CURS BIOFIZICA

BIOFIZICA
CURS
si 55
44 si

ef lucrri
dr. Irena
GRIEROSU

METODE FIZICE I BIOFIZICE CU

APLICAII N MEDICIN
1. Metode electroforetice
2. Metode cromatografice
3. Metode de difracie cu raze X
4. Metode de microscopie electronic
(de balaiaj, prin transmisie)
5. Tipuri de MO

I-A. Electroforeza

Electroforegrama

Explicarea termenilor

Fe = Ff

+
+
+
+
+

ZeE= 6 r v

Fe = fora electric

Ze E
v=
6r

Ze = sarcina electric a
particulei
E = intensitea cmpului
electric
= viscositea mediului
r = raza particulei
v = viteza particulei

Fe

Ff = fora de frecare

I-B. Electrofocusarea

pH
izoelectric

I-C. Imunelectroforeza
Reactie
specifica
Ag-Ac

2 faze

II. Cromatografia
SCOP = separarea
componentelor
unui amestec
1. Faz staionar
- solid
- lichid
- amestec solid / lichid
2. Faz mobil
- lichid
- gaz

4 tipuri de tehnici
cromatografice:
1. de adsorbie
2. prin schimb ionic
3. prin permeaie (n
funcie de forma i
marime)
4. de afinitate

Cromatografie prin permeatie

Cromatografie de permeaie

Cromatografie de afinitate

Imunoabsorbant matrice solid

care conine legat covalent (de
obicei) un Ag.
Mixtura de Ac care urmeaz a fi
separat este aplicat la captul
superior i va trece prin coloana
staionar. Doar Ac specifici Ag din
coloana staionar for forma
complexe Ag-Ac i vor fi reinui.
Se adaug o soluie tampon care
conine o cantitate crescut de
sruri i / sau pH sczut pentru a
rupe legturile necovalente dintre
Ag i Ac su specific.
Se adaug o soluie de eluie care
conine Ag n exces. Aceast
competiie cu imunoabsorbantul pt.
Ac determin elib. Ac n faz fluid.
Ac eliberai n soluie se colecteaz
ntr-un recipient.

III. Difracia cu raze X

BC + BD = n

2d sin = n

BC = BD = AB sin

ecuaia Bragg

AB = d
2d sin = n

A
C

D
d
B

Condiia maximului de interferen se realizeaz pentru

cazul n care diferena de drum a celor dou raze este un
multiplu ntreg al lungimii de und, adic BC + BD = n.

J. Watson i F. Crick - premiul Nobel n Medicin i Fiziologie

1962 mpreun cu M. Wilkins: stabilirea structurii ADN-ului
prin difracie cu raze X

Difracia cu raze X

Cristalul este rotit usor, si doar pentru anumite unghiuri se obtin maxime de
difractie, care vor fi inregistrate pe filmul fotografic. Rezolutia metodei = 5 - 6 .
Imaginea de difractie, inregistrata pe film, corespunde pozitiei atomilor din reteaua
cristalina.

Etapele de studiu ale unei proteine:

a) difractograma (raze X)
b) harta densitatii electronice
(computer)
c) modelul conformational al structurii
proteinei

Structura primar,
secundar, teriar i
cuaternar a
proteinelor

Structura
primar

Structura secundar

Structura
teriar
Structura
cuaternar

 - helix

 - pliat

Trioz-fosfatizomeraza

Funcii generale ale

proteinelor

1. Enzime: catalizeaz ruptura

sau formarea unor legturi
covalente (mii)

Ex:
- pepsina
- ADN-polimeraza

2. Proteine structurale:
susinerea mecanic a celulelor i a
esuturilor

Ex:
- colagenul i
elastina
- tubulina i
actina
- - keratina

3. Proteine de transport:
transportul unor molecule mici sau a unor
ioni
Ex:
- Hb. - oxigen
- Transferina - fier
- Albumina - lipide
- Proteine de
transport
membranar: H2,
glucoz, Ca2+

4. Proteine motrice:

genereaz
micare n celule i esuturi

Ex:
miozina,
kinezina,
dineina

5. Proteine de stocare:
a unor molecule mici sau ioni

Ex:
- feritina
- ovalbumina

6. Proteine semnal: transmit

semnale de la celul la celul
Ex: - hormoni
- factori de cretere: NGF, EGF

7. Proteine receptoare:
detecteaz semnale i le
transmit mainriei celulare
Ex:
- rodopsina
- receptorul
pentru
acetilcolin al
celulei
musculare
primete
semnale
chimice

8. Proteine reglatoare ale

genelor: se leag de ADN pentru a
induce sau a inhiba expresia genelor

9. Proteine cu rol particular

Ex:
- proteinele antigel ale
petilor de la polii
Nord-Sud
- proteine fluorescente
- proteine cu funcie
de adeziv

IV. Metode de microscopie

electronic

Principiul fizic al microscopiei

electronice

Dac viteza crete, descrete,

puterea de rezoluie crete:
p = 1/d = n sinu /
= h/p = h/mv
unde
p = putere de rezoluie
d = distana minim ntre 2 puncte care poate fi distins
separat
n = indicele de refracie
u = unghiul
Un fascicul de electroni accelerat:
- la 10 kV, asociat este 130 nm (13 ),
- la 100 kV, asociat este 30 nm (3 )

Semnalele emise de un material

supus unui bombardament
electronic

MET

MEB

microscop electronic prin transmisie

microscop electronic cu baleiaj

MICROSCOPUL
ELECTRONIC
DE BALEIAJ
Rezoluia este mai
sczut dect n MET.

Imagini pseudo-3D.

Microscopul electronic de baleiaj

Principiu
Un
Unspot
spotde
deelectroni
electronibaleiaz
baleiaz
suprafaa
suprafaaprobei.
probei.
Electronii
Electroniisecundari
secundaride
deenergie
energiemic
mic
(0-50
eV),
emii
n
urma
mprtierii
(0-50 eV), emii n urma mprtierii
neelastice,
neelastice,sunt
suntcaptai
captaii,
i,dup
dupoo
procesare
procesareelectronic,
electronic,formeaz
formeaz
imaginea
pe
un
ecran
fluorescent,
imaginea pe un ecran fluorescent,sau
sau
pe
o
pelicul
fotografic.
pe o pelicul fotografic.
Luminozitatea
Luminozitateafiecrui
fiecruipunct
punctalalimaginii
imaginii
depinde
depindede
denumrul
numrulde
deelectroni
electroni
secundari
nregistrai
din
secundari nregistrai dinpoziia
poziia
corespunztoare
a
probei.
corespunztoare a probei.
Se
Seobin
obinimagini
imaginiale
alesuprafeei
suprafeeiunei
unei
celule,
celule,aaunui
unuimicroorganism
microorganismsau
sauaaunui
unui
esut,
de
unde
impresia
de
imagine
esut, de unde impresia de imagine
tridimensional.
tridimensional.
Mrire
Mriremaximum
maximum200
200000
000x,x,cu
cuoo
rezoluie
rezoluiede
de3,5
3,5nm.
nm.

Alcatuire
Tunelectronic
electronic- -fascicol
fascicolde
de
Tun
electronicu
cudiametrul
diametrulde
decirca
circa
electroni
50nm.
nm.
50
2-3lentile
lentilecondensoare
condensoare- 2-3
diametrulpn
pnlala22nm
nm(spot
(spotmic,
mic,
diametrul
deoareceseciunea
seciuneasa
sadetermin
determin
deoarece
peimagine
imagineun
unsingur
singurpunct).
punct).
pe
lentilcondensoare
condensoarecare
care
OOlentil
regleazdimensiunea
dimensiuneafinal
finalaa
regleaz
spotuluiiifocalizeaz
focalizeazimaginea
imaginea
spotului
peecran.
ecran.
pe
Electroniisecundari
secundarisunt
suntcaptai
captai
Electronii
deun
undetector
detectorde
deAl
Alcare
careacoper
acoper
de
uncristal
cristalde
descintilaie
scintilaiealalunei
unei
un
sondede
descintilaie,
scintilaie,semnalul
semnalul
sonde
obinuteste
esteamplificat
amplificatelectronic
electronicii
obinut
formeazimaginea
imagineape
peecranul
ecranulunui
unui
formeaz
tubcatodic
catodicsau
saualalunui
unuimonitor.
monitor.
tub

Etapele de transformare in
echinocit

Eritrocite umane mbtrnite

E. coli

ochi de
musc
limfocit

Contact entre un
lymphocyte ( en jaune ) et
une cellule dendritique
prsentatrice d'antigne (en
bleu ). Microscopie
lectronique balayage.

Contact entre un
lymphocyte
(immunofluorescence
verte) et une cellule
dendritique prsentatrice
d'antigne. Microscopie
contraste de phase

Pereche de cromosomi umani, X i Y, dup

Nature (2003) 423: 810-812.

Fibre de sticla

Cristale componente ale ceramicii (x 4000); cu verde particule mbogite n calciu, n albastru - particule
care conin fosfor. Didier COT/IEM/CNRS

- granule de polen

MICROSCOPUL ELECTRONIC
PRIN TRANSMISIE

relatia lui de Broglie:

= h/p = h/mv
Se folosesc electronii mprtiai neelastic transmii prin prob
(preparatul de examinat).
nainte de a ajunge la preparat (prob) electronii provenii de la sursa
de electroni (tunul de electroni) sunt focalizai de dou lentile
condensor (electromagnetice). Ei sunt mai mult sau mai puin absorbii
(spunem despre preparat c este mai mult sau mai puin dens pt.
electroni).
Utilizeaz marcheri electrono-opaci.
Imaginea se formeaz n spatele preparatului pe un ecran fluorescent.
Mrirea, raportul dintre mrimea imaginii/mrimea obiectului,
rezoluia, cu att mai bun cu ct este mai mic i apertura mare
(care, ns, mrete aberaiile de sfericitate); la diafragme de
20-70 m rezoluia este 0,1-0,2 nm.
Luminozitatea imaginii depinde de numrul de electroni transmii,
intensitatea fascicolului incident, caracteristicile probei.

MET - PMN

MET - limfocit

mitocondrie

aparat Golgi

membrana

nucleu
reticul
endoplasmic rugos

MO

Limfocit - MEB

MET

Hematii

MO

MEB

AFM

MET

TIPURI DE
MICROSCOAPE OPTICE

MICROSCOPUL OPTIC

Pentru a creste P (descreste ):

-

descreste (390 - 720 nm)

creste n

V. lucrarea practica
difuziunea si osmoza

Legile osmozei

Cellules turgescentes -------> Cellules

plasmolyses

MICROSCOPUL OPTIC
cu imersie

Microscopul polarizant
Pune in evidenta fenomenul de
birefringenta a unor structuri,
expresie a anizotropiei acestora.

- lumina polarizata
- 2 nicoli
- Cruce de Malta

Ultramicroscopul (microscopul
cu fond intunecat)

Iluminarea este din lateral.

Condensorul este de tip cardioid sau
paraboloid.
Se bazeaza pe fenomenul Tyndall
(de difuzie a luminii).

Fenomenul Tyndall

Microscopul cu contrast de faza

celula epiteliala

ciclul celular

Prezinta o lama
sfert de unda
care transforma
defazajul luminii
imperceptibil
ochiului uman
intr-o variatie de
intensitate
perceptibila
vizual
(transforma deci
un contrast de
faza in contrast
de amplitudine).
Permite
observarea
celulelor
necolorate.

Microscopul cu fluorescenta

- utilizeaz markeri fluoresceni -

Principiul fenomenului de
fluorescen:
1. Energia este absorbit de
un atom
2. Electronul sare pe un nivel
superior de energie.
3. Ulterior, electronul revine
la starea initiala si emite un
foton fenomenul de
fluorescen

O sursa UV.
Ecran filtrant care lasa sa treaca doar radiatiile
UV excitatoare ale fluorescentei.

celule epiteliale

GFP - Green Fluorescent Protein

238 aa, 26.9 kDa
Nobel Chemistry 2008

Do you
remember?

The Nobel Prize in Chemistry 2008

was awarded jointly to Osamu
Shimomura, Martin Chalfie and
Roger Y. Tsien "for the discovery
and development of the green
fluorescent protein, GFP".

Bibliografie selectiv

Aurengo A., Grmy F., Petitclerc T. - Biophysique, Mdecine-Sciences

Flammarion, Paris, 1998.
Dimoftache C., Herman S. Principii de Biofizic uman, Ed. Universitar
Carol Davila, Bucureti, 2003.
Duncan G, Physics in the Life Sciences, Blackwell Scientific Publications,
The Alden Press, Oxford, 1990.
Durand A., Escany J-M., Naoun A. La biophysique en 1001 QCM, Ed.
Ellipses, 2004.
Goldfarb D. Biophysics DeMYSTiFieD. McGraw-Hill Companies, 2011.
Herman S. Aparatura medical. Principiile fizice ale aparaturii medicale
moderne,Ed.Teora,Bucureti, 2000.
Nlting, Bengt. Methods in Modern Biophysics. Springer. 2003.
Pascu M., Rusu V., Vasile C., Spectrometria in IR in medicina si farmacie ,
Editura BIT, 2003.
Popescu A., Bazele Opticii, Ed. Universitii Al. I. Cuza, Iai, 1988.
Rusu V., Baran T., Brniteanu D. D. - Biomembrane i patologie, vol. I, Ed.
Medical, Bucureti, 1988, 63-92, 286-292.
Rusu V. Note de curs. 2010.
Rusu V. Nobel Retrospectiv 1905 1995 Laureaii premiului pentru
fiziologie i medicin, Ed. Omnia, Iai, 1996.
Rusu V si colab. Lucrri practice i demonstraii de Biofizic i Fizic
Medical, Ed. Gr. T. Popa Iai, 2003.
Rusu V. Dicionar medical, Ed. Medical, Bucureti, ed. IV, 2011.
Skoog D. A., Holler F. J., Nieman T. A., Principes danalyse instrumentale,
De Boeck Universit, Paris, 2003.
tefnescu C, Rusu V. Biophysics and Medical Physics: An Introduction, Ed.
Tehnopress, 2008.