METODE DE DIAGNOSTIC

MOLECULAR

=studiul bazelor moleculare ale procesului de replicare,

transcriere i translaie a materialului genetic.
ADN

ARN

Proteine

 Transcripia = primul pas n expresia genic.

ADN Transcripie

ARN

Revers transcripie

Transcripia este procesul de creare a unei copii de ARN echivalent a unei

secvene de ADN.
In timpul transcrierii, o secven de ADN este citit de ARN polimeraza, care
produce o, caten complementar de ARN.

Translaia = primul pas n biosinteza proteinelor.

Tehnici de biologie molecular

Izolarea ADN sau ARN

Verificarea puritii i determinarea cantitii de ADN sau ARN
Reacia de polimerizare n lan (Polymerase chain reaction - PCR)
Electroforeza n gel de agaroz
Secvenierea
Clonarea molecular i Expresia genelor

Tehnici bazate pe hibridizarea acizilor nucleici:

Northern Blot
Southern Blot
FISH
PCR
Microarray

Extracia materialului genetic

Metoda coloanelor cu membran de siliciu

Tehnica cu particule magnetice

Sondele de acizi nucleici

Asocierea spontan a ADN-ului pe baza de complementaritate

reprezint baza pentru tehnicile folosite n detectarea i
caracterizarea genelor.
Sondele (primerii) sunt utilizate pentru a identifica gene
individuale sau secvene de ADN.
Sonda de acid nucleic reprezint un segment scurt de ADN
sau ARN de secven cunoscut utilizat pentru a identifica
prezena unei singure catene complementare de ADN n
proba de cercetat.
Legarea ntre cele dou secvene (sonda si proba de cercetat)
este cunoscut sub numele de hibridare.
Cele dou secvene trebuie s mprteasc cel puin 16-20
baze consecutive de complementaritate perfect pentru a
forma hibrid stabil.
Sondele pot fi marcate: radioizotop, fluorocrom, enzim sau
substrat chemiluminescent.
Hibridarea poate avea loc n mediu suport solid sau lichid.

FISH
(Fluorescent In-Situ Hibridization)
este o tehnic ce poate localiza
secvene de acid nucleic n
materialul celular.
Metoda
foloseste
sonde
fluorescente care se leag numai la
acele pri ale catenei fa de care
prezin un grad ridicat de
complementaritate.
Microscopul cu fluorescen este
folosit pentru a afla localizarea
sondei fluorescente.

EXEMPLU
Aplicaii ale metodei n
diagnosticul de laborator

Microarrays (tehnica cipurilor ADN)

Un cip ADN (ADN microarray) este un biosenzor care
analizeaz informaii de segmente genomice provenite
de la bacterii, virusuri, parazii, fungi.
Aceasta se bazeaz pe principiul complemetaritii
cele patru baze azotate: A (adenina), T (timin), G
(guanina) i C (citozina) n care A este pereche cu T i
G este pereche cu C prin legturi de hidrogen.
O secven de ADN cunoscut (sonda de ADN) este
plasat n plci de sticl cu microspoturi (cu diametrul
de civa microni n diametru, aranjate n mai multe
rnduri).
Segmentele de gene sunt extrase din materiale
patologice diferite (de ex snge, esuturi), apoi
amplificate i depuse n cipuri de ADN.

EXEMPLU
Aplicaii ale metodei n diagnosticul de laborator

Principiu test: Rapid, cu rezultate precise ce evideniaz

care alergeni la care este sensibil un animal.
Proba patologic: Indiferent de talia animalului de
companie i de vrst, este nevoie de doar 1-2 ml de snge
integral (sau mai mult de 0,2 ml de ser / plasma) pentru
testare.

PCR (Polymerase chain reaction)

Reacia de polimerizare n lan este o tehnic pentru copierea ADN-ului.
PCR-ul permite copierea unei singure secvene de ADN (milioane de ori).

 PCR-ul are mai multe variante:

Revers-transcription PCR (RT-PCR) pentru amplificarea ARN
PCR n timp real (qPCR) care permit msurarea cantitativ a moleculelor de
ADN sau ARN.
Multiplex PCR-ul permite amplificarea mai multor segmente de ADN ntr-un
singur experiment PCR.

ETAPELE REACIEI PCR

Principiul tehnicii
PCR clasic

Principiul tehnicii real

time PCR cu sonde
TaqMan

metoda PCR (tehnic calitativ)

EXEMPLE
Aplicaii ale metodei n
diagnosticul de laborator

Metoda real-time PCR (metod cantitativ)

Platou

Semnal fluorescent

Faz linear

Faz exponenial

Valoare prag
Referin

Numr cicluri de amplificare

TaqMan RT-PCR
pentru detecie Enterovirus

LCR
Urin
Ser
Martor pozitiv

Numr cicluri de amplificare

EXEMPLU
Aplicaii ale metodei n diagnosticul de laborator

Secvenierea ADN-ului

Metoda se bazeaz pe aciunea ADNpolimerazelor de a sintetiza o a doua caten

complementar secvenei de ADN matri:
Adugarea de di-deoxinucleotide (ddNTP,
lipsite 3'-OH necesar pentru formarea
legturii fosfodiester ntre 2 nucleotide) ntro concentraie sczut pentru a se
amesteca, termin prelungirea polimerului
ADN la puncte aleatorii.
O serie de fragmente terminate la puncte
aleatorii n secvena de ADN sunt apoi
generate i analizate dnd succesiunea ADN.

 Colorani dichlororhodamine sunt folosii pentru a marca ddNTP.Fiecare

ddNTP este marcat cu o anumit variant colorant, cu diferite lungimi de
und de emisie (de exemplu culoare diferit), rezultnd ntr-o singur reacie
generatoare fragmente aleatorii, fiecare fragment fiind marcat cu un colorant
care corespunde bazei terminal.
Aceste fragmente sunt separate folosind electroforeza n gel capilar.
Detectarea se face prin intermediul unui laser ce emite la diferite lungimi de
und corespunztoare pentru a detecta orice fluorescen.
Se genereaz o urm cromatografic a patru lungimi de und de emisie (care
corespund celor patru ddNTP marcate).

METAGENOMICA

Prin aceast metod sunt

extrai toi acizii nucleici
(ADN i ARN) din materialul
patologic.

Ion Proton

Illumina

Principalele avantaje ale metode:

Identificarea de noi patogeni,
respectiv noi gene.
Secvenierea ntregului genom.
Identificarea microbiotei aa cum
se gsete ea n natur.
Incadrarea filogenetic a
agenilor patogeni.

Prob/Material patologic

Utilizrile metagenomicii
n bacteriologie

Utilizrile metagenomicii n virusologie

EXEMPLU
Aplicaii ale metodei n diagnosticul de laborator

Analiza filogenetic
este
reprezentarea
istoriei
evolutive a unei specii sau grup
de specii nrudite;
este prezentat sub forma unui
arbore filogenetic;

EXEMPLU
Aplicaii ale metodei n diagnosticul de laborator