infectate, avnd un numr mai mare de
ataamente (-10,7 i F1

9 ataamente/planta), comparativ cu genotipul matern (6.6

ataamente/planta).
80

Valentino Valentino Valentino F1


kDa

30 zdi

35.5

Fig.4.2.11. Evidenierea polipeptidului cu masa molecular 35.5 kDa la plantele martor i infectate de
floarea-soarelui la diferite etape de dezvoltare
1 Valentino martor, 2 Valentino infectat, 3 - Valentino martor, 4 - Valentino infectat,
5 - Valentino F1 martor, 6 - Valentino F1 infectat, zdi zile dup infecie

Odat cu formarea tuberculelor parazitului pe rdcinile plantei-gazde, la genotipul


heterozigot i patern, spre deosebire de genotipul matern, se constat intensificarea benzilor
polipeptidice din spectrul electroforetic.
Hibridul Valentino i formele parentale ale acestuia la a 40 zi au manifestat un rspuns
uniform la aciunea agentului patogen atestndu-se, n majoritatea cazurilor, spectre polipeptidice
mai expresive pe fond de infecie. Aceasta denot faptul, c creterea numeric a tuberculelor i
dezvoltarea acestora intensific n cazul genotipurilor cercetate metabolismul proteic. Cu toate
acestea, la genotipul matern atacat de parazit, banda cu greutatea molecular 32.8 kDa diminueaz
n intensitate comparativ cu martorul. La formele homozigote se constat intensificarea fraciilor cu
Mr de 10.0 -16.5 kDa, iar la genotipul heterozigot aceste polipeptide se menin la nivelul
martorului, similar etapelor anterioare.
Polipeptidul cu masa molecular de 12,1 kDa (fig. 4.2.12) a crei intensificare se constat la
formele homozigote a hibridului Valentino dup 40 de zile de cultivare n condiii de stres biotic,
conform datelor din literatur reprezint un inhibitor a proteazelor citseinice, din grupa fitocistatine
cu masa molecular cuprins ntre 10 12 kDa. Inhibitori de proteaze din aceast clas mai sunt
numite proteine antifungice, avnd un rol important n aprarea plantelor de ciupercile patogene,
ns mecanismul activitii antifungice a acestora nu sunt pe deplin elucidate (Joshi B., 1998)
kDa

Valentino Valentino Valentino F1

13.4

30 zdi

12.7
12.1

40 zdi
1

Fig. 4.2.12. Evidenierea polipeptidelor cu masa molecular 12.1, 12.7 i 13.4 kDa la plantele martor i infectate de
floarea-soarelui la diferite etape de dezvoltare
1 Valentino martor, 2 Valentino infectat, 3 - Valentino martor, 4 - Valentino infectat,
5 - Valentino F1 martor, 6 - Valentino F1 infectat, zdi zile dup infecie

La etapele ndelungate de cultivare n mediu infectat (50-60 zile), se relev micorarea


intensitii fraciilor polipeptidice cu masa molecular medie i mic (10.0 -30.4 kDa) att la
81

hibridul Valentino ct i la liniile parentale ale acestuia, cu excepia fraciei de 36.2 kDa care se
intensific la forma hibrid la a 60 zi de cultivare. (fig 4.2.13.)

kDa
36.2

Valentino Valentino Valentino F1

60 zdi
1

Fig.4.2.13. Evidenierea polipeptidului cu masa molecular 36.2 kDa la plantele martor i infectate de
floarea-soarelui la diferite etape de dezvoltare
1 Valentino martor, 2 Valentino infectat, 3 - Valentino martor, 4 - Valentino infectat,
5 - Valentino F1 martor, 6 - Valentino F1 infectat, zdi zile dup infecie

La etapele avansate de cultivare pe fond de infecie (50-60 zile) la genotipurile parentale i


hibridul F1 se observ diminuarea fraciilor polipeptidice cu masa molecular relativ medii i mici.
Rezultatele electroforezei polipeptidelor au demonstrat c factorul stresogen/biotic a provocat
modificri n spectrul polipeptidic al genotipurilor studiate, care au constat n intensificarea
anumitor benzi polipeptidice, ce predomina la 30-40 zile i micorarea intensitii benzilor
polipeptidice atestat la 50-60 zile, iar la 15-20 de zile spectrele proteice n majoritatea cazurilor au
fost similare martorul. Aceast constatare relev faptul c conexiunea gazd-parazit n sistemul dat
se stabilete la o etap mai tardiv de aciune a stresului biotic. n acelai timp, manifestarea diferit
a rspunsului defensiv al genotipurilor prin intensificarea/diminuarea sau apariia/dispariia unor
benzi noi pe parcursul cultivrii, denot expresia difereniat a genelor n condiii de stres. Reacia
genotipurilor familiei Valentino la aciunea patogenului a prezentat o specificitate de genotip.
Astfel la genotipul matern la etapele de ataare (15-20 zile) i formarea tuberculelor (30 zile)
de lupoaie nu s-au constatat modificri eseniale n spectrul polipeptidic a acestui genotip, pe cnd
reacia genotipului patern i a hibridului din prima generaie la iniierea infecie s-a manifestat prin
micorarea intensitii benzilor polipeptidice.
4.2.1.5. Identificarea proteinelor asociate cu patogenez la diverse genotipuri de floareasoarelui
Atacul agenilor patogeni poate provoca diverse dereglri n metabolismul celular al plantelor,
perturbnd derularea normal a proceselor de cretere i dezvoltare a plantelor. Reacia
genotipurilor de floarea-soarelui la stresul biotic este diferit, mecanismele fiziologo-biochimice de
rezisten nefiind pn n prezent elucidate.
La nivel celular, unul dintre mecanismele de baz a organismelor vii de a se adapta la factorii
nefavorabili este sinteza proteinelor de stres, activitatea sau acumularea crora se intensific ca
rspuns la aciunea diferitor factori stresogeni: temperaturi extremale ( Kanzaki et al., 2003), stres
toxic (B. Mittra, 2007), stres biotic etc. (A. Dmitriev, 2006).
82

La categoria proteinelor de stres se refer PT (proteinele ocului termic) (Kanzaki et al., 2003),
proteinele-LEA (late embryogenesis abundance) (Close, 1996), proteinele LTPs (lipid-transfer
proteins) (Molina, A., A. Segura, 1993 Cammue, B.P., K. Thevissen 1995 ), defensinele (Broekaert, W.F.,
F.R. Terras,1995), cyclophilin-ike protein (Ostoa-Saloma, P., J.C. Carrero, 2000), proteine RIPs

(ribosome-inactivating proteins) (Barbieri, L.,1993, Ferreras, J. M., R. Iglesias 1995) , inhibitori de


protease (Joshi, B.N., M.N. Sainani1998, Kouzuma, Y., H. Inanaga, 2000 ), ct i PR-proteinele
(Hammond-Kosack KE and Jones J., 1996).
Rezultatele analizelor electroforeogramelor n scopul depistrii PR-proteinelor la ase
genotipuri de floarea-soarelui cu sensibilitate divers la atacul lupoaiei, au pus n eviden spectre
electroforetice individuale n funcie de reacia defensiv a genotipurilor i durata infeciei.
Fiecare etap analizat s-a caracterizat prin prezena a unui numr diferit de componeni
polipeptidici n gelul electroforetic, variaia numeric fiind semnificativ n dependen de perioada
de dezvoltare a plantelor i nesemnificativ n cadrul genotipurilor. Gelurile electroforetice la
etapele studiate s-au deosebit prin prezena unor polipeptide cu masa molecular mare i mic att
la plantulele martor, ct i pe fond de infecie, expresia crora se accentueaz n special n perioada
de 30-40 zile de cultivare la toate genotipurile ambelor familii. n cazul familiei Xenia, aceste
polipeptide nu se evideniaz la etapele iniiale de cultivare (15-20 zile) i se vizualizeaz slab la 60
zile, iar n cazul familiei Valentino apar ncepnd cu a 20 zi i similar familiei Xenia se expreseaz
slab la etapa final.
Paternul proteic al sistemului radicular a genotipurilor cercetate a fost reprezentat n
majoritatea cazurilor de proteine comune, dintre care cele mai reprezentative la ambele familii fiind
cele cu Mr 39, 55.3, 58.0 i 82.4 kDa, prezente i n norm la toate genotipurile n cantiti diferite
n dependen de etapa de cultivare. Modificarea coninutului polipeptidelor cu pondere mare este
neesenial la plantele infectate.
n acelai timp, la diferite etape de analiz au fost evideniate proteine, coninutul crora a
varia semnificativ, nu numai n funcie de etapa ontogenetic a plantelor, dar i de severitatea
stresului

biotic.

Variaia

coninutului

acestor

polipeptide

s-a

manifestat

prin

intensificarea/diminuarea coloraiei benzilor electroforetice.


Reacia individual a genotipurilor la anumii factori poate fi stabilit n baza analizei
componenilor specifici, identificai n profilurile electroforetice cu ajutorul SDS-electroforezei.
Conform datelor din literatur, PR-proteinele implicate n mecanismele defensive la plante,
posed de obicei mase moleculare cuprinse ntre 10-40 kDa ( Stintzi et al., 1993). Reieind din aceste
considerente un interes deosebit n cercetrile noastre au prezentat polipeptidele a cror mase
moleculare s-au ncadrat n acest diapazon. Astfel, ne-am propus drept scop evidenierea PR

83

proteinelor - proteine asociate cu patogeneza la genotipurile de floarea-soarelui infestate cu


Orobanche cumana.
PR-proteinele, descoperite pentru prima data la tutunul infectat cu virusul mozaicului de tutun
[Gianinazzi S., Martin C 1970, Van Loon L.C 1985] se acumuleaz n cantiti mari ca rspuns la
semnalele exogene determinate de patogen sau stres abiotic [Dubos C, Plomion C, 2001]. Aceti
compui au fost grupai n cinci clase. Clasa I include proteine cu masa molecular de ~ 15 17
kDa prezente la un spectru larg de plante. PR-2 i PR-3 sunt reprezentate de chitinaze i respectiv 1,3-glucanaze. Cele din clasa IVa constituie proteine acide cu masa molecular de 13 - 14,5 kDa i
au secvene de aminoacizi similare celor din proteinele a cror sintez este indus de aciuni
mecanice (rni, leziuni), depistate pentru prima data la cartof. Proteinele PR-V au un grad nalt de
secvene similare cu taumatinele din Thaumatococcus danielli [Cornelissen B.J., 1986, Linthorst H.J.,
1991].

Recent, alte ase grupe de proteine au fost incluse n grupul proteine - PR [ Dubos C, Plomion C,

2001].

La floarea-soarelui de asemenea au fost identificate o serie de proteine, similare PR proteinelor din tutun, grupate n 4 categorii [Jung J.L., 1993]. PR1 include o singur polipeptid de 17
kDa, PR2 - o polipeptid cu masa moleculara de 40 kDa, aceasta fiind un precursor al PR1, PR3
reprezint dou polipeptide cu masa molecular de 29 kDa (PR3a) i 37 kDa (PR3b) i PR5 - o
polipeptid cu masa molecular de ~ 20 kDa. n condiii normale aceste proteine manifest un nivel
redus de sintez, pe cnd la infectarea cu fitopatogeni coninutul lor se majoreaz de zeci i sute de
ori, sporirea fiind determinat de activarea genelor responsabile de sinteza acestora [ Jung J.L., 1993;
Linthorst H.J., 1991; Lui D., Raghothama K.G 1994].

Similar datelor din literatura de specialitate, i n cercetrile noastre, unele fracii polipeptidice
cu masa relativ corespunztoare PR-proteinelor se intensific la atacul parazitului (tab.4.2.1).
La toate genotipurile familiei Xenia la etapele de 15-20 zile de la inocularea parazitului s-a
observat intensificarea fraciilor cu Mr 36,2, 28,5, 26,8 i 16,5 kDa. ncepnd cu 30-40 zile de
cultivare pe fond infectat intensificri vdite fiind caracteristice doar genotipului matern, la care pe
parcursul creterii n condiii de stres predomin intensificarea acelorai benzi polipeptidice cu Mr
de 35.5, 26.8 i 16.5 kDa. Aceste polipeptide conform maselor moleculare relative corespund unor
PR- proteine ca PR1, PR2 i PR3.
Intensificarea benzilor polipeptidice se atest n special la genotipul matern i mai puin la
linia patern i hibridul F1, ceea ce denot reacia specific mai expresiv a genotipului matern la
invazia parazitului.
n cadrul genotipurilor care formeaz hibridul Valentino intensificarea polipeptidelor masele
moleculare ale crora sunt similare cu Mr a unor PR-proteine sunt reprezentate n tabelul 2 n care
se observ predominarea polipeptidelor date la formele parentale n special la a 40 zi de la infecie,
84

n timp ce la genotipul hibrid acestea sunt ntr-un numr mai mic. Comun genotipurilor parentale i
hibridului Valentino este intensificarea fraciilor polipeptidice cu Mr de 36.6, 28,5 i 23,1 kDa la
cea de-a 40 zi. Spectrul polipeptidic a variat n dependen de genotip.
Tabelul 4.2.1.
Intensificarea benzilor polipeptidece la genotipurile familiei Xenia ce se ncadreaz n
diapazonul PR-proteinelor
kDa

XF1

zile
15
20
30
40
50
60
15
20
30
40
50
60
15
20
30
40
50
60

36.2
+++
+++

+
+

35.5
+++
++
++
++
+

28.5
+
++

+
+

+
+

26.8
+

23.1

20

++
+++
++
+
+
+

+
++

++

+
+

16.5
++
++
+++
++
++
+
++
+
+

15.7

15.1
++

13.4

++
+
++

++
+
++
+
++

+
+
++

12.7

12.1

+
+
+

++

Intensificarea polipeptidului cu masa molecular 35.5 kDa fiind specific doar pentru linia
matern la 30 zile de la inoculare, iar fracia polipeptidic de 24.3 kDa fiind caracteristic doar
pentru hibridul de prima generaie la 20 de zile de cultivare n condiii stresogene. Conform datelor
din tabelul 2 la formele parentale se observ intensificarea a majoritii benzi polipeptidice (36,2,
28,5, 26,8, 23,1, 20,0, 16,5, 15,7, 15,1, 13,4, 12,7, 12,1 kDa) (tab.4.2.2.)
Tabelul 4.2.2.
Intensificarea benzilor polipeptidece la genotipurile familiei Valentino ce se ncadreaz n
diapazonul PR-proteinelor
kDa

VF1

zile
15
20
30
40
50
60
15
20
30
40
50
60
15
20

36.2

35.5

28.5

26.8

++

++

+++

24.3

23.1

20

18

16.5

15.7

15.1

13.4

12.7

12.1

+
++

+
++

+
++

++

++

++

++

++

+
++

++

++

++

85

30
40
50
60

++

n ceea ce privete diminurile benzilor polipeptidice (tabelul 4.2.3)acestea prevaleaz la hibrid i


genotipul patern i mai puine atestndu-se la linia matern. Caracteristic genotipului patern sunt
diminurile ce predomin la 30-40 zile de la inocularea parazitului, pe cnd la hibridul F 1 se observa
la 20-30 zile de cultivare pe fond infectat. Un interes prezint fracia polipetidic de 24,3 kDa care
la a 30 zi diminueaz att la hibridul F1 ct i la formele parentale ale acestuia.
Tabelul 4.2.3.
Diminuarea benzilor polipeptidece la genotipurile familiei Xenia ce se ncadreaz n
diapazonul PR-proteinelor
kDa

XF1

Zile
15
20
30
40
50
60
15
20
30
40
50
60
15
20
30
40
50
60

36.2

35.5

--

32.5

28.5

26.8

24.3

23.1

20

--

---

21

16.5

15.7

15.1

13.4

12.1

--

--

---

---

---

-----

--

---

---

--

--

---

----

---

---

Tabelul 4.2.4.
Diminuarea benzilor polipeptidece la genotipurile familiei Valentino ce se ncadreaz n
diapazonul PR-proteinelor
kDa

VF1

zile
15
20
30
40
50
60
15
20
30
40
50
60
15

36.2

35.5

32.5

28.5

26.8

24.3

23.1
-

21

-------

---

-----

---

-----

---

16.5

15.7

15.1

--

-----

20

---------

--

13.4

12.7

-----

------

12.1
-

---

--

--

----

--

86

20
30
40
50
60

--

--

---

--

Intensificarea sintezei proteinei cu masa molecular 35.5 kDa s-a atestat la atacul patogenului
n cazul genotipului matern al familiei Xenia la majoritatea etapelor de analiza, iar la forma patern
i hibridul Valentino n special la a 30-a zi. La 40 de zile s-a observat accentuarea polipeptidului cu
Mr 12,1 kDa la formele homozigote ale hibridului Valentino i la genotipul matern al familiei
Xenia.
Diminuarea coninutului unor proteine cu Mr 21 i 20 kDa se atest n special la genotipul
patern i la hibridul Xenia i nu sufer modificri n cadrul genotipurilor familiei Valentino, n
schimb la linia patern a hibridului Valentino se observ diminuarea polipeptidelor cu Mr 28.5 i
24.3 kDa la etapele precoce i tardive de infecie
Astfel, SDS-electroforeza ne-a permis evidenierea polipeptidului cu Mr 35.5, 16.5, 15.1 kDa,
care, dup cum am menionat anterior, se refer la grupul PR proteine asociate cu patogeneza.
Sinteza mai abundent i a unui numr mai mare de proteine s-a constatat la formele parentale
a hibrizilor studiai, valoarea maxim a expresrii PR proteinelor, atestndu-se n cazul genotipului
matern Xenia i formelor parentale a hibridului Valentino.
Astfel, atacul parazitului a provocat modificri notabile n spectrele polipeptidice ale
genotipurilor cercetate, variaii calitative depistndu-se att n dependen de etapa de dezvoltare,
ct i de genotip.
Majorarea coninutului fraciilor respective, n special la etapele critice de infecie, sugereaz
c acestea ar putea avea un rol important n reacia/rspunsul defensiv al plantelor la atacul
patogenului.
Studiile moleculare ale interaciunii Orobanche cumana Wallr cu diverse specii de plante au
relevat acumularea proteinelor asociate cu patogeneza ca trstur caracteristic a reaciei defensive
de baz n declanarea mecanismelor rezistenei sistemice dobndite (Uknes et a., 1992;
., 2000). n conformitate cu datele din literatur, modificarea spectrului proteic ca rspuns la
atacul patogenului, reflect modularea mecanismelor genetice de activare/represare a anumitor gene
responsabile de rezisten (Dangl, 2001).
Unii autori (Sehgal, 1999) au gsit corelaii pozitive ntre parametrii menionai, n timp ce R.
S. Fraser (1982) a demonstrat experimental c PR-proteinele nu joac un rol semnificativ n
obinerea rezistenei dobndite SAR n cazul reinfectrii plantelor, coninutul sporit sau numrul
mai mare de PR-proteine expresate la unele genotipuri necorelnd cu rezisten mai nalt a
plantelor. De asemenea, nu a fost stabilit o corelare direct ntre modificrile paternului proteic i
87

tolerana la secet n cazul studierii proteinelor de stres, induse de deficitul hidric la porumb ( Nayer
Mohammadkhani, Reza Heidari, 2007)

Rezultatele controversate au determinat formularea diferitor concluzii referitor la corelaia


dintre rezistena plantelor i sinteza PR-proteinelor, ca rezultat al expresiei genelor corespunztoare.
Probabil, totui sinteza PR-proteinelor caracterizeaz rspunsul defensiv al plantelor i nu
rezistena.
4.2.2. Modificarea spectrului polipeptidic la nivelul sistemului foliar la diverse genotipuri de
floarea soarelui sub aciunea stresului biotic
Lupoaia este un rizoparazit care nemijlocit se ataeaz de rdcinile florii-soarelui absorbind
apa, substanele minerale i organice din planta-gazd, provocnd un dezechilibru metabolic/trofic,
hormonal att la nivelul rdcinii ct i la nivelul organelor supraterestre ( ).
Interaciunea gazd parazit, manifestat prin reducerea capacitii de absorbie a sistemului
radicularare are un impact indirect asupra proceselor de fotosintez a plantelor-gazd (Stewart and
Press,1990). Plantele parazitate se ofilesc, ca rezultat al intensificrii

transpiraiei i inhibrii

reaciilor de oxido-reducere, determinate de deficitul hidric (Iliescu, 1974). Schimbrile statutului de


nutriie cauzate de plantele parazite sunt considerate a fi responsabile de o reducere, n mediu, cu
30% a ratei de cretere a plantelor.
Din aceste considerente, un interes a prezentat evidenierea particularitilor biochimice ale
interaciunii gazd-parazit la nivelul sistemului foliar.
SDS-PAGE-electroforeza proteinelor extrase din frunzele a ase genotipuri de floarea-soarelui
(hibrizii Xenia i Valentino, ct i liniile parentale ale acestora) au pus n eviden o diversitate
molecular a componenilor cu un anumit grad de specificitate determinat att de genotipul plantei,
ct i de stresul biotic.
n aspect general, spectrele electroforetice ale tuturor genotipurilor studiate au relevat prezena
a 20-40 polipeptide n funcie de etapa de dezvoltare a plantei-gazd, repartizate ntr-un diapazon cu
Mr 11.3-142.6 kDa kDa. Au fost constatate 16 fracii comune pentru ambii hibrizi i liniile
parentale pe parcursul etapelor de cercetare:
-

polipeptide cu o pondere cantitativ mare, reprezentat de fracia cu masa molecular

50.1 kDa prezent la toate etapele studiate;


-

polipeptide cu intensitate medie ce difer n dependen de etapa de dezvoltare, comune

fiind 12 fracii polipeptidice cu Mr: 11.3, 12.0, 13.4, 23.1, 24.729.0, 35.5, 37.4, 41.0, 67.5, 72.7 i
88.8 kDa, cele mai multe benzi polipeptidice de o intensitate medie au fost atestate dup 15 zile de
cultivare fiind 19 la numr, iar la 20-60 zile s-au atestat n jur de 14-15 benzi polipeptidice;

88

benzi minore ca intensitate au fost reprezentate de fraciile cu masele moleculare 120-

112, 34-32, 28-25, 22-13.8 kDa.


4.2.2.1. Varietatea spectrului polipeptidic a genotipurilor hibridului Xenia
i liniilor parentale ale acestuia la nivelul sistemului foliar
Rezultatele obinute la analiza proteinelor sumare extrase din frunzele plantelor martor a
hibridului Xenia i liniile parentale ale acestuia au pus n eviden prezena a unui numr diferit de
fracii polipeptidice n funcie de genotip i de etapa de dezvoltare. Astfel cele mai multe benzi s-au
constatat dup 15-20 zile cultivare (35-41 fracii proteice), la 30-40 numrul acestora fiind ntre 2535 benzi polipeptidice, iar la 50-60 zile s-au depistat 20-25 benzi polipeptidice. Numrul fraciilor
polipeptiduce la genotipul matern i hibridul F1 este similar meninndu-se pe parcursul etapelor
cercetate cu excepia etapei de 20 i 30 zile unde s-a observat prevalarea genotipului heterozigot.
Analiza comparativ a genotipurilor studiate a relevat o descretere constant a numrului de benzi
polipeptidice la linia materna i hibridul Xenia, pe parcursul tuturor etapelor studiate, n timp ce la
genotipul patern se constat o alternare n creterea (dup 40 de zile ) i descreterea numeric
(dup 30, 50, 60 zile).
Paternul polipeptidic a liniilor parentale a hibridului Xenia la etapa de 15 zile sunt foarte
asemntoare, totodat spectrul polipeptidic a genotipului patern este mai expresat i posed dou
benzi specifice cu masa molecular de 26.2 i 11.7 kDa.
La etapa de 20 zile la linia matern se expreseaz polipeptidul de 70.3 kDa, iar la linia patern
i hibrid se observ prezena polipeptidului de 65.4 kDa, evideniat slab att la hibrid ct i la
formele homozigote la etapa precedent. Spectrul polipeptidic al genotipului matern Xenia se
deosebete de cel patern i hibrid prin diminuarea intensitii fraciilor cu masa molecular mic
(11.3-20 kDa).
Comparativ cu etapele anterioare, deosebiri mai accentuate n profilul polipeptidic al
genotipurilor homozigote s-au constatat dup 30 de zile de cultivare, la linia matern atestndu-se
prezena fraciilor cu Mr de 78.4, 65.4, 43, 15.5, 14.5 i 12.0 kDa, iar la linia patern - polipeptidele
cu Mr de 113.9, 33.8, 27.0 i 20 kDa, ultima avnd o intensitate mare a colorantului (fig.4.2.14 ).
Dup 40 zile se constat prezena la linia patern a fraciei de 13.8 kDa ct i lipsa benzii de
24.5 kDa. Caracteristic etapei date este c profilul polipeptidic a liniei materne n diapazonul
fraciilor cu mas mare i medie este mai accentuat/intens colorat, iar benzile cu masa molecular
mic se evideniaz mai bine/exprim n cantiti mai mari la linia patern, n special polipeptidul
20 kDa asemenea etapei precedente/ de 30 zile.

89

kDa
82.4
78.4

68

65.0

45
33.8

25
20.0
19.0
18.0
15.5
14.5

13.4

12.0

Fig.4.2.14.Electroforeza proteinelor sumare extrase din frunzele hibridului Xenia i liniile parentale cultivate n
condiii normale
M- marcher, 1 Xenia , 2 Xenia , 3 - Xenia F1

La 50-60 zile de cultivare nu s-au atestat deosebiri majore, fraciile cuprinse n intervalul de
35-12 kDa, cu excepia benzilor polipeptidice de 20 i 19 kDa, se expreseaz mai slab comparativ
cu etapele de precedente.
Spectrul polipeptidic a genotipului heterozigot posed polipeptide caracteristice ambelor linii
parentale, ct i unele fracii specifice care s-au observat la anumite etape de cretere i dezvoltare.
Astfel, dup 15 zile de cultivare profilul polipeptidic a fost similar cu cel a liniilor parentale, ns sa atest lipsa benzii cu masa molecular 13.8 kDa prezent la formele homozogote.
La 20 zile hibridul se caracterizeaz prin prezena polipeptidului de 65.4 kDa care s-a atestat
la linia patern i a lipsit la forma matern.
Dup 30 zile de cultivare n condiii normale la genotipul heterozigot se relev prezena unor
fracii specifice cu Mr 13.0, 26.0 i 32.2 kDa, ct i fracii polipeptidice motenite de la forma
matern ( 78.4, 65.4, 43, 15.5, 14.5, 12.0 kDa) i patern (33.8, 27.0, 20 kDa).
La 40 de zile se observ prezena fraciei de 70.3 kDa care lipsete la formele parentale, iar
fracia polipeptidic de 24.5 kDa a fost motenit de la genotipul matern. Polipeptidul cu masa
molecular 70.3 kDa iniial s-a constatat la genotipul matern, dup 20 zile de cultivare, ca fiind un
polipeptid specific, aceasta ne face s presupunemc la linia heterozigot polipeptidul dat a fost
motenit de la forma matern.

90

La 50 i 60 zile nu s-au constatat deosebiri eseniale n paternul polipeptidic a genotipului


heterozigot, asemenea formelor parentale fraciile polipeptidice cuprinse n intervalul 12 - 35 kDa
sunt mai slab exprimate comparativ cu etapele precedente.
De menionat c intensitatea coloraiei majoritii benzilor polipeptidice la plantele martor a
fost mai accentuate la genotipul patern. Aceasta fiind o specificitate de genotip determinat probabil
de suprafaa foliar mai mare dect la linia matern i hibrid. Polipeptidul de 65.4 kDa s-a atestat la
etapele incipiente de dezvoltare (15-30 zile de cultivare), fiind caracteristic doar pentru hibridului
Xenia i liniile parentale a acestuia, nefiind depistat la hibridul Valentino i formele parentale lui.
Cele mai multe deosebiri n spectrele polipeptidice s-au atestat dup 30 de zile de cultivare.
4.2.2.2. Impactul patogenului Orobanche cumana asupra metabolismului proteic la nivelul
sistemului foliar a genotipurilor hibridului Xenia i liniilor parentale ale acestuia
Atacul lupoaiei a produs modificri neeseniale n numrului de benzi polipeptidice
comparativ cu martorul, astfel la 15-20 de zile se atest scderea numrului total de benzi, dup 30
de zile la toate genotipurile nu se constat schimbri numerice, pe cnd la 40-60 zile se relev o
dependen de genotip: la linia matern la etapele date numrul de benzi este similar martorului, la
genotipul patern la 40 de zile se atest o cretere, iar la 60 de zile o micorare a numrului total de
polipeptide. La genotipul heterozigot se constat micorarea numrului de benzi.
Genotipurile atacate de parazit posed acelai grup de benzi polipeptidice n funcie de dimensiunea
zonei i a intensitii colorantului ca i genotipurile ce au servit ca martor.
Influena lupoaiei asupra spectrului polipeptidic la etapele studiate s-a manifestat prin
accentuarea i diminuarea unor fracii polipeptidice la anumite etape de dezvoltare a plantei-gazd.
La 15 zile de la infecie aciunea lupoaiei la nivelul spectrului polipeptidic a liniilor parentale
i hibrid s-a manifestat prin diminuarea benzilor polipeptidice n special a celor cu masele
moleculare medii i mici (29.0-13.0 kDa). De menionat c la forma patern odat cu ataarea
parazitului se constat lipsa fraciei de 65.4 kDa (fig. 4.2.15) i intensificarea polipeptidelor cu Mr
33.8 i 12.0 kDa.
Xenia

Xenia

Xenia F1

kDa
67.5
65.4

Fig. 4.2.15. Lipsa fraciei polipeptidice cu masa molecular 61.0 kDa la linia patern cultivat
timp de 15 zile pe fond infectat
1 Xenia martor, 2 Xenia infectat, 3 - Xenia martor, 4 - Xenia infectat, 5 - Xenia F1
martor, 6 - Xenia F1 infectat, zdi zile dup infecie

91

La 20 zile de cultivare pe fond de infecie se atest mai puine modificri, astfel la genotipul
patern i hibridul din prima generaie intensitatea benzilor polipeptidice rmne la nivelul
martorului cu excepia fraciei cu Mr 12 kDa care se intensific la infecie, similar etapei anterioare.
De menionat c la genotipul patern se atest diminuarea benzilor polipeptidice cu Mr 11.3 i 65.4
kDa, iar la hibridul F1 a fraciilor de 119.7, 88.8, 82.4, 67.5, 32.8 i 13.6 kDa. Atacul parazitului la
genotipul matern a determinat intensificarea benzilor polipeptidice cu Mr mare, medie i mic.
Stresul biotic cu o durat de 30 zile la genotipurile parentale a determinat intensificarea benzilor
polipeptidice cu Mr n intervalul 11.3 -67.5 kDa. La genotipul matern s-a observat expresia unui
polipeptid nou la plantele supuse infeciei cu Mr 20 kDa, fracia data fiind prezent la plantele
martor i infectate a genotipul patern i hibridul F1 (fig.4.2.16).
Xenia

Xenia

Xenia F1

kDa

15-20 zdi

20
19

30 zdi
40 zdi
50-60 zdi
1

Fig. 4.2.16. Evidenierea fraciilor polipeptidice cu masa molecular 19.0. i 20.0 kDa la plantele martor
i infectate de floarea-soarelui la diferite etape de dezvoltare
1 Xenia martor, 2 Xenia infectat, 3 - Xenia martor, 4 - Xenia infectat, 5 - Xenia F1 martor,
6 - Xenia F1 infectat, zdi zile dup infecie

Totodat la linia patern s-a constatat lipsa polipeptidelor de 15.5, 14.5 (fig.4.2.17.) i 12.0
kDa, asemenea profilului polipeptidic martor. Polipeptidele respective se intensific la infecie la
linia matern i sunt prezente i la genotipul hibrid, dar care nu sufer schimbri.
Xenia

Xenia

Xenia F1

kDa

15-20 zdi
15.5

14.5

30 zdi
40-60 zdi
1

Fig. 4.2.17. Evidenierea fraciilor polipeptidice cu masa molecular 14.5 i 15.5 kDa la plantele martor
i infectate de floarea-soarelui la diferite etape de dezvoltare
1 Xenia martor, 2 Xenia infectat, 3 - Xenia martor, 4 - Xenia infectat, 5 - Xenia F1 martor,
6 - Xenia F1 infectat, zdi zile dup infecie

92

Hibridul F1 se caracterizeaz prin intensificarea fraciilor cu Mr 12, 18 i 24.5 kDa, ct i


diminuarea nesemnificativ a polipeptidelor din diapazonul 35.5 14.5 kDa, iar o buna parte de
benzi polipeptidice nu se modific la aciunea stresului biotic.
Atacul parazitului dup de 40 zile de la infecie a provocat modificri vizibile la genotipul
hibrid ct i la formele parentale. Astfel la genotipul matern predomin intensificarea fraciilor
polipeptidice cu excepia benzii polipeptidice cu Mr 11.3 kDa, care scade n intensitate (fig. 4.2.18).
Xenia

Xenia

Xenia F1
20 zdi
30 zdi
40 zdi

Fig. 4.2.18. Evidenierea fraciilor polipeptidice cu masa molecular 11.3 i 12 kDa la plantele martor i
infectate de floarea-soarelui la diferite etape de dezvoltare
1 Xenia martor, 2 Xenia infectat, 3 - Xenia martor, 4 - Xenia infectat, 5 - Xenia F1 martor,
6 - Xenia F1 infectat, zdi zile dup infecie

La genotipul patern se constat o diminuarea uoar n intensitatea colorantului a benzilor cu


Mr 43.0-11.3 kDa, cu excepia fraciilor de 23.1, 20.0 i 13.6 kDa care nu sufer modificri la
aciunea stresului. La hibrid predomina intensificarea fraciilor polipeptidice, iar fraciile 35.5 i
11.3 kDa diminueaz n intensitate.
Rezultatele obinute la 50 zile au relevat schimbri majore la linia materna, unde se constat
diminuarea fraciilor din spectrul polipeptidic al plantelor infectate, pe cnd la linia patern i
hibridul F1 atacul parazitului la etapa data a determinat puine modificri, care s-au manifestat prin
intensificarea benzilor mici de 12 i 11.3 kDa
Infecia la etapa de 60 zile a determinat apariia unei noi fracii, la genotipul patern cu masa
molecular de 42 kDa, care lipsete la forma matern i hibridul din prima generaie, att la plantele
martor ct i la cele infectate (fig.4.2.19.).
Xenia

Xenia

Xenia F1

kDa
42.7
42.0
41.0

Fig.4.2.19 . Prezena fraciei polipeptidice cu masa molecular 42.0 kDa la linia patern
cultivat timp de 60 zile pe fond infectat
1 Xenia martor, 2 Xenia infectat, 3 - Xenia martor, 4 - Xenia infectat, 5 - Xenia F1
martor, 6 - Xenia F1 infectat, zdi zile dup infecie

De asemenea la etapa dat s-a constatat accentuarea fraciilor polipeptidice la genotipul


matern i hibridul F1, dar se atest ca unele fracii diminueaz n intensitatea colorantului, astfel
benzile polipeptidic de 20 i 82.4 kDa scad n intensitate doar la linia matern.. La genotipul patern

93

predomin diminuarea fraciilor polipeptidice cu excepia benzilor 35.5 i 43 kDa care nu au suferit
modificri i se menin la nivelul martorului.
Analiza spectrelor electroforetice la diferite etape de infestare la genotipurilor precutate a
scos n eviden unele particulariti, astfel la genotipul matern a hibridului Xenia pe parcursul
etapelor de infestare majoritatea benzilor polipeptidice aveau o intensitate a colorantului mai
mare/evideniat comparativ cu martorul, la genotipul patern n mediu se constat diminuarea
fraciilor polipeptidice, iar hibridul se menine la nivelul martorului cu excepia unor fracii cu masa
molecular mic care la anumite etape fie se intensific sau diminueaz. De menionat c la formele
parentale s-au atestat n majoritatea cazurilor att apariia, ct i dispariia unor fracii polipeptidice
comparativ cu hibridul, cele mai multe schimbri de genul acesta s-a atestat la genotipul patern a
hibridului Xenia.

4.2.2.3. Varietatea spectrului polipeptidic la diverse genotipuri de floarea soarelui


n cadrul familiei Valentino la nivelul sistemului foliar
Analiza SDS-PAGE a proteinelor sumare din frunzele hibridului Valentino i liniile
parentale ale acestuia, n norm, la etapele studiate au pus n eviden prezena unui numr diferit de
benzi polipeptidice. Astfel cele mai multe benzi s-au constatat la 15-20 zile n numr de 37-42
fracii proteice, la 30-40 numrul acestora scade fiind de 34-36 benzi polipeptidice, iar la 50-60 zile
numrul fraciilor continu s scad pn la 18-26 benzi polipeptidice.
Spectrul polipeptidic a genotipurilor homozigote a hibridului Valentino sunt foarte
asemntoare la etapa de 15 zile, pe cnd ncepnd cu 20 zile se atest unele deosebiri. Astfel la
etapa dat la linia matern se relev prezena a fraciilor cu Mr de 90 kDa, care se exprim slab i
27 kDa.
La etapa de 30 zile paternul polipeptidic a formelor parentale a hibridului Valentino sunt mai
stabile/uniforme (posed o similitudine ..mare) comparativ cu liniile parentale a hibridului Xenia la
aceeai perioad. La etapa dat se atest prezena fraciei de 90 kDa la linia patern nefiind
observat la forma matern, iar polipeptidele cu Mr 27 i 32.2 kDa se evideniaz mai bine la forma
matern, iar fracia de 67.5 kDa la linia patern(fig. 4.2.20).
La 40 de zile se constat prezena fraciei de 70.3 kDa la linia matern, iar fraciile
polipeptidice de 13.8 i 32.2 kDa sunt caracteristice genotipului patern.

94

kDa
90.0

68

67.5

45

27.0

25

13.4

Fig. 4.2.20. Electroforeza proteinelor sumare extrase din frunzele hibridului Xenia i
liniile parentale cultivate n condiii normale timp de 30 zile
M- marcher, 1 Valentivo , 2 Valentivo , 3 - Valentivo F1

La 50 i 60 zile spectrele genotipurilor homozigote sunt similare, deosebiri majore nu s-au


constatat, totodat fraciile din diapazonul 35.0-12.0 kDa sunt slabe ca intensitate comparativ cu
etapele precedente.
Paternul polipeptidic a hibridului de prima generaie cuprinde polipeptide evideniate i la
formele parentale. Astfel la etapa de 15 zile se relev o fracie specific acestei perioade cu Mr de
70.3 kDa, lipsesc fraciile de 18 kDa care se atest slab la formele homozigote. Fraciile
polipeptidice cuprinse n diapazonul de 13.6-20 kDa au avut o intensitate mai slab la genotipul
heterozigot comparativ cu formele parentale. La 20 de zile se atest prezena polipeptidului de 90 i
27 kDa asemenea formei materne. Profilul polipeptidic dup 30 de zile de cultivare este identic cu
spectrul liniei materne. La 40 zile nu s-au atestat deosebiri eseniale n spectrul electroforetic a
hibridului fiind mai accentuat comparativ cu formele parentale, iar fraciile cu Mr 13.8 i 32.2 kDa
au fost motenite de la linia patern. Analiza spectrului electroforetic a hibridului dup 50 zile de
cultivare a scos n eviden lipsa polipeptidelor cu Mr 67.5 i 70.3 kDa, iar benzile polipeptidice cu
Mr 11.3, 12, 23.1, 24.5, 35.3 i 36.5 kDa sunt mai accentuate comparativ cu liniile parentale. La 60
zile nu s-au constatat deosebiri.

95

4.2.2.4. Impactul patogenului Orobanche cumana asupra metabolismului proteic la nivelul


sistemului foliar a genotipurilor familiei Valentino
Infecia cu lupoaie a determinat modificri minime al numrului de benzi polipeptidice
comparativ cu martorul, n majoritatea cazurilor predomin diminuarea numeric a fraciilor
polipeptidice, ct i meninerea la nivelul martorului (ex. pentru linia matern la 30 i 40 zile,
pentru linia patern la 20 i 50 zile, iar la hibrid la 40 i 50 zile de la infecie).
Atacul parazitului la etapa de 15 zile a provocat n majoritatea cazurilor diminuarea
intensitii colorantului a benzi polipepidice att la genotipul hibrid, ct i la liniile parentale.
La etapa de 20 de zile de la infecie se constat diminuarea intensitii colorantului a
spectrelor infectate la genotipul matern i hibridul primei generaii, iar la linia patern spectrul
polipeptidic este similar cu cel obinut de la planta martor, cu excepia fraciilor cu Mr 12 i 11.3
kDa, care se accentueaz vdit, iar benzile cu Mr 67.5 i 13.6 kDa scad n intensitate.
Similar hibridului Xenia i formelor parentale a acestuia, la 30 de zile de la infecie la formele
parentale ale hibridului Valentino se constat intensificarea colorantului a majoritii fraciilor
polipeptidice. La genotipul hibrid fraciile cu masa moleculara relativa mare (90-72 kDa) se
intensific, iar polipeptidele cu masa molecular mica (20-13.6 kDa) diminueaz n intensitate cu
excepia fraciei 11.3 kDa care de asemenea se intensific.
Infecia cu lupoaie dup 40 zile s-a manifestat la forma matern prin intensificarea
colorantului benzilor polipeptidice cu excepia fraciilor 35.5 i 20 kDa care diminueaz slab.
Polipeptidul de 70.3 kDa este specific genotipului matern (la etapa dat) intensificndu-se pe fond
de infecie(fig.4.2.21).
kDa

Valentino Valentino

Valentino F1

72.7
67.5

30 zdi

70.3

40 zdi
60 zdi
1

Fig. 4.2.21. Evidenierea fraciei polipeptidice cu masa molecular 70.3 kDa la linia matern cultivat timp de 40
zile pe fond infectat
1 Valentino martor, 2 Valentino infectat, 3 - Valentino martor, 4 - Valentino infectat, 5 - Valentino F1
martor, 6 Valentino F1 infectat, zdi zile dup infecie

La linia patern dimpotriv predomin diminuarea benzilor polipeptidice, iar banda de 12 kDa
crete n intensitate (fig. 4.2.22). Hibridul primei generaii se comport/manifest ca i genotipul
patern, iar fracia de 67.5 kDa practic dispare dup infecie, concomitent se observ intensificarea
polipeptidelor cu Mr 11.3, 18 i 35.5 kDa.

96

Valentino

Valentino Valentino F1
30 zdi
40 zdi
50 zdi

Fig. 4.2.22. Evidenierea fraciilor polipeptidice cu masa molecular 11.3 i 12 kDa la plantele martor i
infectate de floarea-soarelui la diferite etape de dezvoltare
1 Valentino martor, 2 Valentino infectat, 3 - Valentino martor, 4 - Valentino infectat, 5 - Valentino F1
martor, 6 Valentino F1 infectat, zdi zile dup infecie

La 50 zile de la infecie analiza spectrelor electroforetice la genotipurile studiate a relevant c


infecia a provocat intensificarea fraciilor proteice la linia matern i hibridul F 1, cu excepia benzii
cu Mr 67.5 kDa care dispare la genotipul matern i a fraciilor 35.3 kDa la genotipul hibrid. Linia
patern prezint mai puine modificri, dei fraciile 119.7, 67.5 i 33.8 kDa diminueaz n
intensitate, iar benzile polipeptidice cu Mr 35.5, 12.0 i 11.3 kDa se intensific.
Atacul parazitului la 60 zile a determinat intensificarea spectrelor polipeptidice la formele
parentale, iar la genotipul hibrid se atest diminuarea fraciilor polipeptidice
Generaliznd rezultatele expuse mai sus putem meniona c n cazul hibridului Valentino i
liniile parentale la primele etape de dezvoltare a parazitului, n cadrul spectrelor proteice se constat
diminuarea n intensitate a polipeptidelor. La genotipul paterne ncepnd cu etapa de 30 de zile s-au
atestat intensificarea fraciilor polipeptidice, iar la hibrid pe parcursul creterii i dezvoltrii
plantelor infectate paternul polipeptidic a fost n diminuare comparativ cu martorul. Aceast
diminuare constant la F1 se asociaz cu numrul mare de ataamente pe rdcinile genotipului.
Deci spectrul polipeptidic la hibridului Valentino i liniile parentale infectate cu lupoaie a
variat mai puin, comparativ cu hibridului Xenia i formele parentale ale acestuia, aceasta corelnd
cu gradul de infecie la genotipurile date.

97

CAPITOLUL V. DETERMINISMUL GENETIC A REZISTENII UNOR GENOTIPURI DE


FLOAREA-SOARELUI LA LUPOAIE
Elucidarea determinismului genetic al mecanismelor de rezisten la factorii biotici i abiotici,
precum i elaborarea marcherilor moleculari utili n selectarea formelor rezistente de plante de
cultur constituie o problem actual (Parker C.,1994).
Pn n prezent au fost studiate i implementate diverse metode de control a parazitului
lupoaia inclusiv: folosirea erbicidelor, solarizarea solului, rotaia culturilor agricole cu modificarea
timpul de cultivare a plantelor de floarea-soarelui i utilizarea agenilor biologici. ns selecia
formelor de floarea-soarelui rezistente la lupoaie a fost i rmne o preocupare de baz a
cercettorilor (Vrnceanu, 2004).
5.1. Analiza cantitativ a acizilor nucleici
Activitatea funcional a genomului este redat de capacitatea de replicare a ADN-lui, de
transcripie a ARN i sinteza proteinelor, care reflect realizarea potenialului metabolic i
morfogenetic al genotipului [Nagl W.]. Factorii de stres, adesea, blocheaz activitatea funcional a
ADN-lui i sporesc stabilitatea cromatinei. Numeroase cercetri au demonstrat modificarea
coninutului de acizi nucleici, sub aciunea factorilor de stres [ Jui X.C, Nagl W, Duca M., 1998,2002,
., .].

Nagl (1976) i Capesius (1975) raporteaz variaii excesive a

coninutul de ADN nuclear pn la 60%, iar Michaelson (1991) i Cavallini (1989) au detectat
variaii de 32% i 58%, la unele linii de floarea-soarelui. Calitatea ct i cantitatea luminii de
asemenea influeneaz asupra stabilitii coninutului de ADN la floarea-soarelui [Pirce J.H.].
Investigaiile efectuate asupra genotipurilor studiate au remarcat diferene vdite n
modificarea coninutului acizilor nucleici sumari (ADN i ARN) la plantele infectate cu lupoaia.
Coninutul AN sumari la familia Xenia variaz ntre 0,68-1,69 mg/g (tabelul 5.1.1). n condiii
normale de cretere AN sumari au valori n limitele 1,32-1,69 mg/g, cea mai mare valoare
atestndu-se la forma heterozigot.
Pe fon de infecie cu lupoaie se constat o micorare semnificativ a AN n majoritatea
cazurilor, observndu-se cel mai vdit la genotipul homozigot patern la toate trei populaii de
lupoaie utilizate, mai pronunat fiind la lupoaia din regiunea Rostov (0,68 mg/g mas proaspt).

98

Tabelul 5.1.1.
Influena O cumana Wallr. asupra coninutului acizilor nucleici n frunzele de floarea-soarelui
( familia Xenia, mg/g mas proaspt)
Varianta

moldova
rostov
volgograd

Orobanche cumana Wallr

Martor

Genotip

F1

F1

F1

F1

ARN
Mm
1,03 0.012
1,22 0.012
1,53 0.025
0.95 0.015
0,94 0.009
1,47 0.012
0,70 0.019
0,57 0.012
0,73 0.01
1,03 0.009
0,63 0.015
1,47 0.015

td

4.7*
18.6*
1.7
15.3**
39.2**
29.2**
0.46
30.5**
1.7

ADN
Mm
0,29 0.019
0,12 0.012
0,16 0.012
0,11 0.012
0,14 0.006
0,15 0.015
0,11 0.012
0,11 0.006
0,17 0.01
0,07 0.007
0,08 0.009
0,15 0.012

AN
td

8.5*
1.3
0.9
8.6*
1.0
0.4
11.8**
3.1
0.8

1,35
1,34
1,69
1,06
1,08
1,61
0,81
0,68
0,90
1,10
0,71
1,61

* - diferena este statistic autentic cu un prag de semnificaie 95%


** - diferena este statistic autentic cu un prag de semnificaie de 99%

La atacul lupoaiei genotipul heterozigot depete genotipurile homozigote ca i n cazul


martorului (fig. 5.1.1), dar are valori mai mici, cea mai mic atestndu-se n varianta cu lupoaia de
origine Rostov (0,90 mg/g).

F1

Figura 5.1.1. Coninutul AN sumari n frunzele de floarea-soarelui la familia Xenia la aciunea O. cumana Wallr.

Totodat au fost depistate unele deosebiri n coninutul ARN-ului i ADN-ului (tabelul1). n


acest context se relev o stabilitate a coninutul ADN-ului la genotipurile homozigote. La nivelul
populaiilor de lupoaie studiate stabilitatea ADN cel mai bine s-a exprimat la plantele infectate cu
lupoaie autohton.
Menionm faptul, c raportul ARN/ADN variaz pe fon de infecie (tabelul 5.1.2). La
genotipul homozigot matern se constat o cretere a raportului ARN/ADN, comparativ cu martorul
99

demonstrnd creterea activitii funcionale a aparatului ereditar prin intensificarea proceselor de


transcripie, pe cnd la forma homozigot patern i cea heterozigot raportul dat scade, ceea ce
poate fi cauzat de blocarea procesului transcripional.
Tabelul 5.1.2.
Raportului acizilor nucleici (ARN/ADN) n frunzele de floarea-soarelui
la aciunea O. cumana Wallr. ( familia Xenia, mg/g mas proaspt)

Genotip

Martor

F1

5,2
9,9
9,6

Orobanche cumana Wallr.


Moldova Rostov
Volgograd
8,6
6,4
14,7
6,7
5,2
7,9
9,8
4,3
9,2

Generaliznd datele obinute constatm c n cadrul familiei Xenia, genotipul heterozigot n


toate cele trei variante studiate dup coninutul sumar al AN i n special al ARN-ului prevaleaz
genotipurile homozigote parentale, iar lina homozigot matern are valori apropiate de varianta
martor.
n cadrul familiei Valentino coninutul AN variaz n limitele 0,53-2,08 mg/g masa proaspt.
n condiii normale, ca i n cazul familiei Xenia forma heterozigot are valori cele mai mari - 2,08
mg/g comparativ cu formele homozigote parentale 1,49 mg/g (fig. 5.1.2.).
Datele prezentate n tabelul 3 i figura 2 confirm micorarea coninutului sumar al AN n
frunzele plantelor infectate cu lupoaia din diferite regiuni geografice.
Tabelul 5.2.3.
Influena O cumana Wallr. asupra coninutului acizilor nucleici n frunzele de floarea-soarelui
( familia Valentino, mg/g mas proaspt)
Varianta

Genotip

moldova
rostov
volgograd

Orobanche cumana Wallr

Martor

F1

F1

F1

F1

ARN
Mm
1.22 0.015
1.01 0.012
1.77 0.015
0.63 0.024
0.69 0.009
1.02 0.024
0.82 0.012
0.50 0.015
1.10 0.027
0.40 0.012
1.03 0.035
1.67 0.025

td

20.3**
21.5**
26.7**
20.4**
27.1**
21.8**
42.8**
0.36
3.67

ADN
Mm
0,27 0.012
0,48 0.012
0,31 0.012
0,053 0.003
0,11 0.009
0,13 0.009
0,09 0.012
0,09 0.012
0,16 0.009
0,13 0.006
0,11 0.012
0,17 0.012

AN
td

17.4**
25.3**
12.5**
10.6**
22.7**
10.1**
10.8**
21.8**
8.6*

1,49
1,49
2,08
0,69
0,80
1,16
0,91
0,59
1,26
0,53
1,14
1,87

* - diferena este statistic autentic cu un prag de semnificaie 95%, ** - diferena este statistic autentic cu un prag de
semnificaie de 99%

100

Genotipul heterozigot infectat, dup coninutul AN, de asemenea depesc genotipurile


homozigote parentale. La aceast familie toate cele trei populaii utilizate au avut n medie
aceeai aciune, n comparaie cu familia Xenia unde se observ o diferen clar n aciunea
fiecrei populaii de lupoaie.

F1

Figura 5.1.2. Coninutul AN sumari n frunzele de floarea-soarelui la familia Valentino la aciunea O. cumana
Wallr.

Coninutul ARN-lui i al ADN-lui n cazul familiei Valentino variaz n cadrul genotipurilor,


ct i sub aciunea populaiilor de lupoaiei. Raportul ARN/ADN la plantele infectate comparativ cu
martorul crete la majoritatea genotipurilor, excepie fcnd doar genotipul homozigot matern pe
fonul lupoaie din Volgograd (tabelul 5.1.4).
Tabelul 5.1.4.
Raportului acizilor nucleici (ARN/ADN) n frunzele de floarea-soarelui
la aciunea O. cumana Wallr. ( familia Valentino, mg/g mas proaspt)
Genotip

Martor

F1

4,5
2,1
5,7

Orobanche cumana Wallr


Moldova Rostov
Volgograd
10,5
9,11
3,1
6,3
5,6
9,4
7,9
6,87
9,8

Creterea raportului respectiv ne vorbete despre intensificarea transcripiei anumitor gene


implicate n rspunsul defensiv al plantei-gazde la atacul lupoaiei.
Studiul mai detaliat al influenei lupoaiei de origine autohton asupra metaboloismului nucleic
la plantulele diferitor genotipuri de floarea-soarelui a permis s constatm c coninutul AN la
nivelul prii aeriene a genotipurilor studiate n medie este mai mic dect n frunze i variaz de la
0,43 pn la 0,96 mg/g masa proaspt. Genotipurile heterozigote ale familiilor studiate att n
condiii normale, ct i la atacul lupoaiei atest valori mai mari la genotipurile parentale. Pe fon de
infecie are loc diminuarea coninutului AN la majoritatea genotipurilor cu excepia genotipului

101

homozigot patern Xenia i genotipul homozigot matern Valentino, ns aceast cretere este
nesemnificativ (fig.5.1.3).
Rezultatele obinute relev o diminuare a coninutului de ARN, ct i a coninutului de
ADN. (tabelul 5.1.5).
Tabelul 5.1.5.
Coninutul acizilor nucleici la nivelul prii aeriene la familiile Xenia i Valentino sub

Valentino

Xenia

F1

F1

ARN/ADN

ARN

ADN

AN

Varianta

Genotip

Familia

influena O. cumana din Moldova (mg/g mas proaspt)

Control
Infectat
Control
Infectat
Control
Infectat
Control
Infectat
Control
Infectat
Control
Infectat

0,43
0,46
0,56
0,52
0,77
0,69
0,56
0,54
0,66
0,78
0,96
0,8

Mm

td

Mm

td

0,51 0,02
0,42 0,08
0,63 0,02
0,39 0,05
0,69 0,03
0,48 0,04
0,61 0,05
0,50 0,04
0,74 0,03
0,51 0,01
0,90 0,01
0,72 0,01

1,18

0,051 0,006
0,047 0,004
0,060 0,002
0,054 0,008
0,076 0,018
0,043 0,006
0,052 0,002
0,044 0,012
0,058 0,002
0,046 0,001
0,064 0,002
0,055 0,007

0,58

4,44**
3,81*
1,64
0,80
10,59**

0,73
1,75
0,68
6,00**
1,25

10,0
8,94
10,5
7,22
9,08
11,16
11,73
11,36
12,76
11,09
14,06
13,09

Raportul ARN/ADN la plantele infectate comparativ cu martorul scade la majoritatea


genotipurile, excepie fcnd doar genotipul heterozigot a familiei Valentino (tabelul 5.1.5.).

XENIA

VALENTINO

Figura 5.1.3. Coninutul AN sumari la nivelul prii aeriene de floarea-soarelui la familia Xenia i Valentino la
aciunea O. cumana Wallr.

Astfel rezultatele obinute denot o legitate similar a datelor obinute anterior n studiul
modificri AN n frunzele diferitor genotipuri de floarea-soarelui.
102

5.2. Evidenierea marcherului genetic asociat cu gena Or5 ce confer


rezisten la rasa E de lupoaie la unele genotipuri de floarea-soarelui
Majoritatea datelor existente n literatur atest determinismul monogenic dominant al
rezistenei la rasele A - E de lupoaie [ Pogorletsky P.K., 1976; Vrnceanu A.V.,1980; Ish-Shalom-Gordon N.,
1993; Sukno S.A., 1999].

ns unele referine relev o motenire mai complex a caracterului, incluznd

dou gene dominante [Dominguez J., 1996], una recesiv [Ramaiah K.V.,1987], epistazie recesiv dubl
[Kirichenco V.V.,1987] interaciune aditiv a genelor minore [Pogorlekii i Gheele, 1975], gene cu
interaciune complimentar [Krohin, 1980], dou gene Or necumulative [Ciriaev,1987], citoplasmogene
[Paleev, 1983] sau chiar motenirea cantitativ [Pustovoit, 1966]. Studiile recente sugereaz c rezistena
la lupoaie este determinat de mecanisme poligenice cantitative i calitative [ Labrousse P., 2004; PerezVich B., 2004].

Identificarea determinismului genetic al rezistenei se bazeaz tot mai mult pe

utilizarea marcherilor moleculari ADN specifici [Perez-Vich B., 2004], inclusiv a marcherilor
moleculari linkai cu gena Or5, ce confer rezisten la rasa E (Lu. i colab. 2000), utiliznd metoda
BSA (bulked segregant analysis) [Michelmore R.M.,1991].
Utilizarea tehnicii RAPD [Williams J.G.,1990] mbinat cu BSA [Michelmore R.M.,1991] i
folosirea marcherilor moleculari strns linkai la genele rezistenei au permis identificarea genelor
de rezisten la diferite plante, cum ar fi genele rezistenei la finarie la Laptuca sativa [Michelmore
R.M.,1991],

genele rezistenei orzului la Rhynchosporium secalis [Barua U.M.,1993], la rugin

[Borovkova I.G., 1997] i altele. Urmrind construcia hrii RFLP la floarea-soarelui [ Gentzbittel
L.,1995]

i BSA au fost identificai marcheri RFLP linkai cu genele rezistenei la finarie PL1, Pl2

i Pl 6 [Mouzeayar S., 1995; Roeckel-Devert P., 1996; Vear F., 1997]. Toate aceste trei gene au fost linkate la
acelai set de marcheri RFLP i formeaz un cluster a grupului de linkaj 1 [Vear F., 1997].
Pn n prezent la floarea-soarelui au fost identificai marcheri RAPD (UBC120_660) i
SCAR (RTS05, RTS28, RTS40, RTS29 i RTS41) linkai la Or5 i a fost elaborat harta grupului de
linkaj pentru gena Or5, n vecintatea creia la distana de 22,5 cM distal se afl marcherul RAPD
i de la 5,6 cM spre 39,4 cM proximal cei 5 marcheri SCAR. Acest grup de linkaj a fost plasat n
grupul de linkaj 17 (LG17) al mapei CARTISOL RFLP [Lu Y. H., 2000]. Tang (2003) folosind aceeai
metod (BSA) a plasat gena Or5 n regiunea telomeric a grupului de linkaj 3 (LG3) dup harta
marcherilor SSR [Tang S., 2002], cu cel mai apropiat marcher SSR cartat la 6,2 cM proximal de
locusul genei Or5.
n lucrarea dat s-au studiat 54 de genotiputi de floarea-soarelui n vederea evidenierii
locusului lincat la gena Or5. Pornind de la rezultatele obinute de Lu i colab. (2000) n urma
analizei BSA au constatat c unul din cei mai apropiai marcheri SCAR este marcherul RTS-05
103

cartat la distana de 5,6 cM proximal de gena Or5, n cercetrile noastre am utilizat acest marcher
cu fragmentul iniial al primerului RAPD - OPJ18_650 cu un produs de amplificare de 650 pb.
Analiznd rezultatele obinute (fig.5.2.1.) asupra grupurilor de genotipuri (liniile paterne
homozigote i hibridul F1), care alctuiesc hibrizii Valentino, Xenia i Drofa n rezultatul reaciei de
amplificare cu perechea de primeri specifici menionai s-a vizualizat prezena produsului de 650 pb
la toate genotipurile heterozigote i paterne. La linii materne ampliconul s-a evideniat foarte slab
cu excepie linia matern a hibridului Drofa la care ampliconul nu s-a depistat. Aceste date ne
permit s presupunem c aceste genotipuri posed gena Or5, iar lipsa acestuia la genotipul matern
Drofa c aceast linie este susceptibil la rasa E de lupoaie.
pb
1000

650 pb

500

100

F1

Valentino

F1

Xenia

F1

Drofa

Fig. 5.2.1.. Electroforeza produsului de amplificare (650 pb) cu primerul specific RTS 05
M marcher (100-100pb), hibrizii Valentino, Xenia, Drofa i formele parentale ale acestora

Identificarea locusului linkat cu gena Or5 a fost efectuat i la 11 linii androsterile i 7 hibrizi
de floarea soarelui (fig.5.2.2. ). Ampliconul de 650 pb s-a observat bine la liniile androsterile 1 - 3,
5, 6, 10 i slab la liniile 8, 9,11 i lipsete cu desvrire la linia a 7.
pb
1000
650 pb

500

100

1ASC

2 ASC

3 ASC 4 ASC 5 ASC

6 ASC 7 ASC 8 ASC

9 ASC 10 ASC 11 ASC M

Fig.5.2.2. Electroforeza produsului de amplificare (650 pb) cu primerul specific RTS 05


M marcher (100-100pb), linii ASC numerotate convenional de la 1 la 11

Toi hibrizii cercetai au dat amplificare cu primerul specific RTS-05 (fig.5.2.3.)


pb
1000
650 pb

500

h1

h2

h3

h4

h5

h6

h7

100

Fig. 5.2.3. Electroforeza produsului de amplificare (650 pb) cu primerul specific RTS 05
M marcher (100-100pb), hibrizi: h1 Turbo, h 2 Performer, h 3 Vitalia, h 4 Alcazar, h 5 Olea,
h 6- Favorit, h7 - Oxana

104

n studiu de asemenea au fost analizate 27 linii de floarea-soarelui (necunoscute, numerotate


convenional 1 - 27). Conform rezultatelor obinute la 23 de linii s-a atestat prezena ampliconului,
iar la liniile 7, 14, 16 i 24 s-a constatat lipsa acestuia (fig. 5.2.4.).
pb
1000
650 pb
500
100

pb
1000
650 pb

500
100

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

pb
1000
650 pb

500

100

23

24

25

26

27

Fig. 5.2.4. Electroforeza produsului de amplificare (650 pb) cu primerul specific RTS 05
M marcher (100-100pb), linii de floarea-soarelui necunoscute numerotate convenional de la 1 la 27

Studiile efectuate de Lu i colab. 20000 pe linii rezistente (RPG01) i susceptibile (AEHC1)


au demonstrat prezena ampliconului de 650 pb, generat de primerul specific RTS-05, doar la
genotipurile rezistente.
Rezultate obinute denot c liniile i hibrizii analizai poseda rezisten la rasa E de lupoaie
cu excepia liniei androsterile 7asc i Drofa, ct i liniile 7, 14, 16 i 24. Evidenierea slab a
ampliconul de 650 pb la liniile androsterile ( 8, 9,11) i la linii necunoscute( 2, 9, 20) ar putea fi
determinat de calitatea joas a ADN-lui.
Probele care au dat amplificare au fost supuse restriciei cu enzima Taq I, situl de recunoate a
creia este 5' T/CGA 3'. Restricia a durat 12 ore, la temperature de 65 C (Lu Y., 2004).
105

Avnd n vedere c nu se cunoteau produii de restricie cu Taq I i la amplificare s-au


evideniat ampliconi nespecifici n gelul de electroforez s-au plasat o prob cu apmlicon i
produii de restricie a probei date.
Ampliconul de 650pb supus digestie cu Taq I a generat dou fragmente de ADN diferite ca
masa: 530 i 120pb (fig 5.2.5). Din 48 de probe supuse testrii, produii de restricia s-au observat
bine la 28 de probe, foarte slab la 2 probe, iar la 17 nu s-a observat nimic, putem spune cu
certitudine ca doar o singur prob nu a fost resctictat hibridul Favorit (fig.5.2.7.) la care dup
restricie se observ foarte bine ampliconul iniial de 650 pb.
D
a

Pb

D
a

DF1
r

X
r

X F1
r

pb

1000
500

650
530

100

120

Fig. 5.2.5. Electroforeza produsului de resticie


M marcher (100-100pb), D Drofa, X - Xenia, a amplicon, r produii de restricie

h1
a

h2
r

h3
r

h4
r

h5
r

pb

Pb
1000

650
530

500

100
Fig. 5.2.6. Electroforeza produsului de resticie
M marcher (100-100pb), h1 Turbo, h 2 Performer, h 3 Vitalia, h 4 Alcazar, h 5 Olea
a amplicon, r produii de restricie

h6
a

h7
r

M
r

V
a

V
r

V F1
r

r
pb

Pb
1000

650
530

500

100
Fig.5.2.7 . Electroforeza produsului de resticie
M marcher (100-100pb), h 6- Favorit, h7 - Oxana, V Valentino, a amplicon,
r produii de restricie

106

Pb
1000

5
r

pb

650
530

500

100
Fig.5.2.8.. Electroforeza produsului de resticie
M marcher (100-100pb), linii necunoscute numerotate convenional de la 1-5,
a amplicon, r produii de restricie

6
pb

8
r

9
r

10
r

11
r

M
r

Pb
1000

650
530

500

100
Fig. 5.2.9. Electroforeza produsului de resticie
M marcher (100-100pb), linii necunoscute numerotate convenional de la 6,8-11,
a amplicon, r produii de restricie

M
Pb
1000

12
a

13
r

15
r

17
r

18
r

pb

650
530

500

100
Fig.5.2.10. Electroforeza produsului de resticie
M marcher (100-100pb), linii necunoscute numerotate convenional de la 12, 13,15,17,18,
a amplicon, r produii de restricie

107

19
a

20
r

21

22
r

23
r

M
r

Pb
1000
500

100
Fig. 5.2.11. Electroforeza produsului de resticie
M marcher (100-100pb), linii necunoscute numerotate convenional de la 19-23,
a amplicon, r produii de restricie
25

26

27

pb
a

Pb
1000

650
530

500

100
Fig. 5.2.12. Electroforeza produsului de resticie
M marcher (100-100pb), linii necunoscute numerotate convenional de la 25-27,
a amplicon, r produii de restricie
M

1ASC

Pb
1000

2ASC
r

3ASC
r

4ASC
r

5ASC
r

pb

650
530

500

100
6ASC
a

5.2.13. Electroforeza
produsului
8Fig.
9ASC
10ASC de resticie11ASC
M
ASC
M marcher (100-100pb), linii ASC numerotate convenional de la 1-5,
a r amplicon,
r rproduiia de restricie
r
a
a
r
a
r

Pb
1000
500

100
Fig. 5.2.14. Electroforeza produsului de resticie
M marcher (100-100pb), linii ASC numerotate convenional de la 6,8-11,
a amplicon, r produii de restricie

108

Prezena ampliconului de 650 pb la genotipurile studiate presupune prezena genei Or5 ce


confer rezisten la rasa E de lupoaie, iar lipsa ampliconului la genotipul matern Drofa, linia
androsteril Nr. 7 i liniile 7,14,16, 24 ne permite s presupunem c aceste genotipuri sunt
susceptibile la atacul lupoaie rasa E.

CONCLUZII
1.

Cercetrile efectuate au pus n eviden dependena gradului de infecie de genotip,


ct i de originea parazitului. S-a constatat c hibridul se manifest fie ca una dintre liniile
parentale sau intermediar acestor forme. Plantele de floarea-soarelui infectate cu populaia de
109

lupoaie din Volgograd a avut cel mai nalt grad de infecie comparativ cu populaiile din
Rostov i Moldova
2.

Temperaturile joase rein dezvoltarea parazitului, astfel nct acesta nu afecteaz planta gazd, n
timp ce temperaturile nalte grbesc creterea i dezvoltarea parazitului i respectiv diminuarea
indicilor morfo-fiziologici. Rezultatele cercetrilor au scos n eviden c gradul de infecie, la hibrizii
Xenia i Valentino n variantele studiate, s-a meninut la nivelul limitei semnificative a diferenei, ceea
ce denot o labilitate i adaptare a genotipurilor heterozigote la condiiile mediului. Totodat
comparnd aceste genotipuri hibride s-a constatat c Valentino F1 este mai sensibil la atacul parazitului,
fiind atestate cele mai multe ataamente pe rdcini.

3.

Acumularea peroxidului n condiii normale manifest specificitate de genotip, fiind mai


pronunat la familia Xenia i practic lipsit la familia Valentino. Atacul cu lupoaie induce
intensificarea sintezei H2O2 la genotipurile analizate, n special la reprezentanii familiei
Valentino, constituind una dintre reaciile primare de rspuns a plantelor la stres.

4.

Activitatea catalazei scade pe fon de infecia la familiile Xenia i Valentino la nivelul


frunzelor ca rezultat al acumulrii SRO. Cantitatea H2O2 coreleaz cu activitatea enzimei, att
n condiii normale, ct i n urma atacului lupoaiei, fiind relevat prin diminuarea acestui
indice. Diminuarea activitii catalazei n frunze n condiii de infectare coreleaz cu cea din
rdcin, doar n cazul genotipurilor familiei Xenia, pe cnd la genotipurile din familia
Valentino s-a atestat un fenomen invers, ceea ce denot o mai mare susceptibilitate a familiei
date fa de parazit

5.

In baza analizei spectrului electroforetic al proteinelor totale din plantulele de floareasoarelui genotipurile ce formeaz hibridul Xenia conine un spectru mai variat de benzi
polipeptidice comparativ cu genotipurile ce formeaz hibridul Valentino. Atacul parazitului a
provocat modificri notabile n spectrele polipeptidice ale genotipurilor cercetate, n special la
nivel sistemului radicular, variaii calitative depistndu-se att n dependen de etapa de
dezvoltare, ct i de genotip.

6.

cantitatea acizilor nucleici diminuiaz n frunzele genotipurilor studiate cultivate pe fon


infectat cu lupoaia. S-a atestat c coninutul AN sumari la genotipurile heterozigote Xenia i
Valentino cultivate n condiii de stres biotic este mai sporit, fa de genotipurile homozigote
parentale. Aceasta majorare fiind exprimat pe contul creterii ARN-lui

7.

Prezena ampliconului de 650 pb la liniile i hibrizii studiai confirm prezena genei


Or5 ce confer rezisten la rasa E de lupoie, iar lipsa ampliconului la genotipul matern Drofa,
linia androsteril Nr. 7 i liniile 7,14,16, 24 ne permite s presupunem c aceste genotipuri
sunt susceptibile la atacul lupoaie rasa E. Infectarea tuturor genotipuri analizate, ns cu diferit

110

grad de infecie ne face s presupunem c lupoaia utilizat face parte din rasa F, caracterizat
printr-o virulen sporit.

111