Fracionar

ea celular

Definiie
Este o tehnic bazat pe caracteristicile structurilor subcelulare
(form, dimensiune, densitate) care reuete s le diferenieze astfel
permind separarea lor. Celulele pot fi dezmembrate prin:
-ocosmotic
-ultrasonicare
-filtrare prinsitemici.
Dac celula este dezmembrat ntr-o manier delicat, fiecare din
organitele sale poate fi izolat.Procesul de dezmembrare celular se
numete omogenizare,iar procesul ulterior de izolare a organitelor se
numete,fracionare.
Izolarea organitelor necesit tehnici de chimie fizic mergnd de la
strecurare prin site simple, la sedimentarea gravitaional sau
precipitare diferenial sau la ultracentrifugare sau marcare
fluorescent a fragmentelor n gradiente de densitate generate pe
computer.

George Palade a realizat importana excepional a

microscopiei electronicei abiochimiein studiile de
citologie.mpreun au combinat metodele de fracionare a
celulei cumicroscopie electronic, producnd componeni
celulari care erau omogeni morfologic. Analiza biochimic
a fraciunilormitocondrialeizolate a stabilit definitiv rolul
acestor organule subcelulare ca un component major
productor de energie.
Cel mai important element al cercetrilor lui Palade a
fost explicaia mecanismului celular al produciei de
proteine. A pus n eviden particuleintracitoplasmatice
bogate nARN, la nivelul crora se realizeaz biosinteza
proteinelor,numiteribozomisaucorpusculii lui Palade.

Tehnica de fractionare celulara are doua

aplicatii majore:
extragerea organitelor celulare, separarea
lor de mediul normal celular, intr-o cantitate
suficienta si de o mare puritate, pentru a
putea fi studiata compozitia chimica si
functiile lor.
identificarea localizarii intracelulare a unor
molecule specifice, alaturi de celelalte tehnici
de citochimie.

Principiile fractionarii celulare

Primul pas in extragerea unor cantitati suficiente de organite
celulare il reprezinta ruperea membranelor plasmatice prin diferite procedee
mecanice si chimice, urmata de separarea fractiunilor celulare prin
centrifugare, in functie de volum si densitate.
Centrifugarease foloseste pentru o rezolutie cat mai buna a diferentierii
organitelor
celulare, de diferentele dintre proprietatile lor fizice, din
care cele mai importante sunt marimea si densitatea. Exista numeroase
similitudini intre organite atat in ceea ce priveste marimea cat si densitatea
lor, insa, in general, structuri care au un volum asemanator au densitati
diferite.
Centrifugarea diferentiatapresupune separarea fractiunilor celulare
fie doar in functie de marimea particulelor subcelulare, fie doar dupa
densitatea lor.
Pentru ruperea membranelor plasmatice, celulele sunt suspendate intro solutie ce contine o sare cu un pH apropiat de cel al mediului intracelular (de
exemplu sucroza izotonica). Ulterior este necesara agitarea suspensiei
celulare la o viteza foarte mare, prin centrifugare sau prin plasarea sa intr-un
camp sonic de inalta frecventa.

Prepararea omogentelor celulare

In vederea izolarii fractiilor celulare si a studierii proprietatilor lor
functionale, se porneste de la un tesut sau de la celule libere, a caror
membrane plasmatice trebuiesc rupte. Omogenatul celular (tisular) este
reprezentat de componentele celulare, suspendate intr-un mediu
corespunzator.
Omogenatele celulare se pot obtine de la orice tip de celula procariota sau
eucariota. Nu orice tip de tesut este adecvat omogenizarii si fractionarii. De
regula, se folosesc tesuturi moi, relativ voluminoase si usor manevrabile: ficat,
muschi, rinichi, creier.
Tesutul se mai alege si in functie de tipul de organite celulare pe care dorim
sa le separam; pentru obtinerea mitocondriilor se prefera ficatul, pentru
izolarea nucleilor se va utilize ficat sau timus, etc.