Fertilizarea in vitro a

ovocitelor de iap
Strulea Andreea Mihaela
Anul IV
2014 2015

Cuprins
Introducere............................................................................................................ 3
Bariera zona pelucida............................................................................................ 3
Metode utilizate..................................................................................................... 3
Injectarea intracitoplasmatic a spermei............................................................4
Recomandri.......................................................................................................... 5
Anexa..................................................................................................................... 7
Bibliografie............................................................................................................ 8

Introducere
Fertilizarea in-vitro ( cultivarea oocitelor cu sperma pentru fertilizare) este metoda cea
mai des utilizat pentru fertilizarea oocitelor recoltate, la majoritatea speciilor de animale,
inclusiv la iap. ns, la iap, rezultatele fertilizrii in vitro au avut un procent destul de
sczut, datorit incapacitii spermatozoizilor de a penetra zona pelucida a oocitului. Astfel, a
fost dezvoltat tehnica inhectrii intracitoplasmatice ca metod de fertilizare a oocitelor de
iap in vitro. Cecetrile au artat faptul c, injectarea spermei cu hipermotilitate scade
procentajul de succes n cadrul fertilizrii. Aceast descoperire deschide porile pentru o mai
puin costisitoare i laborioas metod de fertilizare in vitro la cabaline1.

Bariera zona pelucida

Principala problem a fertilizrii in vitro este imposibilitatea penetrrii zonei pelucida,
fapt demonstrat de creterea ratei de succes n cazul ndeprtrii acestei zone. Este posibil, ca
acest insucces al penetrrii spermatozoizilor al zonei pelucida s se datoreze modificrilor ce
apar in vitro, care fac oocitul rezistent la penetrare. Aceaste modificri, ntriri ale zonei
pelucida, s-ar datora eliberrii premature a granulelor corticale din cultura de oocite, din
cauza mbtrnirii oocitelor sau cultivrii inadecvate. n urma unor studii realizate asupra
acestui fapt, Dell Aquilla et al., au demostrat faptul c n urma cultivrii oocitelor cu fetuin,
se reduce aceast rezisten a zonei pelucida, dar nu crete procentul de succes al fertilizrii
in vitro2.

Metode utilizate
Raportrile fertilizrii in vitro obinuite sunt puine i dificil de interpretat din cauza
tehnicilor foarte diverse utilizate de diversele laboratoare. Motivele ratei sczute de fertilizare
in vitro, respectiv de dezvotare ulterioar ale ovocitelor de iap, sunt neclare. Capacitarea
spermatozoizilor, maturarea oocitelor, modificrile zonei pelucida, au fost toate propuse ca
responsabile pentru aceste rezultate nesatisfctoare3.
Cea mai incurajatoare metod de inducere a capacitrii i reaciei acromozomiale a
spermatozoizilor este utilizare ionoforilor de calciu, care s-a demonstrat a crete rata
3

fertilizrii de la 17% la 33%. Utilizarea cafeinei sau heparinei pentru inducerea capacitrii nu
a mbuntit rata fertilizrii3.
Cu scopul de a mbuntii rezultatele, s-au folosit tehnici precum3:
-

Disecia parial a zonei pelucida (PZD)

ndeprtarea parial a zonei pelucida (PZR)

Injectarea subzonal a spermei (SUZI)

Efectuarea unei guri (zona drilling ZD)

Injectarea intracitoplasmatic a spermei (ICSI)

Pentru PZD o mic deschiztur n zona pelucida a oocitului. Pentru PZR este
ndeprtat o poriune mic a zonei pelucida pentru a facilita accesul spermatozoidului la
membrana viteline. Succesul ptrunderii spematozoizilor n oocit este de 52% pentru PZR i
18 % pentru PZD. De altfel s-a sesizat polispermia, dac deschiztura n cazul tehnicii PZD
este prea mare.
Pentru ZD, se realizeaz o mic gaur la nivelul zonei pelucida cu ajutorul unei
picturi de soluie de acid Tyrode, pentru a facilita mobilitatea spermatozoidului.
Cele mai bune rezultate s-au obinut dup ce sperma a fost expus la o concentra ie de
1.0 M de Calciu Ionofor A23187.
La sfritul secolului al douzecilea, injectarea intracitoplasmatic a spermei a fost
introdus n practica fertilizrii in vitro la oameni. Aceast tehnic presupune injectarea cu
ajutorul unei pipete foarte fine a unui spermatozoid, dup ce i-a fost ndeprtat coada, direct
n citoplasma unui oocit matur, prezentnd primul globul polar la nivelul spaiului perivitelin.
Totodat, n timp ce alte metode necesit prezena unui spermatozoid capacitat i cu
reacie acrozomial pentru fuzionarea cu membrana oocitului, injectarea intracitoplasmatic
nu necesit acest lucru; singurul lucru foarte important n reuita acestei tehnici este prezen a
unui spermatozoid mobil. Aceast tehnic previne apariia problemelor date de necesitatea
legrii spermatozoidului de membrana oocitului, penetrarea acestului i, n cele din urm,
fertilizarea. Utiliznd injectarea intracitoplasmatic, spermatozoidul introdus direct in
citoplasma oocitului matur de iap, induce fertilizarea3.

Injectarea intracitoplasmatic a spermei

La nceput, se preia sperma cu ajutorul unei micropipete manipulate cu un
micromanipulator microscopic, care este apoi injectat n oocit. A fost dezvoltat aceast
4

metod, ntruct cultivarea mpreun a spermei i a oocitelor pentru fertilizare nu a dat

rezultate.
Pentru aceast tehnic, spermatozoizii sunt preparai prin metoda flotaiei sau a
gradientului de densitate, ntruct este necesar ultizarea unor spematozoizi de cea mai bun
calitate. Oocitul matur este denudat de la nivelul zonei cumulus, iar apoi este plasat ntr-o
plac Petri, ntr-o pictur de mediu uleios. A doua pictur este cea cu mediul care con ine
spermatozoizii. Acest mediu conine polyvinylpyrolidon, o substan ce ncetinete micrile
spermatozoizilor.
Manipularea se realizeaz cu ajutorul unui microscop echipat cu un micromanipulator
cu burghiu Piezo. Acest aparat Piezo imprim o micare de rsucire pipetei de injectare,
ajutnd aceasta s ptrund n interior i s depun materialul direct in interiorul oocitului,
fapt ce este asociat cu o mai bun dezvoltare ulterioar comparativ cu tehnica standard.
Oocitul este meninut n poziie cu ajutorul unei pipete, apoi, cu ajutorul unei pipete
de injectare, ncepnd cu coada, este aspirat spermatozoidul din pictura ce conine
spermatozoiziiError: Reference source not found. (Anexa figura 1)
Oocitul matur utilizat in ICSI trebuie s se afle n metafaza a II-a. Sperma utilizat
este de obicei congelat decongelat, dar poate fi, de asemenea, utilizat i sperma
proaspt sau cea refrigerat. Choi et. Al. au demonstrat c nu exist nicio diferen n
dezvoltarea embrionar ulterioar n cazul utilizrii spermei congelate decongelate sau
refrigerate.
Este important ca membrana spermatozoidului s fie rupt nainte de penetrare, pentru
a ne asigura c spermatozoidul este imotil i c sunt eliberai factorii citosolici spermatici
importani n activarea oocitului.
n adiia producerii unui produs viabil, ICSI este o unealt important ce poate fi
utilizat pentru evaluarea in vitro a maturrii oocitelor, studierea fertilizrii i producerea
embrionilor obinui in vitro pentru studii ulterioare3.

Recomandri
Injectarea intracitoplasmatic trebuie luat n considerare atunci cnd una sau dou
paiete de sperm congelat rmne de la un armsar valoros ce nu mai este n via sau n
cazul n care nu poate fi recoltat sperma. De asemenea, teoretic, pot fi produi mai mul i
5

mnji dintr-o singur paiet. Paietele ar putea fi tiate i astfel decongelate doar o parte a
acesteia, nu paieta ntreag, utiliznd restul penru a alt ICSI, a unui oocit de la o alt iap4.
De altfel, aceast tehnic avansat este indicat pentru iepele ce nu pot rmne
gestante singure ( iepe cu boli uterine cronice, laceraii cervicale sau alte tulburri ale
tractului reproductor care ndeprteaz animalul de la conceperea i pstrarea embrionului).
Injectarea intracitoplasmatic poate fi utilizat i atunci cand se dorete un numr crescut de
gestaii de la o cantitate limitat de sperm, asa cum am menionat i anterior5.
Acest procedur ar trebui folosit doar n cazul iepelor ce nu sunt potrivite pentru
transferul de embrioni obinuit ( iepe la care embrionul viabil este doar rareori recoltat prin
flush uterin standard), sau, n cazul n care dorim obinerea unui mnz de la un anumit
armsar, a crui sperm nu poate fi urilizat eficient cu ajutorul tehnicii de inseminare
artificial in vitro.
Datorit costurilor foarte ridicate a acestei tehnologii i dat fiind numrul crescut de
laboratoare asocitate pentru reuita ICSI, mnjii produi prin aceast metod trebuie s fie
suficinet de valoroi ca s justifice efortul crescut i cheltuielile ridicate5.
Tehnica injectrii intracitoplasmatice are un prognostic mult mai bun n producerea de
embrioni viabili i gestaii dect tehnicile obinuite care fucioneaz la alte specii4.

Anexa

Figura 1. Injectarea intracitoplasmatic a unui oocit de iap. A. Oocitul men inut n poziie,
cu pipeta de injectare (sgeata) adiacent zonei pelucida; B. Zona pelucida puncionaat de
pipet, cu plasarea spermatozoizilor n citoplasma oocitului. Imagine preluat din Steven P.
Brinsko, Terry L. Blanchard, Dickson D. Varner, J. Schumacher, Charles C. Love, K.
Hinrichs, David Hartman, Manual of Equine Reproduction, MOSBY Elsevier, Third Edition

Bibliografie
1. Steven P. Brinsko, Terry L. Blanchard, Dickson D. Varner, J. Schumacher, Charles C.
Love, K. Hinrichs, David Hartman, Manual of Equine Reproduction, MOSBY
Elsevier, Third Edition
2. K. Hinrichs, C. C. Love, S. P. Brinsko, Y. H. Choi, D. D. Varner, In vitro fertilization
of in vitro-matured Equine Oocytes: Effect of Maturation Medium, Duration of
Maturation, and Sperm Calcium Ionophore Treatment, and Comparison with Rates of
Fertilization In Vivo after Oviductal Transfer, Biology of Reproduction, July 1 2002
7

3. Juan C. Samper, Equine Breeding Management and Artificial Insemination,

SAUNDERS Elsevier, Second Edition
4. Patrick M. McCue, SPERM INJECTION, Colorado State University
5. Veterinary Medicine & Biomedical Sciences Texas A&M

University

http://vetmed.tamu.edu/equine-embryo-laboratory/clinical-services/icsi