REFERATE GENERALE

METODE NOI I VECHI N DIAGNOSTICUL

DE LABORATOR AL TUBERCULOZEI
I N DEPISTAREA REZISTENELOR
LA MEDICAIA ANTITUBERCULOAS
Old and new methods for the laboratory diagnosis of tuberculosis
and for the detection of resistant strains to antibuberculous drugs
Dr. Adriana Moisoiu
Institutul de Pneumoftiziologie Marius Nasta, Bucureti

REZUMAT
Tuberculoza (TB) rmne i n secolul XXI o mare problem de sntate public i cea mai mare cauz de
decese datorate unui singur agent infecios la nivel mondial. Cu toate c numrul de cazuri de TB este n
scdere n ultimii ani n Romnia, ele sunt tot mai dificil de tratat atunci cnd apare rezistena la medicamentele
antituberculoase. Este nevoie de o mai rapid detecie a Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) n
laborator i de testare a rezistenei sale la medicamentele antituberculoase. Din acest motiv metodele de
testare n laboratoarele de micobacteriologie se dezvolt continuu. Chiar dac metodele clasice de
microscopie i cultur sunt considerate standard de aur n bacteriologia TB, progresele recente ale biologiei
moleculare i o mai bun nelegere a bazelor moleculare ale rezistenei la medicaia antituberculoas au
determinat apariia unor noi instrumente pentru un diagnostic rapid. Scopul noilor metode este acela de a
crete sensibilitatea i specificitatea abordrii terapeutice i de a determina o scdere a timpul necesar
diagnosticului.
Acest articol este o trecere n revist a metodelor de laborator mai noi i mai vechi ce pot servi unui diagnostic
rapid i pus cu acuratete n infeciile micobacteriene, ceea ce ar putea permite administrarea unui tratament
corect i instituit la timp de ctre clinician.
Cuvinte cheie: tuberculoz (TB), Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis),
diagnostic molecular

ABSTRACT
Tuberculosis (TB) remains even in the XXI century a major problem of public health and one of the major
causes of death from a single infectious agent worldwide. Although the number of cases continues gradually
to decrease in Romania in last years, cases get more difficult to threat, specifically those that are multidrugresistante.
The rapid detection of Mycobacterium tuberculosis(M. tuberculosis) in laboratory and the tests of susceptibility to antituberculous drugs become a necessity. In light of this, the laboratory testing in the mycobacteriology
field is continuously developing. Recent advances in molecular biology and a better understanding of the
molecular basis of drug resistance in tuberculosis have provided new tools for rapid diagnosis.
The aim of this article is to focus on current old and new methods useful for an accurate and rapid laboratory
diagnosis of mycobacterial infections.
Keywords: tuberculosis (TB), Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis),
molecular diagnosis

Diagnosticul de laborator al TB se face n mod

clasic prin microscopie i cultur. Acestea sunt ns
procedee inadecvate pentru un control efectiv al
TB, pentru c sunt mari consumatoare de timp.

Diferenierea M.tuberculosis de alte micobacterii

reprezint i ea o important problem de sntate,
tiut fiind c doar TB se transmite de la persoan la
persoan. Diferenierea micobacteriilor tuberculoase

Adres de coresponden:
Dr. Adriana Moisoiu, Institutul de Pneumoftiziologie Marius Nasta, os. Viilor 90, Bucureti
E-mail: amoisoiu55@gmail.com

REVISTA ROMN DE BOLI INFECIOASE VOLUMUL XVII, NR. 1, AN 2014

39

40

REVISTA ROMN DE BOLI INFECIOASE VOLUMUL XVII, NR. 1, AN 2014

de cele netuberculoase este necesar, dar i util, n

vederea stabilirii unei scheme adecvate de tratament.
Necesitatea scurtrii timpului de diagnostic,
precum i necesitatea diferenierii micobacteriilor
tuberculoase de cele netuberculoase, au determinat
n ultimii ani apariia metodelor moleculare de diagnostic.

niilor la mai mult de 7 zile de la inoculare definete

micobacteriile cu cretere lent.

METODE CLASICE DE DIAGNOSTIC

Identificarea fenotipic a complexului
Mycobacterium tuberculosis (MTC)
1.1. Microscopia

Microscopia specimenului clinic n coloraie

Ziehl-Neelsen este cea mai rapid i mai ieftin
metod de identificare a micobacteriilor. Principalul
dezavantaj al acestei metode este acela c este o
metod cu sensibilitate redus, pragul pozitivitii
fiind de 5.000-10.000 bacili/ml de prelevat clinic.
Colorarea fluorescent a lamelor (ex. cu auraminarodhamina) este superioar coloraiei Ziehl-Neelsen,
ea ducnd la scderea timpului de examinare a unei
lame. Dar nici ea nu poate face diferena ntre bacilii viabili i cei neviabili din respectivul specimen
clinic i nici nu poate face diferena ntre diversele
specii de micobacterii. De aceea este obligatoriu ca
examinarea microscopic a unui specimen clinic s
fie urmat de cultivarea sa.
1.2. Cultura

Cultura este o metod net superioar microscopiei n depistarea M. tuberculosis. Ea poate fi efectuat pe medii solide (Lowenstein-Jensen, Middlebrook 7H10 sau 7H11) sau pe medii lichide (Youmans,
Dubos, Middlebrook 7H9). Pe mediile solide se
poate observa foarte bine morfologia coloniilor de
M. tuberculosis. Coloniile dintr-o prim cultur de
M. tuberculosis obinute pe mediul LowensteinJensen au o textur caracteristic. Ele apar rugoase,
conopidiforme, de culoare alb-crem (Fig. 1). La
examinarea microscopic a unui frotiu dintr-o astfel
de colonie se observ numrul foarte mare de corzi
formate de celulele bacteriene, ceea ce face posibil
diferenierea lor de alte specii micobacteriene. Conversia morfologic a coloniilor de M. tuberculosis
la colonii netede pare a fi un semn de cretere a
patogenicitii determinat de modificri n compoziia peretelui celular.
Rata de cretere pentru micobacterii este definit
ca fiind timpul necesar pentru apariia unor colonii
vizibile cu ochiul liber pe un mediu solid. Micobacteriile ce cresc n mai puin de 7 zile sunt denumite cu cretere rapid, n timp ce apariia colo-

FIGURA 1. Aspectul coloniilor de M. tuberculosis pe

mediul Lowenstein-Jensen

Micobacteriile aparinnd MTC sunt cu cretere

lent. Temperatura lor optim de cretere este de
35-37C i sunt noncromogene (au o culoare albcrem ce nu se schimb dup expunerea la lumin).
M. tuberculosis crete extrem de ncet n laborator, necesitnd 3-8 sptmni de cretere pe mediile solide i cel puin 2 sptmni pe medii lichide.
Aceast cretere lent determin o mare ntrziere
n diagnosticul TB. Pe de alt parte, s-a observat c
la aproximativ 30% dintre pacienii cu TB aceasta
nu poate fi confirmat prin cultura pe mediu solid.
Au aprut ns mediile lichide selective, n care
detecia creterii M. tuberculosis se poate face n
1-2 sptmni, n funcie de numrul bacililor tuberculoi din specimenul clinic. Exist mai multe
tipuri de aparate automate pentru cultura micobacteriilor pe medii lichide selective: BACTEC TB
460, BACTEC MGIT 960, BacT/Alert3D, Versa
TREK.
BACTEC TB 460 utilizeaz mediul Middlebrook
7H9 n care acidul palmitic este marcat radioactiv
cu 14C. Dac exist micobacterii viabile n prelevatul clinic introdus n flaconul de cultur, acestea
vor metaboliza acidul palmitic radioactiv, elibernd
CO2 radioactiv. Rata de producere a CO2 radioactiv
este direct proporional cu rata de multiplicare a
micobacteriilor.
BACTEC MGIT 960 (Mycobacteria Growth Indicator Tube) este un sistem automat ce utilizeaz
un mediu Middlebrook 7H9 modificat cu indicator
de cretere fluorescent (film siliconat cu sare de ruteniu). Multiplicarea micobacteriilor poate fi citit
prin vizualizarea precipitatelor ce apar n partea
inferioar a tubului sau prin utilizarea unui emitor
portabil de lumin UV.

REVISTA ROMN DE BOLI INFECIOASE VOLUMUL XVII, NR. 1, AN 2014

BacT/Alert3D utilizeaz mediul Middlebrook

7H9 n tuburi ce au n partea lor inferioar un detector colorimetric ce-i schimb culoarea de la
verde nchis la galben pe msura acumulrii de CO2
produs de creterea micobacteriilor. Cu ajutorul
unui dispozitiv reflectometric este semnalat optic
i acustic pozitivarea culturii.
Versa TREK este un sistem automat ce utilizeaz
flacoane speciale care conin un burete cu structur
alveolar. Mediul de cultur este Middlebrook 7H9
mbogit cu substane antibacteriene. Detecia creterii micobacteriilor se face prin monitorizarea consumului de O2 i msurarea presiunii din flacon cu
ajutorul unui manometru. Flacoanele n care se
constat scderea presiunii de O2 sunt raportate pozitive i semnalate vizual i acustic de ctre aparat.
Aceste tipuri de aparate ce utilizeaz mediul
lichid pentru detecia creterii M. tuberculosis sunt
n uz n diverse laboratoare de micobacteriologie
din Romnia.
1.3. Teste biochimice i de identificare antigenic

Testele biochimice au fost mult vreme principala modalitate de difereniere a micobacteriilor.

Dar ele necesit o perioad lung de timp pentru
efectuare.
Testele uzuale de difereniere n cadrul MTC
sunt: testul reducerii nitratului, testul acumulrii
niacinei, creterea n prezena tiofen-2-hidrazidei
carboxilice (TCH), testul catalazei la temperatura
camerei, testul arilsulfatazei, testul ureazei, testul
cu pirazinamidaza, tolerana la clorur de sodiu,
testul reducerii teluritului, testul hidrolizei Tween
80. Diferitele laboratoare folosesc teste diferite de
identificare biochimic. De exemplu rezistena la
TCH este o caracteristic a M. africanum, dar concentraia critic folosit pentru acest test variaz
ntre 1 i 5g/ml i aceast lips a standardizrii
testelor creeaz ambiguitate n interpretarea rezultatelor. Clasic, n laboratoarele ce utilizeaz teste
biochimice, doar M. tuberculosis este considerat a
fi rezistent la TCH. Se admite c pentru diferenierea
bacililor din MTC de micobacteriile netuberculoase
(MNT) este necesar efectuarea a minimum 4 teste
biochimice (1).
Actualmente s-au dezvoltat i teste rapide de
identificare a micobacteriilor, cum ar fi: BBL Taxo
TB Niacin test pe strip pentru detectarea produciei
de niacin; BBL Taxo Nitrite Test Strip test pe
strip pentru reducerea nitratului.
S-au dezvoltat i teste imunocromatografice ce
pot detecta tulpinile de micobacterii aparinnd MTC
n mai puin de 15 minute. Un astfel de test este cel
ce pune n eviden antigenul specific pentru

41

M. tuberculosis (Ag MPT 64). Testul se efectueaz

n primele 24-48 de ore dup pozitivarea culturii pe
mediu solid sau lichid, pentru a putea evita falsele
reacii negative. Sensibilitatea testului este de 98,6%,
iar specificitatea de 97,7% (2). Programul Naional
de Control a Tuberculozei din Romnia recomand
utilizarea de rutin a acestui test pentru toate
culturile de micobacterii obinute n laboratoarele
de micobacteriologie de nivel 2 i 3.

METODE MOLECULARE DE DIAGNOSTIC

n ultimii ani s-au dezvoltat mai multe metode
moleculare pentru detecia direct a micobacteriilor
din prelevalul clinic, identificarea speciilor i testarea rapid a sensibilitii la medicamentele antituberculoase pentru M. tuberculosis din culturi bacteriene, metode ce au fcut posibil scurtarea timpului
de diagnostic (3,4).
Totodat, metodele de tipare molecular au fcut
posibil descrierea unor variaii ale fenotipurilor de
M. tuberculosis cum ar fi virulena, caracterele de
cretere, imunogenicitatea i transmisibilitatea (5).
Detecia micobacteriilor din prelevate clinice i/sau
din cultur

Apariia metodelor de amplificare a acizilor nucleici (AAN) au fcut posibil punerea n eviden
a ADN-ului sau ARN-ului micobacterian direct din
prelevatele clinice, anterior unui rezultat al culturii
produsului respectiv, iar dezvoltarea lor ulterioar
le-a fcut accesibile laboratoarelor clinice de micobacteriologie.
Exist mai multe metode de AAN: Enhanced
Mycobacterium tuberculosis Direct Test (E-MTD,
Gen-Probe, San Diego, CA); Amplicor Mycobacterium tuberculosis Test (Amplicor, Roche Diagnostic Systems, Inc., Branchburg, NJ); sistemul
Geno Type MTBDRplus ver 2.0 (Hain Lifescience
GmbH, Nehren, Germany).
Identificarea genotipic a acizilor nucleici

Se efectueaz folosind sonde nucleare (GenProbe, AccuProbe Culture Confirmation Test, San
Diego, CA, etc). Acurateea de confirmare este de
100% pentru M. tuberculosis (6). AccuProbe pentru
MTC poate fi efectuat pe culturi att din mediu
solid, ct i lichid i detecteaz prezena tuturor
membrilor MTC. Amplificarea unitii 16S din
ARNr sau elementul de inserie IS6110 sunt cele
mai obinuite inte utilizate. Alte regiuni folosite
pentru amplificare conin gena rpoB care codific
subunitatea din ARN polimeraza, gena hsp65,

42

REVISTA ROMN DE BOLI INFECIOASE VOLUMUL XVII, NR. 1, AN 2014

gena dnaJ, gena recA, gena sodA. Aceste teste se

pot efecua uor, rezultatul se obine n cteva ore i
au o mare specificitate (7).

Teste comerciale
Testul Amplicor MTB

Testul Amplicor (Roche Molecular Systems,

Basel, Switzerland) se bazeaz pe o metod de protein chain reaction (PCR) prin care ADN-ul micobacterian este amplificat cu primeri biotinai formai
pe baza genei 16S a ARNr.
Amplificarea i detecia ADN-ului se efectueaz
automat cu ajutorul aparatului Cobas Amplicor, n
care, fr manevre suplimentare, produsul de amplificare este transferat automat n staia de detecie
unde va avea loc reacia colorimetric de developare
i citire.
Timpul necesar ntregului proces este de cca 6-7
ore. Controlul intern al acestui sistem de detecie a
micobacteriilor este un ADN sintetic caracterizat
prin secvene identice de inte micobacteriene; cnd
acesta nu este amplificat semnaleaz prezena inhibitorilor. Exist i kit-uri Amplicor pentru detecia
ADN ului M. avium i M. intracellulare din prelevate clinice.
n literatura de specialitate se arat c specificitatea sistemului Amplicor MTB este apropiat de
100%, n timp ce sesibilitatea variaz ntre 90% i
100% n specimenele clinice pozitive la microscopie. (8) Dup ali autori sensibilitatea esutului
Amplicor (comparativ cu cultura) pentru probele
de provenien respiratorie este de 79,4-91,9%;
specificitatea este de 99,6-99,8%, iar valoarea predictiv pozitiv este de 92,6-96,6 i valoarea predictiv negativ este de 98,6-98,7% (9).
Sensibilitatea pentru specimenele negative la
microscopie este ntre 40% i 73,1% comparativ cu
cea a E-MTD i de aceea testul Amplicor a fost
aprobat de FDA n SUA doar pentru detecia direct
a M. tuberculosis n specimenele respiratorii BAAR
pozitive la microscopie.
Sistemul E-MTD

E-MTD (Gen-Probe, San Diego, CA) este un

sistem de amplificare izoterm (42C) ce se bazeaz
pe amplificarea transcripiei mediate dezvoltat de
Kwoh i colaboratorii, n care ARNr este eliberat
din celulele tin prin sonicare, dup care primer-ul
promoter se leag de intele ARNr. Revers transcriptaza este apoi utilizat pentru a copia ARNr pe
un hibrid cADN-ARN.
O regiune complex-specific a genei 16S a
ARN-ului produce un dublu standard de ADN prin
aciunea combinat a revers transcriptazei i ribo-

nucleazei. n contrapartid, ARN polimeraza catalizeaz sinteza ARN-ului ribozomal din ADN-ul
ribozomal sintetizat anterior. n acest fel, un nou
ciclu va ncepe n momentul n care noul produs
ARN ribozomal iniiaz noi transcripii prin revers
transcriptaz.
Ampliconii ARN sunt apoi detectai chemiluminiscent cu un ester de acridinium etichetat ADN
ntr-o soluie de hibridizare. ntreaga procedur de
amplificare este izoterm i se produce ntr-un singur tub, ceea ce duce la scderea riscului de contaminare. Dup efectuarea decontaminrii prelevatului clinic, testul E-MTD poate fi finalizat n cca 3
ore. Acest test nu are nevoie de control intern pentru
a monitoriza prezena sau absena inhibitorilor.
Testul E-MTD funcioneaz att n cazul prelevaelor clinice BAAR pozitive la microscopie,
ct i n cazul celor BAAR negative la microscopie.
Sensibilitatea acestui test pentru specimenele clinice respiratorii este de 90,9-95,2%, specificitatea
sa este de 98,8-100%, valoarea predictiv pozitiv
este de 83,3-100%, iar valoarea predictiv negativ
este de 98,4-99,6% (8-10).
Sistemul BD Probe Tec ET

Sistemul BD Probe Tec ET (Becton Dickinson,

Sparks, MD) utilizeaz ADN polimeraza i amplificarea izotermal pentru a produce multiple copii
ale IS6110, un element de inserie unic pentru
M. tuberculosis.
Anterior introducerii probei n sistemul automat
sunt necesare cteva manevre: proba este inactivat
iniial la 105C i apoi sonicat pentru a extrage
ADN-ul, transferat ntr-un godeu la 72,5C i
subsecvent ntr-un godeu de amplificare la 54C. n
aparatul BD Probe Tec ET microplcile coninnd
probele i reactivii de amplificare se incubeaz la
52,5C i fluorescena emis este monitorizat n
mod continuu. Timpul de finalizare al unei probe cu
acest test este de 3,5-4 ore. Testul conine un control
intern caracterizat de aceeai secven ca i inta
micobacterian. Cnd amplificarea nu s-a fcut,
acest control este cel ce d alert pentru prezena
inhibitorilor. n literatura de specialitate se descriu
rate ale sensibilitii testului ntre 98,5% i 100%
pentru probele pozitive la microscopie i foarte
variabile (ntre 0,33% i 100%) pentru probele negative la microscopie (8).
Sistemul de hibridizare pe band (line probe assay)

Exist dou sisteme comerciale de hibridizare

pe band: Geno Type Mycobacterium i INNO
LiPA Mycobacteria.
Geno Type Mycobacterium este un sistem de
revers hibridizare bazat pe multiplex-PCR, produs

REVISTA ROMN DE BOLI INFECIOASE VOLUMUL XVII, NR. 1, AN 2014

de firma Hain Lifescience GmbH, Nehren, Germania.

Poate detecta att MTC, ct i micobacteriile atipice
(M. avium, M. chelonae, M. abscessus, M. fortuitum,
M. gordonae, M. intracellulare, M. scrofulaceum,
M. interjectum, M. kansasii, M. malmoense,
M. peregrinum, M. marinum/M. ulcerans, complexul M. tuberculosis i M. xenopi).
Sistemul se bazeaz pe detecia polimorfismului
unei singure nucleotide din gena gyrB i pe prezena
sau absena regiunilor de difereniere (RD). Diferitele probe specifice de ADN apar imobilizate ca
linii paralele pe o band i sunt detectate colorimetric.
Sistemul Geno Type Mycobacterium are mai
multe kit-uri:
Geno Type MTBDRplus v 2.0, kit de analiz genetic pentru identificarea complexului M. tuberculosis i identificarea rezistenei la rifampicin (RIF)
i izoniazid (INH) din specimen clinic pozitiv i/
sau negativ microscopic i probe din cultura
bacterian.
Acest test se efectueaz de rutin n cele 2 laboratoare naionale de referin din Romnia pentru toate prelevatele clinice pozitive n microscopie.
Geno Type MTBC, kit de difereniere a complexului M. tuberculosis din culturi, ce difereniaz
urmtoarele specii aparinnd complexului M. tuberculosis: M. tuberculosis/M canettii, M. africanum, M. microti, M. bovis subsp. bovis, M. bovis
subsp. caprae i M. bovis BCG. Acest kit este cea
mai fiabil metod direct de identificare a membrilor MTC, dar nu poate diferenia M. canetii de
ali membri ai MTC.
Geno Type Mycobacterium CM (Common Mycobacteria) ver 1.0, kit de analiz genetic pentru
identificarea celor mai relevante specii micobacteriene cu importan clinic din culturi, identific
urmtoarele specii micobacteriene: M. avium ssp.
M. chelonae, M. abscessus, M. fortuitum, M. gordonae, M. intracellulare, M. scrofulaceum, M. interjectum, M. kansasii, M. malmoense, M. peregrinum, M. marinum/M. ulcerans, complexul M.
tuberculosis i M. xenopi.

43

Testele Geno Type sunt relativ uor de efectuat,

sunt uor de interpretat i sunt rapide.
Sensibilitatea acestor teste, comparativ cu secvena 16S din gena ARNr este de 97,9-99,3%, iar
specificitatea de 92,4-99,4% (8).
Sistemul INNO LiPA Mycobacteria v.2 este
bazat pe principiul revers hibridizrii. Materialul
ADN biotinat este hibridizat cu probe de oligonucleotide specifice imobilizate ca linii paralele pe
o band. Dup hibridizare se adaug streptavidina
etichetat cu fosfataza alcalin ce se leag de orice
hibrid biotinat format anterior. Incubarea cu
5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfat i nitroblue tetrazolium (BCIP/NBT) determin apariia unui precipitat brun purpuriu. Pentru a lucra testul INNOLiPA Mycobacteria v.2, trebuie efectuat amplificarea regiunilor spacer 16S-23S din ARNr. Apoi
produsul de amplificare este hibridizat folosind o
band pe care sunt fixate 22 de probe paralele de
ADN i 2 probe de control (Fig. 2).
Apariia unor linii clar vizibile pe band este
considerat ca reacie pozitiv. Rezultatele obinute
se interpreteaz folosind un ablon furnizat de
productor. Pot fi astfel identificate 17 din cele
mai frecvent izolate specii micobacteriene: MTC,
M avium, M. intracellulare, M. scrofulaceum,
M. kansasii, M. xenopi, M. chelonae, M. gordonae,
M. fortuitum, M. malmoense, M. genavense, M. simiae,
M. smegmatis, M. haemophilum, M. marinum/
M. ulcerans i M. celatum. Sensibilitatea este de
100%, iar specificitatea de 94,4%. (8) Dar INNO
LiPA Mycobacteria v.2 nu poate fi lucrat dect pe
probe din cultur i nu direct din prelevate clinice.
Alte tehnici de biologie molecular prin care se
pot obine rezultate rapide i de mare acuratee n
identificarea speciilor micobacteriene sunt:
Tehnica de secveniere a ADN-ului. Ea const
n efectuarea unei amplificri a ADN-ului micobacterian extras din cultura cu primeri genus-specifici,
urmat de o secveniere a ampliconilor ntr-un sistem automat. Identificarea ulterioar a tulpinii micobacteriene se face prin compararea secvenei de
nucleotide cu o baz cunoscut de secveniere.

FIGURA 2. Localizarea diverselor probe pe banda de INNO LiPA Mycobacteria v2.

44

REVISTA ROMN DE BOLI INFECIOASE VOLUMUL XVII, NR. 1, AN 2014

Asfel de baze de secveniere sunt GenBank, Ribosomal Differentiation of Medical Microsystems

Database (RIDOM)(11), European Molecular Biology Laboratory (EMBL). Cea mai utilizat int
pentru secveniere este 16S ARNr. Instrumentul
comercial cu care se poate efectua secvenierea 16S
ADNr este MicroSeq System (Applied Biosistems,
CA). Prin aceast tehnic nu poate fi difereniat
M. canetti de ali membri ai MTC, dup cum nu pot
fi difereniate nici alte specii de micobacterii ca
M. chelonae, M. abscessus, M. immunogenum.
Pentru diferenierea acestora este necesar o a doua
tehnic de analiz a deleiei.
Reacia de polimerizare n lan i analiza enzimelor de restricie pentru identificarea micobacteriilor din cultur
Este o metod dezvoltat n 1993 de Teleni i
colaboratorii, ce se bazeaz pe amplificarea secvenei 441-bp a genei hsp65 prin tehnica de PCR,
urmat de restricia produsului de amplificare cu
ajutorul a dou enzime de restricie BstEll i Haell.
Fragmentele rezultate n urma digestiei cu enzime
restrictive sunt apoi analizate prin electrofereza n
gel de agaroza i comparate cu un algoritm preexistent. Testul poate fi finalizat ntr-o singur zi. (8)
Metod de genotipare IS6110 RFLP (Restriction
Lenght Fragment Polymorphism) detecteaz variaiile generate de inseria elementului IS6110. Acest
element de inserie este capabil de autocopiere i
apoi se poate insera oriunde n genom printr-un
proces denumit transpoziie. Diversele tulpini difer ntre ele att prin numrul de copii al elementului
IS6110, ct i prin poziia acestor copii n ADN-ul
bacterian. Aceasta a devenit actualmente cea mai
folosit metod pentru diferenierea tulpinilor de
M. tuberculosis izolate. Metoda se poate aplica
doar culturilor de micobacterii de 20-40 de zile
pentru a putea obine suficient material ADN.
Perioada mare de timp limiteaz utilitatea metodei
de tipare RFLP, n special n studiile de transmisie
nozocomial a tuberculozei n uniti clinice. (12)
Spoligotiparea (spacer oligonucleotide typing),
o nou metod de selecie i tipare a MTC dezvoltat
n ultimii ani, este o metod de hibridizare ce
detecteaz variabilitatea n regiunile direct repetitive (DR) din ADN-ul M. tuberculosis. Spoligotiparea este, de fapt, o amplificare a locusurilor DR
ce implic o reacie de PCR, urmat de hibridizarea
produilor de reacie pe o membran ce conine
oligonucleotidele corespunztoare celor 43 de
spaceri legai covalent (Fig. 3). Fiecare tulpin de
micobacterie are un semnal pozitiv sau negativ
pentru fiecare spacer. Rezultatul se poate obine
dintr-o cultur de M. tuberculosis ntr-o singur zi.

Datele din studii internaionale de spoligotipare au

identificat un numr mare de clade sau genogrupuri
(12).

FIGURA 3. Spoligotiparea aspectul spacerilor n

diverse tulpini micobacteriene (13).

Recombinarea genetic, rearanjrile i inseriile/

deleiile asociate acestor elemente, locaia cromozomal i numrul de copii au fost utilizate ca
markeri specifici epidemiologici pentru tulpinile de
M. tuberculosis.
Secvena de ADN cu cel mai mare potenial de
amplificare este elementul de inserie IS6110.
Depinznd de organismul n care a fost caracterizat,
acest element este denumit IS6110 sau IS986
(M. tuberculosis) sau IS987 (M. bovis BCG).
Huard i colaboratorii au investigat profilul DR
al MTC i, bazndu-se pe acest profil, au dezvoltat
o metod rapid i simpl de tipizare a MTC care
utilizeaz, regiunile cromozomale ale MTC ca regiuni de difereniere a deleiei locilor. Ei au utilizat
apte perechi de primeri PCR pentru a amplifica
loci specifici cu care au efectuat un panel de tipare
PCR a MTC.
Acest panel nu face doar diferenierea ntre subspeciile MTC, ci face i o difereniere a izolatelor
MTC de speciile importante de NTM. (14)
Este cunoscut faptul ca diferitele tulpini de
M. tuberculosis au caractere clinice i epidemiologice
distincte. Unele tulpini de M. tuberculosis au o
mare capacitate de diseminare i de a deveni MDR,
n timp ce altele tind s aib doar o limitare local.
De aceea, n ultimul timp a nceput s se acorde o
atenie sporit identificrii tulpinilor de M. tuberculosis. Filogenetic, distribuia specific a clonelor
de M. tuberculosis sau a tulpinilor de MDR-TB
poate fi urmrit prin metode de tipare molecular
la nivel regional, de ar sau chiar la nivel global.
Instrumentul folosit pentru tiparea epidemiologic
a tulpinilor de M. tuberculosis este spoligotiparea
(15;16).
Exist o baz internaional de date de spoligotipare. Cea mai recent versiune, cea de-a patra
baz de date, SpolDB4 conine cca 60.000 de modele distribuite n 2 300 SIT.

REVISTA ROMN DE BOLI INFECIOASE VOLUMUL XVII, NR. 1, AN 2014

Metoda de tipare VNTR (Variable Number

Tandem Repeat) se bazeaz pe analiza segmentului
de ADN ce conine secvena de tandem repeat;
numrul de copii al acestei secvene variaz ntre
tulpini. Metoda const n calcularea numrului de
repetiii pe baza mrimii produsului de amplificare.
Lungimea elementelor repetitive reflect numrul
de copii VNTR amplificate. Rezultatul final este un
cod numeric, corespunztor fiecrui locus VNTR.
Acest tip de genotipare numeric permite studii
comparative intra i interlaboratoare. n comparaie
cu metod IS6110 RFLP, metoda de tipare VNTR
este mai rapid i virtual potrivit pentru toate izolatele de M. tuberculosis, inclusiv pentru acelea cu
doar cteva copii. (17)
Toate aceste teste de AAN existente pe pia fac
posibil scurtarea perioadei de diagnostic, dar ele
nu nlocuiesc examenul microscopic sau cultur.
Pentru c testele nu pot face distincia ntre bacilii tuberculosi vii i cei mori, ele nu pot fi folosite
pentru monitorizarea terapiei antituberculoase. Clinicianul trebuie s interpreteze rezultatul testelor
AAN doar n context clinic (9).
Teste pentru identificarea rezistenei la
medicamentele antituberculoase

TB-MDR constituie actualmente o serioas ameninare din cauza faptului c exist doar un numr
foarte limitat de medicamente antituberculoase ce
se pot administra n asemenea cazuri.

45

Testele de sensibilitate la medicamentele antituberculoase se efectueaz n mod curent n laboratoarele abilitate prin metodele clasice pe medii
solide sau lichide cu medicamente antituberculoase
i prin definirea rezistenei ca i cretere a micobacteriei testate mai mare sau egal cu 1% mpotriva
medicamentului testat. (18)
M. tuberculosis devine rezistent la medicamentele antituberculoase n urma mutaiilor ce apar la
nivelul locilor cromozomali. Mutaiile punctiforme
determin apariia rezistenei la un singur medicament, iar acumularea mai multor astfel de mutaii
punctiforme duce la apariia MDR-TB i XDR-TB.
Apariia tulpinilor de M. tuberculosis rezistente la
antituberculoase se produce n special atunci cnd
tratamentul antituberculos este aplicat cu intermiten, cnd el nu este adecvat, cnd pacientul primete un singur antibiotic antituberculos, cand pacientul nu este compliant la tratament, cnd medicamentele antituberculoase sunt de calitate slab i
rareori datorit slabei absorbii la nivel intestinal.
Detecia tulpinilor de M. tuberculosis rezistente
la antituberculoase se face n mare parte prin metode fenotipice n urma cultivrii pe medii solide cu
medicamente antituberculoase (LJ) sau medii lichide n apatate de tip BACTEC TB-460, BACTEC
MGIT 960, Bact/Allert 3D sau VersaTrek. Cultivarea micobacteriilor pe medii lichide a determinat
o oarecare scurtare a timpului de identificare, dar
nu suficient pentru orientarea clinicienilor n pre-

FIGURA 4. Mecanismul rezistenei la medicamentele antituberculoase (19)

46

REVISTA ROMN DE BOLI INFECIOASE VOLUMUL XVII, NR. 1, AN 2014

scrierea tratamentului optim. Apariia metodelor

moleculare este cea care a fcut posibil scurtarea
perioadei de detectare a rezistenei. Zhang i colaboratorii au sistematizat mecanismele de rezisten la medicamente antituberculoase, redate n
Figura 4. (19)
Mutaia cea mai bine studiat este cea care
determin rezistena M. tuberculosis la rifampicina
(RIF). RIF este un antibiotic antimicobacterian ce
face parte din terapia standard a TB. n 96% din
cazurile de rezisten la RIF, aceasta se datoreaz
mutaiilor n segmentul 81-pb al genei rpoB ce
codeaz subunitatea a ARN polimerazei (9,20,21).
Rezistena la izoniazid (INH) este determinat
de alterri n mai multe gene, dar mutaiile n genele
katG i inhA s-au gsit n proporie de 75-85% la
tulpinile de M. tuberculosis rezistente la INH.
Bazele genetice ale rezistenei la alte antibiotice
antituberculoase sunt mult mai complexe: rezistena
la streptomicin i la alte aminoglicozide este
determinat de mutaii n gena 16S ARNr sau pe
gena rpsL; rezistena la pirazinamid (PYZ) este
determinat de mutaii n gena pncA; rezistena la
ethambutol (ETH) este determinat de mutaii n
gena embB(9).
Tehnicile care permit detecia mutaiilor ce determin rezistena la diverse medicamente antituberculoase sunt:
Secvenierea ADN-ului prin reacia de polimerizare n lan se bazeaz pe amplificarea regiunii asociate rezistenei, dup care ampliconii sunt
secveniai pentru a putea determina prezena sau
absena mutaiilor specifice.
Tehnici de hibridizare pe band, cu cele dou
sisteme comerciale: Inno-LiPA RifTB (Innogenetics, Gent, Belgium) i Geno Type MDRTBplus
(HAIN Lifescience, Nehren, Germany) ce detecteaz rezistena la RIF i/sau INH i Geno Type
MDRTBsl, pentru detecia rezistenelor la fluoroquinolone, etambutol i aminoglicozide. Ambele
tehnici sunt specifice pentru MTC.
Inno-LiPA RifTB conine 10 oligonucleotide
pe banda de nitroceluloz: una pentru MTC, 5
pentru tulpinile slbatice (S1-S5) i 4 (R) pentru
probe n vederea deteciei celor mai frecvente mutaii ce determin rezistena la RIF. Probele R folosite sunt: R2 Asp615Val, R4 His526Tyr, T4b His
526Asp, R5 Ser531Leu. O tulpin de M. tuberculosis
este considerat sensibil la RIF dac toate cele 5
probe slbatice dau un semnal pozitiv i dac cele 4
probe pentru rezisten sunt negative. Absena hibridizrii n una sau mai multe din probele S
semnific o mutaie ce trebuie identificat prin prin
una din probele R. Inno-LiPA RifTB se recomand

a fi utilizat numai n probele n care exist o cantitate

mare de ADN i nu poate fi utilizat direct n
specimenele clinice.
Geno Type MTBDRplus identific simultan
MTC i detecteaz cele mai comune rezistene n
gena rpoB (rezistenta la RIF), katG i inhA (rezistena la INH) (Fig. 5). Rezistena la rifampicin
este identificat n 98,7% dintre cazuri, iar rezistena
la HIN n 92% dintre cazuri folosind Geno-Type
MTBDRplus. Acest test poate fi folosit att pentru
detecia rezistenelor la RIF i INH n tulpinile de
M.tuberculosis izolate pe medii de cultur solide
sau lichide, ct i direct din produsele patologice
pozitive la microscopie (22).
Geno Type MTBDRsl pentru detecia rapid a
rezistenelor la fluoroquinolone, aminoglicozide de
linia a 2-a (amikacin i kanamicin), etambutol i
peptide ciclice (capreomicin) direct din prelevaele
clinice i/sau din cultur. Specificitatea i sensibilitatea sunt ntre 70-80%. Acest test este foarte
util n detecia rapid a pacienilor XDR-TB (23).
PCR-SSCP (protein chain reaction single
strand conformation polymophisms) se bazeaz
pe distorsiunea conformaional pe care substituia
unei nucleotide o poate determina ntr-un singur fir
al unui fragment ADN. Aceast schimbare conformaional determin o mobilitate electroforetic
diferit de cea a fragmentului unui singur fir al
tulpinii slbatice. Aceast metod are o specificitate
de 100% pentru rezistena la RIF i INH i o
sensibilitate de 96% pentru RIF i 87% pentru INH,
utiliznd 4 regiuni genetice (rpoB, katG, inhA i
ahpC). (8)
Metodologia Real-time PCR are o specificitate
de 100% att pentru rezistena la RIF, ct i pentru
cea la INH, iar sensibilitatea este de 98% pentru
detecia mutaiilor responsabile de rezistena la RIF
i 85% pentru detecia mutaiilor responsabile de
rezisten la INH.
Metoda Microarray are la baz regula de complementaritate a bazelor din mostre de ADN cunoscute cu cele din ADN-ul de identificat (24). Prin
analiza unui singur fragment se pot afla informaii
despre mii de gene. O astfel de tehnic este cea
cunoscut sub denumirea de TB-Biochip, prin care
se pot depista rezistene la RIF i INH. Tehnica
biocipurilor a fost dezvoltat de A.D. Mirzabekov
n anii 1980 n Federaia Rus i a fost primul test
de genetic molecular de uz comercial folosit n
diagnosticul TB-MDR.
GeneXpert MTB/RIF (Cepheid GeneXpert
System, Sunnyvale) este un sistem nchis, complet
automatizat, cu card, pentru detecia MTC i a rezistenei la RIF. Metoda const ntr-o reacie de

REVISTA ROMN DE BOLI INFECIOASE VOLUMUL XVII, NR. 1, AN 2014

47

FIGURA 5. Exemple cu benzi Geno Type MDRTB plus prezentnd diverse tipuri de rezistene: 1) MT sensibil la RIF
i INH; 2) MT cu rezisten la RIF i INH (MDR-TB); 3) MT cu monorezisten la INH; 4) MT cu rezisten la RIF i
INH (MDR-TB); 5) MT cu rezisten la RIF i INH (MDR-TB).

PCR n timp real i analiza fragmentelor genetice

de amplificare. Rezultatul se obine n decurs de
dou ore i riscul de contaminare este foarte mic.
Dezavantajul este dat de costul ridicat al echipamentului i al cardurilor de unic folosin.
Prin comparaie cu antibiograma fenotipic pentru detecia rezistenei la RIF, sensibilitatea metodei
este de 99,2%, pn la 100% pentru prelevatele
clinice pozitive la examinarea microscopic i de
72,5% pn la 84,6% pentru prelevatele clinice
negative la examinarea microscopic, dar pozitive
la cultur (25,26). OMS recomand nc din anul
2010 utilizarea acestui sistem n rile cu endemie
TB crescut n diagnosticul iniial al suspecilor de
MDR-TB i al celor cu asociere HIV/TB, tiut fiind
c n 85% dintre cazuri rezistena la RIF se asociaz
rezistenei la INH.
Pirosecvenierea este o metod relativ nou de
secveniere a ADN-ului micobacterian i de depistare a rezistenelor la medicamentele antituberculoase
i care s-a dovedit foarte bun. Exist studii care au
artat o sensibilitate a metodei de 96,7% i o specificitatea de 97,3%. (27) Este o metod mai puin

costisitoare dect GeneXpert, dar rezultatele se

obin n 1-3 zile.
Metoda cromatografiei lichide de nalt performan (HPLC) este o metod de difereniere a
micobacteriilor bazat de diferenele de profil din
acidul micolic. Acizii micolici sunt acizi grai cu
greutate molecular mare ce se pot separa cromatografic, iar cromatograma este apoi interpretat
dup un model specific pentru fiecare specie de
micobacterie. Este o metod cu mare sensibilitate i
specificitate, dar care necesit o nalt expertiz n
recunoaterea speciilor i este greu de aplicat n
laboratoarele de diagnostic curent i nici nu poate fi
folosit direct pe prelevatele clinice. (28)
Utilitatea clinic a metodelor moleculare este
deosebit, ele scurtnd perioada de diagnostic, dar
niciuna din aceste metode nu nlocuiete microscopia frotiului din prelevatul clinic i cultur. Ele
mresc capacitatea de diagnostic n msura n care
sunt corect interpretate, n context clinic i n concordan cu caracteristicile lor de performan, dar
i ale laboratorului ce le efectueaz.

48

REVISTA ROMN DE BOLI INFECIOASE VOLUMUL XVII, NR. 1, AN 2014

BIBLIOGRAFIE
1.
2.
3.

4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.

11.

12.

13.
14.

15.

Cornaglia G., Courcol R., Herrmann J.-L., Kahlmeter G.,

Peigue-Lafeuille H., Vila J. European Manual of Clinical
Microbiology, first edition, ESCMID, 2012
WHO New laboratory tools for tuberculosis control. 2009.
A. Somoskovi, Z. Bartfai, C. Kodmon, I. Hutas Routine direct
detection of Mycobacterium tuberculosis with a rapid test of
polymerase chain reaction applied to a Hungarian patient population.
Orv Hetil, 2001. 142 (38): 2085-2090.
A. Somoskovi, Judit Mester, Yvonne M. Hale, Linda M. Parsons,
M. Salfinger, MD. Laboratory diagnosis of nontuberculous
mycobacteria. Clin Chest Med, 2002. 23 (3): 585-597.
S. Narayanan Molecular epidemiology of tuberculosis, Indian J
Med Res 120, October 2004, p.233-247.
Lebruni L, Espinasse F., Poveda J.V. Vincent-Levy-Frebault
Evaluation of nonradioactive DNA probes for identification of
mycobacteria. J Clin Microbiol. 1992; 30: 2476-2478.
Karen L. Kaul Molecular Detection of Mycobacterium tuberculosis;
Impact on Patient Care, Clinical Chemistry, 2001, vol.47, No.8,
1553-1558.
Sharma N, Sharma V, Singh PR, Jawed B, Babu V, Kandpal J,
Nautiyal SC, Singh RK Tuberculosis and Molecular Diagnosis,
WebmedCentral Biotechnology 2013; 4(2):WMC003992.
Hanna Soini and James Musser Molecular Diagnosis of
Mycobacteria, 2001. Clinical Chemistry 47:5, p. 809-814.
Bergman JS, Youh G, Fish G, Woods GL. Clinical evaluationof
the enhanced Gen-Probe amplified Mycobacterium tuberculosis
direct test for rapid diagnosis of tuberculosis in prison inmates, J Clin
Microbiol 1999; 37:1419-1425.
Dag Harmsen, Jorg Rothgange, Matthias Frosch, and Jurgen
Albert RIDOM: Ribosomal Differentiation of Medical Microorganisms Database, Nucleic Acids Research, 2002, January 1;
30(1):416-417.
Andrea Gori, Alessandra Bandera, Giulia Marchetti, Anna Degli
Esposti, Lidia Catozzi, Gian Piero Nardi, Lidia Gazzola, Giulio
Ferraio, Jan D.A. van Embden, Dick van Soolingen, Mauro
Moroni, and Fabio Franzetti Spoligotyping and Mycobacterium
tuberculosis. Emerging Infectious Diseases, vol.11, No.8, August
2005.
ECDC/WHO Regional Office for Europe Tuberculosis
surveillance and monitoring in Europe, Stockholm: ECDC 2013.
Richard C. Huard, Luiz Claudio de Oliveira Lazzarin, W. Ray
Butler, Dick van Soolingen, and John L. Ho. PCR-Based Method
To Differentiate the Subspecies of the Mycobacterium tuberulosis
Complex on the Basis of Genomic Deletion, 2003. J Clin Microbiol, p.
1647-1650.
E.M. Streicher, T.C. Victor, G. van der Spuy, C. Sola, N. Rastogi,
P. D. Van Helden, and R. M. Warren Spoligotype Signatures in the
Mycobacterium tuberculosis Complex. J Clin Microbiol, 2007,
p.237-240.

16. CDC http://cdc.gov/tb/programs/genotyping/

17. Philip Supply Multilocus Variable Number Tanden Repeat
Genotyping for Mycobacterium tuberculosis. Technical Guide.2005.
Institute de Biologie/Institute Pasteur de Lille.
18. G. Canetti, S. Froman, J. Grosset, P. Hauduroy, Miloslava
Langerova, H. T. Mahler, Gertud Meissner, D. A. Mitchinson, and
L. Sula. Mycobacteria: Laboratory Methods for Testing Drug
Sensivity and Resistance. Bull WHO. 1963, 29: 565-578.
19. Zhang Y, Yew W. W. Mechanism of drug resistance in
Mycobacterium tuberculosis. 2009. Int J Tuberc Lung Dis,
139(11):1320-1330.
20. M. Syaifudin Molecular Identification of Mycobacterium
tuberculosis and Analysis of Its Resistance to Rifampin in Sputa
From Tuberculosis Suspected Patients, Atom Indonesia, vol.36,
no.2(2010), 51-58.
21. Morgan M., Kalantri S., Flores L., and Pai M. A commercial line
probe assay for the detection of rifampicin resistance in
Mycobacterium tuberculosis: a systematic review and meta-analysis:
BMC Infect. Dis, 2005, 5: 62.
22. Somoskovi A., Dormandy J., Mitsani D., Rivenburg J.,
Salfinger M. Use of smear-positive samples to assess the
PCR-based genotype MTBDR assay for rapid, direct detection of the
Mycobacterium tuberculosis complex as well as its resistance ti
isoniazid and rifampin, 2006, J. Clin. Microbiol, 44, 4459-4463.
23. Crudu V., Romancenco E. Diagnosticul microbiologic al
tuberculozei GHID. Ministerul Sanatatii din Rep. Moldova. Institutul
de Ftiziopneumologie. Lab. National de Referinta in microbiologia
tuberculozei, 2012.
24. Heyman S.J., Brewer T.F., Wilson M.E. (1999). The need for
global action against multiresistant tuberculosis. JAMA, vol 281,
No.1, 2138-2140.
25. Sandgren A., Hollo V., Huitric E., Kodmon C. Epidemiology of
tuberculosis in EU/EEA in 2010 monitoring the progress towards
tuberculosis elimination. Euro Surveill.2012;17(12):pii=20124.
26. WHO New laboratory diagnostic tools for tuberculosis control.
Geneva: World Health Organization, 2008. http://whqlibdoc.who.int/
publication/2008/9789241597487.
27. Lulette Tricia C. Bravo, Marion J. Tuohy, Concepcion Ang, Raul
V. Destura, Myrna Mendoza, Gary W. Procop, Steven M. Gordon,
Geraldine S. Hall, and Nabin K. Shrestha. Piroquencing for Rapid
detection of Mycobacterium tuberculosis Resistance to Rifampin,
Isoniazid, and Fluoroquinolones. J Clin Microbiol, 2009, p. 39853990.
28. N. Esther Babady and Nancy L. Wengenack. Clinical Laboratory
Diagnostics for Mycobacterium tuberculosis (2012), Understanding
Tuberculosis Global Experiences and Innovative Approaches to the
Diagnosis, Dr. Pere-Joan Cardona(Ed).