Sunteți pe pagina 1din 84

Fenomenul de restrictie - modificatie

Descoperirea si elucidarea fenomenelor de restrictie (R) si


modificatie (M) ale celulelor bacteriene s-au realizat in principal,
prin studii ale fenomenului de transductie (transfer de material
genetic cu ajutorul bacteriofagilor) efectuate de Luria si Bertani, in
1952-1953 si de Arber si Linn in 1969.
Bariera principala in mentinerea ADN nou transferat in celula
gazda este restrictia acestuia controlata de gazda.
Sistemul de restrictie este reprezentat de endonucleaze de restrictie
care scindeaza moleculele de ADN recunoscute ca exogene
(straine), la nivelul ambelor catene, rezultand fragmente de ADN cu
extremitati libere.
Sistemul de restrictie nu distruge genomul propriu, deoarece este
contrabalansat de sitemul de modificatie/modificare.
Sistemul de modificatie este reprezentat de metilaze care recunosc
aceleasi situsuri ca restrictazele, dar situate in genomul propriu, pe
care le metileaza pentru a le feri de atacul propriilor endonucleaze
de restrictie.

Fenomenul de restrictie - modificatie

Sistemul R-M poate fi privit ca un sistem de aparare al celulei


bacteriene de ADN strain ce patrunde in celula prin conjugare,
transformare, transductie.
Este deci, un sistem imuno-genetic de aparare.
Exemplu: bacteriofagul , multiplicat un timp pe tulpina E. coli B, se
multiplica foarte greu cand e trecut pe tulpina E. coli K. S-a marcat
radioactiv cu P32, ADN fagic si s-a constatat ca acesta este restrictat
imediat dupa ce patrunde in celula gazda. Daca, intamplator, cativa au
parcurs un ciclu lizogen (ca profagi), replicandu-se sincron cu
cromozomul gazdei E. coli K, in prezenta metilazei modificatoare,
devin si ei rezistenti la atacul endonucleazelor de restrictie, la fel ca si
nucleoidul bacterian. Daca fagul e trecut iarasi pe tulpina E. coli B, se
intampina aceleasi probleme deoarece modificarea ADN fagic este
neereditara si este controlata, ca si restrictia, de catre celula-gazda.

Fenomenul de restrictie - modificatie

Genele care codifica sistemul R-M sunt localizate fie in cromozomul bacterian, fie
pe plasmide.
Arber, in 1974, evidentiaza 3 gene raspunzatoare de aceasta activitate:
hsd S implicata in recunoasterea situsului pe ADN;
hsd R codifica endonucleaza de restrictie;
hsd M codifica metilaza: dcm metileaza citozina, dam metileaza adenina.
Aceste gene pot suferi mutatii:
mutatii ce afecteaza hsd R determina fenotip r-m+ (ADN nu mai este restrictat,
ci doar metilat).
mutatii ce afecteaza hsd S determina fenotip r-m- (ADN nu mai sufera nici
restrictie, nici metilare, deoarece enzima nu se mai poate atasa la situsul specific
sau nu-l mai recunoaste);
mutatii ce afecteaza hsd M determina mai degraba fenotip r-m- decat r+m(deoarece subunitatea M intervine in functionarea normala a subunitatii R, ca un
sistem de siguranta, pentru a nu-si degrada propriul ADN).

Fenomenul de restrictie - modificatie

Nomenclatura endonucleazelor de restrictie (H.O.Smith si D. Nathans)

Prima litera (format italic) genul de la care s-a izolat enzima;


Urmatoarele 2 litere (format italic) primele doua litere ale speciei de la care s-a
izolat enzima;
Urmatoarea litera (poate lipsi, format normal) desemneaza tulpina de la care sa izolat enzima;
Cand de la aceeasi tulpina s-au izolat mai multe restrictaze, ele sunt identificate
cu cifre romane (I, II, III)
Exemple:

EcoR I de la E. coli R 13
Nae de la Nocardia aerocolonigenes
EcoR II de la E. coli R 245
Sal I de la Streptomyces albus
Hind I, II, III de la Haemophillus influenzae Mbo I de la Moraxella bovis
Hpa I, II de la Haemophillus parainfluenzae Xma I de la Xanthomonas
Hae I, II, III de la Haemophillus aegypticus malvacearum
Bgl I, II de la Bacillus globigii
Sma I de la Serratia marcescens
BamH I de la Bacillus amyloliquefaciens H Pst I de la Providencia stuartii 164
Bst I de la Bacillus stearothermophillus

Fenomenul de restrictie - modificatie


Sisteme enzimatice R-M de tip I

Au GM mare: 300.000 daltoni;


Necesita cofactori (Mg2+, ATP, S-adenosil L-metionina);
Sunt formate din 3 subunitati R (), M (), S () cu GM 135.000, 60.000 si
55.000 daltoni.
Situsul de recunoastere este acelasi si pentru R si pentru M;
Aceeasi enzima poate functiona ca restrictaza (cand poaseda toate subunitatile) si
ca metilaza (cand pierde subunitarea R sau S);
Metilaza actioneaza chiar la nivelul situsului de recunoastere;
Restrictaza cliveaza catenele de AND la o distanta de 1000-5000 nucleotide in
afara situsurilor specifice.
Situsurile de recunoastere contin 13-15 perechi de nucleotide:
la un capat un trimer
la mijloc un domeniu de 6-8 nucleotide care nu este implicat in recunoastere;
la celalalt capat un tetramer
5 TGA*.(N)6-8TGCT 3
3 ACT. (N)6-8*ACGA 5

Fenomenul de restrictie - modificatie


Sisteme enzimatice R-M de tip I

5 TGA*.(N)6-8TGCT 3
3 ACT. (N)6-8*ACGA 5

Exemple: EcoK si EcoB.


Daca adeninele marcate din situs sunt metilate enzima nu actioneaza in niciun fel;
Daca situsul e hemimetilat (doar o adenina de pe o catena), enzima functioneaza ca o
metilaza si metileaza si cealalta catena;
Daca situsul este nemetilat enzima functioneaza ca o restrictaza si cliveaza ADN.
Gruparea CH3 e data de S-adenosil L-metionina care are rol de donor, dar si de efector
alosteric, deoarece schimba confromatia subunitatii S si permite atasarea enzimei la
situs.
Clivarea nu este randomica (la 1000-5000 nucleotide distanta de situs), ci are loc in
doua etape: mai intai este incizata o catena, apoi cealalta, in apropierea primei incizii si
apoi urmaza o activitate exonucleazica, cu consum de ATP.
Exista doua ipoteze privind clivajul:
fie ca enzima se ataseaza la situsul de recunoastere si apoi se deplaseaza pe
molecula de ADN pana la locul de clivare,
fie dupa atasare, determina plierea moleculei de ADN astfel incat situsul de
clivare este adus in apropierea celui de atasare.

Fenomenul de restrictie - modificatie


Sisteme enzimatice R-M de tip II:

Au greutate moleculara mica.


Actioneaza si in absenta unor cofactori.
Restrictazele sunt enzime diferite de metilaze.
Situsul de atasare este un palindrom (secventa cu bisimetrie rotatorie) de 4-5-6 pb.
Clivarea si metilarea se fac chiar la nivelul situsului de recunoastere.
Metilarea

are loc la A sau C din situs, atunci cand acesta este hemimetilat,
ca donor functioneaza tot S-adenosil L-metionina;
are loc denaturarea locala a ADN-ului in zona situsului si catena ce va fi metilata intra
intr-un sant format intre doua domenii ale metilazei;
nucleotida ce trebuie metilata este extrasa din catena, este metilata, si apoi reasamblata in
catena

Contin in centrul catalitic 2 aminoacizi cu caracter acid (acid glutamic Glu si


aspartic Asp) si unul cu caracter bazic (lizina Lys) ce intervin in mecanismul de
clivare. Astfel, Lys activeaza o molecula de apa care executa un atac nucleofilic
asupra gruparii fosfat si desface legatura fosfodiesterica, Mg 2+ stabilizeaza sarcinile
negative ale gruparii 2-PO4, iar Glu si Asp cedeaza cate un proton gruparilor OH -

Fenomenul de restrictie - modificatie


Sisteme enzimatice R-M de tip II:
Dupa modul de clivare, se clasifica in:
Enzime care produc capete netede (flush, blunt, smouth ends):
Hind II, Hae III, Sma I, Hpa I, Nae I;
5GG CC 3
3CC GG 5

Enzime care produc capete adezive (cohesive, sticky ends) 5 (EcoR I


si II, Hind III, Hpa II, Bam H I, Sal I, Xma I) sau 3 (Bgl I sau KpnI)

Fenomenul de restrictie - modificatie


Sisteme enzimatice R-M de tip II
EcoR I

Descoperita la E. coli tulpina R13;

Codificata de o gena plasmidiala de pe un plasmid conjugativ R de 7 x 10 6 daltoni;

Este un dimer cu GM de 30.000 daltoni;

Situsul de recunoastere este un palindrom de 6 nucleotide (5GAATTC3);

Prin clivare formeaza capete 5 lipicioase din cate 4 nucleotide (5AATT3) ;

Metilarea are loc la A din vecinatatea timinei;

La fagul exista 5 situsuri pentru EcoR I.

5G AA*T T C 3
3C T T A*A G 5

Fenomenul de restrictie - modificatie


Sisteme enzimatice R-M de tip II
EcoR II
Descoperita la E. coli tulpina R245;
Codificata de o gena plasmidiala de pe un plasmid conjugativ R15;
Situsul de recunoastere este un palindrom de 5 perechi de nucleotide
(5CCTGG3);
Prin clivare formeaza capete 5 lipicioase din cate 5 nucleotide
(5CCTGG3);
Metilarea are loc la C din vecinatatea timinei;
5 N CC*TGG
3
3
GG AC*C .N 5

Fenomenul de restrictie - modificatie


Sisteme enzimatice R-M de tip II

Exista enzime cu situsul inclus in situsul altei restrictaze: Mbo are un situs de 4pb
inclus in situsul de 6pb al enzimei Bam H I.
5 G GATC* C 3
3 C C*TAG G 5
Enzimele izoschizomere sunt izolate de la specii diferite, recunosc aceleasi situsuri
si produc aceeasi taietura, deci creeaza capete identice (Bam H I si Bst I)
5 G GATC* C 3
3 C C*TAG G 5
Enzime neoschizomere sunt izolate de la specii diferite, recunosc aceleasi situsuri
si produc taieturi diferite, deci creeaza capete diferite ( Nae I capete netede iar
Xma I capete 5 coezive)

Fenomenul de restrictie - modificatie


Sisteme enzimatice R-M de tip II
Unele enzime recunosc situsuri diferite, dar produc capete
identice (Bam H I si Bgl II)
5 G G ATC* C 3
3 C C*TAG G 5

5 A G ATC* T 3
3 T C*TAG A 5

Unele enzime recunosc un situs cu ambiguitati (Hind II):

5 GTCAAC 3 sau 5 GTTAAC 3 sau 5 GTCGAC 3

Fenomenul de restrictie - modificatie


Sisteme enzimatice R-M de tip III

Descoperite in 1978, de catre Kauc si Piekarowicz, la fagul plasmide-like P1;


Exemple: EcoP I sau Eco P15
Au situsul de clivare la mica distanta de cel de recunoastere si metilare (la 25-27 pb)

Sisteme enzimatice R-M de tip IV


Sunt rare si mai putin eficiente;
Restrictaza recunoaste si cliveaza un situs metilat;
Dpn I si II de la Diplococcus pneumoniae au acelasi situs si formeaza capete netede,
dar Dpn I necesita pentru clivare A metilata (si nu poseda metilaza
corespunzatoare), iar Dpn II cliveaza numai cand C nu e metilata (si poseda
metilaza corespunzatoare, de aceea Dpn II apartine la sistemul R-M II):
5 G A* T C* 3
3 C* T A*G 5

LIGAZELE

Catalizeaza formarea legaturilor covalente fosfodiesterice intre capetele 3OH si 5


PO4 ale unor fragmente de ADN dc.
Daca fragmentele au capete netede, se utilizeaza Ligaza T4 (izolata de E. coli
infectata cu fagul T4) si energia este furnizata de ATP;
Daca fragmentele au capete coezive, se utilizeaza ADN ligaza iar sursa de energie
este NAD+ .
Temperatura optima pentru refacerea legaturii fosfodiesterice este 15-22C
Metoda decamerilor : in prezenta ligazei T4, la capetele netede ale fragmentelor
ADN ce urmeaza sa se uneasca, se adauga secvente linker de cate 10pb in care se
afla situsuri pentru endonucleaze de restrictie ce formeaza capete coezive si care,
apoi, se unesc cu ADN ligaza si genereaza ADN recombinant.
Metoda cozilor homopolimerice adauga, cu ajutorul terminal transferazei, la
extremitatile 3 terminale ale fragmentelor ce urmeaza sa se sudeze, cozi scurte
poli (A) respectiv poli (T). Este posibil sa se utilizeze si perechile GC. Incubarea
fragmentelor cu capete complementare la 22C duce la formarea ADN
recombinant.

MECANISME DE TRANSFER GENETIC


LA PROCARIOTE
Informaia genetic la procariote se afl ntr-un circuit intens, extrem de
activ, denumit flux genetic i care se realizeaz n dou sensuri:
pe vertical (prin diviziuni succesive, informaia genetic se
transmite de la ascenden la descenden, asigurndu-se
transmiterea ereditar a caracterelor de la o generaie bacterian la
alta) i
pe orizontal (transmiterea informaiei genetice ntre indivizii
aceleiai generaii) prin trei mecanisme importante:

transformarea,
conjugarea,
transducia.

Fluxul genetic pe orizontal asigur recombinarea genetic la


procariote i se realizeaz, direct sau indirect, ntre o bacteriedonor care furnizeaz o molecul de ADN exogen (exogenot) i
ADN-ul cromozomal sau plasmidial (endogen sau endogenot) al
bacteriei-receptor. Cele dou molecule formeaz un ADN-hibrid,
astfel c, celula bacterian care l conine, este un recombinant.

MECANISME DE TRANSFER GENETIC


LA PROCARIOTE
I. Transformarea genetic
Reprezint procesul prin care o bacterie-receptor ncorporeaz ADN
exogenot extracelular, liber (cromozomal sau plasmidial), l menine
stabil (l ferete de atacul endonucleazelor proprii) i l exprim (prin
transcriere i translaie).
Procesul a fost descoperit n 1928 de ctre microbiologul englez F.
Griffith la Diplococcus pneumoniae (pneumococ).
Dup morfologie, structura i patogenitate, pneumococii se ncadreaz
n dou grupe:

Tulpini de tip S I, II, III, (din engl. smooth - neted), care au capsul de natur
polizaharidic, sunt patogeni i pe medii solide formeaz colonii netede i
Tulpini de tip R I, II, III, (din engl. rough rugos) care nu posed capsul, sunt
nepatogeni i dezvolt pe medii agarizate, colonii rugoase.

Patogenitatea, determinat de prezena capsulei, se transmite ereditar.


Pierderea capsulei, nsoit de pierderea patogenitii e determinat
ntotdeauna de transformarea natural a pneumococilor din tipul S, n
acelai tip R (de exemplu: un pneumococ de tip S I nu se va
transforma niciodat n pneumococ de tip R II, ci doar n tipul R I).

MECANISME DE TRANSFER GENETIC


LA PROCARIOTE

Medicul (Griffith) a realizat experimentele in vivo, pe loturi de


oareci i a observat cu surprindere c un amestec de:
pneumococi vii, nepatogeni, de tip R i de
pneumococi patogeni, de tip S, dar omori n prealabil prin
cldur, a avut efect letal asupra lotului de oareci.
De la animalele moarte de pneumonie, s-au izolat pneumococi
patogeni, de tip S, vii.
La acea dat, nu s-a putut explica fenomenul i nici natura
chimic a substanei care a produs transformarea.

MECANISME DE TRANSFER GENETIC


LA PROCARIOTE

n 1944, experienele lui Griffith au fost reluate in vitro, de ctre


un grup de trei cercettori de la Institutul Rockefeller: O. T.
Avery, Mac Leod i McCarty.
Ei au izolat mai nti ADN de la tipul de pneumococi capsulai,
patogeni S III i l-au introdus n mediul de cultur al
pneumococilor nepatogeni de tip R II.
Dup incubare, s-a observat c printre coloniile rugoase ale
pneumococilor R II, apar i colonii netede, dar nu de tip S II, ci de
tip S III (deci tipul capsulei dobndite a fost specific tulpinii de la
care provenea ADN-ul exogen, transformant).
Aceast modificare este inhibat de DN-az. Caracterul dobndit
se transmite ereditar, fidel la descendeni astfel c, prin diviziunea
bacteriei rezultat prin transformare, apare o colonie neted.
Astfel, pentru prima dat, s-a stabilit c nu proteinele, ci ADN-ul
este molecula care asigur transmiterea ereditar a caracterelor.

MECANISME DE TRANSFER GENETIC


LA PROCARIOTE

Acest mare adevr, a fost o vreme negat, pn n 1952, cnd Hershey


i Chase, prin experiene de marcare radioactiv, au demonstrat c
ADN-ul este unicul purttor al informaiei ereditare.
Ei au marcat cu 32S proteinele din capsida unor bacteriofagi i cu 35P,
ADN-ul fagic.
Fagii respectivi au fost folosii pentru a infecta o tulpin de
Escherichia coli i s-a observat c proteinele capsidei ramn
extracelular i numai ADN-ul fagic ptrunde n celula bacterian,
determinnd-o s multiplice virusul i s produc particule fagice
complete, inclusiv cu capsul.
Pentru aceast demonstraie, cei doi cercettori au primit Premiul
Nobel n 1969. Aceste prime experiene de transformare genetic au
inaugurat revoluia molecular n genetic i au deschis era ingineriei
genetice.

MECANISME DE TRANSFER GENETIC


LA PROCARIOTE

Spre deosebire de celelalte mecanisme de recombinare genetic,


transformarea nu necesit participarea direct a unei celule-donor vie,
ci doar a unui fragment din ADN-ul acesteia.
O condiie a finalizrii recombinrii genetice prin transformare, este
ca bacteria-receptor s fie ntr-o stare fiziologic activ, tranzitorie,
care s-i permit internalizarea ADN-ului exogen, liber, numit stare
de competen.
Deoarece genomul procariot posed aparatul genetic ce controleaz
strict starea de competen i permite internalizarea ADN-ului
exogenot, bacteriile sunt singurele organisme capabile s realizeze
transformarea genetic natural.
Competena const n modificri ale structurii peretelui celular, mai
ales la nivelul mezozomilor, ceea ce determin expunerea
(demascarea) receptorilor pentru ADN i facilitarea internalizrii
acestuia.

MECANISME DE TRANSFER GENETIC


LA PROCARIOTE

Competena genetic este ntlnit la muli taxoni bacterieni i are o


origine evolutiv foarte veche. Poate fi anulat prin mutaie.
Poate fi:

constitutiv (la genul Neisseria) sau


inductibil.

Atinge maximum n diferite etape ale ciclului celular (n faza


logaritmic de cretere la genurile Azotobacter, Streptococcus,
Staphylococcus sau la trecerea din aceasta faz, la faza staionar, la
genurile Bacillus i Pseudomonas).
n experimentele de laborator (in vitro), starea de competen este
indus artificial prin tratarea celulelor receptor cu CaCl 2 (sau cu ali
cationi bivaleni), ageni chelatori sau enzime ce atac peretele celular
(muraminidaz).
Proporia de celule aflate n starea de competen dintr-o populaie
bacterian se estimeaz prin frecvena celulelor transformate (< 5% la
Pseudomonas sp. i Streptomyces sp., ntre 10-25% la Bacillus sp. i
100% la Azotobacter sp.).

MECANISME DE TRANSFER GENETIC


LA PROCARIOTE
Exist mai multe tehnici de transformare genetic in vitro:
fuziunea protoplatilor receptor cu ADN exogen
mpachetat n lipozomi,
electrotransformarea (sau electroporarea care folosete
curentul electric pentru a permeabiliza nveliurile
receptorului pentru moleculele de ADN exogenot) sau
bombardarea receptorilor cu microparticule de aur sau
tungsten, pe care este adsorbit ADN exogen (metoda
biolistica).

MECANISME DE TRANSFER GENETIC


LA PROCARIOTE
Etapele transformrii genetice la bacterii
Adsorbia ADN liber exogen la celula-receptoare a fost descris de
ctre M. Lorenz i colaboratorii, n 1994. De regul, se leag la
receptori ADN d.c., mai rar ADN m.c. (la pH 5.0 la Bacillus subtilis i
la Haemophilus influenzae sau la pH 7.0 la Neisseria gonorrhoeae).
Legarea poate fi situs nespecific, permind ncorporarea de ADN de
la specii ndeprtate filogenetic (ex. la Bacillus sp. exist 50 situsuri
de legare a ADN per celul competent, iar la Streptococcus sp. exist
70 astfel de situsuri). Unele specii bacteriene adsorb, ntr-o manier
situs specific, doar ADN exogen de la specii nrudite filogenetic. n
acest caz, numrul situsurilor este mult mai mic (8 la Haemophilus
influenzae sau 10 la Neisseria gonorrhoeae) i la acestea se leag
secvene scurte de 10-11 pb, cu o succesiune strict de nucleotide.
Iniial, adsorbia este reversibil i ADN exogen este sensibil la atacul
DN-azelor, apoi legarea este ireversibil i enzima nu mai poate
degrada ADN-ul transformant.

MECANISME DE TRANSFER GENETIC


LA PROCARIOTE

Internalizarea ADN-ului transformant se realizeaz prin mecanisme


diferite la bacteriile Gram pozitive de cele Gram negative.
La bacteriile Gram-pozitive exist un aparat de internalizare reprezentat de
setul de proteine Com.
Proteina Com C are rol de protein reglatoare i intervine n procesarea
celorlalte proteine din aparatul de translocare.
Proteinele din familia Com E sunt situate n peretele celular i au rol
direct n legarea ADN-ului exogenot. Com E1 proemin prin captul
NH3+ la exteriorul celulei, aceast conformaie alosteric asigurnd
ataarea ADN la situs, iar Com E2-Com E3 traverseaz peretele
celular, fr s proemine la exterior i faciliteaz translocarea ADN
exogen prin peretele celulei-receptoare.
Familia de proteine Com G sunt situate n membrana plasmatic i sunt
codificate de un operon cu 7 ORF-uri. Com G1 este o ATP-az ce
furnizeaz energia necesar procesului. Celelalte 6 proteine Com G
formeaz un canal proteic transmembranar.
Proteinele Com F sunt codificate de un operon cu 3 ORF-uri, iar Com
F1 este o translocaz ADN-dependent (B. Dreisekelmann, 1994).

MECANISME DE TRANSFER GENETIC


LA PROCARIOTE

La limita dintre peretele celular i plasmalem, o endonucleaz


degradeaz una din catenele ADN-ului transformant, astfel
nct, n celula receptoare ptrunde ADN m.c. cu captul 3OH
nainte.
Un alt model de nglobare n celula receptare Gram-pozitiv a
ADN-ului transformant este printr-un canal neproteic format
din polihidroxibutirat (PHB), polifosfai i Ca2+ cu diametru
de 2,4 nm (Vassu T. i al., 2001).

AND transformant dc
Endonucleaz

ComE1
ComE2E3
ComC

Perete celular

Com G

Membran plasmatic

Com F1
3OH

ComG
1

MECANISME DE TRANSFER GENETIC


LA PROCARIOTE

La bacteriile Gram-negative (Haemophilus influenzae),


mecanismul de internalizare a fost descris de ctre M. Lorenz
i colaboratorii, tot n 1994. La locurile de adeziune ntre
membrana extern i cea intern exist nite formaiuni
(extensii membranare) numite transformasomi (10-12/celul
competent). n interiorul lor, ADN d.c. exogen e protejat de
atacul DN-azelor. Acetia sunt alctuii din componenete ale
membranei externe i au o nlime de 35 nm i un diametru de
20 nm. La polul superior, sunt situai doi receptori de natur
proteic, la care se fixeaz ADN-ul transformant. La polul
inferior, posed un por cu diametru de aproximativ 5 nm, la
nivelul cruia exist o endonucleaz, care degradeaz una din
catene, astfel c n celul ptrunde doar o monocaten de ADN
(cu captul 3OH nainte) (Vassu T. i al., 2001).

Receptori pentru
ADN transformant
dc
Transformazo
m

Membran
extern
Membran
intern

3OH

Por

Endonucleaz

MECANISME DE TRANSFER GENETIC


LA PROCARIOTE

Eclipsa este perioada n care ADN exogen, internalizat, nu se


exprim nc n celula receptoare i particip la procese de
recombinare genetic. Are loc sinapsa, mperecherea
monocatenei de ADN exogen cu regiunea omoloag, dar
neidentic din ADN celulei-receptor, devenit i ea
monocatenar. Sinapsa presupune recunoaterea regiunilor i
mperecherea pe baz de complementaritate, cu formarea unui
heteroduplex ADN-donor-ADN-receptor.
Exprimarea ADN-ului transformant n celula gazd. Prin
transcriere i translaie, informaia genetic nou, adus de
ADN exogenot, determin sinteza unor proteine structurale
sau enzime, care confer caractere fenotipice noi, ce pot fi
evideniate i n baza crora sunt selectai recombinanii.

MECANISME DE TRANSFER GENETIC


LA PROCARIOTE
II. Conjugarea reprezint procesul de transfer unidirecional de material
genetic de la o bacterie-donor la o bacterie-receptor, prin intermediul
unei legturi intercelulare directe numit pil de conjugare. Pilul de
conjugare este o formaiune ce aparine celulei donor i prezena sa
este determinat de existena unui element genetic specializat, localizat
de regul plasmidial, numit conjugon.
Procesul de conjugare bacterian a fost descris pentru prima dat de ctre
Lederberg i Tatum n 1946, ca un fenomen de para-(proto-)
sexualitate la procariote, legat de prezena/absena factorului de
fertilitate, notat F. Cercetrile ulterioare au artat c F este de fapt un
plasmid din categoria plasmidelor conjugative i conjugarea nu mai
este asimilat fenomenului de sexualitate, ci fenomenului de flux
genetic pe orizontal ce caracterizeaz regnul Monera.

MECANISME DE TRANSFER GENETIC


LA PROCARIOTE
CONJUGONUL - sistemul genetic implicat n conjugarea genetic, este
format la plasmidul F, din: regiunea leader, regiunea ori T i operonul
tra.
Regiunea leader este prima secven de ADN care ptrunde prin
conjugare, n celula receptoare i este constituit din 13 pb (nalt
conservate n evoluie), situate ntre regiunea ori T (unde este nickat
monocatena) i secvena rep-inc. Genele mai importante pe care le
conine aceast regiune sunt:

gena ssb, ce prezint omologie cu cea situat n cromozomul bacterian i


codific proteina Ssb cu rol n stabilizarea monocatenelor de ADN n timpul
transferului conjugativ;
genele psi A - psi B codific proteine Psi A i Psi B, ce inhib activitatea
proteazic a enzimei Rec A;
genele flm A, B i C, codific enzime ce formeaza sistemul de stabilitate i
partiie plasmidial, prin eliminarea descendenilor plasmid-free (care nu au
primit o copie a plasmidului);
un situs de recunoatere, de la care este iniiat sinteza catenei complementare
(dup ptrunderea monocatenei plasmidiale n celula receptoare) i asamblarea
primosomului. Plasmidul F nu posed o primaz proprie (folosete primaza
codificat de cromozomul bacterian).

MECANISME DE TRANSFER GENETIC


LA PROCARIOTE

Regiunea ori T reprezint originea transferului conjugativ i este


de asemenea foarte bine conservat n evoluie (difer foarte puin,
chiar la taxoni bacterieni ndeprtai filogenetic).
Difer de originea replicrii plasmidiale, care se noteaz ori V.
Este flancat de situsul pentru endonucleaza de restricie B gl II
(care o separ de regiunea leader) i de gena tra M (prima din
operonul tra).
Prezint dou segmente importante din punct de vedere
funcional:
zona pentru nickare i
zona pentru transfer.

MECANISME DE TRANSFER GENETIC


LA PROCARIOTE

Zona pentru nickare cuprinde, de la situsul pentru B gl II ctre gena tra M


urmtoarele situsuri:
situsul unde are loc ruperea ( nick) legturii fosfodiesterice dintr-o
monocaten a plasmidului, care urmeaz a fi transferat prin conjugare
n celula recepoare;
zon bogat n A/T, la nivelul creia are loc curbarea intrinsec a
moleculei de ADN plasmidial;
situsul A pentru care prezint specificitate proteina histone-like IHF
(Integration Host Factor), ataare care determin curbarea moleculei
de ADN, n zonele bogate n A/T, cu 140;
jumtate din situsul sby A, la care se ataeaz specific proteina Tra Y,
determinnd o curbare suplimentar a ADN plasmidial, cu nc 40.
Zona pentru transfer cuprinde (respectnd acelai sens):
cealalt jumtate din situsul sbyA;
zona bogat n perechi A/T, unde are loc de asemenea curbarea
moleculei de ADN;
situsurile sbm C, B, A, la care se ataeaz proteina Tra M (semnal
chimic al mperechierii donor-receptor).

zone de curbur
intrinsic

Bgl II

AAA...TT Situs
T
A
TTT...AA

sby A

A
nick

AAA...TT sbm C
T
A
TTT...AA

A
IHF

Dimer Tra
Y

Regiunea pentru
nickare

Tra M

Regiunea pentru
transfer

Regiunea ori T din plasmidul F

tra M

MECANISME DE TRANSFER GENETIC


LA PROCARIOTE
Operonul tra este un ansamblu de gene (ORF
Open Reading Frames) ce funcioneaz ntr-o
succesiune strict controlat, printr-un reglaj
genetic complex. Ordinea n care intervin n
procesul de conjugare, caracterizarea rolului i
reglajul lor specific, sunt prezentate n
descrierea etapelor conjugrii.
ETAPELE CONJUGRII:
1.
Formarea agregatelor de conjugare
donor-receptor prin intermediul pilului de
conjugare F, un element extracelular
prezent pe celulele cu rol de donor. Acesta
recunoate i se ataeaz specific la
suprafaa celulelor receptor.

MECANISME DE TRANSFER GENETIC


LA PROCARIOTE

De asemenea, pilul de conjugare recunoate proteinele de


excludere de suprafa (din membrana altor celule donor,
pentru a evita agregarea greit donor-donor).
Este format din monomeri de pilin, aranjai helical, formnd
astfel filamentul de pilin, cu o lungime de 1-20 m.
Pilul de conjugare poate s se scurteze prin depolimerizare de
la ambele capete (att dinspre donor, ct i dinspre receptor) i
prezint situsuri pentru fagi pilus-specifici.
Sinteza monomerilor de pilin este controlat de 3 gene: tra A
care codific subunitile de pilin, gena tra Q codific o
protein nsoitoare care protejeaz pilina, asigur translocarea
acesteia prin membrana celulei donor i expunerea ei la
suprafa, gena tra X care codific o protein ce acetileaz
pilina. Asamblarea pilului este controlat de 11 gene tra L, E,
K, B, V, C, W, U, F, H, G (aceasta avnd funcie dubl:
asamblare i stabilizare)

MECANISME DE TRANSFER GENETIC


LA PROCARIOTE
2.

Stabilizarea agregatelor de conjugare const n interaciunea


pilului F cu proteina OmpA de pe suprafaa celulei receptoare. Etapa
este controlat de proteinele Tra G i Tra N codificate de genele tra
G i tra N. Prin depolimerizare dinspre celula receptor, pilul se
scurteaz i cele dou celule se apropie foarte mult, pn se
realizeaz comunicarea celular direct. Gena tra D codific proteina
Tra D, care formeaz un canal prin membrana celulei donor.
Excluderea de suprafa ntre dou celule de tip donor este controlat
de genele tra T i tra S, care au promotor propriu ( PT i PS) i se
exprim chiar fr activarea ntregului operon tra de la promotorul
PY. Proteina Tra T se afl n membrana extern a celulei donor i
intervine n fazele iniiale ale agregrii celulare, iar Tra S se afl n
membrana intern a celulei donor i blocheaz transferul
monocatenei de ADN plasmidial, ctre receptor, dup o agregare
incorect.

MECANISME DE TRANSFER GENETIC


LA PROCARIOTE
3.

Transferul conjugativ al ADNm.c. plasmidial este iniiat de proteina


semnal Tra M. Aceasta declaneaz o cascad de evenimente
moleculare de reglaj ntr-o ordine strict controlat. Gena tra M
prezint promotor propriu PM i astfel poate fi transcris separat i
independent de alte gene din operonul tra (ca i genele tra S i tra T).
Evenimentele se determin unele pe altele, iar ordinea lor este
urmtoarea:
ataarea specific a proteinelor Tra M la situsurile sbm C, B, A,
din zona pentru transfer a regiunii ori T ;
ataarea proteinei Tra Y sub form de dimer, la cele dou jumti
ale situsului sby A din ori T;
ataarea proteinei IHF la situsul A din zona pentru nikcare a
regiunii ori T;
curbarea extrem a moleculelor de ADN n cele dou zone bogate
n A/T din ori T i modificarea densitii helicale n aceast zon;

MECANISME DE TRANSFER GENETIC


LA PROCARIOTE

gena tra I codific proteina Tra I care i exercit activitatea


de helicaz-nickaz:
desfacerea progresiv a dublului helix;
topirea punilor de hidrogen;
ruperea unei legturi fosfodiesterice pe o caten a ADN
(n zona pentru nickare a regiunii ori T);
ataarea proteinei Tra I la captul 5 al catenei nickate
i direcionarea ei n celula receptor;
proteina Ssb se ataeaz de monocaten i o stabilizeaz

AND dc

TraI

DONOR

Membran intern

Tra D
Tra N

Membran extern
OmpA

OmpA

TraT

TraT

RECEPTOR

Ssb
5PO4

Tra N
Membran extern
Membran intern

MECANISME DE TRANSFER GENETIC


LA PROCARIOTE

Regiunea reglatorie a operonului tra const n 3 gene, care sunt


transcrise de la promotori proprii:
gena tra J posed promotor propriu PJ i codific proteina Tra J,
care este o protein reglatoare ce asigur transcrierea genei tra Y
de la promotorul PY;
gena tra Y cu promotorul PY care reprezint promotorul major,
central, al multor gene tra, de la care este iniiat transcrierea
policistronic a acestora;
gena fin P posed promotorul Pfin P, de la care este transcris un
ARN, notat Fin P, format din 75 ribonucleotide, cu rol de ARN
antisens, deoarece se suprapune parial pe gena tra J inhibndu-i
astfel transcrierea (i, implicit, este blocat transcrierea ntregului
operon tra). Fin P este instabil i se cupleaz cu proteina Fin O
(codificat de gena fin O), pentru a cpta stabilitate. Astfel
sistemul fin P fin O este sistemul de represie ce inhib ntreg
operonul tra.

MECANISME DE TRANSFER GENETIC


LA PROCARIOTE

Transductia reprezint transferul de material genetic de la o


bacterie donor la una receptor, prin intermediul unui vector viral
(fag temperat).
Termenul a fost folosit prima dat de Zinder i Lederberg n 1952, pe
studii la Salmonella typhimurium. Cercettorii au folosit dou
tulpini auxotrofe: una incapabil de a sintetiza fenilalanina,
triptofanul i tirozina (Phe- Trp- Tyr-) i alta incapabil s
sintetizeze metionina i histidina (Met- His-), cultivate ntr-un tub
Davis n form de U, pe un mediu minimal, lipsit de aminoacizii
menionai, dar cu sruri anorganice i glucide ca surs de energie.
Cercettorii au constatat c din 109 tulpini auxotrofe iniial, au
aprut 105 tulpini prototrofe (Phe+ Trp+ Tyr+ Met+ His+).
Din cauza timpului scurt n care au aprut, nu puteau fi mutante de
reversie, ci recombinani genetici. n acest caz, recombinarea
genetic nu se realizeaz prin contactul direct al celor dou tulpini
auxotrofe, ci prin intermediul fagului temperat P22 pe care s-a
ntmplat s-l poarte, ca profag, unul dintre genitori. Acest fag se
poate insera oriunde n genomul de Salmonella typhimurium i
poate transducta orice gen bacterian ( transducie generalizat).
III.

MECANISME DE TRANSFER GENETIC


LA PROCARIOTE

Bacteriofagii sunt virusuri ale celulelor bacteriene i pot fi viruleni


sau temperai. Fagii viruleni omoar bacteriile infectate, dup ce
acestea au realizat morfogeneza fagic complet. Fagii temperai
prezint dou opiuni evolutive n celula bacterian gazd:
ciclul litic, ce const n morfogeneza fagic, liza bacteriei gazde i
eliberarea particulelor fagice mature;
ciclul lizogen n care genomul fagic se integreaz ca profag n
cromozomul bacteriei gazd, se replic sincron cu acesta. La un
moment dat, se poate face trecerea de la ciclul lizogen la ciclul
litic, prin excizia corect a genomului fagic din nucleoid (caz n
care rezult particule fagice mature intacte, identice cu cele care au
realizat infecia) sau incorect (caz n care genomul fagic preia
gene bacteriene adiacente situsului de ataare i se elibereaz astfel
bacteriofagi recombinai, ce determin recombinarea genetic prin
transducie a bacteriilor pe care le vor infecta ulterior). Cnd preia
dou sau cteva gene bacteriene se numete cotransducie.

Nucleoid
bacterian

Ataarea fagului i
injectarea ADN
fagic n celula
gazd
Circularizarea
genomului fagic
Integrarea
genomului fagic ca
profag
n cromozomul
bacterian

Inducie
fagic

CICLUL LIZOGEN

CICLUL LITIC

MECANISME DE TRANSFER GENETIC


LA PROCARIOTE

Transducia poate fi:


specializat, cnd genomul fagic se inser n situsuri specifice din
cromozomul bacterian i, deci, nu poate transducta dect anumite
gene;
generalizat, cnd genomul fagic se poate integra n orice situs
din nucleoid i poate astfel transducta orice gen bacterian.
Cel mai cunoscut i mai utilizat fag temperat este fagul lambda .
Are o greutate molecular de 3,1 106 dal.
Este alctuit din cap cu simetrie icosaedric (20 fee), cu
diametru de aproximativ 60 nm.
Capsida este format din 72 capsomere
Coada flexibil, necontractil, din 35 discuri suprapuse, se
termin cu o prelungire.
Exist 4 fibre subterminale cu care se ancoreaz de nveliul
celulei bacteriene pe care o infecteaz.

MECANISME DE TRANSFER GENETIC


LA PROCARIOTE
Genomul fagului
un ADNd.c. liniar format din 48.502 pb, complet
secvenializat.
Capetele 5 ale fiecrei catene sunt mai lungi i
monocatenare i sunt alctuite din 12-20
nucleotide complementare, formnd astfel capete
5coezive (adezive, lipicioase).
n momentul infeciei fagice, sub aciunea ADNligazei bacteriene, nucleotidele complementare ale
capetelor 5 se unesc prin puni de hidrogen,
formnd situsul cos, iar genomul fagic devine
astfel circular - cercul Hershey.

MECANISME DE TRANSFER GENETIC


LA PROCARIOTE

Replicarea genomului fagic de ctre celula bacterian gazd,


parcurge dou etape.

n prima faz, modelul de replicare este , bidirecional, rezultnd dimeri


circulari.
Recombinaza Red, codificat de gena red, desparte cei doi monomeri circulari.
La 30 min din momentul infeciei, ncepe a doua faz a replicrii, dup modelul
cercului rotativ, unidirecional (Rolling Circle RC), ncepnd de la ori V, unde
endonucleaza A incizeaz una din catene.
Catena intact servete ca matri, iar catena veche, incizat, este dislocat din
dublul helix i pe msur ce este dislocat este, la rndul ei, replicat.
Astfel, dup mai multe runde de replicare, se formeaz o molecul dublu
catenar multimeric (concatemeri).
Endonucleaza A scindeaz concatemerii, la nivelul situsurilor cos, n monomeri
dublu-catenari, liniari, cu capete 5coezive.
Monomerii sunt ncapsidai n capside fagice preformate (tot de ctre celula
gazd) i, la 60 min de la infecie, celula bacterian gazd sufer fenomenul de
liz i se elibereaz n mediu peste 100 particule fagice mature.

MECANISME DE TRANSFER GENETIC


LA PROCARIOTE
Cele aproximativ 50 de gene din genomul
fagului se clasific n funcie de
momentul transcrierii n:
gene cu transcriere timpurie: N, cro i cI,
prin care se stabilete decizia binar a
fagului spre ciclul litic ( N, cro) sau
lizogen (cI);
gene cu transcrierea mijlocie: int, xis, red
cII, cIII, O, P, care controleaz procesele
de replicare i recombinare;
gene cu transcriere trzie (Q, S, R, genele
pentru morfogenez fagic: a capului W, B, C, D, E, F i a cozii - Z, U, V, G,
H, M, L, K, I, J).

MECANISME DE TRANSFER GENETIC


LA PROCARIOTE
DECIZIA BINAR LIZ-LIZOGENIE
1. CICLUL LIZOGEN se desfoar prin exprimarea genei cI.
Gena cI este transcris ncepnd de la promotorul PRM
(repression maintenance), la care se cupleaz ARN
polimeraza.
Produsul genei cI este un represor pentru genele N, cro, dar i
pentru genele implicate n morfogeneza fagic.
Represorul are o structur polipeptidic cu un capt -COOH
terminal i un capt -NH2 terminal.
Doi astfel de monomeri dimerizeaz prin intermediul capetelor
-COOH terminale (forma dimeric a represorului este esenial
pentru meninerea lizogeniei), iar doi dimeri formeaz un
tetramer, n momentul cuplrii cu operatorii multipli ai genelor
adiacente N i cro .

Situs de
dimerizare

Situs de
tetrameriz
are

Situs de
clivare

Situs de ataare la
operatori

MECANISME DE TRANSFER GENETIC


LA PROCARIOTE

Operatorii multipli ai genei cro sunt: OR3, OR2, OR1 (R right


deoarece gena cro este situat n dreapta genei cI).
Operatorii multipli ai genei N sunt: OL3, OL2, OL1 (L left
deoarece gena N este situat n stnga genei cI).
Represorii, n form tetrameric, se ataeaz la situsuri specifice de 17
pb din operatorii multipli, prin intermediul capetelor lor -NH2
terminale. Consecina principal este blocarea transcrierii genelor cro
i N (care sunt implicate n ciclul litic, si deci, se desfasoara ciclul
lizogen).
Deoarece promotorul: PR (al genei cro) este parial suprapus cu OR1,
iar PL (promotorul genei N) este parial suprapus cu OL1, atunci cnd
operatorii sunt blocai de represori, ARN polimerazele nu pot s se
ataeze la promotori i deci transcrierea acestor dou gene este
blocat.
Ca urmare, se desfoar ciclul lizogen.

MECANISME DE TRANSFER GENETIC


LA PROCARIOTE

Represorul cI, cnd se afl la un nivel constitutiv,


funcioneaz ca reglator pozitiv al propriei transcrieri, n
sensul c OR3, (care este parial suprapus cu operatorul OcI i
promotorul PRM ai genei cI) este liber i permite ARN
polimerazei s transcrie gena cI i s sintetizeze n continuare
represorul cI.
Cnd concentraia represorului cI este prea mare, acesta se va
cupla chiar i de OcI i i va bloca propria sintez.

Sinteza
represorului cI

Inhibarea
transcrierii de la PR
respectiv PL ce are
ca efect lizogenia

La concentraii
crescute, represorul
cI se ataeaz
la toi cei 6 operatori
adiaceni inhibndui propria sintez

MECANISME DE TRANSFER GENETIC


LA PROCARIOTE
2. Ciclul litic se desfoar prin exprimarea genei cro i N, atunci cnd:
represorul cI exist mai mult n form monomeric dect ca dimer,
cnd proteaza Rec A scindeaz monomerii.
Deci, cnd represorul cI se gsete la o concentraie sczut, nu se
mai ataeaz de operatorii multipli ai genei cro (OR3, OR2, OR1) i
permite astfel ARN polimerazei s transcrie gena cro.
Se sintetizeaz astfel, o protein antirepresor Cro, care se va cupla cu
operatorul genei cI (OcI care-i parial suprapus cu PRM). n acest fel,
va mpiedica ARN polimeraza s transcrie gena cI (deci nu se mai
sintetizeaz represorul cI).

LIZOGENIE

LIZA

MECANISME DE TRANSFER GENETIC


LA PROCARIOTE

Tot n lipsa represorului cI n form dimeric, sunt liberi i operatorii


multipli ai genei N i astfel are loc i transcrierea acesteia.
Proteina N are funcie de anti-terminator al transcrierii, n sensul c
transcrierea nu se oprete spre stnga, dup parcurgerea genei N, ci
continu cu transcrierea genelor mijlocii cIII, xis, int, att. Spre
dreapta, transcrierea nu se oprete dup parcurgerea genei cro, ci
continu cu citirea genelor mijlocii cII, O, P, Q.
Produsul genei Q este de asemenea o protein anti-terminator al
transcrierii, care permite transcrierea policistronic i a genelor S i R.
Transcrierea se oprete doar cnd se atinge punctele tL (spre stnga)
i tR1, tR2 (spre dreapta).
Consecina este desfurarea ciclului litic (degradarea ADN-ului
bacteriei gazd, morfogeneza fagic, liza bacterian, eliminarea
particulelor fagice mature).

MECANISME DE TRANSFER GENETIC


LA PROCARIOTE
Integrarea genomului fagic, ca profag n nucleoidul bacterian se
face situs specific ntre genele gal (pentru metabolizarea galactozei) i
bio (pentru sinteza biotinei).
Cromozomul bacterian posed ntre aceste dou gene, situsul attB
(attachment on bacteria) cu secven de nucleotide notat
convenional BOB.
Situsul attP (attachment on phage) din genomul fagic, are o secven
de nucleotide notat POP. Secvena O (mijlocul celor dou situsuri)
este comun i este format din 15 pb
(3...GCTTTTTTATACTAA....5).
Integrarea este controlat de gena
int, care codific o recombinaz situs
specific, dar i de proteina histone-like
IHF bacterian.
Dup integrare, genomul fagic va fi
flancat de dou situsuri recombinate: attL

MECANISME DE TRANSFER GENETIC


LA PROCARIOTE

Excizia profagului din nucleoidul bacterian (inducie fagic) este


controlat de genele xis, int i de proteina IHF i are loc cnd
represorul cI este inactivat. n momentul exciziei eronate, genomul
fagic poate prelua genele adiacente gal+ sau bio+ i le poate transfera
altor tulpini bacteriene auxotrofe, realiznd astfel recombinarea
genetic prin transducie.

Inginerie genetic la drojdii


Materialul genetic nuclear la S. cerevisiae
ncadrare sistematic:
Filum Ascomycota
Clasa Saccharomycetes
Ordinul Saccharomycetales
Familia Saccharomycetaceae
Saccharomyces cerevisiae (drojdia de bere)
S. cerevisiae cobaiul geneticii rivalizeaz cu E. coli argumente:
Are o organizare simpl
Se manipuleaz uor n laborator
Are rol important n industrie (alcool, vin ,bere, panificaie)
Surs bogat de vitamine din complexul B
Are numr relativ redus de cromozomi (16) i cantitate mic de ADN nuclear 1010
daltoni
Peretele celular poate fi uor ndeprtat enzimatic rezultnd protoplati
Lipsa de patogenitate i organizarea de tip eucariot faciliteaz exprimarea genelor
eucariote de interes medical, clonate n aceasta.

Inginerie genetic la drojdii


Materialul genetic nuclear la S. cerevisiae
Taxonomie molecular:
Drojdiile S. cerevisiae (Ascomycota) sunt forme teleomorfe (stadii perfecte, sexuate, care prezint
meioz i sporulare i deci, implicit sexualitate) ale unor fungi imperfeci (Deuteromycota) de tip
Candida, considerai ca forme anamorfe (stadii imperfecte, asexuate, care se divid doar prin
mitoz).

Ciclul de via:
Diplofaza (predominant) debuteaz cu conjugarea a dou celule haploide (n), formeaz un zigot
binucleat, care prin cariogamie, devine celul diploid (2n), apoi nmugurete i formeaz colonii
diploide. Haplofaza (mai scurt) debuteaz cu diviziunea reducional (meioz, sporulare) a unor
celulele diploide devenit asc, prin care iau natere 4 ascospori (n), difereniai sexual (2a/2).
Prin germinare i nmugurire, acetia dau natere la noi colonii haploide. Rearanjamente
cromozomale stau la baza interconversiei tipului celular al ascosporilor (a sau a).

Inginerie genetic la drojdii


Materialul genetic nuclear la S. cerevisiae

Tipuri de fertilizare:
Autofertilizare: o tulpin homotalic, monosporal (cu ascospori de un singur fel: a
sau ) sufer interconversia tipului de mperechere i se transform ntr-o cultur
mixt n care are loc apoi conjugarea ntre doi ascospori diferii: a x diploizi (2n)
Fertilizare ncruciat: conjugarea are loc ntre ascosporii diferii dintr-o tulpin
heterotalic, disporal
Cultur (n) monosporal MAT a
Faza vegetativ

Tulpini homotalice a sau


capabile de autofertilizare

Interconversie

Cultur (n) mixt MAT a, MAT


Faza vegetativ
Conjugare
Faza reproductoare
Celule 2n
MAT a / MAT
Faza vegetativ

Tulpini heterotalice a i
capabile de fertilizare ncruciat

Meioz
Faza reproductoare

Celule n (ascospori)
2a , 2
Faza vegetativ

Inginerie genetic la drojdii


Materialul genetic nuclear la S. cerevisiae
Interconversia tipului de mperechere:
Pe cromozomul III exist locusul MAT (locusul tipului de mperechere = mating
type). La ascosporii haploizi exist doar MAT a sau MAT . Formele diploide sunt
heterozigote pentru locusul MAT (MAT a / MAT ) avnd cele dou alele pe cei doi
cromozomi omologi din perechea III.
Locusul MAT este flancat de dou casete silenioase: HML (homotalic left) i
HMR (homotalic right) care poart informaie suplimentar a sau . La formele
heterotalice nu se exprim dect locusul MAT deoarece cele dou casete silenioase
sunt represate de proteine specifice codificate de gene SIR (silent information
regulator) .
Locusul MAT are 4 segmente X, Y, Z, W. Segmentul Y are 600 pb, este variabil i
codific fie pentru factorul a (alela MATa), fie pentru factorul (alela MAT ).
Segmentele X, Z, W sunt, n esen, identice.
Gena dominant HO (prezent la tulpinile homotalice) codific o endonucleaz
Ho (Y/Z) care recunoate o secven specific la jonciunea dintre segmentele Y i Z
unde realizeaz o incizie dublu catenar. Tulpinile heterotalice posed alela
recesiv ho, fapt care nu permite interconversia tipului de mperechere.

Inginerie genetic la drojdii


Materialul genetic nuclear la S. cerevisiae
Etapele interconversiei tipului de mperechere la tulpinile homotalice:

endonucleaza Ho recunoate o secven de nucleotide ntre segmentele Y i Z ale


locusului MAT (ntr-un ascospor de tip ) i produce incizii dublucatenare numai
aici, deoarece HML i HMR sunt represate de proteinele Sir.

fragmentul Y din locusul MAT va fi degradat i va fi nlocuit (sintez


reparatorie) prin copierea informaiei din segmentul Y al locusului HML sau HMR ,
cel care poart informaia corespunztoare tipului opus de mperechere (n figur
HMRa). Astfel ascosporul devine ascospor de tip a.

Inginerie genetic la drojdii


Materialul genetic nuclear la S. cerevisiae
Intervenia genelor cdc (cell division cycle) n controlul ciclului celular la S. cerevisiae
Cum decide o celul haploid (ascospor) daca se divide sau conjug ?
Interfaza are cele trei etape G1, S, G2. n G1 exist un punct critic numit START (pn la care
conjugarea este posibil), dar care odat depit, dicteaz intrarea n diviziune (mitoz), deci
e cel mai precoce eveniment controlat genetic n care celula se angajeaz n diviziune.
Gene implicate:

cdc 36, cdc39 activate naintea momentului START, controleaz procesul de conjugare i
deci, formarea diploizilor capabili de sporulare (meioz).

cdc 28 activat determin depirea punctului START i continuarea fazelor S i G2 cu


mitoza. Aceast gen codific o proteinkinaz esenial pentru desfurarea diviziunii.

La trecerea dintre G1 la S, cdc28 e activat de ciclinele N: Cln1,2,3.

La trecerea dintre S la G2, cdc28 este activat de ciclinele B: Clb1,2

cdc 2, 7, 8, 9, 17, 21, 24, 31 sunt alte gene implicate n trecerea de la G1 la S

Inginerie genetic la drojdii


Materialul genetic nuclear la S. cerevisiae

ORGANIZAREA MATERIALULUI NUCLEAR LA S. cerevisiae


1,3 x 107 daltoni
14 x 103 kpb
6500 gene
16 cromozomi ( I 245 kpb,
XII 2500 kpb)
140 gene pentru ARNr (pe cromozomul XII)
400 gene pentru ARNt
numai 4% dintre gene posed structur mozaicat, cu introni (specific eucariotelor)
cromatina posed proteine histonice
Secvenele ARS (autonomously replicating sequence):

Echivalente cu secvena ori (deci au rol n iniierea replicrii);


400 secvene ARS care se succed la 35pb i formeaz clustere (20-80 secv. ARS) numite
uniti replicative.

Secvenele CEN (secvene centromerice): au 130pb; au rol n structura centromerului


i a kinetocorului; situate pe cromozomii III, IV, XI.
Secvenele TEL scurte, repetate n tandem, plasate la captul cromozomilor, cu rol de
a proteja telomerele; C(1-3) A sau G(1-3) T.

Inginerie genetic la drojdii


Materialul genetic nuclear la S. cerevisiae
Plasmida 2m

O molecul de ADN dcCCC; 6,3 kpb;


4,2 Mdaltoni; 60-100 copii/celul;
Localizare nuclear !!!!
Structur nucleosomal (deci
asemntoare fibrei de cromatin:
ADN+histone);
Posed dou secvene invers repetate
IR de 599pb care mpart plasmida n
dou regiuni cu secvene unice
(2774pb respectiv 2346pb). n funcie
de orientarea relativ a acestor regiuni
unice, exist dou forme echivalente
de plasmid 2m : A i B. Este
posibil trecerea (fliping) de la A B
precum i existena formelor
multimerice de 4 m sau de 6m.
Nu se inser niciodat n ADN
cromozomal

Inginerie genetic la drojdii


Materialul genetic nuclear la S. cerevisiae
Plasmida 2m
Posed 4 gene:
FLP (fliping) situat n regiunea unic mare,
codific o protein de recombinare AB;

REP1 situat n regiunea unic mic i REP2


situat n regiunea unic mare, au rol n
replicare, stabilitate, partiie dar i n
exprimarea genelor plasmidiale;

RAF1 situat n regiunea unic mic, regleaz


exprimarea genic;
Secvena ARS (originea replicrii plasmidiale),
situat ntre IR1 i regiunea unic mic;
Secvena FRT plasat n regiunile IR1 i 2,
reprezint situsuri de recunoatere pentru
recombinaza FLP;
Secvena STB reprezint situs pentru produii
genelor REP1 i 2

Inginerie genetic la drojdii


Materialul genetic extranuclear la S. cerevisiae
Mitocondria
Este un organit specializat n respiraia celular i fosforilarea oxidativ;

Are un sistem genetic propriu i mecanisme proprii de sintez proteic;

Biogeneza mitocondriei este rezultatul interaciunii a dou genomuri nuclear (95% din
enzimele necesare replicrii i transcrierii ADNmt) i mitocondrial.
ADN mt (mitocondrial):

Este o molecul de ADNdc CCC (75kpb, 50Mda) necomplexat cu histone, ci cu proteine histone
like;

Posed un procent mare de perechi AT(80%) i un procent redus de GC (12-20%) cu tendina de


a suferi deleii;

Are multe gene mozaicate, ceea ce presupune prelucrarea posttranscripional cu ajutorul unei
maturaze care ndeprteaz intronii;

Sinteza proteic proprie este inhibat de cloramfenicol i eritromicin i este insensibil la


cicloheximidin (inhibitor specific al proteosintezei la eukariote);

Codul genetic mitocondrial prezint o serie de diferene fa de cel nuclear:

CODON

Cod genetic universal

Cod genetic mitocondrial

UGA

Stop

Trp

AUA

Ile

Met

CUA

Leu

Thr

Inginerie genetic la drojdii


Materialul genetic extranuclear la S. cerevisiae
GENOMUL MITOCONDRIAL cuprinde:

Gene pentru 24 specii moleculare de ARNt grupate ntr-un cluster;

Gene pentru dou specii moleculare de ARNr de 15S (din subunitatea mic a
mitoribozomilor) i de 21S (ARNr de 5S lipsete din ribozomii mitocondriei);

Gena var1 codific proteina principal ce leag ARNr n mitoribozomi;

Gena pentru ARN de 9S care, complexat de o protein formeaz o ribozim implicat n


maturarea ARNt

Genele CO I, CO II, CO III pentru subunitile citocrom-oxidazei;

Gena pentru apoproteina citocromului b;

Genele pentru subunitile 6, 8, 9, ale ATP-azei mitocondriale;

ORF I-III cu funcie nc necunoscut;

1-4 origini de replicare;

13 puncte de iniiere a transcrierii


n ADN spacer
Toate aceste gene sunt plasate pe o singur caten a ADN mt.
Pe cealalt caten se afl o singur gen (pentru ARNt pentru Thr).

Inginerie genetic la drojdii


Materialul genetic extranuclear la S. cerevisiae

Genomul mitocondrial se poate mpri n 4


fragmente:

Un fragment bogat n AT (5%GC) 50%


din ADNmt, care este spaiator (spacer);

Un fragment cu 22-65% GC 50% din


ADNmt, care conine genele;

Dou fragmente scurte foarte bogate n GC


(2-3% din ADNmt) care reprezint situsuri
pentru endonucleazele de restricie.

Inginerie genetic la drojdii


Materialul genetic extranuclear la S. cerevisiae
Tehnologii performante care stau la baza studierii ADN cromozomal i a ADNmt la drojdii:

HPLC (High performance liquid chromatography) prin care se hidrolizeaz ADN in


nucleotide i se determin direct %GC;

Tehnica densitii de plutire (buoyant density) prin care s-a dovedit c densitatea ADNdc
crete liniar cu %GC datorit celor 3 puni de hidrogen, care fac moleculele mai compacte,
mai dense;

Temperatura de topire Tm (melting midpoint) este temperatura la care jumtate din ADN este
dublucatenar, jumtate este monocatenar (denaturat), va fi cu att mai mare cu ct %GC este
mai mare:
%GC = 2,08 x Tm 106,4 (Owen, 1985)

RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphisms) polimorfismul lungimii fragmentelor


rezultate prin aciunea simultan a mai multor enzime de restricie (pn la 40);

OFAGE (Ortogonal Field Alternation Gel Electrophoresis) const n dou perechi de


elctrozi aezate astfel nct produc cmpuri electrice n diagonal, iar moleculele de ADN
migreaz pe o traiectorie curb deprtndu-se de centru.

Inginerie genetic la drojdii


Materialul genetic extranuclear la S. cerevisiae

FIGE (Field Inversion Gel Electrophoresis) se schimb cu 180 polaritatea cmpului la


fiecare ciclu, lsnd un timp dublu pentru direcia spre anod. Astfel s-au obinut pentru S.
cerevisiae 13 benzi deoarece cromozomii cu dimensiuni apropiate comigreaz (XIII cu XVI,
VII i XV, V i VIII). Mrimea cromozomului XII difer (2-3Mda) n funcie de numrul
copiilor pentru ARNr (100-200).
CHEF (Contur Clamped Homogeneous Electric Fields) folosete o arie hexagonal n care
sunt plasai multi electrozi mici n serie astfel nct cmpurile se ntretaie n unghiuri de 120
RGE (Rotating Gel Electrophoresis) se rotete gelul cu 90 la fiecare ciclu.
TAFE (Transverse Alternating Field Electrophoresis )

Inginerie genetic la drojdii


Materialul genetic extranuclear la S. cerevisiae
Mutantele petite
Descrise pentru prima dat n 1949 de Efhrussi i colaboratorii;
Apar datorit unor modificri ale ADNmt care afecteaz capacitatea de respiraie i de
multiplicare, astfel c n laborator, pe medii de cultur, dau colonii mici (petite) deoarece ele se
multiplic att timp ct n mediu exist glucoz i produc ATP doar prin glicoliz anaerob;
Sunt incapabile s respire sau nivelul respiraiei este foarte sczut datorit afectrii ADNmt i
implicit a structurii i fiziologiei mitocondriei:

Mitocondrii mai mici, sferice sau filamentoase;


Numrul lor scade i pierd cristele mitocondriale;
Au o distribuie neregulat (tind s formeze agregate).

Pot fi evideniate prin colorare cu sruri de tetrazoliu (coloniile normale apar roii, cele petite
apar incolore)
Sunt mutaii ireversibile i segreg n F1, de regul, ntr-un raport nemendelian sau mendelian
(cnd exist gene nucleare: P, p1, p2 care controleaz fenotipul petite);
Apar i spontan cu o frecven de 1-2 %, dar pot fi induse experimental cu o frecven mult
mai mare;
Genomul mitocondrial a fost notat cu astfel c tulpinile slbatice sunt + . Prin deleie
complet apar mutantele neutre 0 . Prin deleii pariale (20-90% din ADNmt), urmate de
duplicaii, apar mutante supresive - . Cu ct segmentul conservat din + este mai mic, cu att
numrul de copii /celul este mai mare.

Inginerie genetic la drojdii


Materialul genetic extranuclear la S. cerevisiae

Conjugarea ascosporilor haploizi :


a + x 0 diploizi a+ 0
2a+ + 2 +
meioz
deci ntre + i 0 este preferat fenotipul + (deci tipul slbatic) !
2a- + 2 a + x - diploizi a+ meioz
deci ntre + i - este preferat fenotipul - (deci mutantele supresive) !
Explicaia ar consta fie n replicarea preferenial a moleculelor ADN mt -, fie n
recombinarea genetic cu distrugerea moleculelor ADN mt +.

Inginerie genetic la drojdii


Materialul genetic extranuclear la S. cerevisiae
Caracterul killer (K) a fost studiat de Bevan i Somers (1963)

Este determinat de prezena n citoplasm a uneia sau mai multor specii moleculare de
virusuri ARNdc care codific o toxin ce omoar celulele sensibile, dar care nu are nici un
efect asupra celulei care o produce (deoarece manifest imunitate, rezisten la propria
toxin) (K+R+). Exist tulpini K1, K2, K3 i pot avea imunitate ncruciat. Tulpinile
K2+R2+ sunt mai competitive n fermentaia mustului de struguri nesteril pentru c sunt
rezistente la sulfii i sunt o garanie pentru evitarea contaminrii (inconvenientul const n
instabilitatea lor la 37C i transformarea lor n tulpini neutre sau chiar sensibile.
Exist celule de drojdie:

sensibile (S) care nu posed ARN viral, deci nu produc toxin i sunt omorte de tulpinile
killer (K-R-)

killer sensibile (K-S) care produc un tip de toxin la care sunt imune, dar n acelai timp
sunt sensibile la alte toxine killer

killer-termosensibile care omoar celulele S numai la temperaturi mai mici de 30C

super-killer care au un efect letal foarte puternic (K+++)

neutre (N) care nu produc toxin (nu omoar celulele S) dar sunt rezistente la toxin (K-R+)

autokiller care prezint o mutaie a genei rex1 ce determin autodistrugerea, cnd sunt
cultivate n anumite condiii.

Inginerie genetic la drojdii


Materialul genetic extranuclear la S. cerevisiae
Genetica fenotipului killer:

n citoplasma drojdiilor de S. cerevisiae killer s-au descoperit 2


tipuri de particule virus-like:
VSc-L

sunt particule helper

codific proteinele capsidelor (identice pentru cele dou particule


virus-like L i M): o protein major - 75kda i 2 proteine minore
53 kda i 37kda

codific polimerazele necesare replicrii ambelor genomuri

4,5kpb; 2,1-3,4 Mda; 100 copii/celul

La tulpina K7 de S. cerevisiae, particula L mutant a devenit


dependent de o mutant nuclear mak10
VSc-M

sunt particule defective

codific toxina i factorul de imunitate

necesit prezena particulei L dar i a unor produi sintetizai n


celula drojdiei purttoare

1,8kpb; 1-1,2 Mda; 10-12 copii/celul

dependente de 29 gene nucleare care i confer stabilitate

Inginerie genetic la drojdii


Materialul genetic extranuclear la S. cerevisiae

Producerea toxinei killer:


Se sintetizeaz un precursor care posed 3 subuniti: i (care vor forma toxina
propriu-zis) i (care va forma factorul de imunitate)
Secvena leading are afinitate pentru membrana reticulului endoplasmatic unde are
loc prelucrarea post-translaional (glicozilare). Toxina are 43kda i cele dou
subuniti i sunt legate prin puni disulfidice -S-S-)
Proteinaze specifice ndeprteaz secvena leading i factorul de imunitate care va
rmne legat de receptori specifici din membrana celulei killer.
Mod de aciune:
Toxina se leag de receptori din peretele celular (1,6- D-glucan) fr consum de
energie, apoi de un receptor membranar
Subunitatea

este transferat n interiorul celulei sensibile ,


genereaz pori n membrana plasmatic,
i modific permeabilitatea, crete efluxul de ioni de K i de ATP din celul,
scade pH intracelular,
perturb metabolismul i celula sensibil moare.