ZEARALATEST

MANUAL DE INSTRUES
PORTUGUS

NDICE
PGINA
1.0

Introduo
1.1 Objetivo do Uso
1.2 Princpio
1.3 Aplicabilidade e Aprovao
1.4 Limitaes
1.5 Amostragem
1.6 Prazo de Validade e Condies de Estocagem
1.7 Procedimento geral Zearalatest
1.8 Procedimento geral Zearalatest para HPLC

03
03
03
03
03
04
05
06

Preparo e Calibrao do Equipamento

2.1 Calibrao do fluormetro srie 4
2.2 Calibrao do Mini-fluormetro MF-2000
2.3 Passos para preparo da filtrao
2.4 Ajuste do suporte da bomba
2.5 Limpeza do equipamento

07
09
10
11
12

Preparo de Reagentes e Teste

3.1 Preparo das solues de extrao
3.2 Preparo de soluo de diluio
3.3 Preparo de solues de de Revelador ZearalaTest
3.4 Checagem de reagentes

13
13
13
13

Procedimentos para fluormetro

Materiais e equipamentos requeridos para procedimento fluorimtrico
4.1
Milho
4.2
Raes
4.3
Sorgo

15
16
17
18

Procedimentos para HPLC

Materiais e equipamentos requeridos para procedimento HPLC
Milho, Sorgo e Raes

19
20

Precaues
6.1 Precaues Gerais para procedimento Fluorimtrico
6.2 Solues de problemas no procedimento fluorimtrico

21
22

7.0

Assistncia tcnica no Brasil

23

8.0

Responsabilidades

23

9.0

Informao Adicional

23

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

AflaTest

Pgina

1.1 OBJETIVO DO USO

Zearalatest um mtodo quantitativo para deteco de zearalenona em milho, raes para
aves e sorgo. Zearalatest um teste utilizado em ampla variedade de locais, de unidades
armazenadoras no campo e laboratrios de controle de qualidade nas indstrias at laboratrios
de anlises do governo qualquer lugar onde anlises rpidas, fceis e acuradas de zearalenona,
podem prevenir contaminao e melhorar a qualidade dos alimentos. Pode ser executado em
menos de 15 minutos, excluindo-se o preparo da amostra, e no requer habilidades especiais.

1.2 PRINCPIO
A zearalenona uma mjcotoxina estrognica produzida pelo fungo Fusarium graminearum. A
zearalenona induz a feminizao em animais em concentrao de 1 ppm em alimentos.
Concentraes altas (50 100 ppm) podem interferir na concepo, ovulao, implantao,
desenvolvimento fetal e viabilidade de novas concepes.
Amostras so preparadas pela mistura com uma soluo de extrao, triturao e filtrao. O
extrato ento aplicado em uma coluna Zearalatest com anticorpos especficos para
zearalenona. Neste estgio, a zearalenona se liga aos anticorpos da coluna. A coluna ento
enxaguada com gua para livrar a coluna de imunoafinidade de impurezas. Pela passagem de
metanol atravs da coluna, as zearalenonas so removidas dos anticorpos. Esta soluo
metanlica pode ser injetada em HPLC ou quantificada em um fluormetro. Estas etapas esto
representadas na seo 1.7 e 1.8.

1.3 APLICABILIDADE E APROVAO

Zearalatest foi otimizado para fornecer medidas quantitativas de zearalenonas em milho, raes
para aves com 17% de protena e sorgo. Assistncia para determinao de zearalenonas em
commodities no listadas neste manual pode ser obtida contatando-se nosso Departamento de
Assistncia Tcnica.

1.4 LIMITAES
Este teste foi desenvolvido para uso de acordo com os procedimentos e reagentes descritos nas
pginas a seguir. No utilize material com prazo de validade vencido. Modificaes nestas
instrues podem no gerar resultados timos.

1.5 AMOSTRAGEM
Micotoxinas no ocorrem em toda semente de um lote ou podem ocorrer apenas numa pequena
poro de sementes do lote. Devido a ampla faixa de concentrao de micotoxinas entre
sementes individuais num lote contaminado, variaes de amostra para amostra podem ser
grandes. importante obter uma amostra representativa de um lote. O produto deve ser coletado
de diferentes locais de um lote esttico baseado num parmetro de referncia. Este plano de
amostragem pode ser traado do topo ao fundo do lote. As amostras obtidas do lote devem ser
trituradas e homogeneizadas e uma sub-amostra deve ser retirada para a anlise.
Para maiores informaes sobre amostragem de gros, consulte as publicaes FGIS a seguir:
FGIS Aflatoxin Handbook
FGIS Grain Inspection Handbook, Book 1, Grain Sampling
FGIS Mechanical Sampling Systems Handbook
Quantidades limitadas destas publicaes esto disponveis gratuitamente, sob consulta. Escreva
AflaTest

Pgina

para:
USDA - APHIS, MSD - HSB PDMS
Room 1 A 28
4700 River Road
Riverdale, MD 20737

1.6 PRAZO DE VALIDADE E CONDIES DE ESTOCAGEM

Armazene temperatura ambiente. Armazenagem a temperaturas acima de 30 C por perodos
prolongados pode reduzir o prazo de validade. Se a estocagem acima de 30C for prevista, todos
os produtos podem ser armazenados a 4C. Recomenda-se utilizar reagentes temperatura
ambiente (18 22C).

AflaTest

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1.7 PROCEDIMENTO GERAL ZEARALATEST

EXTRAO DA AMOSTRA
Misturar 20g de amostra moda com 5g de sal e
50 ml de metanol:gua (80:20)
Misturar a alta velocidade por 2 minutos.
Filtrar em papel de filtro qualitativo.

DILUIO E FILTRAO
Diluir 10ml do extrato com 40 ml de Tampo
PBS/0,1% Tween-20. Filtrar com filtro de microfibra.

CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE
Passar 10ml de filtrado pela coluna de afinidade.
Lavar a coluna com 10ml de Tampo
PBS/0,1% Tween-20. Lavar depois com 10 ml de
gua destilada.
Eluir as zearalenonas da coluna com 1ml de metanol
HPLC. Coletar o eluato na cubeta.

QUANTIFICAO
Injetar em HPLC
OU
Adicionar 1 ml de revelador ao eluato e agitar.
Colocar a cubeta em um fluormetro.
Verificar leitura digital aps 5 min.

AflaTest

Pgina

1.8 PROCEDIMENTO GERAL ZEARALATEST PARA HPLC

EXTRAO DA AMOSTRA
Misturar 20g de amostra moda com 2g de sal e
50 ml de acetonitrila:gua (90:10).
Misturar a alta velocidade por 2 minutos.
Filtrar em papel de filtro qualitativo.

DILUIO E FILTRAO
(0-50ppm) Diluir 1 ml do extrato com 49 ml de gua.
(0-5 ppm) Diluir 10 ml do extrato com 40 de gua.
Filtrar com filtro de microfibra.

CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE
Passar 10ml de filtrado pela coluna de afinidade.
Lavar a coluna com 10ml de gua.
Eluir as zearalenonas da coluna com 1,5ml de
Metanol HPLC.
Coletar o eluato na cubeta.

QUANTIFICAO
Adicionar 1,5 ml de gua deionizada ao eluato.
Agitar em vortex.
Injetar de 100 200 ul em HPLC.

AflaTest

Pgina

2.1

CALIBRAO DO FLUORMETRO SRIE 4

1.

Ligue o equipamento com auxlio do boto ON/OFF localizado na parte

traseira.

2.

Pressione a tecla SELECT TEST at aparecer Zearalatest no visor. Ento

pressione ENTER.

3.

O fluormetro ler:
START CALIBRATION . . . OPEN THE LID
INSERT RED VIAL

Levante a tampa e coloque a ampola vermelha do padro de calibrao. Certifique-se

que a ampola est totalmente encaixada e abaixe a tampa .
4.

O visor ler:
HIGH CAL

0,45 PPM

Se este o valor desejado para a ampola vermelha, pressione ENTER. De outra

forma, entre com o valor de calibrao desejado pressionando as teclas numricas,
segundo o procedimento especfico. Confirme o aparecimento do valor desejado no visor e
pressione ENTER.
5.

O visor ler:
READING HIGH CAL . . . SAVING HIGH INTENSITY

E ento:
OPEN THE LID
INSERT GREEN VIAL
Levante a tampa, retire a ampola vermelha e coloque a ampola verde, novamente
certificando-se que a ampola est totalmente encaixada e abaixe a tampa.
6.

O visor ler:
LOW CAL

- 0,05 PPM

Se este for o valor desejado da ampola verde para o mtodo utilizado pressione
ENTER. Se no, entre com o valor determinado para o mtodo especfico a ser utilizado.
Confirme o aparecimento do valor desejado no visor e pressione ENTER.
7.

O visor ler:
READING LOW CAL . . . SAVING LOW INTENSITY

E depois:
OPEN THE LID
Levante a tampa e retire a ampola verde.
8.

O visor ler:
VICAM V 1.1 READY

AflaTest

Pgina

O visor pode mostrar outro nmero para indicar qual verso do software est instalada.

9.

Pressione SELECT TEST o visor ler:

ZEARALATEST

Pressione ENTER

10.

O visor ler:
START RUN TEST . . . OPEN THE LID

11.
Coloque a ampola amarela do padro de calibrao para micotoxinas. A leitura
da ampola amarela encontra-se listada na seo de procedimentos.
12.
O fluormetro est agora pronto para realizar a leitura das amostras. O
fluormetro srie 4 precisa ser calibrado uma vez por semana.
Para recalibrar o fluormetro: pressione a tecla STOP. Pressione a tecla OPTIONS at
que aparea no visor:
CALIBRATE TEST
Ento pressione ENTER. O visor deve indicar:
ZEARALATEST
Caso contrrio, pressione SELECT TEST at que ZEARALATEST aparea no
visor e ento pressione ENTER.
Coloque as ampolas vermelha e verde do padro de calibrao para micotoxinas e
calibre o equipamento conforme descrito anteriormente.
Para correr um teste: pressione SELECT TEST at que aparea no visor.
ZEARALATEST (ou o teste desejado)
Pressione ENTER

Para cancelar qualquer procedimento: pressione STOP

Para maiores detalhes sobre o uso do fluormetro, favor consultar o Manual de Instrues
do Fluormetro.

AflaTest

Pgina

2.2

CALIBRAO DO MF-2000

TM

: Mini Fluormetro VICAM V1.0

A calibrao ser necessria apenas se a unidade for desligada ou aps 24 horas da

ltima calibrao.
1. Ligue o aparelho utilizando o boto ON/OFF localizado na parte e traseira.
2. As luzes verdes POWER e READY se acendero indicando que o instrumento est ligado e
pronto para prosseguir os testes. Deixe o instrumento aquecer por 15 minutos.
3. Pressione o boto RUN / STEP. A luz vermelha INSERT RED VIAL se acender.
4. Seja a aproxima etapa dentro de 15 segundos ou a luz READY se acender.
5. Abra a tampa e coloque a ampola vermelha. Certifique-se que a ampola est completamente
encaixada e feche a tampa.
6. Pressione o boto RUN / STEP. A calibrao estar completa quando a luz vermelha INSERT
GREEN VIAL se acender. Seja a prxima etapa dentro de 15 segundos ou a luz READY se
acender.
7. Abra a tampa e retire a ampola vermelha e coloque a verde. Certifique-se que a ampola est
completamente encaixada e feche a tampa.
8. Pressione o boto RUN / STEP. A calibrao estar completa quando a luz verde INSERT
SAMPLE acender.
9. Abra a tampa e remova a ampola verde a luz INSERT SAMPLE estar acesa.
10. Coloque a ampola amarela para checar a calibrao. Pressione RUN / STEP. As luzes BAR
GRAPH acendero. Verifique o resultado com a faixa aceitvel listada no procedimento
apropriado.
11. A luz READY acender.
12. Pressione o boto RUN / STEP. A luz INSERT SAMPLE acender.
13. Coloque a cubeta contendo o eluato da amostra e pressione RUN / STEP. As luzes BAR
GRAPH acendero, leia a concentrao de toxina utilizando a tarjeta apropriada.
14. Repita os passos 11 e 12 para ler mais amostras.
15. A luz vermelha OVER HIGH CAL ser acionada quando a concentrao de toxina for mais alta
que a concentrao da ampola vermelha.
16. A luz vermelha ERROR se acender quando ocorrer um erro de inicializao, quando a
concentrao da amostra estiver fora da faixa (muito alta ou muito baixa), quando o calibrador
alto tiver mais fluorescncia que o instrumento pode medir ou quando o calibrador baixo tiver
menos fluorescncia que o instrumento pode detectar.

AflaTest

Pgina

2.3

PASSOS
FILTRAO

PARA

PREPARO

DA

Filtro plissado

O primeiro passo para filtrao uma filtrao

simples atravs de um filtro de papel plissado
para separar o extrato de outras partculas
grosseiras da amostra slida. O filtrado
coletado em um recipiente limpo ou proveta.

Montagem do papel de filtro

1. Abrir completamente um filtro plissado e

coloc-lo em um recipiente limpo. (Opcional:
um funil pode ser usado para apoiar o filtro).
2. Dobrar as extremidades do filtro sobre a
borda do copo para mant-lo no lugar.
Manter as dobras plissadas do filtro para
maximizar a rea da superfcie. Isto
aumentar a superfcie de filtrao.
3. No necessrio esperar todo o extrato
passar atravs do filtro para continuar.

Filtro de Microfibra
O segundo passo da filtrao a filtrao por
Gravidade do extrato atravs de um filtro de
microfibra. Isto remove qualquer precipitado no
extrato e assegura que o extrato passar
facilmente pela coluna de afinidade. A filtrao
em microfibra realizada imediatamente antes
da cromatografia de afinidade.

1.

Coloque um pequeno funil no topo da

seringa ou num copo coletor limpo.

2.

Coloque suavemente um filtro de microfibra

no pequeno funil, pressionando o filtro para
dentro do funil com o dedo indicador. Tenha
cuidado para no rasgar ou perfurar o filtro.

AflaTest

Pgina

10

2.4

AJUSTE DO SUPORTE DA BOMBA

A cromatografia de afinidade Zearalatest

facilmente realizada com coluna de afinidade
Zearalatest fixada em um suporte para bomba
(item n. 21010). Este suporte tem uma seringa
de vidro de 10 mL que serve como um
reservatrio para a coluna. Uma grande seringa
de plstico com mbolo e engate fornece
presso de ar para empurrar manualmente o
lquido atravs da coluna. Uma bomba de
aqurio ajustvel (item n. 20650) pode ser fixada
ao tubo da bomba ao invs de uma bomba de
seringa, para operar sem usar presso manual.
Um suporte duplo (item n. 21030), suporte para
quatro posies com bomba de aqurio (item n.
21045), e suporte para doze posies (item n.
G1104) so teis para correr vrias amostras ao
mesmo tempo.

Seringa
de vidro

Cortar a
ponta da
tampa da
coluna

1. Remover a tampa grande do topo da coluna.

2. Fixar o engate plstico (item n. G1109)
coluna. Este engate pode ser reutilizado para
colunas adicionais.
3. Coloque um copo para coleta do resduo sob
a coluna. Mantenha a tampa superior da
coluna. Entornar o extrato no filtro de
microfibra (veja seo anterior) e coletar a
quantidade desejada de extrato em uma
seringa de vidro usando a marcao do
cilindro da seringa.
4. Aspire atravs do mbolo da seringa de
plstico.
5. Inserir engate do final do tubo da seringa.
Remover a tampa da coluna.
6. Aplicar presso ao mbolo da seringa de
plstico para empurrar o lquido atravs da
coluna. Manter o fluxo uma velocidade de
1-2 gotas por segundo. Empurrar todo lquido
atravs da coluna. Repetir para lavagem e
eluio.
Nota: Evite retirar o mbolo da seringa de
plstico, cujo engate est fixado a seringa de
vidro. Isto pode deslocar as partculas que
suportam a camada de anticorpos e afetar os
resultados do teste. As seringas devem ser
levantadas antes da eluio para acomodar as
cubetas.

AflaTest

Seringa
para
bombear

engate

Seringa
de vidro

extrato

Coluna
de
afinidade

Mangueira de
conexo
lixo

Suporte para bomba

Pgina 11

2.5 LIMPEZA DO EQUIPAMENTO

Antes de Iniciar o teste Zearalatest

Para eliminar fluorescncia de fundo assegure-se que o equipamento est limpo e no
contaminado com materiais que podem causar fluorescncia de fundo. Isto particularmente
importante quando se usa um novo equipamento ou equipamento que no tenha sido usado por
um longo perodo de tempo.
Antes de usar o equipamento, este deve ser lavado com uma soluo fraca de detergente e ento
enxaguado abundantemente com gua purificada. Isto inclui as seringas de vidro usadas para
reservatrio da amostra. As seringas so tratadas com um lubrificante para uso com o embolo. O
lubrificante necessita ser lavado com um detergente suave e o cilindro da seringa enxaguado
completamente com gua purificada antes do uso para Zearalatest , outras peas do
equipamento que necessitam ser lavadas com um detergente suave e enxaguadas com gua
purificada antes do uso so pipetas, funis e copo do lquido. Frascos dispensadores necessitam
somente ser enxaguados com metanol antes do uso.
Entre Anlises
Aps cada anlise, o suporte do copo necessita ser lavado com uma soluo fraca de detergente e
enxaguado completamente com gua purificada. O mesmo procedimento de limpeza deve ser
realizado para qualquer equipamento que ser reutilizado.
No lave os frascos dispensadores com sabo. Frascos dispensadores de metanol necessitam
somente ser reabastecidos novamente com metanol.
Entre as anlises, a seringa deve ser enxaguada com gua purificada. Isto ser suficiente para
prevenir contaminao cruzada de amostras. Aps um grande nmero de amostras ter sido
testado, a seringa de vidro deve ser lavada com uma escova e um detergente suave e ento
enxaguada com bastante gua.
No recomendado lavar e reutilizar as cubetas. Essas cubetas so projetadas para uso de uma
s vez e devem ser descartadas.
Outras Precaues Importantes

Use somente equipamento indicado pela Vicam.

Evite contato de quaisquer reagentes ou solues (tais como: metanol, gua, extrato, eluato da
coluna ou revelador) com borracha ou plstico flexvel suave. Esses materiais podem levar
contaminantes fluorescentes para a amostra e, desta forma, afetar os resultados.

Nota: Algumas tampas do copo de liqidificador so forradas com papelo parafinado. Estes
forros no so resistentes ao metanol e solues aquosas e se desarranjam quando usados para
extrao da amostra. O extrato ser ento contaminado com materiais, que podem causar
fluorescncia de fundo. Liqidificador com forro de papelo no deve ser usado.

AflaTest

Pgina 12

3.1

PREPARO DAS SOLUES DE EXTRAO

Os procedimentos Zearalatest utilizam soluo metanol/gua ou acetonitrila/gua para a
extrao da zearalenona da amostra.
Para preparar a soluo:
Use reagentes puros (ex.: metanol grau HPLC ou melhor) quando preparar as solues de extrao.
SOLVENTE
ACETONITRILA
METANOL

METANOL
(ML)
900
800

GUA PURIFICADA
(ML)
100
200

VOLUME TOTAL
(ML)
1000 (1 litro)
1000 (1 litro)

PRECAUO: O solvente de extrao inflamvel. Mantenha o frasco bem fechado quando no estiver em
uso. Prepare a soluo de extrao toda semana ou conforme a necessidade. As frmulas acima so para
preparo de 1 litro de soluo. O volume de soluo pode aumentar ou diminuir de acordo com a quantidade de
reagente necessria extrao.

3.2

Preparao das solues de diluio/lavagem:

Tampo de lavagem PBS / 0.1% Tween-20

1 mL Tween-20
1000 mL PBS
Uma soluo 10X concentrada tambm pode ser adquirida (Vicam, artigo #G1112). A
soluo 10X concentrada deve ser diludo para 1X com gua purificada conforme a necessidade
ex.: diluir 100 mL de 10X concentrado com 900 mL de gua pura.
PREPARO DA SOLUO REVELADORA ZEARALATEST

3.3

Para preparar a soluo reveladora Zearalatest diluda:

O revelador ZearalaTest utilizado para realar a fluorescncia da zearalenona e
aumentar a sensibilidade do ZearalaTest. Cada frasco contm 2,5 gramas de cloreto de alumnio
slido, suficiente para 50 anlises.
O cloreto de alumnio deve ser diludo com 50 ml de metanol grau HPLC. Agitar o frasco
at a completa dissoluo do sal. O frasco deve permanecer fechado para evitar a evaporao do
metanol. A validade do revelador de 1 ms aps diludo.
Nos procedimentos ZearalaTest, os nveis de zearalenona so detectados e quantificados
por fluorescncia.
Para utilizar o revelador:
Pipetar exatamente 1,0 mL da soluo reveladora diluda diretamente na cubeta contendo
o eluato da coluna de afinidade e agitar bem antes de realizar a leitura da soluo no fluormetro.
Quando utilizar o frasco dispensador, assegure-se que no h bolhas de ar na tubulao antes de
dispensar a soluo reveladora.

3.4

CHECAGEM DE REAGENTES
Nos procedimentos Zearalatest , os nveis de zearalenona so detectados e quantificados
por fluorimetria. Para determinao acurada da concentrao fundamental que a zearalenona na
cubeta esteja emitindo fluorescncia. Fluorescncia de fundo e/ou quimioluminiscncia causada por
reagentes ou pela cubeta sero erroneamente medidos como zearalenona pelo fluormetro.
uma boa prtica e fortemente recomendado checar os reagentes e as cubetas para

AflaTest

Pgina 13

certificar-se que no so fluorescentes e no iro contribuir para a medida de fluorescncia do

fluormetro. Este um processo fcil e deve ser realizado diariamente ou toda vez que novos
reagentes ou cubetas forem utilizados.

Para checar reagentes e cubetas:

1.

Calibrar o fluormetro.

2.

Pipetar 2 mL do metanol utilizado para a eluio da coluna na cubeta.

3.

Medir a fluorescncia de fundo no fluormetro. A leitura deve ser 0 ppb.

4.

Pipetar 2 mL da gua purificada utilizada para lavar a coluna na cubeta.

5.

Medir a fluorescncia de fundo no fluormetro. A leitura deve ser 0 ppb.

6.

Pipetar 2 mL do revelador diludo na cubeta.

7.

Medir a fluorescncia de fundo no fluormetro. A leitura deve ser 0 ppb.

8.

Pipetar 1 mL de metanol na cubeta e adicionar 1 mL do revelador diludo. Agitar bem.

9.

Medir a fluorescncia de fundo no fluormetro. A leitura deve ser 0 ppb.

***** IMPORTANTE *****

Solues que no apresentem 0 ppb de leitura devem ser testadas novamente em outra
cubeta. Se a soluo no ler 0, deve ser descartada e uma nova soluo preparada e testada.
Se todas as trs solues apresentarem leitura acima de 0, checar novamente a calibrao
do fluormetro. Se a calibrao estiver satisfatria, ento h grande possibilidade de que as cubetas
estejam defeituosas e um novo pacote de cubetas deve ser utilizado. Certifique-se de utilizar
cubetas fornecidas pela Vicam. Outras cubetas podem conter material fluorescente.

Sugesto de auxlio: antes de iniciar a anlise de amostras, uma boa checagem de

procedimentos, reagentes e equipamento realizar um teste sem nenhuma amostra. A leitura no
fluormetro de uma amostra em branco deve ser 0 ppb.

AflaTest

Pgina 14

4.0

PROCEDIMENTOS PARA FLUORMETRO

MATERIAIS E EQUIPAMENTOS REQUERIDOS PARA PROCEDIMENTO
FLUORIMTRICO

Equipamentos Requeridos

Descrio

Item nr.

*Proveta graduada, 50 ml
*Escala digital com adaptador AC
*Liqidificador com jarra em ao inox
*Proveta graduada, 250 ml
*Frasco dispensador de metanol
*Frasco de lavagem, 500 ml
*Estante para cubetas
*Suporte para bomba nica posio
*Padro de calibrao
*Funil para filtro, 65 mm (10)
*Fluormetro srie 4 ou
TM
MF 2000 Mini Fluormetro

20050
20100
20200
20250
20501
20700
21010
21020
33020
36020
G8000
G8200

Materiais Requeridos
Descrio

Item nr.

Colunas Zearalatest, para fluormetro e HPLC (25/cx) G1012

*Pipetas descartveis (50/pct)
20652
*Papel de filtro canelado VICAM (100)
31240
*Filtro de microfibra, 1.0 um, 9 cm (100)
G2005
*Leno de papel
31967
Tampo PBS/0.1% Tween-20 10X (150 mL)
G1112
Revelador ZearalaTest
32011
*Cubetas descartveis (250/pct)
34000
Metanol, grau HPLC
*Copos plsticos descartveis
36010
Funil para filtro, 65 mm (10/pct)
36022
gua destilada, deionizada ou osmose reversa
Cloreto de sdio no-iodizado (sal, NaCl)

AflaTest

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4.1

PROCEDIMENTO ZEARALATEST PARA MILHO

1.0

Calibrao: utilize padro de calibrao de micotoxinas (cd. 33020)

VERDE
-0,05

2.0

2.3
2.4

3.2
3.3
3.4

5.2
5.3
5.4
5.5

AflaTest

Pipetar ou entornar 10 mL do extrato filtrado em uma proveta limpa.

Diluir o extrato com 40 mL de tampo PBS / 0,1% Tween 20. Misturar bem.
Filtrar o extrato diludo atravs de filtro de microfibra de 1,0 m (artigo # G2005)
na seringa de vidro para medir 10 mL. Use um filtro de microfibra para cada
anlise.

Cromatografia de Afinidade (coluna)

5.1

6.0

Pesar 20 g de amostra com 2 g de sal (NaCI) e colocar em um copo de

liqidificador.
Adicionar ao copo 50 ml de metanol: gua (80:20 v/v) ou acetonitrila:gua
(90:10v/v).
Tampar o copo do liqidificador e bater em alta velocidade por 2 minutos.
Remover a tampa do jarro e passar o extrato em um filtro de papel plissado.
Coletar o extrato em um recipiente limpo.

Diluio do Extrato
4.1
4.2
4.3

5.0

Calibre o fluormetro.
Prepare a soluo metanol:gua (80:20 v/v) toda semana ou conforme a
necessidade.
Prepare o tampo PBS1X / 0.1% Tween 20 todo ms ou conforme a necessidade.
Certifique-se que os reagentes em branco (1ml metanol HPLC + 1ml mistura de
revelador na cubeta) tem 0 ppm de leitura no fluormetro calibrado.

Extrao da Amostra
3.1

4.0

AMARELO
0,2 0,03

Preparo
2.1
2.2

3.0

VERMELHO
0,45

Passar 10 mL do extrato filtrado completamente atravs de uma coluna de

afinidade Zearalatest a um fluxo de cerca de 1-2 gotas/segundo at que o ar
passe pela coluna.
Passar 10 mL de tampo PBS com 0,1% Tween 20 atravs da coluna a um fluxo
de cerca de 2 gotas/segundo.
Lavar a coluna passando 10 mL de gua destilada ou deionizada razo de cerca
de 2 gotas/segundo at que o ar passe pela coluna.
Eluir a coluna de afinidade pela passagem de 1,0 mL de metanol grau HPLC
atravs da coluna a um fluxo de cerca de 1 gota/segundo e coletar toda a amostra
eluda (1 mL) em uma cubeta de vidro.
Adicionar 1.0 mL do revelador ao eluato na cubeta. Agitar bem e colocar a cubeta
num fluormetro calibrado. Ler a concentrao de zearalenona aps 300
segundos.

Limite de Deteco:

0,10 ppm.

Pgina 16

4.2

PROCEDIMENTO ZEARALATEST PARA RAES

1.0

Calibrao: utilize padro de calibrao de micotoxinas (cd. 33020)

VERDE
-0,05

2.0

2.3
2.4
2.5

3.2
3.3
3.4

5.4
5.5
5.4
5.5

AflaTest

Pipetar ou entornar 10 mL do extrato filtrado em uma proveta limpa.

Diluir o extrato com 40 mL de tampo PBS / 0,1% Tween 20. Misturar bem.
Filtrar o extrato diludo atravs de filtro de microfibra de 1,0 m (artigo # G2005)
na seringa de vidro para medir 10 mL. Use um filtro de microfibra para cada
anlise.

Cromatografia de Afinidade (coluna)

5.1

6.0

Pesar 20 g de amostra com 2 g de sal (NaCI) e colocar em um copo de

liqidificador.
Adicionar ao copo 50 ml de metanol: gua (80:20 v/v) ou acetonitrila:gua (90:10).
Tampar o copo do liqidificador e bater em alta velocidade por 2 minutos.
Remover a tampa do jarro e passar o extrato em um filtro de papel plissado.
Coletar o extrato em um recipiente limpo.

Diluio do Extrato
4.1
4.2
4.3

5.0

Calibre o fluormetro.
Prepare a soluo metanol:gua (80:20 v/v) toda semana ou conforme a
necessidade.
Prepare o tampo PBS1X / 0.1% Tween 20 todo ms ou conforme a necessidade.
Certifique-se que os reagentes em branco (1ml metanol HPLC + 1ml mistura de
revelador na cubeta) tem 0 ppm de leitura no fluormetro calibrado.
Certifique-se que 2 ml de gua numa cubeta tem 0 ppm de leitura no fluormetro
calibrado.

Extrao da Amostra
3.1

4.0

AMARELO
0,2 0,03

Preparo
2.1
2.2

3.0

VERMELHO
0,45

Passar 10 mL do extrato filtrado completamente atravs de uma coluna de

afinidade ZearalaTest a um fluxo de cerca de 1-2 gotas/segundo at que o ar
passe pela coluna.
Passar 10 mL de tampo PBS com 0,1% Tween 20 atravs da coluna a um fluxo
de cerca de 1 - 2 gotas/segundo.
Lavar a coluna passando 10 mL de gua destilada ou deionizada razo de cerca
de 2 gotas/segundo at que o ar passe pela coluna.
Eluir a coluna de afinidade pela passagem de 1,0 mL de metanol grau HPLC
atravs da coluna a um fluxo de cerca de 1 gota/segundo e coletar toda a amostra
eluda (1 mL) em uma cubeta de vidro.
Adicionar 1.0 mL do revelador ao eluato na cubeta. Agitar bem e colocar a cubeta
num fluormetro calibrado. Ler a concentrao de zearalenona aps 300
segundos.

Limite de Deteco:

0,10 ppm.

Pgina 17

4.3

PROCEDIMENTO ZEARALATEST PARA SORGO

1.0

Calibrao: utilize padro de calibrao de micotoxinas (cd. 33020)

VERDE
-0,05

2.0

2.3
2.4
2.5

3.2
3.3
3.4

5.6
5.7
5.4
5.5

AflaTest

Pipetar ou entornar 10 mL do extrato filtrado em uma proveta limpa.

Diluir o extrato com 40 mL de tampo PBS / 0,1% Tween 20. Misturar bem.
Filtrar o extrato diludo atravs de filtro de microfibra de 1,0 m (artigo # G2005)
na seringa de vidro para medir 10 mL. Use um filtro de microfibra para cada
anlise.

Cromatografia de Afinidade (coluna)

5.1

6.0

Pesar 20 g de amostra com 2 g de sal (NaCI) e colocar em um copo de

liqidificador.
Adicionar ao copo 50 ml de metanol: gua (80:20 v/v).
Tampar o copo do liqidificador e bater em alta velocidade por 2 minutos.
Remover a tampa do jarro e passar o extrato em um filtro de papel plissado.
Coletar o extrato em um recipiente limpo.

Diluio do Extrato
4.1
4.2
4.3

5.0

Calibre o fluormetro.
Prepare a soluo metanol:gua (80:20 v/v) toda semana ou conforme a
necessidade.
Prepare o tampo PBS1X / 0.1% Tween 20 todo ms ou conforme a necessidade.
Certifique-se que os reagentes em branco (1ml metanol HPLC + 1ml mistura de
revelador na cubeta) tem 0 ppm de leitura no fluormetro calibrado.
Certifique-se que 2 ml de gua numa cubeta tem 0 ppm de leitura no fluormetro
calibrado.

Extrao da Amostra
3.1

4.0

AMARELO
0,2 0,03

Preparo
2.1
2.2

3.0

VERMELHO
0,45

Passar 10 mL do extrato filtrado completamente atravs de uma coluna de

afinidade ZearalaTest a um fluxo de cerca de 1-2 gotas/segundo at que o ar
passe pela coluna.
Passar 10 mL de tampo PBS com 0,1% Tween 20 atravs da coluna a um fluxo
de cerca de 1 - 2 gotas/segundo.
Lavar a coluna passando 10 mL de gua destilada ou deionizada razo de cerca
de 2 gotas/segundo at que o ar passe pela coluna.
Eluir a coluna de afinidade pela passagem de 1,0 mL de metanol grau HPLC
atravs da coluna a um fluxo de cerca de 1 gota/segundo e coletar toda a amostra
eluda (1 mL) em uma cubeta de vidro.
Adicionar 1.0 mL do revelador ao eluato na cubeta. Agitar bem e colocar a cubeta
num fluormetro calibrado. Ler a concentrao de zearalenona aps 300
segundos.

Limite de Deteco:

0,10 ppm.

Pgina 18

5.1

MATERIAIS E EQUIPAMENTOS REQUERIDOS PARA PROCEDIMENTO HPLC

Equipamentos Requeridos

Descrio

Item nr.

Proveta graduada, 50 ml
Escala digital com adaptador AC
Liqidificador com jarra em ao inox
Proveta graduada, 250 ml
Frasco dispensador de metanol
Frasco de lavagem, 500 ml
Estante para cubetas
Suporte para bomba nica posio
Funil para filtro, 65 mm (10)
Vortex mixer
Frasco dispensador de metanol 500 ml (0-3 ml)

20050
20100
20200
20250
20501
20700
21010
21020
36020
23040
20501

Materiais Requeridos
Descrio

Item nr.

Colunas ZearalaTest, para fluormetro e HPLC (25/cx) G1012

Papel de filtro canelado VICAM (100)
31240
Filtro de microfibra, 1.0 um, 9 cm (100)
31955
Tampo de lavagem para micotoxinas 5X (200 mL)
32014
Revelador ZearalaTest
32011
Cubetas descartveis (250/pct)
34000
Metanol, grau HPLC
Copos plsticos descartveis
36010
PBS 10Xconc. (150 mL)
G1113
gua destilada, deionizada ou osmose reversa
Cloreto de sdio no-iodizado (sal, NaCl)

AflaTest

Pgina 19

5.2

PROCEDIMENTO ZEARALATEST HPLC PARA MILHO, SORGO E RAES

1.0

Configurao do HPLC:
1.1
1.2
1.3
1.4

2.0

Extrao da Amostra
2.1
2.2
2.3
2.4

3.0

Pesar 20 g de amostra com 2 g de sal e colocar em um copo de liqidificador.

Adicionar ao copo 50 ml de acetonitrila: gua (90:10 v/v).
Tampar o copo do liqidificador e bater em alta velocidade por 2 minutos.
Remover a tampa do jarro e passar o extrato em um filtro de papel plissado.
Coletar o extrato em um recipiente limpo.

Diluio do Extrato
3.1
3.2
3.3

4.0

Coluna C18 , coluna de ao inoxidvel 3.9 mm X 150 mm, 4 m

Fase mvel: acetonitrila:gua:metanol (46:46:8)
Fluxo: 1,0 mL/min.
Detector de fluorescncia: detector de Fluorescncia Kratos Spectroflow 980,
excitao 274 nm, emisso 440 nm.

Pipetar ou entornar 1 mL do extrato filtrado em uma proveta limpa.

Diluir o extrato com 49 mL de gua destilada por osmose reversa. Misturar bem.
Filtrar o extrato diludo atravs de filtro de microfibra (Vicam, artigo # 31955) na
seringa de vidro para medir 10 mL.

Cromatografia de Afinidade (coluna)

4.1

4.2
4.3
4.4
4.5

Passar 10 mL do extrato filtrado (10 mL = 0,08g da amostra) completamente

atravs de uma coluna de afinidade ZearalaTest a um fluxo de cerca de 1-2
gotas/segundo at que o ar passe pela coluna.
Passar 10 mL de gua destilada por osmose reversa atravs da coluna a um fluxo
de 1-2 gotas/segundo at a passagem de ar.
Eluir a coluna de afinidade pela passagem de 1.5 mL de metanol grau HPLC
atravs da coluna a um fluxo de 1 gota/segundo ou menos e coletar toda a
amostra eluda (1,5 mL) em uma cubeta de vidro. Fluxo por gravidade aceitvel.
Adicionar 1,5 ml de gua destilada ao eluato. Agitar em Vortex.
Injetar de 100 200 ul em HPLC.

5.0

Limite de Deteco:

6.0

Recuperao: a porcentagem de recuperao

aproximadamente 90% na faixa de 0 50 ppm.

AflaTest

0,10 ppm.

utilizando

este

mtodo

Pgina 20

de

6.1
1.
2.
3.

6.2

PRECAUES GERAIS PARA O PROCEDIMENTO HPLC

No faa a eluio da coluna com acetonitrila.
Eluir a coluna vagarosamente (~ 1 gota/segundo) com 1,5 mL de metanol HPLC. Fluxo por gravidade
aceitvel.
O revelador Zearalatest reagiro com qualquer protena. Mantenha as solues de reveladores,
eluato da coluna e ponteiras utilizadas para pipetar solues livre de protenas (i.e.: impresses digitais).

PRECAUES GERAIS PARA PROCEDIMENTO FLUORMETRICO

Sempre utilize equipamentos e reagentes bons e limpos (metanol grau HPLC para eluio e gua destilada,
deionizada ou osmose reversa). Cheque os reagentes para fluorescncia de fundo, conforme descrito na
seo 3.3 Checagem de reagentes. Cubetas no fornecidas pela Vicam podem apresentar fluorescncia
de fundo e por isso no devem ser utilizadas com os testes Vicam.
Certifique-se que o dispensador de metanol est abastecido e livre de bolhas de ar antes de dispensar o
metanol.
Realize a anlise do incio ao fim sem interrupes.
Use cubetas limpas e evite contaminao da soluo eluida na cubeta. Verifique se h contaminantes dentro
da cubeta (turbidez, partculas ou bolhas de ar) ou sujeira ou digitais no lado de fora. Limpe a cubeta por fora
com um leno de papel suave e assegure-se que no h partculas no extrato antes de realizar a leitura no
fluormetro.
Passe o extrato pela coluna imediatamente aps a filtrao em microfibra. normal que a amostra s vezes
apresente turbidez aps filtrao em microfibra.
Use apenas os equipamentos especificados pela Vicam. Evite contato de quaisquer reagentes ou solues
(tais como: metanol, extrato, eluato da coluna, revelador) com borracha ou plsticos flexveis. Estes
materiais podem contaminar a amostra com partculas fluorescentes.
Certifique-se de utilizar filtro de microfibra 1.0 m (Vicam, artigo # G2005). Use um novo filtro para cada
anlise.
Proteja os padres de calibrao da luz e esteja atento para o prazo de validade.
No exceda o fluxo de gotejamento recomendado no procedimento.

AflaTest

Pgina 21

6.2

SOLUES DE PROBLEMAS NO PROCEDIMENTO FLUORIMTRICO

1. Problema: falsa leitura alta
Soluo:
Checar reagentes. Certifique-se que a gua e a soluo de eluio tm leitura 0.
No agite a cubeta colocando nela uma tampa e agitando. Mantenha os dedos afastados do fundo
da cubeta quando estiver agitando-a.
Lave as seringas de vidro novas com gua e sabo neutro. Depois, enxge com gua purificada e
metanol antes de utilizar para remover o lubrificante do mbolo.

2. Problema: falsa leitura baixa

Soluo:
Certifique-se que a metodologia foi seguida corretamente.
Mantenha o fluxo de passagem na coluna recomendado para passagem da amostra, lavagem e
eluio.
Certifique-se que a soluo de extrao foi feita corretamente e tem menos de uma semana de
preparo.

3. Problema: resultados inconsistentes

Soluo:
Compare leituras de uma mesma corrida na coluna com o mesmo filtrado ao mesmo tempo.
Certifique-se que as amostras foram bem trituradas. Amostras diferentes podem dar variaes de
resultado devido a variaes no contedo de zearalenonas. Mesmo pores diferentes de uma
mesma amostra podem variar no contedo de zearalenonas.
Proteja o padro de calibrao da luz e reponha anualmente.
Calibre o fluormetro corretamente para o procedimento adotado.
Siga as instrues cuidadosamente. Analise uma amostra do incio ao fim sem parar.
Corra uma amostra conhecida diariamente para servir com um controle dirio de preciso. Agite
bem o filtrado antes da diluio.
Certifique-se que o dispensador de metanol est cheio e livre de bolhas de ar antes de us-lo.
Colete todo o eluato da amostra na cubeta.
Utilize o tempo de leitura de 300 segundos (delay time).

Solues de problemas no fluormetro Vicam Srie-4

1. Problema: display / visor

Soluo: limpe a memria e configure o visor como segue:
No VICAM READY digite a seqncia: 8, 3, 1, 1, 5. O visor mostrar: CLEAR MEMORY?,
pressione ENTER. O visor mostrar CONFIRM CLEAR?, pressione 1. A memria estar limpa. A
seguir, no VICAM READY , pressione estes nmeros um de cada vez: 7, 5, 7, 6, 1, 2. Voc no
ver nenhuma mudana no visor VICAM READY. Para equipamentos com nmero de srie maior
que 177, pressione o nmero 2. Para equipamentos com nmero de srie inferior a 177, pressione
1. Este procedimento configurar o visor para uma reviso. Depois disso, teste o equipamento

AflaTest

Pgina 22

operando-o normalmente.

2. Problema: resultados variam de 0 a 270 ppb na ampola de calibrao

Soluo: Certifique-se de empurrar as ampolas de calibrao e as cubetas totalmente no encaixe
do fluormetro, de forma que o fundo do frasco toque o fundo da cela de amostra.

7.0

ASSISTENCIA TCNICA NO BRASIL

Para assistncia tcnica favor contatar:

SOLCAMPO
PABX: (19) 3933-3141
e-mail: solcampo@solcampo.com.br

8.0

RESPONSABILIDADES

Os mtodos analticos descritos acima foram desenvolvidos pela Vicam para serem usados exclusivamente com os
reagentes deste teste. O usurio assume todos os riscos do uso dos procedimentos analticos e produtos Ochratest . A
Vicam no fornece garantia de nenhum tipo, expressa ou implcita, alm daquela dos produtos Ochratest conforme
especificaes impressas e padres de controle de qualidade Vicam. A Vicam optar por consertar ou substituir algum
produto ou item, que comprove estar com defeito na manufatura ou material. A Vicam a empresa exclusiva para reparar
ou substituir tais produtos e est no lugar de todas as garantias escritas, expressas oralmente, ou implcitas, incluindo
alguma garantia implcita de comercializao ou aptido para um propsito particular. A Vicam no tem responsabilidade
por lucros antecipados ou perdidos, inconvenincia ou dano direto, acidental, conseqente ou, por outro lado, por pessoa
ou propriedade, ou por responsabilidade estrita ou negligncia originria ou em conexo com o uso destes procedimentos
de anlise ou produtos Ochratest.
O FLUORMETRO VICAM FOI DESENVOLVIDO E MANUFATURADO CONFORME AS ESPECIFICAES DA VICAM E
APROPRIADO PARA UTILIZAO EM CONEXO OU CONJUGAO COM PRODUTOS, PROCEDIMENTOS E
MTODOS VICAM APROPRIADOS, ASSEGURANDO UMA APLICAO CONSISTENTE E ALTAMENTE FIEL DA
TECNOLOGIA ESPECIALIZADA PRPRIA DA VICAM. PORTANTO, QUALQUER UTILIZAO DESTE FLUORMETRO
COM OU EM CONJUGAO COM QUALQUER PRODUTO QUE NO SEJA DA VICAM, COMPROMETE A
INTEGRIDADE DA APLICAO/PROCEDIMENTO E PODE RESULTAR EM DANOS FSICOS AO PRODUTO, CUJO
DANO CAUSADO, INCLUINDO QUALQUER REPARO DA GARANTIA OU REPOSIO, NO SER DE
RESPONSABILIDADE DA VICAM. QUALQUER USO DO FLUORMETRO VICAM COM OU EM CONJUGAO COM
PRODUTOS QUE NO SEJAM VICAM, APESAR DE PREJUZO CAUSADO AO EQUIPAMENTO, PODE DISPENSAR A
VICAM DE REALIZAR REPAROS OU REPOSIO DO PRODUTO DURANTE OU APS O PERODO DE GARANTIA.
As informaes e protocolos precedentes, bem como outros produtos desenvolvidos pela Vicam so periodicamente
atualizados e revisados com o intuito de aumentar a confiana, otimizar o uso e melhorar a satisfao do consumidor.
Quando uma verso melhorada, nova ou substituta de um protocolo ou produto est disponvel, a Vicam no se
responsabiliza por qualquer informao ou produto anterior, mesmo que o uso do produto ou protocolo anterior esteja
dentro da validade. Para manter-se informado sobre qualquer protocolo novo, contate a Vicam por e-mail, fax ou telefone,
ou direto com seu representante local.
A Vicam no deve ser responsabilizada por qualquer resultado ou desempenho insatisfatrio ou incorreto, envolvendo
protocolos ou produtos Vicam se o teste ou a amostragem em questo no for conduzida corretamente. O consumidor
unicamente e totalmente responsvel por orientar o pessoal tcnico envolvido nos testes e amostragem de material de
anlise, quando da utilizao de produtos e protocolos Vicam.
Todos os produtos Vicam so protegidos por patente internacional e marca registrada.

AflaTest

Pgina 23

9.0

INFORMAO ADICIONAL
O presente manual de instrues foi traduzido e editado em portugus pela Solcampo.,
visando facilitar ainda mais a compreenso das metodologias indicadas e a aplicabilidade
do produto.
Todas as informaes constantes deste manual so cpia fiel das informaes
originais constantes do mais recente Zearalatest Instruction Manual e so de total
responsabilidade da Vicam L. P.

AflaTest

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