Sunteți pe pagina 1din 23

Proiect

Determinarea Ochratoxinei A din cafea boabe prin


metoda HPLC

1. Introducere
Micotoxinele sunt substane chimice produse de anumite specii de mucegaiuri:
Aspergillus, Fusarium, Penicillium, Trichothecium, etc. Ele pot fi puse n eviden i n sporii
acestora sau n substratul pe care cresc fungii. Exist o varietate foarte mare de micotoxine,
dar nu toate sunt importante din punctul de vedere al siguranei alimentaiei umane.
Micotoxinele cele mai importante, cu riscuri semnificative pentru sigurana alimentaiei
umane sunt: aflatoxinele, fumonisinele, ochratoxinele, patulina, trichotecina i ergotoxina.
Oamenii de tiin i-au descoperit la nceputul anilor 1960 odat cu izbucnirea bolii
curcanuluiX n Anglia. Aproape 100.000 de curcani au fost ucii, deoarece alunele pe care leau consumat erau contaminate cu Aspergillus flavus, un mucegai ce produce micotoxine.
Mai mult, toxina nu poate fi distrus prin fierbere sau prin metabolism. Astfel, un
animal care a mncat porumb infectat transmite toxina mai departe la omul care consum
carnea animalului sacrificat. Occidentalii au luat imediat msuri, n sensul c au dezvoltat o
adevrat industrie a depozitrii, diferit pentru fiecare produs n parte. Un astfel de sistem de
protecie n alimentaia public, numit HCCP - de exemplu - a fost preluat de la specialitii
NASA, care l inventaser pentru securitatea cosmonauilor. Concomitent au adoptat o serie
de msuri legislative care s protejeze piaa alimentar de produsele infectate cu toxina
uciga. Fenomenul este n continuare studiat de specialitii occidentali, majoritatea rilor
lumii fiind monitorizate din acest punct de vedere, acest lucru producnd efecte economice
pentru cei ce ncalc legislaia securitii alimentare.
Alte mucegaiuri care produc micotoxine includ Aspergillus, Penicillium i Fusarium.
Diferite mucegaiuri produc diferite micotoxine. Mai mult de 400 micotoxine au fost
pn acum identificate, iar numrul lor continu s creasc.
O situaie precis a distribuiei geografice a micotoxinelor a fost fcut ntr-un studiu
prezentat n 1977, la prima conferin despre micotoxine a Organizaiei pentru Alimentaie i
Agricultur (FAO), Organizaiei pentru Sntate Mondial (WHO) i Programului Naiunilor
Unite pentru Mediu (UNEP). Aceasta a artat c n alimentele i nutreurile contaminate
natural cu fungi se gsesc n concentraii mari doar apte micotoxine: aflatoxina, ochratoxina
A, patulina, zearalenona, tricotecenele, citrinina i acidul penicilic.
Distributia micotoxinelor n diferite zone ale globului se caracterizeaz prin
urmtoarele:

n regiunile reci (Canada, nordul SUA i majoritatea rilor europene) domin aflatoxinele
(excepie fac produsele de import provenite din rile calde) dar foarte importante sunt:
vomitoxina, zearalenona, ochratoxina, DAS, toxina T-2 i toxina HT-2;
n sudul i centrul Europei, unde se cultiv porumb (Suedia, Austria, Ungaria), domin
fusariotoxinele (vomitoxina, zearelona, toxina T-2);
n nordul Europei (Danemarca, Polonia) pe primul loc se afl ochratoxina A;
n regiunile calde i umede din America Latin, Asia, Africa i anumite zone din Australia,
mai rspndite sunt aflatoxinele.
Micotoxinele pot fi produse cnd produsele alimentare sunt infectate cu mucegaiuri ori
n timpul perioadei de cretere a plantelor sau n timpul depozitrii. Procesul de fabricaie
include msuri de prevenire a contaminrii cu mucegaiuri, dar cu toate acestea, deoarece este
dificil de meninut produsele complet sterile, se poate ca acesta s conin totui mici cantiti
de micotoxine.
n rile dezvoltate cu clim temperat, aceste concentraii sunt att de joase, nct nu
sunt duntoare. n rile n curs de dezvoltare din regiunile tropicale sau subtropicale,
micotoxinele apar mai des i n concentraii mai mari din cauza condiiilor de depozitare
necorespunztoare. De asemenea, climatul cald i umed al regiunilor tropicale crete riscul de
infecie cu mucegaiuri. esutul animal poate fi infectat cu micotoxine cnd animalele sunt
hrnite cu mncare contaminat cu mucegai.
Exist cteva ci care ajut la distrugerea mucegaiului care poate fi prezent n
ingredientele crude i care ajut la prevenirea dezvoltrii lui n produsele alimentare. n
timpul depozitrii i procesrii se iau msuri stricte pentru a ajuta la prevenirea creterii
mucegaiurilor. Condiiile de depozitare sunt foarte importante. Mucegaiurile necesit
combinaii potrivite de ap, nutrieni, temperatur i aciditate pentru a crete i nmuli.
Creterea lor poate fi prevenit prin controlarea acestora i a altor factori. De exemplu,
nclzirea pe o perioad suficient de timp ucide mucegaiurile, de aceea multe tehnici de
procesare a produselor alimentare ce includ pasteurizarea i conservarea ajut la ndeprtarea
oricror mucegaiurilor care pot fi prezente. Uscarea produselor ndeprteaz umezeala
necesar mucegaiurilor, n timp ce, reducnd temperatura de depozitare sau fcnd produsele
mai acide ajut la prevenirea creterii mucegaiurilor.
Majoritatea mucegaiurilor sunt sensibile la cldur i sunt distruse prin pasteurizare.
Cteva tipuri de mucegaiuri sunt cu toate acestea rezistente la cldur. Acestea sunt adesea
gsite n fructe, produse din fructe sau produse neprelucrate derivate din fructe (de exemplu
pectin) i necesit temperaturi de 100 C sau mai mari pentru a fi distruse. Cu toate c acest
3

tratament termic funcioneaz pentru mucegaiuri, multe micotoxine nu sunt sau sunt parial
distruse prin pasteurizare sau sterilizare.
2. Clasificarea principalelor micotoxine
Cele mai frecvente micotoxine sunt aflatoxinele, ochratoxinele,
patulina, sterigmatocitele, tricotecenele i zearaleonele.
Aflatoxinele sunt secretate de Aspergillus flavus, dar i de un numr
mare de mucegaiuri printre care: Aspergillius ochraceus, Penicillium
puberulum, diferii de penicilii i chiar Rizopus sp. Principalul productor
rmne ns Aspergillius flavus, care are sporii galben-verzui i este lipsit de
ascosporic. Se dezvolt bine pe semine oleaginoase i produse secundare rezultate de la
fabricarea uleiului (srot, tre), n special pe arahide, dar i pe cereale. O ngrijorare
justificat a aprut n condiiile extinderii n alimenaia derivatelor proteice din leguminoase
ca nlocuitori de lapte i carne, deoarece posibilitatea ngerrii aflatoxinelor de ctre populaie
i n special de ctre copii a crescut foarte mult. Astfel s-au descris hepatite acute la copii n
alimenaia crora s-au depistat cantiti mari de aflatoxine, ca urmare a folosirii de nlocuitori
de lapte obinui din semine oleaginoase atacate de fungi.
ntruct producia maxim de aflatoxine are loc la o incubare la 24-25 C, deci la
temperaturi relative ridicate, acumularea aflatoxinelor este specific rilor cu clim cald.
Aflatoxinele sunt reprezentate de patru fraciuni majore i o serie de fraciuni minore,
toate derivai ai furofuranului cu nucleu cumarinic substituit, identificat dup fluorescent n
lumina ultraviolet.
Principalele fraciuni cunoscute sunt: B1, B2, G1, G2, M1, M2, B2 , P1. Toxicitatea maxim
o prezint aflatoxina B1, urmat de G1, B2, i G2. Fraciunea P1, s-a dovedit a fi lipsit de
toxicitate, n teste pe embrionii de gin i de asemenea fraciunile B2 i G2.

Fig. 1 Structura principalelor aflatoxine


Aflatoxinele au greuti moleculare mici, ceea ce le priveaz de proprietile
antigenice. Ele sunt foarte termostabile, n schimb sunt stabile la aer i lumin. Aflatoxinele
pot fi considerate ca fiind puternice hepatotoxice, hepatocancerigene i mutagene. S-a
constatat ca animalele tinere sunt mai sensibile dect cele n vrst. Exist de asemenea,
diferente de sensibilitate n funcie de specie, ce mai mare sensibilitate prezentnd-o bobocii
de ra. De remarcat c toate vertebratele, de la om pn la peti, sunt sensibile la aflatoxine,
ns n mod diferenial. La unele specii predomin efectul hepatotoxic, la altele cel
hepatocancerigen. Valoarea DL50 variaz n funcie de tipul aflatoxinelor ((mg/kg); de
exemplu pentru aflatoxina B1, 0,018; pentru B2 0,085, pentru G1 0,039, pentru G2 0,173.
n anul 1961, Lancaster i colaboratorii au pus n eviden proprietiile cancerigene
ale aflatoxinelor. Capacitatea cancerigen nu se constituie numai la nivel hepatic, ci i la
stomac, pulmoni etc. Tipul de leziune este de hepatit necrozant difuz, pn la ciroz
mutil.
Intoxicaia evolueaz acut sau cronic, n funcie de doza de aflatoxin ingerat de
sensibilitate. n general n intoxicaiile acute se remarc starea hemoragipar, dizenterie,
uneori icter, creterea activitii unor enzime serice. Aflatoxicoza cronic are, dup Moreau,
efecte de carcinogenoz, teratogenoz i mutagenez.
5

Mediul cel mai favorabil pentru formarea aflatoxinelor l reprezint arahidele i porumbul.
n India de exemplu, unde se produce 38% din cantitatea mondial de arahide, 10-40%
din probele sub form de boabe i 82% din sroturile analizate n perioada 1965-1967 coninea
micotoxine n concentraii ridicate. n Norvegia, aflatoxinele au fost identificate n toate
probele de arahide importante n perioada 1968-1973, 11,3% din eantioane depind
coninutul de 100 g/kg.
n porumb, aflatoxinele au fost depistate n rile de nord i sudul Americii, din Asia i
Africa. n S.U.A de exemplu, n statele din zona sud-vestic, aflatoxinele au fost prezentate n
50% din probe la o concentraie de 60g/kg; n statul Georgia, n 1979, n 90% din probele de
porumb testate au fost gsite aflatoxine. Aflatoxina M1 a fost identificat n 50% din probele
de lapte analizate, n Iran. Aceast toxin a fost gsit n concentraii de 0,6 g/kg, n
brnzeturile importate din Franta.
Aflatoxinele, n concentraii mari pot fi decelate i n carne, ou, paste i crevei.
Acumularea n diferite organe se face difereniat. La porc cantitatea maxim de aflatoxin se
determin n ficat n timp ce n rinichi cantitatea este mai mic (54 g/kg).
Un studiu numit "Sigurana alimentar", publicat n anul 2002 n colecia francez
"tiine i tehnici alimentare", arat c Romania se afl printre rile infectate cu microtoxine.
Din produsele autohtone analizate de francezi, jumtate muste au de asemenea substane
ucigase. Capitolul "Romnia" din acest document e intitulat "Studiile Dutton - 1996" (adic
studiile au fost fcute nc de la acea vreme), iar oamenii de tiin occidentali situeaz ara
noastr n zona afectat de ceea ce ei au numit, cu 15 ani n urm, "sindromul balcanic". nc
de atunci se tia c populaiile Romniei, Bulgariei i rile fostului spaiu iugoslav consum
cereale puternic infectate cu ciuperci productoare de micotoxine, de tip "aflatoxin", n
special cele care atac rinichii. De ce? n timp ce rile dezvoltate i-au creat tehnologii
avansate pentru depozitarea alimentelor, tocmai pentru a preveni mbolnvirea populaiei cu
micotoxine, rile srace, printre care i Romnia, nu au investit nimic n acest domeniu. n
ar nu s-au fcut asemenea studii i nu s-a scos un cuvinel despre legtura dintre alimentele
de pe piaa romneasc i aflatoxine. Singurele date despre noi nine ne pot da occidentalii,
care spun ca cel puin jumtate din hrana pe care o punem zilnic pe mas conine substane
cancerigene de tip aflatoxin.
Ochratoxinele au fost identificate n numeroase produse alimentare de origine
vegetal: porumb, gru, orez, ovz, orz, sorg, soia, leguminoase, cafea i pete srat, n
concentraii pn la 2800 g/kg.

n Danemarca de exemplu, s-a stabilit c contaminarea orezului cu ochratoxine reprezint


cauza nefropatiei la porci. Cazurile de nefropatii produse de ochratoxine au fost identificate i
la psri.
Ochratoxina A se poate acumula n esuturi (rinichi, ficat, muchi) i se elimina prin
lapte. La porcii care prezentau nefropatii, ochratoxina a fost prezentat n rinichi, n
concentraii ridicate. Toxicitatea acut a ochratoxinei este cuprins ntre 0,2 i 0,34 g/kg. Ea
este prima netrotoxin determinat, care produce, n afar de leziuni renale i leziuni hepatice.

Fig. 2 Ochratoxina A
Ochratoxina A a fost detectat n sngele i rinichii de porc precum i n sngele uman i
laptele mamelor. Cele mai mari accidente cu aceast toxin s-au ntlnit n sngele de porc
60% din cazuri, n cereale 13%, n rinichi de porc 21%.
Folosind RIDASCREEN OCHRATOXINA A putei determina aceste reziduuri n cereale,
fnee, bere i ser de porc ntr-un mod rapid i sigur.
Ca productori de ochratoxine au fost identificate specii de Aspergillus i Penicillium,
i anume: Aspergillus ochraceus, Aspergillus alliaceus, Aspergillus melleus, Aspergillus
ostianus, Aspergillus petrakii, Aspergillus sclerotiorum, Aspergillus sulphureus, Penicillium
viridicatum, Penicillium commune, Penicillium Cyclopium, Penicillium palitans, Penicillium
purpurescent, Penicillium variabile.
Tulpinile de Aspergillus ochraceus, cu nalt toxicitate, sunt frecvente prezente n
mediul natural. Exist posibilitatea unui sinergism ntre diferii fungi n producerea
micotoxinei. Sunt poluate cu ochratoxine, n special, cerealele.

Tabel 1 Prezena ochratoxinelor n diferite produse


Produsul
Porumb

Coninut maxim (ppm)


166

Orz

127

Gru

100

Fasole

2100

Arahide

4900

Orez i ovz

27500

Rinichi de porc

67000

Cafea

5 g/kg

Aspergillus ochraceus este un mucegai existent n sol care poate prolifera pe cereale i
leguminoase: gru, porumb, orez, orz, secar, soia, arahide, mazare, etc. Necesit condiii de
dezvoltare cu temperatur de 20-25 C i umiditate de peste 16%.
Mucegaiurile care secret ochratoxina A produc i acid penicilic substan cancerigen
cunoscut, efectele micotoxinelor fiind sinergice.
n zona balcanic, inclusiv n Romnia, a creat, a dezvoltat la oameni diverse tumori
de-a lungul traiectului urinar. Din Africa de Nord a venit informaia c, ntre nefritele cronice
intestinale i expunerea la ochratoxin, exist o corelaie foarte pozitiv.
Inducerea cancerului la oameni de ctre Ochratoxina A a fost confirmat i de Agenia
Internaional de Cercetri asupra Cancerului (IARC). Inducerea cancerului renal a fost
obinut la oareci, la doze mici de numai 70 g/kg/corp viu. Ochratoxina A este foarte
prezent n mai toate alimentele analizate pe piaa Uniunii Europene. Ele nu numai c au fost
prezente, dar au fost i foarte disponibile din punct de vedere biologic. n alimentele obinute
din plante, din 7000 de mostre, Ochratoxina A a fost gsit n 57,2 din cazuri n concentraie
peste limita admis. Cea mai mare frecven a toxinei s-a ntlnit n pine, bere, cafea, alune
i fructe uscate, macaroane i prjituri. N-a lipsit ns nici din fructe, sucuri i vin.

Cantitatea medie de Ochratoxin A ingerat de populaie


12
10
8

Nanograme (ng/kg)

Alimente de baz
Vegetarieni

Copii

4
2
0

Legend:
A Pine

H Pizza, sufleuri, supe

Q Bere

B Chifle

I Dulciuri

R Vin, ampanie

C Prjituri

J Unt, margarin

S Sucuri, ap, alte

D Cereale

K Brnz, lapte praf

buturi.

E Macaroane

L Mezeluri

F Cereale natur

N Cafea

cartofi

Legume,

fructe,

O Cacao
P Ceai

Fig. 3 Formarea micotoxinelor


Patulina cunoscut sub mai multe denumiri printre care mai frecvent i clavacina se
acumuleaz n cereale i numeroase fructe i leguminoase: mere, pere, piersici, caise, ciree,
struguri, banan, tomate, etc. putnd trece i n produsele de prelucrare, n special n sucurile
de fructe.

Fig. 4 Patulina
Patulina este foarte toxic pentru plante i animale. S-a pus n eviden o aciune
mutagen, teratogen i carcinogen.
Sinteza micotoxinei este realizat de diferite mucegaiuri n funcie de mediu. Astfel,
n pmnt este produs de Penicillium urticae, pe fructe i derivate de Penicillium expansum
i Byssochlamys spp., iar la orez de Aspergilius clavatus.
Patulina este o furopiranon, cu greutate molecular 154, stabil n mediu acid, dar
instabil n mediu alcalin. Se caracterizeaz printr-o bun termostabilitate, nefiind distrus la
80C.
Principalele modificri anatomopatologice sunt: congestie, edeme i hemoragii
pulmonare, degenerescene hepatic, de vezic biliar, rinichi i suprarenale.
Sterigmatocistinele fac parte din metabolitii furofuranici. Efectele toxice sunt
asemntoare cu ale aflatoxinei B1 (toxic carcinogen, mutagen i teratogen). Toxicitatea acut
este ns mai redus dect a aflatoxinei B1 i variaz n funcie de modul de aplicare specia
animalului i ali factori. Alte efecte include necroze miocardice, alterarea celular, reducerea
cromatinei din nucleu i progresiv degenerare celular nsoit de o fragmentare a nucleelor.

Fig. 5 Sterigmatocistine.

Fig. 6 Trichotecene.

Fungii care produc sterigmatocistin sunt: Aspergillus versicolor; Aspergillus


amstelodami; Aspergillus regulosus; Aspergillus aurantio-brunneus; Aspergillus chevalieri;

Aspeegillus flavus; Aspergillus nidulans; Aspergillus

parasiticus; Aspergillus rubber;

Aspergillus sidowi; Aspergillus ustus; Penicillium luteum; Bipolaris sorokiniana; Drechtera


sp.
Tricotecenele reprezint o clas de compui care include circa 40

de substane

nrudite avnd ca structurde baz 12,13 - epoxitricotecenul. Ei sunt metabolii ai mai multor
genuri de fungi imperfecti: Fusarium, Tricothecium, Mycothecium, Cephalosporium i
Stahybotrys. Dintre aceste genuri rolul cel mai important revine lui Fusarium sp., deoarece
afecteaz cel mai recent cerealele i seminele de leguminoase, n condiii climatice
caracteristice. Aceste micotoxine, n rile din zona temperat, prezint un pericol mai mare
dect aflatoxinele.
Din cele 40 de tricotecene, numai 6 contamineaz produsele alimentare i furajere:
toxina T-2, nivalenolul, dezoxinivalenolul, diacetoxinpenolul, tetraolul i neosolaniolul.
Tricotecenele, n concentraii pn la 5000 g/kg, au fost gsite n porumbul i orzul mai
multor ri.
n intoxicaiile acute, tricotecenele provoac vomismente, slbiciune, diaree,
tahicardie, hipotensiune i colaps. La nivelul tractusului intestinal se constata hemoragii,
eroziuni i ulcere. Formele subacute se manifest prin leucopenie i anemie.
Temperatura optim de producere a toxinelor este cuprins ntre 1,5 i 8C. Fluctuaiile
brute la temperatur intensific mult biosinteza toxinelor. Acestea sunt termostabile,
resistnd 18 ore la 110C i, ca urmare i manifest efectul i dup operaiile de coacere i
fierbere.
Tricotecenele afecteaza sistemul nervos, provocnd alterarea reflexelor, hiperestezic,
deficien de orientare, dermografism i stri depresive.
Toxina T-2 este pricipalul tricotecen care se formeaz pe porumb mucegit, dar poate fi
identificat i pe alte cereale. Porumbul care se maturizeaz trziu sau are un coninut mare de
apa este predispus la primul nghet alterrii de ctre fusarii i acumulri de toxin. Toxina T-2
provoac dizenterie mortal la mamifere i are un efect de reducere a coagulabilitii sngelui.
Se manifest prin vomismente, gastro enterit cu dizenterie, scdere n greutate i moarte.
Zearalenonele reprezint contaminani frecveni ai produselor cerealiere. n
concentraii mari pn la 50 g/kg, toxinele s-au determinat n porumb, orz i gru n S.U.A.,
Canada, Australia, Japonia i n multe ri din Europa.

Fig. 7 Zearalenona
Zearalenona F2 este elaborat de Fusarium roseum, respectiv de Giberella zeae,
forma perfect a lui Fusarium roseum, dar i de alte fusarii i micei. S-au izolat i fraciunile
F3, F1 i F5, dar cu aciune toxic mai redus.
Zearalenonele sunt biosintetizate i la temperatur sczut, de 12C; ridicarea
temperaturii la 25C sporete producerea de micotoxine. n doze mari au aciune estrogen,
producnd avorturi la femelele gestante i sterilitatea.
Monileformina este o micotoxin sintetizat de Fusarium monileforme, care se
dezvolt pe porumb i alte cereale. Efectul toxic este de 4,0 g/kg la puii de o zi.

Fig. 8 Monileformina
Manifestrile clinice sunt neuro- i hepatotoxice i apar la cel puin 2 sptmni de la
consumul produsului infectat. Ele debuteaz cu inapeten i slbire urmat de semne
nervoase: paralizia parial sau complet a faringelui, spasme musculare.
Rubratoxinele sunt substane toxice elaborate de Penicillium rubrum i Penicillium
purpurogenum i se prezint sub dou forme: A i B. Ele provoac o stare hemoragic i sunt
hepatotoxice. Rubratoxina B are i o oarecare aciune carcinogen, acionnd sinergic cu
aflatoxina B1. n mod obijnuit produsele pot fi contaminate concomitent cu Aspergillus flavus
i cu Penicillium rubrum, efectele conjugndu-se.

Fig. 9 Rubratoxina B
Factorul toxic este solubil n ap, termostabil i prezint aciune antibiotic. Dozele
subletale produc oprirea creterii i apariia unor malformaii congenitale la animalele de
experien.
Citreoviridina este o substan cu efecte neurotoxice, sintetizat de Penicillium
citreoviridae, care se dezvolt cu predilecie pe orez, la temperaturi joase, de 12-18C.

Fig. 10 Citreoviridina
Citreiviridina este responsabil de apariia unor simptome asemntoare bolii beriberi. La obolani provoac paralizia progresiv a membrelor posterioare, vom, convulsii, etc.
La om, n studii avansate se constat tulburri cardiace ca palpitaii tahicardice, hipotermice
care se finalizeaz n stop respirator.
Micotoxinele au aciune tremorgen, secretate de numeroi fungi, provoac la animale
tremurturi musculare i convulsii. Astfel, Penicillium cyclopium secret acizi ciclopiazinici,
care provoac la oareci tremurturi, urmate de convulsii i tetanie mortala. Se dezvolt pe
porumb, arahide, fasole i alte leguminoase.

3. Determinarea Ochratoxinei A din cafea boabe prin metoda HPLC


Scop. Validarea metodei de determinare a ochratoxinei A prin cromatografie de lichide
de nalt performan (HPLC) i aplicarea acesteia pe probe de cafea boabe prjit.
Material i metod. Probele de cafea, achiziioante din reeaua comercial, au fost
supuse extraciei cu un amestec CH3OH: NaHCO3 (n raport de 80:20). Extractele au fost
purificate prin extracie n faz solid (C18) pentru reinerea ochratoxinei A. Micotoxina a
fost eluat cu cloroform; faza organic a fost evaporat la sec i apoi, reziduul reluat cu 0,6 ml
faz mobil. Un volum de 20 l a fost supus analizei HPLC. Analiza s-a realizat pe un
cromatograf de lichide tip HP 1090 Series II, echipat cu o coloan cromatografic tip Stable
Bond SB - C18 (150 x 4,6 mm; 5 m), folosind ca faz mobil un amestec de acetonitril :
ap : acid acetic (n raport de 99 : 99 : 2). Detecia ochratoxinei A s-a realizat n fluorescen
(ex=228 nm i em=423 nm).
Rezultate. Metoda HPLC a fost validat. ntr-un numr de 5 probe (12,5% din numrul
total de probe), ochratoxina A a fost prezent sub limita maxim admis de legislaia n
vigoare (5 g/kg cafea boabe prjit), ntr-o singur prob concentraia ochratoxinei A a fost
peste limita maxim admis A iar n 34 de probe (85% din numrul total probe) ochratoxina A
nu a fost identificat prin metoda aplicat. Discuii. Aceast lucrare contribuie la evaluarea
prezenei ochratoxinei A n produsele alimentare (cafea boabe) comercializate n Romnia i
atrage atenia asupra riscului consumului de alimente contaminate cu micotoxine.
Ochratoxina A este un metabolit toxic produs de specii din genul Aspergillus n zonele
tropicale i subtropicale i de specii din genul Penicillium n zonele temperate (1).
Ochratoxina A a fost izolat pentru prima dat din culturi de Aspergillus ochraceus de Van der
Merwe i colab. n anul 1965 (2) n timp ce testau capacitatea toxigen a unor tulpini de
micromicei izolate din diferite boabe de cereale i legume.

Fig.11 Ochratoxina A structura chimic

Penicillium verrucosum este izolat frecvent din probe de cereale n timp ce A.


Ochraceus contamineaz boabele verzi de cafea, condimentele, boabele de cacao, soia i
arahide (3). Studii experimentale au demonstrat aciunea imunotoxic, neurotoxic,
nefrotoxic, teratogen i cancerigen a ochratoxinei A. Datorit aciunii cancerigene,
evideniate pe animale de experient, ochratoxina A a fost inclus de Agenia Internaional de
Cercetare a Cancerului (1993) n grupul substanelor posibil carcinogene grupul 2B.
Material i metod
- balan;
- baie de ultrasunete;
- micro-sering Hamilton;
- HP 1090 Series II lichid cromatograf echipat cu detector cu multidiode UV-VIS i detector
de fluorescen;
- coloan cromatografic tip Stable Bond SB - C18 (150 x 4,6 mm; 5 m);
- standard ochratoxin A (Sigma-Aldrich);
- coloane SPE C18 (Lida, manufacturing corp.);
- hrtie de filtru cantitativ (Schleicher & Schuell MicroScience);
- acetonitril (puritate HPLC, gradient grade, Riedel de Han);
- cloroform (puritate HPLC, Sigma Aldrich);
- metanol ChromasolvR (puritate HPLC, Riedel de Han)
- acid acetic glacial 99,99% (Sigma Aldrich);
- sulfat de sodiu (A.C.S. reagent, Sigma Aldrich);
- ap (puritate HPLC, Merck);
- faz mobil: amestec acetonitril : ap : acetic acid (n rapotul 99: 99: 2).
Procedeu de lucru
Extracia ochrotoxinei A i purificarea extractului
Probele de analizat (cafea boabe prjit - vrac) au fost supuse extraciei n vederea
separrii Ochratoxinei A.
Astfel o cantitate de 20 grame prob mrunit se agit 20 minute cu un volum de 20
ml amestec CH3OH : NaHCO3 3% (80:20) dup care se filtreaz prin hrtie de filtru
cantitativ (4, 5). Filtratul se trece prin coloana SPE precondiionat prin splare succesiv cu
4 ml metanol, respectiv 4 ml ap purificat. Ochratoxina A este eluat de pe coloan cu un
volum de 3 ml cloroform, cu o vitez de 2 ml/min. Faza organic se evapor la sec; reziduul

obinut se reia cu un volum de 0,6 ml faz mobil i se supune analizei HPLC prin injectarea
unui volum de 20 l n condiiile menionate.
n paralel, s-au lucrat probe mbogite cu cantiti cunoscute de Ochratoxin A pentru
stabilirea randamentului de extracie.
Analiza HPLC s-a realizat astfel: un volum de 20 l prob (obinut prin dizolvarea
reziduului obinut n urma prelucrrii probei ntr-un volum de 0,6 ml faz mobil) a fost supus
analizei pe un cromatograf de lichide tip Hp 1090 Series II, echipat cu

o coloan

cromatografic tip Stable Bond SB C18 (150 x 4,6 mm; 5m), folosind ca faz mobil un
amestec de acetonitril : ap : acid acetic (n raport 99 : 99 : 2). Detecia Ochratoxinei A s-a
realizat n fluorescen (ex=228 nm i em=423 nm).
Rezultate i discuii
Specificitatea
Pentru determinarea specificitii metodei au fost analizate probe coninnd
Ochratoxina A i o prab coninnd faza mobil utilizat ca solvent al probelor injectate. La
timpul de retenie al Ochratoxinei A nu s-a obinut nici un semnal n cromatograma
corespunztoare fazei mobile, rezult deci faptul c nu exist interfereni.
Indentificarea picurilor
Identificarea picului corespunztor Ochratoxinei A se realizeaz n funcie de timpul
de retenie. n condiiile menionate, timpul de retenie pentru Ochratoxina A este de 9,5 min.

Fig. 12 Cromatograma pentru soluia standard de Ochratoxina A


Validarea metodei de determinare a Ochratoxinei A prin cromatografie de lichide de
nalt performan (HPLC)
Pentru determinarea cantitativ a Ochratoxinei A, metoda de analiz prin HPLC
prezentat a fost validat urmrindu-se urmtorii parametri: stabilitatea n timp a soluiei,
linearitatea, limita de detecie i limita de cuantificare, precizia sistemului, precizia metodei,
exactitatea metodei.
Stabilitatea soluiei

Pentru a determina stabilitatea soluiei de Ochratoxin A a fost analizat o prob cu o


concentraie de 19,5 ng/ml Ochratoxin A dup ce a fost meninut la temperatura camerei 2,3
i 10 zile. Rezultatele experimentale sunt prezentate n urmtorul tabel.
Nr.
1
2
3

Ziua
0
2
3

Arie pic
33,8
30,9
33,3

Date statistice
Arie medie

10

31,8

RSD

32,45
SD = 1,3379
(%)

4,1230
n concluzie, probele n faz mobil coninnd Ochratoxin A pot fi stocate la
temperatura camerei cel puin 10 zile, fr a aprea degradarea acestui compus, avnd n
vedere faptul c aria picului corespunztor Ochratoxinei A este aproximativ constant (n
acest caz, deviaia standard relativ avnd valoarea de 4,1230%).
Liniaritate, limita de detecie i limita de cuantificare
Pentru studiul linearitii au fost analizate ase serii de soluii, pentru fiecare
cromatogram a fost calculat aria picului corespunztor Ochratoxinei A, iar valoarea ariei
medie a fost reprezntat grafic funcie de concentraie. Prin analiz statistic au fost calculate
ecuaia dreptei de regresie, coeficientul de corelaie (r) i eroarea standard de regresie.
Folosind panta dreptei de regresie i eroarea standard a acestei drepte s-au calculat valorile
limitei de detecie i limitei de cuantificare.
Dup prelucrarea statistic a determinrilor a rezultat o valoare de 16,9629% a
deviaiei standard relative ceea ce demonstreaz precizia metodei; regsirea medie fiind de
99,2% (pe intervalul 61,6 126,1%), ceea ce demonstreaz exactitatea metodei.
Valoarea medie (18 valori i o precizie de 95%) intervalul de regsire este de 83,29
115,00%.
Metoda de analiz valid a Ochratoxinei A prin HPLC a fost aplicat la determinarea
Ochratoxinei A din probe de cafea boabe.

Nr. crt.

Nr. prob Denumire prob

1
2
3
4
5
6

3
4
5
6
10
40

Cafea Indonezia
Cafea Indonezia
Cafea Indonezia
Cafea Indonezia
Cafea Columbia
Cafea India

Ochratoxin A
(g/kg prob cafea boabe)
0,77
0,87
1,06
0.55
9,47
3,35

Tabel 2 Coninutul
n Ochratoxin A

Probele au fost procurate din reeaua comercial din uniti ce comercializeaz


produse vrac. S-au analizat 40 de probe de cafea boabe prjit, de diferite sorturi (Columbia
10 probe, Jacobs 10 probe, Indonezia 9 probe, Brazilia 4 probe, Robusta 4 probe, India
1 prob, cafea decofeinizat 5 probe.
n urma analizei prin HPLC, cromatogramele obinute au fost prelucrate, stabilindu-se
aria picurilor corespunztoare Ochratoxinei A i, folosind ecuaia dreptei de regresie, s-a
calculat coninutul n Ochratoxin A pentru probele de cafea.
Din analiza datelor obinute n urma determinrii Ochratoxinei A din cele 40 probe de
cafea boabe prjit, s-a constatat c ntr-o singur prob (2,5% din numrul total de probe)
Ochratoxina A este prezent ntr-o cantitate mai mare dect limita maxim admis de
legislaia n vigoare (5 g/kg cafea boabe prjit); n 5 probe (12,5% din numrul total de
probe) Ochratoxina A se gsete n concentraii sub limita maxim admis, iar ntr-un numr
de 34 probe (85% din numrul total de probe) Ochratoxina A nu a fost identificat prin
metoda aplicat.
Concluzie
Avnd n vedere consumul crescut de cafea n rndul populaiei adulte este necesar
adoptarea unor msuri n vederea protejrii sntii consumatorului, o msur important
fiind evitarea comercializrii produselor cu un nivel ridicat de contaminare cu Ochratoxin A.

Bibliografie/Netografie:
1. Prof. Univ. Dr. Mihai Berca Micotoxinele O problem veche, dar nou pentru
sigurana alimentar;
2. Surez-Quiroz ML, Gonzales-Rios O, Barel M- Effect of chemical and enviromental
factors on Aspergillus ochraceus growth and toxinogenesis in green coffee; Food
Microbiology 2004;
3. Roman L, Boji M, Sndulescu R; Validarea metodelor de analiz i control, Ed.
Medical, Bucureti, 1998.
4. Oprean R., Rozet E, Dew W et al..Ghid de validare a procedurilor analitice
cantitative, Ed. Medical Universitar Iuliu Haieganu, Cluj Napoca, 2007.
5. Natural toxins. In: AOAC Official Methods of Analysis, 2000
6. Maximum levels for certain contaminants in foodstuffs. In: Commission regulation
(EC) No 1881/2006, 19 December 2006.
7. Banu C. si colab.: Suveranitate, securitate si siguranta alimentara, Ed. ASAB,
Bucuresti, 2007.
8. Rasucanu Florentina, Stela Zamfirescu: Implicatiile micotoxinelor n lantul trofic
Plante furajere- Animale-Om Ed. PONTO,Constanta, 2008.
9. HOTARREA nr. 924 din 11 august 2005 privind aprobarea Regulilor generale pentru
igiena produselor alimentare, restrictioneaza tot mai mult circulatia furajelor si
alimentelor contaminate cu micotoxine
10. Abarca, M. L., Accensi, F., Bragulat, M. R., Castella, G., Cabanes, F. J. 2003.
Aspergillus carbonarius as the main source of ochratoxin A contamination in dried
vine fruits from the Spanish market. Journal of food protection. 66, 504-506.
11. Abarca, M. L., Bragulat, M. R., Castella, G., Cabanes, F. J. 1994. Ochratoxin A
production by strains of Aspergillus niger var. niger. Applied and Environmental
Microbiology. 60, 2650-2652.
12. ALBASSAM, M.A., YONG, S.I., BHATNAGAR, A.K., SHARMA, A.K .&
PRIOR,M.G. (1987).- Histopathologic and electron microscopic studies on the acute
toxicity of ochratoxin A in rats.-Vet.Pathol., 24, 427-435.
13. ARORA, R.G. & FRLEN, H. (1981).- Interference of mycotoxins with prenatal
development of the mouse. 2. Ochratoxin A induced teratogenic effects in relation to
the dose and stage of gestation. Acta Vet. Scand., 22, 535-552.
14. Battilani, P., Languasco, L., Pietri, A., Bertuzzi, T., Giorni, P. 2000. Ochratoxin A in
grape and wine: causes and conditions of production; Preliminary results. Proceedings

of the 5th Congress of the European Foundation for Plant Pathology, Giardini Naxos,
Italy, 2000 Abstract 502 P, 89. Journal of plant Pathology, 533-555.
15. Bayman, P., Baker, J. L., Doster, M. A., Michailides, T. J., Mahoney, N. E. 2002.
Ochratoxin Production by the Aspergillus ochraceus Group and Aspergillus alliaceus.
Applied and Environmental Microbiology 68, 2326-2329
16. Belli, N., Marin, S., Duaigues, A., Ramos, A. J., Sanchis, V. 2004a. Ochratoxin A in
wines, musts and grape juices from Spain. Journal of the Science of Food and
Agriculture, 84, 591-594.
17. BELMADANI, A., STEYN, P.S., TRAMU, G., BETBEDER, A.M., BAUDRIMONT,
I.& CREPPY, E.E. (1999).- Selective toxicity of ochratoxin A in primary cultures from
different brain regions.- Arch.Toxicol., 73, 108-114.
18. CANET, C. (1999).- rglementation mondiale dans : Mycotoxines : Evaluation et
gestion du risque, chapitre 16, Lavoisier, Tec & Doc., Paris, 409-428.
19. CASTEGNARO, M. (1999).- Risques cancrognes dans : Mycotoxines : Evaluation
et gestion du risque, chapitre 5, Lavoisier,Tec & Doc, Paris, 121-140.
20. CREPPY, E.E., CASTEGNARO, M., GROSSE, Y., MERIAUX, J., MANIER, C. &
MONTCHARMONT, P. (1993).- Etude de lochratoxicose humaine dans trois rgions
de France : Alsace, Aquitaine et rgion Rhnes Alpes.- In : Human ochratoxicosis and
its pathologies, Creppy, E.E., Castegnaro, M. & Dirheimer, G.- INSERM/John Libbey
Eurotext, 231, 147-158.
21. www.ansv.ro
22. www.pesteur.ro
23. www.mycotoxin.org
24. www.sanatateplus.net

ANEXA 1

Micotoxinele creaz probleme de fertilitate i moarte a feilor prin mumifiere, alturi


de ali factori.

ANEXA 2
Tabel Sensibilitatea relativ a animalelor fa de micotoxine
Animal
Toxin
Zearalenon

Vit

Pui

Porci
Cretere
+++

ngrare
+++

Deoxynivalenon
Ochratoxina A

Scara de sensibilitate:
-

puin toxice

mediu toxice

++

toxicitate ridicat

+++

toxicitate foarte ridicat

+
++

++
++

+++
+++