Studiile de Taxonomie polifazica

METODELE FENOTIPICE
Informatia fenotipica
(1) spectrul larg de trasaturi exprimate,
(2) markeri chemotaxonomici si
(3) proteine si functiile lor;

Constituie baza descrierii formale a taxonilor, de la nivel de

specie si subspecie pna la nivel de gen si familie, asa cum
este prevazuta in Bergeys Manual of Determinative
Bacteriology.
tabele de identificare / chei de determinare

Identificarea microorganismelor prin metode fenotipice

Tabele politetice

Identificarea fenotipica a membrilor familiei Enterobacteriaceae cu ajutorul tabelelor politetice (dupa Difco
Laboratories).

Identificarea microorganismelor prin metode fenotipice

chei de determinare

Metode fenotipice
Analize morfologice
Analize fiziologice si
biochimice
Analize chemotaxonomice
Analiza proteinelor

Caractere
stabile si
caractere
variabile

controale pozitive si negative, in special in cazul in care

conditiile de analiza difera de cele prezentate in lucrarile
standard de referinta.
caracteristicile morfologice, fiziologice si biochimice
trebuie atent evaluate pentru a determina pe cele
comune, unice taxonului respectiv

I. Metode fenotipice
Trasaturi fenotipice exprimate
forma si dimensiunea celulelor, modul de grupare
caractere celulare specifice: crestere apolara, formarea de apendici
celulari, prosteca, muguri, ramificatii
prezenta unui ciclu de viata Caulobacter spp, Pirellula
formarea de endospori, exospori dimensiunea acestora in raport cu
dimensiunea celulei vegetative
localizarea flagelului
mobilitate
structuri intracelulare specifice: vacuole cu gaz, granule cu S sau PHB

Tipuri morfologice

Morfologie, mod de grupare

Morfologie, mod de grupare

Morfologie, mod de grupare

Morfologie, mod de grupare

Morfologie, mod de grupare

Metode de microscopie
Metode de microscopie clasic, optic sau
fotonic
utilizeaz spectrul luminii vizibile (cu cele doua
extremitti: IR i UV) i care folosete fotonii
radiaiilor luminoase pentru formarea imaginii
microscopul cu fond clar, cu fond negru, cu contrast
de faza, cu lumina polarizat, cu fluorescen

Metode de microscopie electronic

utilizeaz fascicule de electroni pentru formarea imaginii,
lentilele fiind nlocuite cu cmpuri electrice
microscopie electronic de transmisie, microscopie electronic
de baleiaj sau scanning.

Microscopie optica fond intunecat

o surs de iluminare lateral, indirect a preparatului, cmpul microscopic

rmnnd negru deoarece nu primete lumin direct, n timp ce
particulele existente n cmpul microscopic, chiar cele de dimensiuni
foarte mici, absorb o cantitate suficient de radiaie luminoas pe care o
disperseaz, devenind astfel surse secundare de lumin, vizibile pe
cmpul microscopic ntunecat (aspect de cer nstelat).

Microscopie in contrast de faza

decelarea i localizarea microorgansimelor vii in esuturi, pentru evidenierea

micrii flagelilor, sporulrii i a altor procese care necesit studiul
microorganismelor n stare viabil, cu pstrarea nemodificat a aspectelor lor
structurale.

Microscopie fluorescenta

Microscopie electronica

I. Metode fenotipice
Trasaturi fenotipice exprimate
Morfologia bacteriana
Caracter Gram,

Caracterul acido-alcoolo-rezistent

Formarea de spori

Endospori bacterieni
Coloraia Benito-Trujillo
forme de rezistenta la conditile nefavorabile de mediu inconjurator

Formarea de spori
spori de propagare

Morfologia si dimensiunea sporilor

Spori asexuati/sexuati
Endospori/exospori
Mobilitate

Incluzii intracitoplasmatice

Polimeri extracelulari
capsula

Mobilitate
Flagel

Tipuri de mobilitate
mobilitatea trebuie descrisa intr-un
mod adecvat,
atat forma cat si viteza de
deplasare prezinta semnificatie
taxonomica

Ordinul
Mobilitate
Spirochetales
Filamente axiale - spirochete

Filamente axiale structuri tip

flagel, intalnite la spirochete
Mobilitate prin insurubare
Treponema pallidum

Ciclu de viata
Caulobacter crescentus

http://en.wikipedia.org/wiki/Caulobacter_crescentus

I. Metode fenotipice
Trasaturi fenotipice exprimate
Caractere de colonie si de cultura

morfologia,
culoarea si
dimensiunea
coloniei,
prezenta si
tipul corpilor de
fructificare, a
miceliului).

I. Metode fenotipice
Trasaturi fenotipice exprimate

DOMENIUL ARCHAEA
fenotipurile archeene - grupuri fiziologice principale

Trasaturile fiziologice
parametrii de crestere:
temperatura

includ

date

pH-ul
toleranta la diferite concentratii de NaCl,
tipul respirator.

Tipul respirator.

despre

I. Metode fenotipice
Trasaturi fenotipice exprimate
Trasaturile nutritionale - tipuri de trofii si la exigentele de

crestere (dupa forma in care pot prelua din mediu diferitele

elemente biogene: nativa sau combinata si respectiv din
combinatii simple, complexe, anorganice sau organice).

Waites Michael J., Morgan Neil L., Rockey John S., Higton Gary. Industrial Microbiology:An Introduction; Blackwell
Science Ltd. 2001.

I. Metode fenotipice
Trasaturi fenotipice exprimate
Trasaturile biochimice se refera la sursa de C utilizata,

fermentarea glucidelor, profilul enzimatic.

(1) teste conventionale
(2) sisteme multi-test,
(3) sisteme microtest

Teste biochimice conventionale

Respiratia aeroba lantul respirator proteine de oxidoreducere:

Transportori de electroni: Citocromi

Oxidoreductaze :
Dehidrogenaze
Citocromoxidaze

1/2O2 + 2H+ + 2eH2O2

catalaza

2H2O
H2O + 1/2 O2

Studiul catalazei este util n diferenierea genurilor

Streptococcus sp. i Staphylococcus sp., Bacillus
sp i Clostridium sp.
Control de calitate: Pseudomonas aeruginosa - martor
sigur (+); Salmonella spp., Proteus sp. - martor sigur
(-)

Mediile multitest
Permit evidentirea simultana a mai multor caractere biochimice

TSI Triple Sugar Iron + indicator de pH

Detectarea
tiosulfatreductazei

Fe SO4

Alte aspecte

Rosu fenol

Mediile multitest
MIU Mobilitate Indol Ureaza
Opacifierea
uniforma a
mediului

Metabolizarea triptofanului
cu producere de indol
volatil
Inrosirea benzii de hartie de
filtru

Metabolizarea
ureei inrosirea
mediului

Mediile multitest
MILF Mobilitate Indol Lizin-decarboxilaza
Opacifierea
uniforma a
mediului Metabolizarea
triptofanului cu
producere de
indol volatil
Inrosirea benzii
de hartie de
filtru

Fenil-alanin-dezaminaza

Fermentarea glucozei
acumulare de acizi
Virajul culorii la galben (R -)
LDC determina acumularea de
cadaverina
Virajul culorii la violet (R+)

Adaugarea 1-2
pic FeCl3
Aparitia unui
inel verde

Sistemele microtest
Sistemele microtest sunt sisteme automatizate de fingerprinting fenotipic utile la
analiza fenotipica clasica.
Identificarea microorganismelor se obtine cu ajutorul unui manual numeric sau a
soft-urilor de calculator bazate pe Taxonomia numerica.
Datele fenotipice sunt analizate prin comparatie numerica computerizata.
Sistemele Api
identificarea enterobacteriilor
(Api 20 E )
identificarea bacililor Gram negativi nonenterobacterii
(Api nonE,, Api Staph,, Api Listeria, Api
Bacillus Api 32 Strep)
Identificarea bacteriilor lactice si alti
anaerobi
(Api CH, Api Anaero)

Sistemele microtest

Api Staph

Api Strep

Citrobacter sp.

Proteus mirabilis

Pseudomonas aeruginosa

Enterobacter cloace

Sistemele Automatizate

Vitek
PhoenixM
Aster ID
Biolog

I. Metode fenotipice
Trasaturi fenotipice exprimate
Testele de inhibitie selectiva a cresterii
-pe medii selective (cu adaos de antibiotice /coloranti),
-permit cresterea si izolarea anumitor microorganisme in

prezenta diferitelor substante si

-prezenta sau activitatea diferitelor enzime,
-metabolizarea diferitilor compusi,
-rezistenta constitutiva la antibiotice etc.

MacConkey Agar recomandat pentru detectia si izolarea enterobacteriilor din probe clinice,
produse lactate, alimente, apa, produse farmaceutice si industriale
MacConkey Broth- Pharmacopoeia
substanele
nutritive
agent selectiv,
inhiba cocii
Gram pozitivi

Substrat fermentescibil

indicator de pH

cultura lactozo-fermentativa

CRESTEREA BACILILOR
DE PE MEDIU MACCONKEY

cultura lactozo-non
fermentativa

mediu de diferentiere a
speciilor de
enterobacterii lactozo
fermentative (virajul
culorii mediului la
galben) de cele nonfermentative

VRBG agar (Violet Red Bile Glucose)

- mediu MacConkey modificat, dezvoltat de Moessl; in 1960, lactoza fiind
inlocuita de glucoza, prin urmare nu permite diferentierea coliformilor
lactozo-pozitivi de lactozo-negativi, insa are o rata de recuperare mai
mare decat acesta
- aplicatii in analiza probelor clinice, produse alimentare si cosmetica
Sursa de N
agent selectiv,
inhiba cocii
Gram pozitivi

Sursa de carbon si energie

indicator de pH

Enterobacteriile dezvolta colonii roz

inconjurate de un halou rosietic

MEDII DE CULTIVARE A MICROORGANISMELOR N

LABORATOR
Cetrimide agar
folosit pentru izolarea si identificarea tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa

Sursa de C si
N
Stimuleaza
producerea de
piocianina si
fluoresceina

Agent selectiv actioneaza

ca o sare cuaternara de
amoniu, producand
eliberarea de azot si fosfor
din celulele bacteriene,
altele decat Pseudomonas

Sursa de C

MEDII DE CULTIVARE A MICROORGANISMELOR N

LABORATOR
Slanetz and Bartley Medium
mediu inalt selectiv pentru enterococi, dupa incubare la 44-45C, toate coloniile
rosii sau brune - presumptive enterococci.
utilizat pentru determinarea cantitativa a enterococilor din apa, bauturi racoritoare,
ape uzate si diferite produse biologice de origine animala prin metoda membranei
filtrante

agent selectiv,
inhiba bacteriile
Gram negative

MEDII DE CULTIVARE A MICROORGANISMELOR N

LABORATOR
Baird Parker Agar
mediu selectiv pentru izolarea si identificarea prezemtiva a stafilococilor
coagulazo-pozitivi
utilizat pentru detectia si determinarea cantitativa a tulpinilor de Staphylococcus
aureus in produse alimentare, produse cosmetice

Sursa de C si
N
promoveaza
cresterea
stafilococilor

Diferentierea
stafilococilor
coagulazo pozitivi
colonii negre
inconjurate de o
zona opaca de

Agenti selectivi, inhiba

cresterea altor bacterii, cu
exceptia stafilococilor

MEDII DE CULTIVARE A MICROORGANISMELOR N

LABORATOR
Chapman Agar
izolarea stafilococilor prin inhibarea cresterii majoritatii bacteriilor datorita
concentratiei ridicate de sare
mediu inalt selectiv, recomadat pentru izolarea stafilococilor patogeni din
probe clinice, produse cosmetice

Sursa de C si N
Agenti selectivi,
inhiba cresterea
altor bacterii, cu
exceptia
stafilococilor

Substrat fermentescibil
indicator de pH

MEDII DE CULTIVARE A MICROORGANISMELOR N

LABORATOR
Bile Esculine Azide agar

mediu selectiv utilizat pentru izolarea selectiva si

diferentierea streptococilor de grup D

Sursa de C si N
agent selectiv + azida
de sodiu inhiba
bacteriile Gram
negative si pozitive,
altele decat enterococii

esculetol

Precipitat de
culoare neagra

I. Metode fenotipice
Trasaturi fenotipice exprimate
Lizotipizarea (tiparea fagica)
- specificitatea relatiei bacteriofag-bacterie
- identificare a tulpinilor bacteriene in functie

de sensibilitatea lor fata de un bacteriofag /

un set de bacteriofagi.
- se evidentiaza prin aparitia plajelor de liza
celulara in cultura bacteriana obtinuta din
tulpina analizata; pattern de sensibilitate
caracteristic fagograma

Aplicatii:
-stabilirea diagnosticului bacteriologic in clinica,
-in studiile de sistematica bacteriana, ca si
-in studiile epidemiologice la stabilirea originii si circulatiei
unei tulpini bacteriene intr-o colectivitate in cursul unei

I. Metode fenotipice
Trasaturi fenotipice exprimate
Antibiotipizarea - sensibilitatea la antibiotice este determinata

prin stabilirea antibiotipului ce reprezinta pattern-ul de rezistenta

sau sensibilitate a microorganismelor fata de un set de agenti
antimicrobieni (antibiotice).

Antibiotipul se stabileste
cu ajutorul tehnicii antibiogramei

I. Metode fenotipice
Trasaturi fenotipice exprimate
Teste serologice (identificare pe baza caractere
de antigenitate)
aglutinare,

seroneutralizare
imunofluorescenta

capsula,
flageli,
fimbrii, ca si
molecule intracelulare
sau produsi de secretie (enzime, toxine).

Testele serologice au aplicatii taxonomice restrnse

a unele microorganisme si laboratoare de referinta.

Aglutinarea bacteriana

Ag-Ab complex

Neisseria meningitidis,
Streptococcus pneumoniae,
Haemophilus influenzae
Staphylococcus aureus
Listeria monocytogenes
Salmonella spp
Escherichia coli
Vibrio cholerae
Leptospira (MAT test)

Markeri chemotaxonomici
Perete celular:

peptidoglican,
acizi micolici,
acizi teichoici etc.
Membrana plasmatica: Acizi grasi,

Lipide polare
Lipoquinone respiratorii
Pigmenti etc
Citoplasma:
Poliamine

Markeri chemotaxonomici
Peptidoglican
structura relativ uniforma la bacteriile Gram-negative si, prin

urmare, nu prezinta interes taxonomic.

Nu au fost observate diferente printre membrii Diviz Proteobacteria si Diviz Bacteroides
este extrem de variabil ca structura si compozitie chimica si,

implicit, extrem util la bacteriile Gram-pozitive, in mod special la

actinomicete si bacteriile inrudite acestora, la care s-au
identificat 8 chemotipuri de peptidoglican cu specificitate de
gen sau specie.

Analiza structurii PG la bacteriile Gram

pozitive
La bacteriile Gram-pozitive se observa o variatie mare, diferentele in

secventa de aminoacizi, tipurile de diaminoacizi prezenti si modul de

legare incrucisata fiind folosite la descrierea tipurilor de peptidoglican.

Diaminoacizi :
acidul meso- si L-diaminopimelic,
L-ornitina, L-Lizina si acid Ldiaminobutiric.
D-ornitina este prezenta uneori
in puntile interpeptidice.

clasificarea bacteriilor Gram-pozitive, ex. Brevibacterium

ammoniagenes a devenit Corynebacterium ammonigenes.

Peptidoglican de
tip A (3-4)

Peptidoglican de
tip B (2-4)

genurile fam Microbacteria

Compozitia in aac a lantului lateral peptidic (tetrapeptid) ce

include diaminoacidul caracteristic este de obicei comuna tuturor
speciilor unui gen
Un grad mare de variabilitate se poate detecta in modul de
legare incrucisata intre laturile peptidice laterale, ce poate varia
printre speciile unui anumit gen ex g. Microbacterium sau chiar
intre tulpinile unei specii Micrococcus luteus.

Markeri taxonomici
peptidoglican
Analiza chimica structurii PG este obligatorie pentru toti

membrii unui nou gen Gram pozitiv descris precum si in cazul

unui noi specii Gram pozitiv.
Compozitia completa a PG unei noii specii descrise a unui gen

recunoscut trebuie sa fie in acord cu caracteristicile genului si

trebuie sa ofere informatii care sa realizeze diferentierea noii
specii descrise de alte specii ale genului.
Domeniul Archaea pseudomureina acidul N-acetil muramic

a fost inlocuit de N acetil talosuronic.

Markeri chemotaxonomici
Lipidele
lipide polare (constituienti majori ai stratului lipidic al membranei

plasmatice bacteriene),
sfingolipide (doar la un numar limitat de taxoni) si
LPS (lipopolizaharidele din membrana externa a bacteriilor Gramnegative).
Lipidele polare
molecule amfipatice ce contin o grupare polara legata la 2
acizi grasi.
unele lipide polare sunt comune printre bacterii si, ca atare,
nu prezinta valoare taxonomica. Altele insa sunt specifice:

Lipidele polare
fosfatidil-inozitol-manozidele sunt specifice actinomicetelor;
Archaea au lipide cu legaturi eterice intre glicerol si

regiunea hidrofoba a lanturilor, in contrast cu eubacteriile

ce prezinta lipide cu legaturi esterificate;
membrii genului Sphingomonas prezinta un singur lipid
polar (ex. sfingoglicolipid) ce reprezinta o caracteristica
taxonomica distinctiva.

Bacteria
fosfolipide, glicolipide, fosfoglicolipide
aminofosfolipide, lipide aminoacid derivate,
capnine, sfingolipide (glico sau fosfosfingolipide)
si hepanoide
Archaea
aminofosfolipide, glicolipide, fosfoglicolipide
Diversitate mare de lipide polare cunoscute in prezent la procariote, in
numeroase cazuri structurile acestora nu au fost elucidate.

Lipopolizaharidele
Semnificatii taxonomice:
Natura glucidului prezent la nivelul Lipidului A
precum si natura acizilor grasi
Modul de legare al acestora (legaturi esterice sau
amidice) la glucid
Lungimea lantului de acizi grasi.

Markeri chemotaxonomici
Acizii grasi cu lant lung
sunt constituenti majori ai lipidelor, fosfolipidelor si LPS din

membrana externa a bacteriilor Gram-negative si ai acizilor

lipotheicoici la bacteriile Gram-pozitive
> 300 de structuri chimice diferite:

variatia de lungime a lantului de carbon (intre 8 si 26 atomi de

C);

prezenta acizilor grasi saturati (acid capric, acid lauric, acid

miristic etc.) si nesaturati (obisnuit mononesaturati:
pentadecenoic, acid palmitoleic, acid palmitelaicic, acid oleic,
acid vaccenic);

prezenta sau absenta ramificatiilor (ramificatiile sunt

predominante la bacteriile Gram-pozitive) si tipul de acizi
ramificati;

Markeri chemotaxonomici

prezenta si tipul grupelor substituite: ciclopropan sau OH (in

pozitia 2/3 a moleculei: acid 3-hidroxicapric, acid 2- sau 3hidroxilauric, acid 2- sau 3-hidroximiristic, acid 2- sau 3hidroxipalmitic);

gradul de saturare a legaturilor chimice dintre atomii de

carbon;

prezenta unui singur acid gras sau a unui pattern specific:

bacteriile - subdiviziunii a-Proteobacteria au ca trasatura
prezenta
de prezenta
acizi grasia modificati
inoctadecenoic;
cadrul unor grupe de
comuna
40-70% acid
bacterii (formati prin condensarea unui acid gras cu o molecula
cu greutate mica, ex un aac)
sfingolipide, capnine, alchilamine
dioli Thermomicrobium roseum

Acizii micolici
acizi grasi 2-alchil-3-hidroxi
lanturi lungi caracteristice (intre 24 si 90 atomi de carbon)
identificati doar la un numar limitat de genuri corineforme si

genuri filogenetic inrudite: Mycobacterium, Corynebacterium,

Nocardia, Dietzia, Gordona, Rhodococcus, Turicella,
Tsukamurella.
Prezenta acizilor micolici diferentiaza aceste genuri de alti

corineformi lipsiti de acizi micolici (genurile Arthrobacter,

Brevibacterium, Cellulomonas, Clavibacter, Curtobacterium,
Microbacterium) (Zuber si colab., 2008).
In cazul majoritatii bacteriilor, lungimea lantului lateral micolat

se coreleaza strans cu clasificarea bazata pe secventierea

genelor ARNr 16S.

Markeri chemotaxonomici
Lipoquinone respiratorii/Quinonele izoprenoide
prezente la microrganismele aerobe si anaerobe Bacteria
clasificate pe baza structurii chimice in doua clase:,

naftoquinon
e
benzoquino
ne

o a 3 clasa: quionone (Sulfolobus, Caldariella),

naftoquinone
filoquinona (vitamina K1) prezenta doar la plante;
menaquinone (inclusa si vitamina K2) detectate la membrii Dom.

Archaea, -, - si -Proteobacteria, in mod exceptional la - si Proteobacteria, celelalte bacterii Gram-pozitive;

derivati ai vitaminei K2 :dihidromenaquinona,
dimetilmenquinone si chlorobiumquinona (bacteria sulfuroasa
verde Chlorobium thiosulphatophilum);
lungimea lantului lateral variaza 5-15 unitati izoprenoide, de obicei
nesaturate, insa anumite grupe de organisme prezinta pattern-uri
specifice de saturare:
proteobacteria si clasa Halobacteria puct de saturare alifatic al lantului lateral
lanturile laterale - clasa Halobacteria- octaprenil
- Proteobacteria penta-hepta
prenil
bacterii Gram pozitive cu procent molar G+C ridicat pct
de saturare- inelul naftoquinonei
Lanturi laterale izoprenoide complet saturate - Archaea
Lungimea lantului lateral, gradul de saturare si pozitia saturarii

urmareste indeaproape clasificarea ARN16S

Benzoquinone
subdivizate in:
ubiquinone (formal denumite coenzima Q)

detectate doar la membrii -(Q10, Q9 si Q11), (Q8)si -Proteobacteria (Q7-Q14), descrise si la

microfungi (mucegaiuri si drojdii);
rhodoquinona (identificata la bacteria

nesulfuroasa rosie Rhodospirillum rubrum).

plastoquinone prezente doar la alge si plante si

absente la bacteriile fotosintetizante.

Markeri chemotaxonomici
Poliaminele
reprezinta markeri chemotaxonomici pentru membrii grupului

de archee metanogene, ca si pentru membrii familiei

Vibrionaceae .

clasificarea proteobacteriilor:
-Proteobacteria -spermidina sau sym-homospermidina;
-Proteobacteria - putrescinei si diamin-2-hidroxiputrescinei
-Proteobacteria:
familia Enterobactericeae - componentele principale sunt

reprezentate de diaminopropan si putrescina;

sym-norspermina la genul Vibrio;
spermidina la genurile Xanthomonas, Freteuria, Halomonas,
Deleya si Oceanospirillum;
cadaverina si spermidina la genul Stenotrophomonas;
putrescina, spermidina si cadaverina la genul Pseudomonas.

Analize chemotaxonomice
Procariotele sunt foarte diversificate din punct de vedere

chimic iar prezenta unor compusi chimici precum:

Acizi teichoici, acizi teichuronici

Arabinogalactani, alte heteropolizaharide

Sfingolipide - Sphingomonadaceae

diferentierea variatelor grupe taxonomice.

Analize chemotaxonomice
Cromatografia
metod de separare bazat pe distribuia unui solut ntre
dou faze, una mobil (gaz sau lichid) i alta staionar (un
solid sau un lichid).
TLC (Thin layer chromatography)
faza mobil este un solvent sau un amestec de solveni care
strbat ascendent o faz staionar (un gel de 0,25m de
silice sau alt absorbant) fixat pe o plac de sticl sau o foaie
semirigid, din material plastic sau aluminiu.

Analize chemotaxonomice
Cromatografia n faz gazoas
faza mobil este un gaz (gaz purttor de obicei heliu sau hidrogen),
iar faza staionar poate fi lichid sau solid.
Distribuia compuilor din amestec se produce printr-un

proces de transfer de mas interfazic, prin repartiie. Pentru a

putea fi separai, compuii din prob trebuie s aib solubiliti
diferite.
Cromatografia de lichide de nalt performan (HPLC)
sistemul HPLC are trei componente critice, coloana (n care se produce
separarea), pompa (care foreaz trecerea fazei trecerea fazei mobile prin
coloan) i detectorul (care monitorizeaz separarea).
uzual se utilizeaz detectorul spectrofotometric bazat pe absorb ia molecular
n UV i VIZ. - datelor de structur pentru compu ii de identificat.

Proteinele bacteriene
Analiza proteomului sau a unor
seturi
proteice
analiza proteomului,
spectrometrie de masa
compararea pattern-urilor proteice si a LPS prin electroforeza

in gel de poliacrilamida si
electroforeza enzimelor multilocus.
Proteomica

= Genomica functionala abordata la nivel

proteic.
variatia de lungime si continutul in baze azotate (G+C %mol)
a secventelor genice dicteaza variatia de secventa a
proteinelor si, ca atare, proteomul poate fi considerat marker
taxonomic.
pattern-uri proteice:

MALDI-TOF MS (Matrix-assisted laser desorption

ionizationtime of flight mass spectrometry)
metod analitic rapid pentru caracterizarea microorganismelor

(identificare, profil antibiorezisten, caractere biochimice

diverse).
Etape:
proba este depus pe un suport metalic, mpreun cu o substan

cu greutate molecular mic cu rol de matrice care favorizeaz

ionizarea probei (acioneaz ca donor de protoni).
uscarea i cocristalizarea matricei i a probei de analizat,
expuse apoi unui fascicul laser de obicei cu lungime de und de
337nm (aceasta este varianta cea mai des utilizat n
dispozitivele comerciale, dar iradierea laser se poate face i la
alte lungimi de und), care va fi aplicat n spot pe suprafaa
probei, pentru evitarea degradrii termice a acesteia
(dimensiunile spotului 0,05-0,2mm).

MALDI-TOF MS (Matrix-assisted laser desorption

ionizationtime of flight mass spectrometry)
absorbia unei cantiti mari de energie determin sublimarea

rapid a probei i ionizarea acesteia.

pot fi astfel analizate inclusiv proteine ribozomale, cu dimensiuni
de pn la 100 kDa.
analizorul TOF presupune parcurgerea de ctre moleculele

ionizate a unei distane pn la detector, fiind expuse acestuia

n ordinea cresctoare m/z (mas/ sarcin).
spectrele de mas obinute sunt utilizate pentru identificarea

microorganismelor din prob, de obicei fiind identificate proteinele

ribozomale,
utilizndu-se biblioteci de date spectrale.

Spectrometria de masa (SM)

avantaje:
spectrul larg de aplicabilitate;
rapiditatea, sensibilitatea si caracterizarea cu acuratete/
confidenta a microorganismelor individuale;
simplitatea etapei de prepare a probelor, absenta etapelor
premergatoare de separare a proteinelor de interes si
automatizarea etapelor de obtinere a fingerprint-ului de
masa (Lange si colab., 2008).

Electroforeza in gel de
poliacrilamida (EGPA)

separarea proteinelor doar pe baza masei lor moleculare, nu si

a compozitiei lor astfel ca fiecare banda electroforetica

contine de fapt mai multe clase de proteine.
investigarea relatiilor la nivel de gen si de specie.
gradul de similaritate a pattern-urilor proteice este o masura a

gradului de inrudire, detalii informative fiind furnizate prin

analiza numerica.
bacteriile Gram-negative, inrudirea infraspecifica este

investigata si prin EGPA a lanturilor O specifice LPS.

Compararea proteinelor individuale

secventierea comparativa a aminoacizilor din componenta

proteinelor
prin reactii de tip serologic (Ag-Ac).

Serologia comparativa a proteinelor

Reactiile de tip serologic pot detecta asemanari structurale intre

enzime din diverse tulpini bacteriene. Acesta tehnica se bazeaza

pe faptul ca orice variatie in secventa de aminoacizi a unei
proteine se va reflecta in structura sa secundara si, deci, si in
antigenitate.
genurile Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus