Sunteți pe pagina 1din 3

Tolan Andreea Eleonora

CSPA, AN 4

Tehnici de biologie moleculara


Izolarea ADN:
Este un procedeu de rutina folosit in vederea obtinerii materialului
genetic utilizat in analize moleculare ulterioare.
Etapele izolarii ADN-ului sunt:
1. Lizarea celulelor : (distrugerea celulelor) se realizeaza pentru ca
moleculele de ADN sa fie expuse tratamentelor ulterioare. In general,
aceste procedeu se realizeaza prin mojararea sau sonicarea probei,
precum si prin tratament cu solutii tampon specifice, in functie de
peretele celular sau membrana celulara in cauza.
2. Eliminarea lipidelor membranare prin adaugarea unor detergenti.
3. Adaugarea proteazelor : este un procedeu care se realizeaza optional si
consta in indepartarea proteinelorcu ajutorul anumitor enzime numite
proteaze.
4. Precipitarea ADN cu un alcool-etanol rece sau izopropanol.
In functie de tipul celulelor din care se urmareste izolarea ADN, se impune
includerea unor etape aditionale celor amintite. Unele celule contin perete
celular, al carui continut poate sa difere de la un organism la altul. De
asemenea, mediul in care se gasesc celulele din care se doreste izolarea
ADN poate sa ingreuneze urmarea pasilor necesari.
Metode de purificare:
Purificarea ADN-ului se realizeaza in faza solida si in faza lichida.
In faza lichida se produce lizarea proteinelor -> digestia lor -> separarea
proteinelor de ADN -> precipitarea ADN cu alcool -> rehidratarea.
In faza solida se realizeaza lizarea proteinelor -> aplicarea tuburilor ->
spalarea -> elutia ADN.
Electroforeza ADN in gel de agaroza:
Electroforeza este cea mai simpla si mai des folosita metoda de a separa
si analiza moleculele de ADN. Electroforeza este o metoda fizico-chimica de
analiza ce permite separarea proteinelor pe baza diferentelor intre vitezele

de deplasare intr-un camp electric aplicat mediului respectiv. Ca urmare a


caracaterului lor amfoter, proteinele poseda o sarcina electrica ce depinde
de natura moleculei, pH si de compozitia mediului. Moleculele incarcate
electric, aflate in solutie si supuse actiunii unui camp electric, vor migra catre
electrodul de polaritate opusa.
Este o metoda standard de purificare de fragmente ADN. Prepararea
gelurilor se face prin topirea agarozei pana la obtinerea unei solutii clare,
transparente. Moleculele de ADN care strabat gelul se gasesc in mediul lichid
asigurat de tamponul de electroforeza (TBE, TAE).
Echipamentul electroforetic se compune din aparatul de electroforeza,
transiluminatorul cu UV si sistem de preluare a imaginilor.
Pentru determinarea concentratiei de ADN este folosita spectofotometria.
Se masoara intensitatea absorbantei solutiei in comparatie cu curba etalon
standard. Absorbanta se transforma apoi in densitate optica. Este o
determinare usoara si rapida, iar datele sunt stocate pe calculator.

Utilizari ale ADN-ului izolat:


ADN-ul izolat este folosit pentru : prepararea proiectului genomic, ca
proba pentru PCR, pentru clonare, secventiere gene, in analiza organizarii
genomului, pentru studiul structurii genelor, amprentare ADN, analiza
compozitiei genomului si detectarea anomaliilor sau mutatiilor.

Tehnica PCR:
Polymerase Chain Reaction Reactia in lant a polimerazei
Este o metoda in vitro pentru sinteza enzimatica a unor secvente specifice
de ADN si ARN.
A fost pusa la punct la mijlocul anului 1980 de Kery Mullis revolutionand
genetica moleculara ca si tehnica de secventiere a ADN.
Principiul metodei are la baza o tehnologie in vitro care imita capacitatea
naturala de replicare a ADN si care consta in generarea rapida a unor copii
multiple a unei secvente nucleotidice tinta dintr-o gena de interes sau un
patogen specific. Numarul de copii ale secventei tinta va creste exponential
cu fiecare ciclu de amplificare, deoarece fiecare secventa nucleotidica nou
sintetizata constituie o matrita pentru o noua copie. Produsul PCR care
reprezinta o copie a ADN sau ARN tinta original, se numeste amplicon.
Reactia PCR se desfasoara pe trei etape:

1. Denaturarea: in urma incalzirii amestecului de reactie la 94C, ADN-ul


tinta este separat (denaturat) in 2 catene;
2. Hibridizarea primerilor: ca urmare a scaderii temperaturii la 5570C, primerii se vor atasa complementar la capetele 3 ale celor 2
catene;
3. Elongatia: la temperatura de 72C, ADN polimeraza termostabila in
prezenta Mn2+ si a excesului de deoxinucleotid-trifosfati
(deoxiadenozina, deoxiguanozina, deoxicitidina si deoxiuridina) va
extinde primerii atasati in lungul matritei tinta si va produce un
amplicon ADN. Analizorul va repeta automat acest proces pentru un
numar stabilit de cicluri (de obicei 30-35), la fiecare ciclu dublandu-se
cantitatea de amplicon ADN.
Tehnicile PCR au aplicatii in : clasificarea organismelor, genotipizare,
arheologie moleculara, detectarea unor mutatii genetice, industria
medicamentoasa, industria alimentara, stabilirea paternitatii.