ENZIME

Enzimele n procese metabolice

Enzime
1. Istoric

2. Definiie
3. Caracteristici ale catalizei enzimatice

4. Mecanisme de aciune cinetica reaciilor enzimatice

5. Structur
6. Specificitate
7. Localizare intracelular
2

ENZIME - Istoric
Sunt cunoscute de secole

Procese enzimatice Procese de fermentaie

ACRIREA LAPTELUI
FERMENTAREA MUSTULUI
OETIREA VINULUI
FABRICAREA BERII

1640 Medicul olandez VON HELMONTZ introduce termenul de

FERMENTAIE
Apare termenul de FERMENI
lb. latin fervere = a fierbe, a fermenta (bule de gaze care se
degaj)
3

 1783 SPALLANZANI pune n eviden aciunea sucului gastric (la

psri) n procesele digestive
NU EXPLIC ; NU D DENUMIRI
1814 KIRCHOFF descoper AMILAZA din mal- descrie aciunea ei
1836 - SCHWANN descrie PEPSINA

BERZELIUS; LIEBIG CHIMITI CARE SEMNALEAZ IMPORTANA

CATALIZEI N PROCESELE BIOLOGICE
1833 1836:

Apare termenul DIASTAZE pentru c se studia

DEGRADAREA DIASTAZIC A AMIDONULUI N MALTOZ; prima

diasataz era amilaza
1878 PROF. KHNE la Univ. Heidelberg a INTRODUS TERMENUL
DE ENZIME
lb. greac: EN= n
ZYMOS= drojdie
4

Descoperirile se in lan dup aceast dat:

PTIALINA din saliv
PEPSINA din sucul gastric
EMULSINA LIEBIG I WHLER
LIPAZA CLAUDE BERNARD (Paris)
APARE TERMENUL DE CATALIZ
lb. greac: a descompune ; a strica (erau referiri la faptul c HCl
descompune amidonul)

1878 TRAUBE presupune c enzimele au structur proteic (dar nu este

nimic sigur)
1920 WILLSTTTER a reuit s purifice unele enzime utiliznd metode de
adsorbie dar, NU LE STABILETE STRUCTURA CHIMIC

1929 ENCICLOPEDIA BRITANIC: enzimele par a fi proteine dar acest

lucru nu este sigur
NATURA CHIMIC A ENZIMELOR A RMAS MULT TIMP OBSCUR
5

 1926 A fost izolat prima enzim n stare pur, cristalizat UREAZA

de JAMES SUMNER- biochimist american- Premiul Nobel (1946)

1926-1930: Cercettorii americani au lmurit natura proteic

James Sumner
(1887 1955)

a enzimelor

1929-1930: KUNITZ cristalizeaz PEPSINA

1936 NORTHROP cristalizeaz TRIPSINA, CHIMOTRIPSINA

1946 Cercetrile iau mare amploare

1960-1964: STEIN i MOORE public studii ample i foarte serioase

privind structura enzimelor

= ENZIMOLOGIA =
6

1956 americanii Ochoa i Kornberg: enzimele care asigur biosinteza ARN

i ADN (ARN- i ADN- polimeraza)
1958 jonciunea ntre genetic i studiul enzimelor, Beadle i Tatum
demonstreaz c fiecare enzim este codificat la nivelul ADN de o gen,
dup principiul o gen, o enzim;
1965 Monod i Jacob: biosinteza enzimelor este reglat la nivelul
transcrierii genelor (premiul Nobel)
1970 - Temin i Baltimore: revers transcriptaza - o enzim viral capabil s
catalizeze biosinteza ADN din ARN
1982 enzima -amilaza este produs prin inginerie genetic

1989 Altman i Cech: descoperirea proprietilor catalitice ale

acidului ribonucleic (ARN) Premiul Nobel
n comunicatul de pres al Academiei Regale Suedeze de tiin din 1989 se
meniona: acidul ribonucleic, ARN-ul din celulele vii nu este numai o
molecul a ereditii, ci poate s funcioneze ca un biocatalizator. Aceast
descoperire a fost o surpriz total pentru oamenii de tiin i se refer la

aspecte de baz ale fundamentelor moleculare ale vieii. Multe capitole

din manualele noastre ar trebui astfel s fie rescrise.

2005 Greider i Blackburn (SUA): telomeraza - enzim cu rol n conservarea

lungimii cromozomilor n cursul replicrii ADN, la eucariote.
Implicaii n cancer i n mbatrnire.
mpreun cu J. Szostak: laureai a Premiului Nobel pentru Medicin n anul 2009

Elizabeth Blackburn (n. 1948)

9

Enzime
1. Istoric

2. Definiie
3. Caracteristici ale catalizei enzimatice

4. Mecanisme de aciune cinetica reaciilor enzimatice

5. Structur
6. Specificitate
7. Localizare intracelular
10

Enzime. Definiie

catalizatori biochimici propriu-zii = biocatalizatori

biocompui de natur organic
proteine nalt specializate
biomolecule caracterizate prin - eficien
- specificitate
- putere catalitic deosebit
- capacitate de reglare mult superioar
catalizatorilor, utilizai in vitro, n chimia anorganic i organic

acioneaz n condiii blnde de reacie (condiii fiziologice,

compatibile cu viaa celulei umane):
pH neutru (~7);
temperatura organismului uman (~36C);
presiune atmosferic normal.

11

CARACTERISTICILE CATALIZEI ENZIMATICE

I. Caracteristicile aproximativ comune catalizei chimice
Mresc viteza de reacie fr s se consume;

Cantiti mici de enzime sunt capabile s transforme cantiti

mari de substrat = vitez de reacie foarte mare => eficien
extraordinar;
Dup terminarea unei reacii pot cataliza transformarea altei
molecule de substrat;
Enzimele catalizeaz numai reaciile care sunt termodinamic
posibile (G < 0). Nu modific starea de echilibru, ci viteza cu
care se ajunge la echilibru;

Catalizeaz n general reacii reversibile.

12

II. Caracteristicile specifice catalizei enzimatice, sunt determinate de

condiiile deosebite existente n organismele vii:

- Structura proteic a enzimelor:

CONDIII BLNDE DE REACIE (pH, temperatur, presiune)

- Natura biocompuilor transformai

Substane cu inerie chimic mare

13

Particularitile catalizei enzimatice:

Cataliz microeterogen (i omogen i eterogen): enzimele sunt

compui macromoleculari fixai pe formaiuni subcelulare;
Grad (foarte) mare de specificitate = > menine ordinea n celule
Procesele enzimatice sunt procese autoreglate (enzimele catalizeaz
n general reacii care se petrec n lan)

mbtrnirea enzimelor = proces determinat de natura lor proteic

(n organismele vii au loc permanent procese de degradare i de sintez
proteic = turnover)

14

MECANISMUL CATALIZEI ENZIMATICE

EXPLICAIA EFICACITII ACIUNII ENZIMELOR
Enzimele mresc viteza reaciilor chimice !
Eficacitatea catalizatorilor, n general i deci i a enzimelor poate fi
explicat aplicnd LEGEA LUI ARRHENIUS:
dlnk
dT

Ea
RT2

n care:

k=constanta de vitez
Ea=energia de activare
T=temperatura (grade Kelvin)
R=constanta gazelor

Accelerarea vitezei unei reacii cu enzime n raport cu viteza unei

reacii fr catalizator poate fi chiar de 106 1017 ori !

=> VITEZA DE REACIE DEVINE ASTFEL APROPIAT DE LIMITA TEORETIC
15

=> Ca i n cazul unor reacii spontane din chimia general

accelerarea vitezei unei reacii chimice are loc prin mai multe modaliti:
1.) Prin creterea numrului de molecule bogate n energie care s realizeze
ciocnirile eficace dintre molecule, printr-un exces de energie necesar
activrii moleculelor (energie solar, descrcri electrice, creterea
temperaturii, etc) DAR, acestea sunt condiii improprii organismului viu!!

2.) Prin scderea energiei de activare - n organismul viu

Enzimele scad energia de activare prin formarea unui complex intermediar activat
enzim-substrat (ES) nalt energetic, cu reactivitate mare.

Deci, pentru realizarea actului catalitic, enzima E trebuie s se fixeze pe

substratul specific S pentru a forma
COMPLEXUL ENZIM-SUBSTRAT (ES)
16

FORMAREA COMPLEXULUI ACTIVAT ENZIM - SUBSTRAT (ES)

O reacie enzimatic parcurge mai multe stadii:
E+S

ES

ET

E+P

COMPLEXUL ACTIVAT (ES) rezult prin formarea unor combinaii

specific reactive ntre gruprile catalitice i substrat

Centrul activ al enzimei (galben) are o conformaie

molecular adaptat la substrat (rou)

17

Exemplul clasic:
Reacia catalizat de CATALAZ
H2O2 + H2O2 2 H2O + O2

G < 0

Descompunerea H2O2 LA CLDUR: ENERGIA DE ACTIVARE = 18 kcal (76 kJ/mol)

Descompunerea H2O2 CU CATALIZATOR MINERAL (Pt):
ENERGIA DE ACTIVARE = 8 kcal (49 kJ/mol)

Descompunerea H2O2 CU ENZIMA CATALAZA:

ENERGIA DE ACTIVARE = 2,3 kcal (8 kJ/mol)
Aplicnd legea i ecuaia lui Arrhenius s-au calculat constantele de vitez pentru:
Recia catalizat de PLATIN
Reacia catalizat de CATALAZ
S-A DEMONSTRAT C :

k catalaz
k platin

= 106

Deci, la 37OC CATALAZA DESCOMPUNE PEROXIDUL DE HIDROGEN DE CIRCA UN

MILION DE ORI MAI REPEDE DECT PLATINA
18

(1)

Stare iniial

CATALAZA
(2)

Stare final

H2O2 + H2O2

2 H2O + O2

G < 0

Scderea energiei de activare n reacia de descompunere a peroxidului

de hidrogen la cldur (1) n prezena platinei (2) i a enzimei catalaza

19

MECANISME CARE INTERVIN I POT EXPLICA FORMAREA

COMPLEXULUI ACTIVAT ENZIM - SUBSTRAT (ES)
=> Efect de PROXIMITATE
(POZIIONARE, APROPIERE, VECINTATE) dintre
centrul activ al enzimei i moleculele care urmeaz a fi
transformate.

=> EFECT DE AEZARE CONFORMAIONAL FAVORABIL

=> EFECT DE CATALIZ COVALENT

Exemplu: formarea unei baze Schiff ntre substrat i unele grupri

funcionale din centrul activ al enzimei.
EFECT DE CATALIZ ACID-BAZ

20

ENZIMELE INDUC ARANJAREA SUBSTRATULUI NTR-O POZIIE RELATIV

FAVORABIL LA GRUPRILE CATALITICE NLESNINDU-LE INTERACIUNILE
(EFECT DE APROPIERE)

Interaciile dintre centrul activ i substrat au loc prin intermediul acelorai

legturi care stabilizeaz i structura proteic, i anume:
interacii hidrofobe, electrostatice, de hidrogen, sau de tip van der Waals.
21

Formarea complexului enzim-substrat (ES) activat, starea de

tranziie (T*) i formarea produsului de reacie (P)
22

CENTRII ACTIVI AI ENZIMELOR

Centrul activ al enzimei sau centrul catalitic al enzimei reprezint o
parte special structurat a enzimei care fixeaz substratul asupra
cruia acioneaz.

Reprezint regiuni bine determinate de pe suprafaa enzimei.

23

STRUCTURA ENZIMELOR
Cu foarte rare excepii enzimele sunt proteine sau heteroproteine
Excepiile, descoperite n ultimii 20 de ani structur de acizi

ribonucleici de tip catalitic = ribozime

Exemple: Ribonucleaza P este un complex protein ARN
EXIST DOU MARI CATEGORII DE ENZIME DIN PUNCT DE VEDERE STRUCTURAL:
I. CU STRUCTUR UNITAR: - PROTEINE SIMPLE - CONSTITUITE NUMAI DIN
AMINOACIZI

II. CU STRUCTUR BINAR: - HETEROPROTEINE PROTEINE CONJUGATE:

PROTEIN + COFACTOR (PARTE NEPROTEIC)
24

I.

ENZIMELE CU STRUCTUR UNITAR - PROTEINE SIMPLE

Exemple:
RIBONUCLEAZA (124 RESTURI DE AA) ARE 12.700 DALTONI

TRIPSINA (24.000 DALTONI)

PEPSINA (33.000 DALTONI)

1 DALTON = 1,661 x 10-24 grame

MURAMIDAZA (LIZOZIM) 129 AA

Activitatea acestor enzime depinde numai de structura proteinelor

25

I. ENZIMELE CU STRUCTUR UNITAR

Centrul activ este reprezentat de un numr mic de aminoacizi.
Exemplu: la chimotripsin centrul activ este format din HISTIDIN i SERIN

OBSERVAIE! Aminoacizii din centrul catalitic al enzimei:

Pot fi la distan din punct de vedere al structurii primare

Dar spaial apropiai din punct de vedere al structurii tridimensionale

Ribonucleaza: centrul activ His + Ser

Colinesteraza: centrul activ Ser
Hexokinaza: centrul activ- gruprile SH ale cisteinei

26

Centrul activ al
chimotripsinei
His + Ser

Centrul catalitic al anhidrazei

carbonice
Zn2+ + 3 molecule de His + H2O
27

II. ENZIMELE CU STRUCTUR BINAR: HETEROPROTEINE PROTEINE

CONJUGATE:

PROTEIN + COFACTOR (PARTE NEPROTEIC)

Structura binar este indispensabil manifestrii aciunii catalitice
- COMPONENTA PROTEIC SE NUMETE APOENZIM
- COFACTORUL poate fi:
COENZIM (legtura dintre apoenzim i componenta neproteic este
labil, se poate separa prin dializ sau prin alte mijloace de partea

proteic)
GRUPARE PROSTETIC (cofactorul se fixeaz pe apoenzim prin
legturi covalente i nu pot fi separate prin dializ)
28

COFACTORII, din punct de vedere chimic pot fi:

VITAMINE
HORMONI
METALE
Coenzimele i gruprile prostetice au structuri chimice, funcii i
mecanisme de aciune diferite.
Unii cofactori sunt considerai cosubstrate
DE EXEMPLU: REACIILE REDOX

ROLUL COMPONENTEI PROTEICE:

Confer specificitatea de substrat

Dirijeaz i specificitatea de aciune

ROLUL COFACTORULUI:

Particip la realizarea funciei catalitice

Confer specifictatea de reacie (de aciune)

29

Reprezentarea schematic a structurii enzimelor i a centrilor activi:

(a) protein-enzima, cu structur unitar;
(b) heteroproteina, cu structur binar (apoenzima + cofactor)
30

STRUCTURA ENZIMELOR

STRUCTURA APOENZIMEI
STRUCTURA PRIMAR
Se refer la scheletul covalent al lanului polipeptidic i la secvena de
aminoacizi componeni.
Se specific:
numrul de aminoacizi
felul aminoacizilor
succesiunea lor n lan

tipurile de legturi
locul punilor disulfurice (-S-S-)

Structura primar a enzimei

Ribonucleaza A din pancreasul bovin
31

STRUCTURA SECUNDAR

Desemneaz aranjamentul obinuit ntr-o singur dimensiune n spaiu,

prin dispunerea elicoidal a catenei polipeptidice.
Conformaia unic, n zig-zag, este determinat de starea

de hibridizare a atomilor participani la structura lanului

Exist dou tipuri de lanuri:
- -helix
- -helix (tip foaie pliat).

Structur secundar de tip -helix (a) i -helix (tip foaie pliat) (b)
32

STRUCTURA TERIAR
Desemneaz asamblarea n spaiul tridimensional (organizarea spaial)

a lanurilor polipeptidice cu structur primar i secundar bine definite

Determin tipurile de legturi noncovalente stabilite ntre radicalii
aminoacizilor care pot stabiliza conformaia respectiv
Exist dou tipuri diferite de structuri teriare :
1) globular (ghem), Ex: albumina, ribonucleaza, lizozimul

2) fibrilar (fibre), Ex: colagenul

Caracteristicile structurii teriare:
Imprim enzimelor diferite proprieti biologice.

Este stabilizat prin:

- interaciuni electrostatice;
- legturi de hidrogen;
- interaciuni de tip hidrofob;
- puni disulfurice;
- interaciuni ntre radicalii polari ai aminoacizilor.

33

Structura schematic tridimensional a Ribonucleazei A:

(a) tip panglic sau ribbon- ilustreaz structurile de tip - i -helix ale
lanurilor polipeptidice, (b) tip bilue sau space filling ilustreaz atomii
din componena lanurilor polipeptidice

34

STRUCTURA CUATERNAR

Specific protein-enzimelor oligomere, poate rezulta din:

- asocierea unor lanuri polipeptidice cu structur teriar;

- asocierea unor protomeri (dimeri, trimeri, tetrameri, etc)

Protomerii se leag ntre ei prin legturi de tip noncovalent, realizate prin

puncte sau suprafee complementare.

Caracteristic enzimelor de tip allosteric, cu funcii nalt specifice.

Activitatea catalitic a enzimelor depinde de integritatea conformaiei

proteinei native.

Prin denaturare sau disociere n subunitile componente, activitatea sa

catalitic se pierde (de obicei).

35

Integritatea structurii primare, secundare, teriare i cuaternare sunt

eseniale pentru activitatea catalitic a enzimelor !

Niveluri de organizare n structura apoenzimei

36

SPECIFICITATEA ENZIMATIC
1. SPECIFICITATEA DE REACIE = capacitatea enzimei de a cataliza un
anumit tip de reacie (sau reacie nrudit) posibil din punct de vedere
termodinamic.
Exemple:
oxidoreductaze
transferaze
- Determinat n special de structura chimic a cofactorului (coenzimei sau a
gruprii prostetice)

Excepii:
Enzimele dependente de piridoxal-fosfat (PLP) sunt enzime care au n
structura lor vitamina B6 activat, pot cataliza reacii de:
decarboxilare
transaminare
izomerizare
- Mecanismele sunt diferite !

37

2. SPECIFICITATEA DE SUBSTRAT = proprietatea enzimei de a aciona

asupra unei anumite substane sau asupra unui grup de substane
cu unele caracteristici chimice comune.

Determinat de natura apoenzimei (partea proteic a enzimelor).

Asigur

ordinea

desfurrii

reaciilor

chimice

celul,

mpiedicnd formarea i degradarea haotic a diferiilor constitueni.

Gradul de specificitate variaz de la o enzim la alta.

Specificitatea de substrat poate fi

explicat sugestiv cu ajutorul
modelului lact-cheie
(lock and key model): numai un
substrat potrivit, cu o structur
complementar centrului activ al
enzimei va putea fi convertit n
produi de reacie.
38

A. Specificitatea absolut de substrat

Exemple: ureaza, fumaraza, arginaza
- acioneaz asupra unui singur substrat cataliznd un singur tip de
reacie chimic.

39

Specificitatea stereochimic
Configuraia spaial a moleculelor substratului.
Specificitatea optic
Specificitatea geometric

tipuri de specificitate
absolut de substrat

Asimetria structural
este o caracteristic
generala a sistemelor
biologice !

Capacitatea de a recunoate specific substraturi care conin centri

asimetrici.
Acioneaz numai asupra unuia dintre izomerii optici
Exemple: - L aminoacid oxidaza, D aminoacid oxidaza, maltaza
- fumaraza, enzim ce catalizeaz reacia de hidratare numai pentru
izomerul trans, acidul fumaric
- lactat dehidrogenaza (LDH) acid L-lactic
OBSERVAIE: Existena specificitii se poate corela cu necesitile metabolice ale
celulei.
40

B. Specificitatea relativ de substrat

Catalizeaz acelai tip de reacie dar pot aciona asupra mai multor substrate cu
structuri chimice comune.
Exemple:

Peptidazele hidrolizeaz legturile peptidice.

Specificitatea peptidazelor se manifest fa de anumite legturi peptidice la care

particip aminoacizi determinai:
Exemplu: Pepsina hidrolizeaz numai legturile peptidice realizate
ntre un aminoacid dicarboxilic i un aminoacid cu structur aromatic.

Fenoloxidazele - catalizeaz reaciile de oxidare a diferiilor fenoli.

Glucozidazele - hidrolizeaz legturile glucozidice dintre un glucid (specificitate

mare) i un alt compus (agliconul).

41

LOCALIZAREA ENZIMELOR N ORGANE I ESUTURI

- Repartizarea poate fi neuniform.
- Se cunosc enzime prezente n cvasi-totalitatea esuturilor animale.

Exemple:
enzimele din lanului respirator
enzimele din ciclul Krebs
fosfatazele
Alte enzime nu sunt elaborate dect de ctre anumite celule ale unor organe.
Exemplu:
pepsina

Un caz interesant: existena mai multor izoforme enzimatice sau izoenzimen organe diferite, n cadrul aceluiai organism.
Exemplu:
La om exist izoenzime ale lactat dehidrogenazei (LDH) n funcie de organ
42
(esut muscular, hepatic).

Exemplu: LOCALIZAREA ENZIMELOR la nivelul SISTEMULUI DIGESTIV

Glande salivare
-amilaza

Pancreas exocrin
-amilaza
Chimotripsina
Tripsina
Lipaza

Glande fundice ale

stomacului
Pepsina
Intestin subire
Zaharaza
Maltaza
Lactaza

43

LOCALIZAREA INTRACELULAR
A ENZIMELOR

Tehnici moderne de fracionare a

omogenatului celular prin

ultracentrifugare diferenial =>
Repartizarea enzimelor pe diferite
formaiuni subcelulare;
Orientarea reaciilor enzimatice n

funcie de nevoile celulei => reglarea

metabolismului celular

44

Diferitele organite subcelulare conin enzime marker specifice

Nucleul
Enzimele necesare biosintezei acizilor nucleici
Exemplu: ADN polimeraza
Mitocondriile
Sediul respiraiei celulare i a fosforilrii oxidative, deci
conin enzimele necesare acestui proces
Reticulul endoplasmic rugos (RER)
Asociat cu ribozomii, conine o mare varietate de enzime
care asigur att sinteza de proteine i polizaharide
(glicoproteine)
Reticulul endoplasmic neted (REN)
Enzimele necesare oxidrii i detoxifierii compuilor
xenobiotici (medicamente, pesticide)
Lizozomii
Sunt bogai n enzime hidrolitice, de degradare
45

FACTORII CARE INFLUENEAZ VITEZA UNEI REACII

ENZIMATICE

1. Temperatura mediului de reacie

2. pH-ul mediului de reacie
3. Concentraia enzimei
4. Concentraia substratului
5. Efectorii enzimatici - activatori
- inhibitori

1. TEMPERATURA MEDIULUI DE REACIE

Temperatura mediului de reacie

efector fizic

Temperatura poate modifica:

stabilitatea enzimei;
afinitatea enzimei pentru substrat;
viteza de scindare a complexului enzim-substrat [ES];
afinitatea enzimei pentru diferii activatori i inhibitori: temperatura
influeneaz pozitiv viteza de reacie pn la atingerea unei temperaturi
optime, dup care viteza de reacie scade rapid.

Temperatura optim = temperatura

corespunztoare vitezei maxime de
aciune a enzimei
(aproximativ 40- 50C)

2. INFLUENA pH-ului MEDIULUI DE REACIE ASUPRA ACTIVITII

ENZIMELOR
pH-ul mediului de reacie = concentraia ionilor de hidrogen

pH-ul optim al unei enzime: pH-ul mediului de reacie pentru care activitatea
enzimei respective ca i viteza de reacie este maxim.

pH-ul optim poate varia n funcie de: - natura substratului,

- concentraia de substrat,
- originea enzimei,
- temperatur, presiune.
Pentru enzimele din organismul uman pH-ul optim de aciune este chiar pH-ul
normal al mediului n care ele i ndeplinesc funcia catalitic.

La majoritatea enzimelor pH-ul optim este n jurul valorii 7

Influena exercitat de pH-ul mediului se datoreaz:
ionizrii centrilor activi din molecula enzimei;
ionizrii substratului, modificndu-se astfel activitatea sa pentru centrii activi ai
enzimei

Exemplu amilaza salivar acioneaz numai la nivelul cavitii bucale deoarece este
inhibat de pH-ul acid al stomacului.

Pentru majoritatea
enzimelor, variaia vitezei de
reacie n funcie de pH are
aspectul unei curbe n form
de clopot (pH = 5,5-8).

Excepii:
pepsina, tripsina, papaina,
arginaza, colinesteraza

FACTORII CARE INFLUENEAZ VITEZA UNEI REACII ENZIMATICE

1. Temperatura mediului de reacie

2. pH-ul mediului de reacie

3. Concentraia enzimei
4. Concentraia substratului
5. Efectorii enzimatici - activatori
- inhibitori

50

INFLUENA CONCENTRAIEI ENZIMEI ASUPRA VITEZEI DE REACIE

Viteza unei reacii enzimatice depinde de concentraia enzimei din mediul de reacie.
v = k [E]

unde k constanta caracteristic pentru fiecare reacie enzimatic

v viteza de reacie
[E] concentraia de enzim

Viteza de reacie este proporional cu concentraia enzimei.

Dar, cu ct concentraia de enzim este mai mare cu att cantitatea de substrat necesar
desfurrii reaciei va fi mai mare.

51

Influena concentraiei de enzim [E] asupra vitezei de reacie:

- n condiii normale (N),
- n cazul reducerii concentraiei de substrat (B),
- n prezena activatorilor (A) sau a inhibitorilor (I) enzimatici n mediul de reacie,
- n prezena unor impuriti (C).
52
Poriunea din grafic O C = perioad de lag

FACTORII CARE INFLUENEAZ VITEZA UNEI REACII

ENZIMATICE

1. Temperatura mediului de reacie

2. pH-ul mediului de reacie
3. Concentraia enzimei
4. Concentraia substratului
5. Efectorii enzimatici - activatori
- inhibitori

53

INFLUENA CONCENTRAIEI SUBSTRATULUI ASUPRA VITEZEI

REACIILOR ENZIMATICE
Ecuaia Michaelis-Menten
Formarea complexului activat enzim - substrat (ES)

Prima teorie privitoare la dependena vitezei

unei reacii enzimatice de concentraia
substratului a fost elaborat n 1913, la Berlin,

de Leonor Michaelis i de Maud Menten.

54

Ipoteza formrii unui complex activat ntre enzim i substrat, notat ES.
E + S ES ET* EP E + P

Schematic, reacia enzimatic se desfoar astfel:

E + S

ES

E + P

unde se noteaz: [E] = concentraia total a enzimei

[S] = concentraia substratului

[ES] = concentraia complexului activat enzim-substrat

([E]-[ES]) = concentraia enzimei libere
Se consider c reacia global este ireversibil, deci c produsul de reacie nu rmne
legat de enzim.

55

E + S

ES

E + P

Fiecare din cele trei reacii se caracterizeaz printr-o vitez de reacie,

respectiv printr-o constant de vitez specific (k):

E + S

k+1

ES

k+2

E + P

k-1
Se consider prima parte a reaciei, care este reversibil:
k+1
E + S
ES
k-1

Cele dou viteze de reacie, pentru ambele sensuri, sunt

proporionale cu concentraiile reactanilor:

v+1 = k+1([E] - [ES]) [S]

v1 k 1[ES]
La echilibru, cele dou viteze de reacie sunt egale : v+1 = v-1

k+1([E] - [ES]) [S] = k-1[ES]

56

DECI, n orice moment al reaciei vitezele de formare i de scindare a complexului

ES sunt aproximativ egale, aa nct [ES] poate fi considerat constant.
Se mparte ecuaia cu factorul k+1[ES]:
Se separ constantele de vitez i rezult:

k+1([E] - [ES]) [S] = k-1[ES]

k+1[ES]

k+1[ES]

k-1
([E] - [ES]) [S]
= KM
k+1
[ES]
(1)
unde KM a fost denumit iniial constanta Michaelis, fiind de fapt
constanta de disociere a complexului enzim-substrat.

k-1
k-1
([E] - [ES]) [S]
([E] - [ES]) [S]
= KM
= KM
=
=
k+1
k+1
[ES]
[ES]

KM [ES] = ([E] - [ES]) [S]

KM [ES] = [E] [S] - [ES] [S]
KM [ES] + [ES] [S] = [E] [S]

[ES]( KM+ [S] ) = [E] [S]

[E] [S]
[ES] =
KM + [S]

(2)
57

Prelucrm a doua parte a reaciei enzimatice:

E + S

k+1

ES

k+2

E + P

k-1
k +2
[ES]
E P

[ES] =

v+2 k 2 [ES]

v+2

(3)

k+2
ntr-o reacie enzimatic se urmrete formarea produsului de reacie P, deci
viteza de reacie notat v+2 poate fi considerat ca vitez propriu-zis a reaciei
enzimatice notat v, vitez de interes practic.
v
(4)
[ES] =
k+2
Se egaleaz relaia (4) cu relaia (2):

v
[E] [S]
=
KM + [S]
k+2
Din relaia (4) rezult:
[ES] = [E]

v=

(5)

v = k+2 [ES] (7)

k+2 [E] [S]

KM + [S]

(6)

unde k+2 = constant catalitic (indic

eficacitatea enzimei)

v Vmax

Vmax = k+2 [E] (8)

v=

Vmax [S]
KM + [S]

(9)

Ecuaia MichaelisMenten

58

v=

Ecuaia Michaelis-Menten: expresia matematic ce

definete relaia cantitativ dintre viteza unei reacii
enzimatice, concentraia de substrat i valoarea
constantei lui Michaelis KM.

Vmax [S]
KM + [S]

Ecuaia permite calcularea KM, n funcie de

concentraia substratului.

v=

Vmax

Vmax

Vmax [S]
KM + [S]
saturare

2KM + [S] = 2 [S], deci KM = [S]

Influena concentraiei substratului [S] asupra cineticii reaciilor

enzimatice. Reprezentarea grafic a ecuaiei Michaelis-Menten
59

PRELUCRRI ALE ECUAIEI MICHAELIS-MENTEN

E + S

k+1

ES

k+2

E + P

k-1
Ecuaia Michaelis-Menten se baza pe o ipotez care nu corespunde realitii:
k-1 >> k+2
k+2 = constanta de vitez a reaciei de descompunere a complexului enzimsubstrat, n enzim i produi de reacie (adic n substrat transformat), este
suficient de mic pentru a nu influena mersul reaciei, care este condiionat
exclusiv de k+1 i k-1.
Deci n teoria Michaelis-Menten nu are loc transformarea substratului; se consider
k+2 ca fiind foarte mic, ceea ce nu corespunde realitii.
n mod real se micoreaz [S] i crete [P] !!
Aceast contradicie aparent a teoriei Michaelis-Menten se poate elucida dac
cinetica reaciilor enzimatice este interpretat inndu-se seama de cinetica strii
staionare.

60

TEORIA BRIGGS I HALDANE. CINETICA STRII STAIONARE (I)

G.E. Briggs i J.B.S. Haldane au analizat ecuaia general a reaciilor enzimatice
i au elaborat n anul 1925 o teorie mai cuprinztoare.
Atunci cnd enzima i substratul se gsesc
n contact, are loc o micorare rapid a
concentraiei enzimei libere, deoarece
aceasta se combin cu substratul formnd
complex [ES].
Acest stadiu al reaciei poart denumirea
de faz iniial i precede stabilirea fazei
staionare, spun Briggs i Haldane, n care
viteza de transformare a substratului este
egal cu viteza de formare a produsului
reaciei, iar concentraia complexului [ES]
rmne tot timpul constant.
Concentraia total de enzim, [E]T = [E] + [ES]
61

TEORIA BRIGGS I HALDANE. CINETICA STRII STAIONARE (II)

Briggs i Haldane admit existena

la un moment dat a unui
echilibru dinamic ntre procesul
de formare a complexului (ES)
din E + S i procesul de scindare
(descompunere) a complexului
activat ES pe de o parte n E + S,
i pe de alt parte n E + P.
Echilibrul dinamic ntre aceste
dou procese contrare duce la o
concentraie staionar a
complexului [ES].

62

ALTE PRELUCRRI ALE ECUAIEI MICHAELIS-MENTEN

Ecuaia Lineweaver-Brk
Hans Lineweaver i Dean Brk au propus n 1934 inversarea ecuaiei Michaelis-Menten

v=

K + [S]
1
= M
v
Vmax [S]

Vmax [S]
KM + [S]

(17)

Ecuaia Lineweaver-Brk:

KM . 1
1
1
+
=
v
[S]
Vmax
Vmax

(18)

Ecuaie de tipul y = ax + b:
unde:

x=

1
[S]

; y=

1
v

63

Importana practic a reprezentrii Lineweaver-Brk

Mult mai exact pentru evaluarea experimental a KM !
Se poate determina experimental viteza de reacie (1/v)
corespunztoare la cel puin trei valori cunoscute ale
concentraiei de substrat (1/[S]).
Dreapta stabilit experimental intersecteaz
axa 1/v n punctual 1/Vmax;
prin prelungirea ei, dreapta intersecteaz
axa abscisei n punctul 1/KM,
obinndu-se astfel grafic valoarea KM .

KM . 1
1
1
(18)
+
=
v
[S]
Vmax
Vmax

Atunci cnd x = 0 i y = 0,
se determin coordonatele la origine.
pentru y = ax + b, atunci cnd y = 0 1/v = 0, ecuaia (18)
devine:
KM 1
1
=
Atunci cnd x = 0, deci 1/[S] = 0, relaia (18) devine:
[S]
V
V
max

max

1
=
[S]

1
Vmax
KM
Vmax

=-

1
KM

1
v

1
Vmax
64

Semnificaia biochimic a constantei Michaelis-Menten (KM)

KM este un parametru cinetic, practic i util pentru evaluarea aciunii unei enzime;
- este o caracteristic a fiecrei enzime, independent de concentraia de enzim;
- se exprim n uniti de concentraie de substrat (moli/litru).
Valorile KM variaz :
n funcie de structura substratului ;
n funcie de pH-ul mediului de reacie ;
independent de concentraia enzimei.

E + S

k+1

ES

k+2

E + P

k-1

k -1 k 2
KM
k 1

KM este o constant ce poate fi determinat practic din datele experimentale

Pentru o reacie enzimatic simpl, KM red capacitatea de disociere a lui ES n E i S.
KM red tria legturii ntre E i S.
1/KM reprezint n prim aproximaie afinitatea enzimei pentru substratul su.
valori mici ale KM, (1/KM mare) => afinitate mare a enzimei pentru substrat (10-5 - 10-8 mol/L) ;
valori mari ale KM (1/KM mic) => afinitate mic (legturi slabe ntre E i S) (10-1 - 10-2 mol/L).
65

Valorile constantelor Michaelis-Menten pentru unele enzime

Denumirea
enzimei
Alcool
dehidrogenaza

Lactat
dehidrogenaza
izoenzima H4

Codul EC

Sursa biologic

1.1.1.1

Drojdie

1.1.1.27

Inim de bou
Bacillus subtilis

Aspartat
2.6.1.1
aminotransferaza

Inim de porc

Pepsina

Mucoasa
stomacal
porc

3.4.23.1.

Substrat
Etanol
NAD+
Acetaldehid
NADH
Lactat
NAD+
Piruvat
NADH
Lactat
NAD+
Piruvat
NADH
L-aspartat
2-oxoglutarat
Oxalacetat
L-glutamat
Acetil Lalanildiiodtirozina
Acetil L-fenilalanil-Lfenilalanin

KM (M)
1,3 x 10-2
7,4 x 10-5
7,8 x 10-4
1,0 x 10-2
1,7 x 10-2
1,0 x 10-4
1,4 x 10-4
2,4 x 10-5
3,0 x 10-2
9,0 x 10-4
8,0 x 10-4
6,5 x 10-5
3,9 x 10-3
4,3 x 10-4
8,8 x 10-5
8,9 x 10-3
7,5 x 10-5
4,3 x 10-4
66

Pentru multe enzime valoarea KM = 10-2 - 10-8 M

n cinetica enzimatic se utilizeaz i o alt constant, notat Kcat care
se definete prin raportul :
v
K cat max
[E]T - concentraia totala de enzim
[E]T
Constanta catalitic (Kcat) red numrul de transformri substrat => produs pe
care fiecare centru activ le catalizeaz intr-o unitate de timp (turnover).

Cunoscnd valorile i semnificaiile lui KM i Kcat se poate calcula raportul KM/Kcat,

raport care red eficiena catalitic a enzimei.
Enzima

Substratul

KM (M)

Kcat (S-1)

Kcat / KM

Acetil colinesteraza

Acetil colin

9,5 x 10-5

1,4 x 104

1,5 x 108

Anhidraza carbonic

CO2

1,2 x 10-2

1,0 x 106

8,3 x 107

Anhidraza carbonic

HCO3-

2,6 x 10-2

4,0 x 105

1,5 x 107

Catalaz

H2O2
Esterul etilic al
N-acetil-glicinei

2,5 x 10-2

1,0 x 107

4,0 x 108

4,4 x 10-1

5,1 x 10-2

1,2 x 10-1

Fumaraz

Fumarat

5,0 x 10-6

8,0 x 102

1,6 x 108

Ureaz

Uree

2,5 x 10-2

1,0 x 104

4,0 x 105

Chimotripsin

Medicamentele
influeneaz
viteza reaciilor
enzimatice i
eficiena
catalitic a
enzimelor
67