Lucrare practic numrul 13

Tipuri celulare ntlnite n organismul uman.

Proliferare i difereniere celular, culturile celulare

Toate

esuturile sunt constituite din celule si substan intercelular.

Substana intercelular poate fi reprezentat ntr-o cantitate ce difer n funcie de

esut: foarte redus cum ntlnim n esutul epitelial sau abundent n esutul
conjunctiv. La esutul conjunctiv n aceast substan se gsesc i elemente
fibrilare. Att substana intercelular ct i fibrele sunt produse de elaborare ale
celulelor tisulare locale. Astfel devine clar c elementul constitutiv de baz al
fiecrui esut este celula, care reprezint unitatea morfologic i funcional a
oricrui esut.

Dimensiunile celulei sunt particulare fiecrei localizari tisulare n diferite

organe:
-4-5 microni (celulele granulare din cerebel),
-7-8 microni (limfocite, eritrocite),
-30-40 microni (neuronii din coarnele anterioare ale mduvei spinrii),
-180-200 microni (ovulul).

Forma celulelor
Este dependent de funcia lor i de modul de agregare, din care cauz celulele
n preparatele histologice se prezint sub forme variate:

-celula sferic: ( ovocit, leucocit, adipocit, condrocit,

etc),
Figura 1. Celula sferic. Adipocitul (celula gras). Are un contur sferoidal, coninnd un
nucleu turtit i situat spre periferie, sub plasmalem i puin citoplasm.

-celula

poliedric

(celulele

spinoase

din

epiteliul

malpighian epiderm, epiteliul bucal),

Figura 2. Celule poliedrice. Celulele stratului spinos epidermic sunt

prevzute cu multe laturi, au nucleul sferic i situat central, 1, iar ntre ele las
spaii intercelulare. Celulele nu sunt lipite una de alta i se leag ntre ele prin
spini intercelulari, 2, (desmozomi).

-celula turtit, pavimentoas (celulele endoteliale, celulele mezoteliale),

Figura 3. Celula turtit (pavimentoas) cu citoplasm puin i ntins iar nucleul discoidal
proemin n zona central. Limitele celulare se evideniaz prin impregnare argentic , se coloreaz n
negru.

-celula stelat (neuronul celulele nervoase),

Figura 4. Celul stelat (neuron). Corpul celulei prezint prelungiri periferice care sunt
mai intens impregnate la origine dnd celulei aspect stelet. Nucleul este rotund, slab colorat, cu
nucleol situat central.

-celula fuziform (fibra musculara neted miocitul),

Figura 5. Celul fuziform. Celula muscular neted. Celula are

form alungit, (de aici i numele de fibra) i ascuit la cele dou capete,
(form de fus). Nucleul alungit este situat central.

-celula flagelat (spermatozoidul),

Figura 6. Celul flagelat. Spermatozoidul. Se remarc la o extremitate a

celulei capul spermatozoidului ovalar, intens colorat (conine nucleul) i o prelungire
subire i uor flexuoas-coada (flagelul) spermatozoidului.

-celula

piriform

(celula

Purkinje,din

scoara

cerebeloas)

Figura 7. Celul piriform

-celula cubic ( celulele epiteliului tiroidian, celulele plexurilor coroide, celulele

din epiteliul canaliculului biliar din spaiul Kiernan),

Figura 8. Celule cubice. Celula are form cubica, nucleu sferic situat central.

-celula cilindric (celula epiteliului mucoasei gastrice, celula epiteliului

mucoasei intestinale, celula epiteliului mucoasei uterine),

Figura 9. Celule cilindrice, nalte, ce prezint doi poli (pol bazal i pol apical). La polul
apical apar fine striaii, platoul striat. Nucleul este ovalar situat n treimea inferioar.

-celula caliciform (celula mucoas din epiteliul mucoasei intestinale i din

epiteliul mucoasei respiratorii),

Figura 10. Celul caliciform ( are forma unui caliciu de floare sau a unei cupe de ampanie)

-celula piramidal (neuronii piramidali din scoara cerebral, celula secretorie

din acinii serosi),

Figura 11. Celul piramidal

-celula cu prelungiri mult ramificate dndu-i un aspect neregulat (Ex: celula

pigmentar, melanocitul). Pigmentul secretat de melanocit este melanina, ce confer
citoplasmei aspectul brun nchis.

Figura 12. Celul pigmentar ce prezint prelungiri mult ramificate dndu-i celulei un
aspect ce nu-i permite ncadrarea n nici o form bine precizat, din care cauz i se spune c este
form neregulat. Este colorat prin pigmentul su.

de

-celula discoidal (hematia), sau echivalente celulare

Fig. 13 Hematie. Este anucleat, vzut din fa este rotund i mai slab colorat la mijloc,
vzut din lateral apare ca un disc biconcav.

Plasmodiul este o formaiune citoplasmatic multinucleat rezultat dintr-o

singur celul prin creterea citoplasmei i nmulirea
nucleilor. Ex: Fibra muscular striat.

Figura 14. Fibr muscular striat. Se remarc forma de panglic a fibrei

musculare striate n a crei citoplasm bogat i eozinofil se gsesc numeroi nuclei
ovalari, dispui n periferie. Sub sarcolem, aspectul striat al citoplasmei, este dat de
structura specific a miofibrilelor fibrei musculare.

Sinciiul este o formaiune citoplasmatic multinucleat rezultat prin

contopirea mai multor celule. Ex. Osteoclastul, sinciiul trofoblastic, etc.

Figura 15. Osteoclast. Apare ca o celul voluminoas cu citoplasma bogat,

cu contur neregulat coninnd muli nuclei sferoidali.

Metode de studiu ale biologiei celulare

Culturile de celule

Dezvoltarea organismului uman este rezultatul unor procese de diviziune,

cretere, nmulire i difereniere celular care duce la dobndirea unor funcii i
structuri morfologice specifice tipurilor de celule.

Mecanismele creterii i

proliferrii celulelor au fost urmrite experimental prin cultivarea de celule in

vitro .
Definiie: termenul general de "culturi de celule" desemneaz totalitatea
tehnicilor prin care un organ, un esut sau celule dispersate (natural sau prin
tehnici de laborator) sunt meninute n via sau multiplicate n afara organismului
("in vitro").
Prin culturile de celule, se poate studia comportamentul celulelor n condiii
strict definite:
-se adaug sau se extrag molecule specifice (de exemplu factori de cretere) i
se determin efectele asupra comportamentului celular;
-se obin populaii omogene de celule pentru analize biochimice; pe culturi
mixte, se studiaz interaciunile ntre tipurile celulare.
Pe lng scopurile de cercetare, culturile de celule sunt folosite i pentru
producerea vaccinurilor virale.

A.

Clasificarea culturilor de celule :

Dup felul substratului, pot fi:

- pe suport organic nutritiv;
- pe suport organic nenutritiv;
- pe suport anorganic;
- n suspensie n mediu lichid.

Dup tipul de material biologic cultivat se disting dou mari categorii de

culturi:
1. Culturi de organe (organocultur) - reprezint ntreinerea, de obicei fr
multiplicare, n medii nutritive adecvate a unor fragmente de organ (intestin, trahee,
rinichi).
n general, cultura de organe "in vitro" este dificil i necesit medii nutritive
complexe i condiii tehnice speciale.
2. Culturi de celule - reprezint multiplicarea "in vitro" a celulelor din:
-fragmente de esut (explante); in jurul explantului se formeaz o coroan de
celule care se multiplic;
-suspensii de celule naturale sau obinute prin dispersarea n laborator.

n prezent, se pot obine culturi celulare n linie continu, meninute de-a

lungul a 15-20 de pasaje fr a se transforma sau degenera, precum i linii celulare
stabilizate, care i menin nealterai parametrii morfologici i fiziologiei iniiali dup
multiple diviziuni.
Clonarea reprezint separarea unei singure celule i multiplicare a ei separat
rezultnd o linie celular uniform din punct de vedere genetic.
n organism, celulele se gsesc sub influena mecanismelor de conservare i
control. Odat scoas din mediul natural de via, celula are nevoie, pentru a
supravieui i a se multiplica "in vitro", de o serie de condiii de ordin fizic, chimic,
bioenergetic care s mimeze ct mai mult situaia "in vivo".

Reuita culturilor de celule "in vitro", depinde n mare msur de:

-folosirea instrumentarului steril;
-aplicarea unor tehnici aseptice;

-utilizarea unor medii de cultur care s asigure celulelor cultivate "in vitro"
condiii apropiate de acelea pe care le ofer organismul viu.

Deosebirile eseniale dintre aceste dou modaliti de via i de multiplicare

celular sunt:
- "in vivo", celulele sunt supuse controlului neuroendocrin i influenei
esuturilor din vecintate; aportul de substane nutritive i eliminarea produselor
de metabolism se face continuu prin snge i limf;
- "in vitro", celulele nu sunt supuse acestui control; aportul i eliminarea sunt
periodice.

B. Mediile de cultur
Se pot clasifica dup mai multe criterii:
dup consisten - sunt medii lichide i semilichide;
dup compoziie - exist medii naturale, semisintetice i sintetice;
dup valoarea nutritiv i scopul urmrit - se cunosc medii de cretere, care
asigur proliferarea celulelor din cultur, medii de meninere utilizate pentru
ntreinerea culturilor ajunse la dezvoltare maxim i care pstreaz toate
activitile celulare i medii defective, testarea celulelor n condiii speciale de
cretere.
Mediile de cultur celular trebuie s asigure:
-echilibrul ionic obinut cu soluii izotone (pentru pstrarea continu a
presiunii osmotice); pH-ul optim (pH 7.2 - 7.4) meninut cu substane tampon
(tampon fosfat sau bicarbonat de sodiu CO 2); n mediu exist i un indicator de
pH;
-temperatura optim, coninutul de 02 i de CO2 favorabil;

-elemente nutritive, indispensabile metabolismului: hidrai de carbon (glucoz),

proteine animale (din lichide biologice - plasm, ser, lichid amniotic) i aminoacizi
eseniali, grsimi, vitamine, hormoni, substane stimulatoare ale creterii;
-evitarea contaminrii cu germeni patogeni prin adugarea de antibiotice
(penicilin, streptomicin) i antifungice (stamicin, micostatin);
-stimularea multiplicrii i creterii celulelor prin adugarea de extracte
embrionare.
Mediile nutritive conin:
-o soluie salin (soluie tampon i indicator);
-elemente proteice (ser sau plasm sau lichid amniotic, aminoacizi);
-elemente stimulatoare ale creterii (extracte tisulare de origine embrionar sau
adult);
-vitamine;
-antibiotice.
C. Tehnica culturii celulare
Se desfoar n mai multe etape, n toate etapele se respect riguros regulile
de asepsie.
a. Reeditarea - se face din cele mai varitate esuturi provenite de la om, animal
sau plante. Dup proveniena lor esuturile ce urmeaz a fi cultivate se mpart n:
- esuturi normale: - embrionare (se cultiv uor, cretere rapid);
- adulte (medii complexe, cretere lent, precedate de un
timp de laten de cteva zile);
-esuturi tumorale.
b. Dispersarea mecanic (mrunirea embrionului) se realizeaz ntr-un
mediu steril, cu ajutorul unui foarfece special. Dac nu se obin rezultate
satisfctoare, fragmentele rezultate sunt supuse dispersrii chimice cu tripsin la
37C, pe suprafaa unui agitator magnetic.

Aciunea tripsinei se oprete prin rcirea soluiei i apoi celulele se separ de

soluia de tripsin prin centrifugare i se nltur supenatantul reprezentat de
tripsin.
Se resuspend sedimentul celular ntr-un mediu nutritiv, apoi se prepar o
diluie 1:10 a suspensiei celulare n mediu nutritiv pentru efectuarea numrrii.
c. Numrarea cu camera de numrare (hemocitometru).
Din diluia preparat (9 ml de mediu nutritiv, 1 ml din suspensia de celule) se
pune o pictur pe suprafaa unei camere de numrare, pentru a stabili densitatea
celulelor din suspensie.
Dup determinarea densitii suspensiei celulare, se adaug un anumit volum
de mediu nutritiv astfel nct sa se ajung la numrul optim de celule pe mililitru,
i anume 106 celule /ml.
d. Determinarea viabilitii celulelor din suspensie cu ajutorul soluiei de
albastru de triptan 0.5%;
-se adaug 0.1 mI soluie n 0.9 ml de suspensie celular.
-o pictur din acest amestec se examineaz la micro scopul fotonic
- celulele vii rmn necolorate, cele moarte aprnd albastru-violet.
Mortalitatea nu trebuie s depeasc 10%.
e. O cantitate din suspensia de celule pentru care s-a determinat
viabilitatea i densitatea optim se repartizeaz pe suprafaa recipientului de
cultur, ct mai uniform, cu ajutorul unei pipete Pasteur; se ine la termostat la
37C, timp de 30 - 60 min. apoi se introduce mediul de cultur, astfel ca el s nu
antreneze fragmentele fixate pe pereii recipientului. Vasul se nchide i se
incubeaz la 37C, fr a se agita timp de 3-4 zile.
Metoda este analog i n cazul utilizrii esturilor solide umane, embrionare
sau adulte.

f. Controlul culturilor
Controlul mediului de cultur se efectueaz la 12-24 de ore pentru:
- contaminare (bacterii, fungi, virui);
- constantele fizico-chimice (pH, proteine totale);
-aprecierea eficienei culturii (densitatea celular pe suport, eficiena de
formare a coloniilor).
Controlul morfologic al celulelor din culturi se face prin:
- microscopie fotonic pe preparate proaspete se examineaz celulele vii la
microscopul cu contrast de faz sau pe preparate permanente fixate i colorate;
- histoautoradiografie;
- microscopie electronic.

Activitate practic
Cultura de limfocii din sngele periferic

Reeditarea Se ia 3ml snge, prin puncie venoas la plica cotu1ui, cu

ajutorul unei seringi sterile, heparinat anterior recoltrii. Se poate recolta snge i
din puncie n pulpa degetului, ns aceast metod comport risc de infecie a
culturii mai frecvent, motiv pentru care are aplicaie limitat.
nsmnarea mediului - const n repartizarea mediului de cultur special n
flacoane de sticl sterile de 20 - 30 ml, n care se va pune 10 ml de mediu de
cultur n condiii sterile. Se las s ajung la temperatura camerei, dup care se
plaseaz n fiecare flacon 12 - 20 picturi din sngele recoltat (numrul picturilor
fiind n funcie de leucograma persoanei investigate).

Se nchide flaconul cu un dop steril i se agit uor pentru omogenizare.

Cultura este inut la termostat la 37C timp de 72 - 96 ore, interval n care la
fiecare 24 ore se verific ph-ul i aspectul.
Acidifierea mediului este tamponat cu fosfat - tampon.
Culturile care i schimb culoarea sau devin tulburi, vor fi ntrerupte,
deoarece cultura este compromis.