Proiect

Universitatea de Medicin i Farmacie Gr. T.
Popa Iai
Facultatea de Farmacie
REZUMATUL
TEZEI DE DOCTORAT
C o n t r ib u i i l a s t u d i u l a n a l i t i c a l
ocratoxinelor cu aplicaii pe
produse alimentare
Conductor tiinific,
Prof. univ. dr. Vasile Dorneanu
Doctorand,
Farm. Delia Robu (Bulea)
IAI
- 2011-
REZUMATUL
TEZEI DE DOCTORAT
C o n t r ib u i i l a s t u d i u l a n a l i t i c a l
ocratoxinelor cu aplicaii pe
produse alimentare
Conductor tiinific,
Prof. univ. dr. Vasile Dorneanu
Doctorand,
Farm. Delia Robu (Bulea)
IAI
- 2011-
Bulea D. - Contribuii la studiul analitic al ocratoxinelor

cu aplicaii pe produse alimentare
CUPRINSUL TEZEI
CUPRINS ...................................................................................................3
INTRODUCERE........................................................................................9
SCOP I OBIECTIVE .............................................................................11
A. STADIUL ACTUAL AL CUNOATERII .........................................13
CAPITOLUL I Consideraii generale privind micotoxinele.. 13

I.1.
Introducere ................................................................. 13
I.2.
Clasificarea micotoxinelor ......................................... 14
I.3.
Efectele toxice ale micotoxinelor............................... 17
CAPITOLUL II Consideraii privind ocratoxinele................ 19
II.1. Structura chimic ....................................................... 19
II.2. Fungi productori de ocratoxin A ............................ 21
II.3. Contaminarea alimentelor cu ocratoxina A ............... 23
II.4. Producerea de ocratoxin A ....................................... 28
II.4.1.
Factori ce influeneaz producerea de OTA ...... 29
II.4.1.1. Temperatura................................................... 29
II.4.1.2. Umiditatea ..................................................... 29
II.4.1.3. Biocenoza substratului ................................. 29
II.4.1.4. Activitate apei................................................ 29
II.5. Prevenirea contaminrii alimentelor cu ocratoxin A 30
II.5.1.
Msuri necesare a se aplica nainte de recoltare 32
II.5.2.
Msuri ce pot fi aplicate n timpul recoltrii...... 33
II.5.3.
Msuri ce se pot aplica dup recoltare ............... 33
II.5.4.
Msuri aplicate n timpul depozitrii ................. 33
II.5.5.
Msuri aplicate n procesul de prelucrare .......... 33
II.6. Metode de reducere a OTA din produse alimentare .. 34
II.6.1.
Metode fizice...................................................... 34
II.6.2.
Metode chimice.................................................. 34
i

II.6.3.
Metode biologice ................................................ 35
II.7. Biosinteza ocratoxinei A ............................................ 36
II.7.1.
Gene implicate n biosinteza ocratoxinei A........ 36
II.7.2.
Ipoteze privind biosinteza ocratoxinei A............ 40
II.8. Toxicocinetica ocratoxinei A ..................................... 45
II.8.1.
Absorbie ............................................................ 45
II.8.2.
Transportul ......................................................... 45
II.8.3.
Distribuie ........................................................... 46
II.8.4.
Metabolizare ....................................................... 46
II.8.5.
Eliminare ............................................................ 46
II.9. Toxicitatea ocratoxinei A ........................................... 46
II.9.1.
Mecanismele aciunii toxice i efectele
ocratoxinei A asupra organismului uman i animal ........... 47
II.9.1.1. Inhibarea sintezei de proteine ........................ 47
II.9.1.2. Efecte asupra metabolismului lipidic............. 47
II.9.1.3. Efecte asupra metabolismului glucidic .......... 48
II.9.1.4. Efecte congestive i hemoragice.................... 48
II.9.1.5. Aciune imunotoxic...................................... 48
II.9.1.6. Aciune neurotoxic....................................... 48
II.9.1.7. Aciune cancerigen....................................... 49
II.9.1.8. Aciune genotoxic ........................................ 49
II.9.1.9. Aciune teratogen ......................................... 49
II.9.1.10. Aciune nefrotoxic...................................... 49
II.10.
Legislaia privind coninutul de ocratoxin A n
produse alimentare.................................................................. 50
CAPITOLUL III METODE DE ANALIZ A
OCRATOXINEI A DIN PRODUSE ALIMENTARE.............. .53
III.1.
Proprieti fizico-chimice ale ocratoxinei A........... 53
III.1.1. Date generale ...................................................... 53
III.1.2. Spectrul UV ........................................................ 54
III.1.3. Coeficient molar de absorbie............................. 54
III.1.4. Punct de topire.................................................... 55
III.1.5. Activitate optic.................................................. 55
III.1.6. Exponent de aciditate ......................................... 55
III.1.7. Stabilitatea ocratoxinei A ................................... 55
III.2.
Proprieti fizico-chimice ale ocratoxinei B........... 56
ii

III.2.1. Date generale...................................................... 56

III.2.2. Punct de topire ................................................... 56
III.2.3. Activitate optic ................................................. 56
III.2.4. Spectrul UV........................................................ 56
III.2.5. Fluorescena ocratoxinei B................................. 56
III.2.6. Stabilitatea ocratoxinei B ................................... 57
III.3.
Proprieti fizico - chimice ale ocratoxinei C ........ 57
III.3.1. Date generale...................................................... 57
III.3.2. Spectrul UV........................................................ 57
III.4.
Relaia structur chimic toxicitate..................... 57
III.5.
Metode de extracie i purificarea extractelor
coninnd ocratoxin A din produse alimentare ................... 58
III.5.1. Extracia ocratoxinei A ...................................... 58
III.5.1.1. Extracia i purificarea extractelor coninnd
ocratoxin A din cereale ................................................ 59
ocratoxin A din cafea ................................................... 60
ocratoxin A din bere i vin60
III.5.2. Purificarea extractului ........................................ 61
III.5.2.1. Extracia pe faz solid ................................ 61
III.5.2.2. Purificarea pe coloane de imunoafinitate..... 62
III.6.
Metode de determinare calitativ i cantitativ a
ocratoxinei A.......................................................................... 63
III.6.1. Metode spectrofotometrice spectrofotometrie de
fluorescen ........................................................................ 63
III.6.2. Metode cromatografice ...................................... 63
III.6.2.1. Cromatografie pe strat subire (CSS) ........... 63
III.6.2.2. Cromatografia de gaze (GC) ........................ 64
III.6.2.3. Cromatografia de lichide de nalt
performan (HPLC) ...................................................... 64
III.6.2.4. Teste de confirmare a ocratoxinei A ............ 64
III.6.3. Metode electroforetice ....................................... 65
III.6.4. Metode imunochimice - testul ELISA ............... 65
III.6.5. Metode radio - imunochimice ........................... 67
iii

B. PARTEA PERSONAL..................................................................... 69
CAPITOLUL IV INSTITUIREA A DOU METODE DE

ANALIZ PRIN CROMATOGRAFIE DE LICHIDE DE
NALT PERFORMAN PENTRU DETERMINAREA
OCRATOXINEI A 69
IV.1.
METODA I............................................................. 77
IV.1.1. Principiul metodei: ............................................. 77
IV.1.2. Material i metod .............................................. 77
IV.1.2.1. Aparatur...................................................... 77
IV.1.2.2. Reactivi......................................................... 77
IV.1.2.3. Soluii standard............................................. 77
IV.1.3. Condiii cromatografice...................................... 78
IV.1.4. Rezultate i discuii............................................. 79
IV.1.4.1. Determinarea specificitii ........................... 79
IV.1.4.2. Determinarea selectivitii............................ 80
IV.1.4.3. Determinarea liniaritii ............................... 82
IV.1.4.4. Limita de detecie i limita inferioar de
cuantificare ..................................................................... 88
IV.1.4.5. Determinarea preciziei ................................. 88
a. Precizia sistemului (Repetabilitatea injectrii)... 88
b. Repetabilitatea .................................................... 89
c. Precizia intermediar .......................................... 91
IV.1.4.6. Exactitatea metodei ...................................... 93
IV.1.4.7. Stabilitatea soluiei ....................................... 94
IV.1.5. Concluzii privind determinarea ocratoxinei A prin
metoda HPLC ..................................................................... 96
IV.2.
METODA II ........................................................... 97
IV.2.1. Principiul metodei .............................................. 97
IV.2.2. Material i metod .............................................. 97
IV.2.2.1. Aparatur...................................................... 97
IV.2.2.2. Reactivi......................................................... 97
IV.2.2.3. Soluii standard............................................. 98
IV.2.3. Condiii cromatografice...................................... 99
IV.2.4. Rezultate i discuii............................................. 99
IV.2.4.1. Determinarea specificitii ........................... 99
IV.2.4.2. Determinarea selectivitii.......................... 100
iv

IV.2.4.3. Determinarea liniaritii ............................. 102

IV.2.4.4. Limita de detecie i limita inferioar de
cuantificare................................................................... 107
IV.2.4.5. Determinarea preciziei ............................... 108
a. Precizia sistemului (Repetabilitatea injectrii) 108
b. Repetabilitatea metodei.................................... 108
c. Precizia intermediar........................................ 110
IV.2.4.6. Exactitatea metodei.................................... 112
IV.2.4.7. Stabilitatea soluiei..................................... 113
IV.2.5. Concluzii privind determinarea ocratoxinei prin
HPLC (metoda II) ............................................................ 114
IV.3.
Date comparative privind validarea metodelor I i II
de determinare a ocratoxinei A prin HPLC ......................... 115
CAPITOLUL V APLICAII ALE METODEI HPLC DE
DETERMINARE CANTITATIV A OCRATOXINEI A DIN
PRODUSE ALIMENTARE .................................................... 117
V.1. Identificarea i determinarea cantitativ a ocratoxinei A
din probe de cafea boabe folosind metoda I ........................ 117
V.1.1.
Identificarea ocratoxinei A prin cromatografie pe
strat subire (CSS) ............................................................ 118
V.1.1.1. Principiul metodei ....................................... 120
V.1.1.2. Reactivi i materiale.................................... 120
V.1.1.3. Mod de lucru ............................................... 120
V.1.1.4. Rezultate i discuii ..................................... 121
V.1.2.
Determinarea cantitativ a ocratoxinei A prin
cromatografie de lichide de nalt performan (HPLC) . 123
V.1.2.1. Material i metod....................................... 123
V.1.2.2. Procedeu de lucru:....................................... 124
V.1.2.4. Concluzii ..................................................... 135
din probe de pine ................................................................ 136
V.2.1.
strat subire (CSS) ............................................................ 137
V.2.1.1. Principiul metodei ....................................... 137
V.2.1.2. Reactivi i materiale.................................... 137
v

V.2.1.3. Mod de lucru................................................ 137

V.2.1.4. Rezultate i discuii...................................... 138
V.2.2.
cromatografie de lichide de nalt performan (HPLC).. 140
V.2.2.1. Material i metod ....................................... 140
V.2.2.2. Mod de lucru................................................ 140
V.2.2.4. Concluzii...................................................... 147
din probe de mlai folosind metoda II.................................. 148
V.3.1.
strat subire (CSS)............................................................. 148
V.3.1.1. Principiul metodei........................................ 148
V.3.1.2. Reactivi i materiale .................................... 148
V.3.1.3. Mod de lucru................................................ 148
V.3.2.
V.3.2.2. Mod de lucru................................................ 151
V.3.2.4. Concluzii...................................................... 157
din probe de fin folosind metoda II................................... 157
V.4.1.
V.4.1.2. Mod de lucru................................................ 158
V.4.1.4. Concluzii...................................................... 162
V.4.2.
Concluzii i recomandri privind produsele
cerealiere i derivate ......................................................... 162
din probe de bere folosind metoda II.................................... 165
V.5.1.
vi


V.5.1.2. Mod de lucru ............................................... 165
V.5.1.4. Concluzii ..................................................... 171
din probe de arahide folosind metoda II .............................. 172
V.6.1.
V.6.1.2. Mod de lucru ............................................... 172
V.6.1.4. Concluzii ..................................................... 176
din probe de stafide folosind metoda II ............................... 178
V.7.1.
V.7.1.2. Mod de lucru ............................................... 178
V.7.1.4. Concluzii ..................................................... 182
din probe de vin folosind metoda II ..................................... 183
V.8.1.
V.8.1.2. Mod de lucru ............................................... 183
V.8.1.4. Concluzii i recomandri............................. 188
CAPITOLUL VI Concluzii generale ................................... 191
Bibliografie............................................................................... 197
Anexa 1 - Lista de figuri .......................................................... 210
Anexa 2 - Lista de tabele.......................................................... 213
vii

INTRODUCERE
Micotoxinele sunt metabolii secundari produi de fungi,
toxici att pentru organismul uman ct i animal. Micotoxinele sunt
produi naturali secretai de fungi care determin un rspuns toxic
atunci cnd ajung n mod natural n concentraii ridicate la om i
animal [1].
Termenul de micotoxin deriv de la grecescul mykes
ciuperc, fung i latinescul toxicum otrav.
Fungii reprezint grupul cel mai mare de microorganisme din
sistemul biologic incluznd cca 25000 de specii fapt ce a dus la
concluzia c nu trim ntr-o lume cu fungi ci ntr-o lume a fungilor.
Cunotinele omenirii despre fungi i ntoxicaiile produse de
acetia dateaz nc din antichitate. Prima meniune scris a unei
micotoxicoze este fcut de Plinius cel Btrn, sec. I e.n., care a
descris n cartea 18 din Istoria natural semnele sindromului cauzat
de alcaloizii cornului secarei (Claviceps purpurea), sindrom care mai
trziu a fost numit ergotism.
Au fost izolate i caracterizate cca. 300 micotoxine i este
posibil ca noi micotoxine s fie descoperite n viitor.
Contaminarea cu fungi a alimentelor i furajelor conduce la
pierderi economice considerabile. Contaminarea fungic este
asociat cu producerea de micotoxine cu efecte toxice prin ingestie
att pentru om ct i pentru animale.
Avnd n vedere importana deosebit a cunoaterii nivelului
de contaminare cu micotoxine a alimentelor i puinele studii
efectuate n Romnia privind ocratoxinele, ne-am propus studiul
analitic al prezenei i nivelului contaminrii cu acestea a produselor
alimentare comercializate i consumate n zona judeului Iai.
Datorit insuficientelor informaii privind toxicitatea i efectele
ocratoxinelor B i C, ne-am ndreptat studiul asupra ocratoxinei A,
compus a crui toxicitate asupra organismului uman i animal este
cunoscut.
1

SCOP I OBIECTIVE
SCOPUL LUCRRII:
Lucrarea Contribuii la studiul analitic al ocratoxinelor
cu aplicaii pe produse alimentare i propune instituirea i
validarea unor metode de determinare a ocratoxinei A prin metoda
cromatografiei de lichide de nalt performan, aplicarea acestora pe
diverse produse de origine vegetal i identificarea nivelului de
contaminare.
OBIECTIVELE LUCRRII:
- informarea i documentarea din literatura de specialitate
privind metodele de analiz calitativ i cantitativ deja existente
pentru ocratoxina A;
- informarea, documentarea i prezentarea datelor privind
originea, structura, efectele toxice asupra organismului uman,
prevenirea contaminrii i decontaminarea produselor alimentare cu
ocratoxin A;
- instituirea a dou metode de separare i determinarea
cantitativ a ocratoxinei A prin metoda cromatografie de lichide de
nalt performan;
- verificarea anumitor performane analitice ale metodelor
urmrind parametrii de validare pentru cele dou metode de analiz
instituite n conformitate cu cerinele prevzute de literatura de
specialitate;
- aplicarea celor dou metode HPLC validate pentru separarea
i determinarea cantitativ a ochratoxinei A, n vederea identificrii
gradului de contaminare, pe diverse produse alimentare (cafea, mlai,
pine, bere, arahide, stafide, vin i fin) i interpretarea rezultatelor
obinute n urma analizelor efectuate.
.
2

A.STADIUL ACTUAL AL CUNOATERII

C A PI TO LU L I
C ON SI D ER A I I G EN ERA LE PR IV I ND
MI C O TO X IN ELE
Micotoxinele fac parte din categoria metaboliilor secundari
ai unor organisme care se dezvolt pe alimente pe care le impurific,
conferindu-le de cele mai multe ori proprieti toxice.
Dezvoltarea mucegaiurilor pe alimente are, n general,
consecine grave deoarece elaboreaz metabolii secundari care sunt
responsabili de aciunea toxic asupra organismului uman i animal.
Potrivit FAO (Food and Agriculture Organization), 25% din
recoltele la nivel mondial sunt contaminate cu micotoxine.
Exist ase clase majore de micotoxine care apar frecvent:
aflatoxine, tricotecene, fumonisine, zearalenon, ocratoxina A i
cornul secarei.
Principalele efecte toxice sunt efecte carcinogene, genotoxice
nefrotoxice, hepatotoxice, estrogenice, tulburri de reproducere,
imunosupresie sau efecte la nivelul pielii
C A PI TO LU L I I
C ON SI D ER A I I PR I V IND O CR ATO X IN ELE
Ocratoxina A (OTA) a fost izolat pentru prima dat de Van
der Merwe n anul 1965, din culturi de Aspergillus ochraceus, fung
ce a fost descris de Wilhelm n anul 1887 [3]. Ulterior i alte specii
de Aspergillus i Penicillium au fost descrise ca productoare de
ocratoxin A [4].
Ocratoxinele reprezint un grup de compui cu structur
chimic nrudit, n molecula crora L-fenilalanina este cuplat
printr-o legtur amidic cu un derivat izocumarinic (Figura nr. 1
Tabelul nr. 1).
3

Figura nr. 2 - Structura

chimic a ocratoxinei A
Figura nr. 1 - Structura

general a ocratoxinelor
Tabelul nr. 1 Structura chimic a ocratoxinelor

Denumire
R1
Ocratoxine naturale
Ocratoxina A
Ocratoxina B
Ocratoxina C
Metil-esterul ocratoxinei A
Metil-esterul ocratoxinei B
Metil-esterul ocratoxinei C
Ocratoxina
Ocratoxina
4-R-Hidroxiocratoxina A
4-s- Hidroxiocratoxina A
10- Hidroxiocratoxina A
Tirosina analog a ocratoxinei
A
Serina analog a ocratoxinei A
Hidroxiprolina analog a
ocratoxinei A
Lisina analog a ocratoxinei A
Ocratoxine sintetice
d-Ocratoxina A
Etil-amida ocratoxinei A
Radical
R2
R3
R4
R5
fenilalanin
fenilalanin
esterul etil al
fenilalaninei
esterul metil al
fenilalaninei
esterul metil al
fenilalaninei
esterul etil al
fenilalaninei
OH
OH
fenilalanin
fenilalanin
fenilalanin
Cl
H
H
H
H
H
H
H
Cl
Cl
Cl
H
Cl
Cl
Cl
H
H
H
OH
H
H
H
OH
H
H
H
H
H
H
OH
tirosin
Cl
serin
Cl
hidroxiprolin
Cl
lisin
Cl
d-fenilalanin
etil amida
fenilalaninei
Cl
Cl

Ocratoxina A (Figura nr. 2) este un metabolit toxic produs de

specii din genul Aspergillus (A. ochraceus, A. wentii, A. glaucus, A.
fumigatus, A. niger, A. terreus etc.) n zonele tropicale i subtropicale
i de specii din genul Penicillium (P. verrucosum, P. expansum,
P. commune, P. chrysogenum etc.) n zonele temperate.
Analize efectuate n diferite ri din ntreaga lume, situate n
toate zonele climatice, au pus n eviden prezena ocratoxinei A
ntr-o varietate de produse alimetare de origine vegetal, n
concentraii uneori periculoase pentru sntatea populaiei: arahide,
cereale, semine de bumbac, cafea, pine, fin, orez, mazre, fasole,
bere, vin etc [43].
Administrarea de doze crescute i unice de ocratoxin A
poate duce la intoxicaie acut care se manifest printr-o serie de
simptome ca anorexie, poliurie, polidipsie, hemoragie digestiv,
deshidratare care pot provoca moartea la cteva sptmni dup
administrare.
Mecanismele prin care ocratoxina A i manifest aciunea
toxic sunt complexe: inhibarea sintezei de proteine, peroxidarea
lipidic, sechestrarea calciului microzomal. Pincipalele efecte
determinate de ctre aceasta sunt: efecte asupra metabolismului
lipidic, glucidic, efecte congestive i hemoragice, aciune
imunotoxic, aciune neurotoxic, aciune cancerigen, aciune
genotoxic, aciune teratogen, aciune nefrotoxic.

C A PI TO LU L I I I
METO D E D E ANA LI Z A O CRA TO X IN EI A
D I N PRO DU SE ALI M EN TA R E
Ocratoxina A este un compus cristalin, incolor ce prezint
fluorescen verde-albastr n lumin UV (ex = 330 333 nm,
em = 445 - 470 nm). Este solubil n solveni organici polari
(moderat solubil n acetonitril i acetat de etil, respectiv solubil n
cloroform i metanol). OTA este uor solubil n ap i solubil n
soluie apoas diluat de bicarbonat de sodiu [106].
Compusul prezint un caracter slab acid, important pentru
metodele analitice utilizate n determinarea ocratoxinei A [107].
Astfel, este posibil extracia ocratoxinei A cu solveni
organici n mediu acid. Majoritatea metodelor de extracie folosite de
ctre diferii autori, n literatura de specialitate, realizeaz extracia
ocratoxinei A n mediu acid dar sunt prezentate, n numr mult mai
mic, i metode de extracie n mediu alcalin.
Purificarea extractului se poate realiza, n principal, prin
extracie pe faz solid sau prin utilizarea coloanelor de
imunoafinitate.
n determinarea calitativ i cantitativ a ocratoxinei A sunt
utilizate diferite metode analitice:
- Metode cromatografice
Cromatografie pe strat subire (CSS)
Cromatografia de gaze (GC)
Cromatografia de lichide de nalt performan
(HPLC);
- Metode electroforetice;
- Metode imunochimice;
- Metode radio-imunochimice.

B. PARTEA PERSONAL
C A PI TO LU L IV
I N STI TU IR EA A D OU METO D E D E ANA LI Z
PR I N CR OMA TOG RA FI E D E LI CH I D E D E
N A LT PER FOR MAN PEN TRU
D ETER MI NA R EA O CR A TOX IN EI A
Dezvoltarea metodelor de analiz pentru determinarea
ocratoxinei A a avut ca punct de plecare A.O.A.C. International
Official Methods of Analysis [141].
Principiul metodelor a constat n separarea i determinarea
cantitativ a ocratoxinei A folosind o coloan cromatografic cu
umplutur n faz invers (Stable Bond SB C18 (150 mm x 4.6 mm,
5 m), Luna C18(2) 100A (150 x 4,6 mm, 5m)), faza mobil
acetonitril: ap: acid acetic (99:99:2, v/v/v), cu detecie n
fluorescen cu lungimea de und de excitaie ex = 228 nm i
lungimea de und de emisie em = 423 nm.
Avnd n vedere faptul c tipul de coloan cu care s-au
nceput determinrile (Stable BondSB C18) a necesitat nlocuirea pe
parcursul derulrii analizelor iar achiziionarea uneia identice nu a
fost posibil, n partea a doua s-a utilizat o coloan de tip Luna
C18(2) cu parametri asemntori, fapt care a necesitat reverificarea
performanelor analitice ale metodei.
Dup stabilirea condiiilor optime de analiz (faz staionar,
faz mobil, debit, lungime de und de excitaie i de emisie) s-au
verificat anumite performane analitice ale metodelor, urmrind
urmtorii parametri de validare: specificitatea, liniaritatea funciei de
rspuns, liniaritatea rezultatelor, limita de detecie, limita inferioar
de cuantificare, precizia (precizia sistemului, precizia metodei,
precizia intermediar) i exactitatea.

1. METODA I
Pentru determinarea ocratoxinei A prin cromatografie de
lichide de nalt performan s-a utilizat un cromatograf de lichide tip
Agilent Technologies 1090 echipat cu detector de fluorescen.
Principiul metodei
Separarea i determinarea cantitativ a ocratoxinei A prin
cromatografiei de lichide de nalt performan pe coloan Stable
BondSB C18 (150 mm x 4,6 mm, 5 m), cu faz mobil format din
acetonitril: ap: acid acetic (99:99:2, v/v/v) cu debitul de 0,7 mL/min
i detecie n fluorescen cu ex = 228 nm i em = 423 nm.
Aparatur
- Cromatograf de lichide de nalt performan de tipul HP
1090 Series II prevzut cu detector de fluorescen tip HP 1046 A;
- Coloan cromatografic Stable Bond SB C18 (150 mm x
4.6 mm, 5 m);
- Balan analitic tip Kern 770;
- Baie de ultrasunete Cole-Parmer.
Reactivi
- Ocratoxina A - Aspergillus ochraceus (Sigma);
- Metanol gradient grade de puritate HPLC (Merck);
- Acetonitril R Chromasolv min 99,8% (Riedel-de Han);
- Acid acetic glacial 100% (Merck);
- Ap purificat (rezistivitate 18,2 M);
- Filtre Millipore 45 m.
Soluii standard
Se prepar soluia etalon stoc de ocratoxin A de concentraie
0,5 mg/mL n metanol. Din soluia stoc se prepar prin diluie cu
metanol soluia etalon de lucru de concentraie 25 g/mL. Prin diluii
succesive cu metanol se prepar soluii de concentraii cuprinse ntre
9,7656 ng/mL - 1250 g/mL.
Condiii cromatografice
-Faz mobil:CH3CN:H2O:CH3COOH (n raport 99:99:2, v/v/v);
-Debit faz mobil: 0,7 mL/min;
-Volumul de prob injectat n HPLC - 20 L;
- Temperatur coloan: 25 C;
- Detecie n fluorescen cu ex = 228 nm i em = 423 nm.
8

Validarea metodei
Verificarea anumitor parametri de validare s-a realizat n
conformitate cu literatura de specialitate [170, 171, 172, 173, 174]
urmrind urmtorii parametri: selectivitatea, specificitatea metodei,
determinarea liniaritii, limitei de detecie, limitei inferioare de
cuantificare, preciziei (precizia sistemului i precizia metodei,
precizia intermediar) i exactitii.
Determinarea specificitii
Pentru studiul specificitii metodei s-a procedat astfel:
a) s-a determinat timpul de retenie al ocratoxinei A prin
injectarea unei soluii de concentraie 1,250 g/mL n metanol.
Cromatograma obinut este prezentat n Figura nr. 3, ocratoxina A
avnd un timp de retenie de 9,5 min.
b) au fost efectuate 2 analize pe solventul utilizat (metanol) la
prepararea soluiilor standard i a probelor. Dup cum era de ateptat,
la timpul de retenie corespunztor ocratoxinei A nu s-au obinut
picuri interferente.
Figura nr. 3 - Cromatograma unei soluii standard de

OTA - 1,250 g/mL (metoda I)
Determinarea selectivitii
Selectivitatea metodei a fost demonstrat n cazul fiecrui tip
de aplicaie pe categorii diferite de probe i s-a observat c nu apar
alte picuri interferente la timpul de retenie a ocratoxinei A.
Determinarea liniaritii
Se prepar i analizeaz soluii etalon de OTA cu valorile
concentraiilor cuprinse ntre 9,7656 ng/mL i 1250 ng/mL. Pentru
9

fiecare valoare a concentraiei au fost analizate un numr de 6 soluii.

Valorile medii ale ariilor picurilor obinute se reprezint grafic n
funcie de concentraie.
Se reprezint grafic variaia ariei medii n funcie de
concentraie i se determin intervalul de concentraie pentru care
aceast variaie este liniar. Se traseaz dreapta de regresie pentru
acest interval i se determin coeficientul de corelaie (r), deviaia
standard a pantei dreptei de regresie (SE) i ecuaia dreptei
Arie pic = f (c), Arie pic = a x Concentraia + b.
Pe intervalul de concentraie 9,7656 ng/mL - 1250 ng/mL,
variaia ariei picului ocratoxinei A este liniar (r2 = 0,9998,
r2 = coeficient de determinare).
Prin prelucrarea statistic se obine ecuaia dreptei de
calibrare: Arie pic = 0,9434 x Concentraia +13,977, r2 = 0,9998.
Aadar, domeniul de liniaritate al metodei este
9,7656- 1250 ng/mL.
Pe de alt parte, avnd n vedere faptul c metoda dezvoltat
urmeaz a fi aplicat pentru determinarea ocratoxinei A din probe n
care aceasta se afl n concentraii foarte mici, ne-am propus s
ngustm domeniul de lucru. Astfel, am considerat ca domeniu de
lucru intervalul 9,7656 39,063 ng/mL.
Figura nr. 4 prezint dreapta de calibrare obinut n studiul
liniaritii metodei de determinare a OTA pe domeniul de lucru.
Figura nr. 4 - Dreapta de calibrare pe domeniul de lucru

(metoda I)
Rezultatele obinute n urma evalurii statistice a liniaritii
sunt prezentate n Tabelul nr. 2.
10

Tabelul nr. 2 - Evaluarea statistic a linearitii

Parametru
Valoare
Coeficient de determinare (r2)
0,9995
Coeficient de corelaie (r)
0,9997
Eroare standard (SE)
0,3478
Intercept
1,1265
Panta
6,7853
Ecuaia dreptei de calibrare este:
Arie pic = 1,1265 x Concentraia (ng/mL) + 6,7853
Pentru evaluarea liniaritii rezultatelor se reprezint grafic
variaia concentraiei calculate utiliznd ecuaia dreptei de calibrare
n funcie de concentraia teoretic.
Dup cum se observ din Figura nr. 5, ntre concentraia
introdus teoretic i cea calculat folosind ecuaia dreptei de calibrare
exist o corelaie liniar, panta acestei drepte fiind unitar iar
interceptul avnd o valoare foarte mic (0,00005). Coeficientul de
determinare al acestei drepte are valoarea r2 = 0,9995.
Figura nr. 5 - Liniaritatea rezultatelor (metoda I)

Avnd n vedere faptul c interceptul are o valoare foarte
mic, se poate afirma c aceast dreapt trece prin origine. Pe de alt
parte, dreapta ce trece prin origine i are panta egal cu unitatea este
prima bisectoare. Aceasta nseamn c ntre concentraia introdus
(teoretic) i cea calculat utiliznd ecuaia dreptei de calibrare
corelaia este foarte bun.
11

Limita de detecie i limita inferioar de cuantificare

Pentru aprecierea limitei de detecie i a limitei inferioare de
cuantificare s-a folosit metoda de calcul ce utilizeaz deviaia
standard (SE) i panta dreptei de regresie:
3,3 SE 3,3 1,1265
= 0 ,54ng / mL
=
panta
6 ,7853
10 SE 10 1,1265
=
= 1,66ng / mL
LQ =
panta
6 ,7853
LD =
Determinarea preciziei
n cadrul preciziei au fost studiate precizia sistemului,
precizia metodei i precizia intermediar.
a. Precizia sistemului (Repetabilitatea injectrii)
Pentru a examina precizia sistemului, aceeai soluie
coninnd ocratoxin A n concentraia de interes (19,53 ng/L) s-a
injectat de 6 ori obinndu-se tot attea cromatograme.
Din cromatogramele obinute s-a msurat ariile picurilor,
calculndu-se valoarea medie, deviaia standard i deviaia standard
relativ.Valorile experimentale obinute se regsesc n Tabelul nr. 3.
Tabelul nr. 3 - Precizia sistemului (metoda I)
Nr. determinrii
Arie pic
1
29,5
2
28,7
3
29,9
4
28,4
5
28,2
6
30,3
Media
29,17
SD
0,86
RSD
2,94%
Concluzie:
Avnd n vedere valoarea deviaiei standard relative obinute
(RSD = 2,94%), comparativ cu limita de 5% acceptabil pentru
determinri analitice, se poate afirma c la determinarea prin HPLC a
ocratoxinei A, sistemul este precis.
12

b. Repetabilitatea (Precizia metodei)

Pentru stabilirea repetabilitii metodei s-a ales varianta de
lucru cu un minim de 9 determinri acoperind domeniul specific de
concentraie (3 determinri la 3 valori ale concentraiei). Au fost
analizate soluii pe un interval de 30% fa de concentraia de
interes, 19,53 ng/mL. Se prepar soluiile de lucru prin diluare cu
metanol: 25,63 ng/mL, 19,53 ng/mL i 14,65 ng/mL. Pentru fiecare
nivel de concentraie se prepar i se analizeaz un numr de trei
probe msurndu-se experimental aria picurilor.
Utiliznd ecuaia dreptei de calibrare i valorile ariilor
corespunzatoare picurilor ocratoxinei A se calculeaz concentraia
(n ng/mL) pentru fiecare prob n parte. Se determin concentraia
calculat ca procent din valoarea concentraiei teoretice. Valorile
obinute sunt prelucrate statistic. Astfel, sunt calculate: valoarea
medie, deviaia standard, deviaia standard relativ i intervalul de
ncredere pentru fiecare valoare individual ca i pentru valoarea
medie. Deviaia standard relativ trebuie s aib o valoare mai mic
de 5%.
Valorile experimentale obinute sunt prezentate n Tabelul nr. 4.
Tabelul nr. 4 - Precizia metodei (metoda I)
Nr.
det.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Concentraie
teoretic
(ng/mL)
14,65
19,53
25,63
Date statistice
Arie pic
22,7
23,4
23,6
28,2
29,9
30,3
35,4
35,8
35,7
Concentraie
calculat
(ng/mL)
14,13
14,75
14,93
19,01
20,52
20,87
25,40
25,76
25,67
Media
SD
RSD
Regsire
(%)
96,4
100,7
101,9
97,3
105,1
106,9
99,1
100,5
100,1
100,9%
3,39
3,36%
13

Concluzie:
Conform datelor experimentale obinute, dup prelucrarea
statistic a acestora, se observ c pe un interval de 30% fa de
valoarea de interes, metoda este precis, deviaia standard relativ
(RSD) fiind sub limita impus de 5%.
c. Precizia intermediar
Pentru determinarea preciziei intermediare la determinarea
ocratoxinei A prin HPLC, ntregul experiment s-a efectuat utiliznd
aceeai reactivi n trei zile diferite, modul de lucru fiind identic ca i
n cazul determinrii repetabilitii metodei. Pentru fiecare nivel de
concentraie se prepar i se analizeaz un numr de trei probe,
msurndu-se experimental aria picurilor.
corespunztoare picurilor ocratoxinei A se calculeaz concentraia
(n ng/mL) pentru fiecare prob n parte. Se determin concentraia
de 5%.
Datele experimentale obinute sunt prezentate n Tabelul nr. 5.
Tabelul nr. 5 - Precizia intermediar (metoda I)
Concentraie
Concentraie
Arie
Regsire
Nr.
teoretic
calculat
det.
pic
(%)
(ng/mL)
(ng/mL)
1
23,5
14,84
101,3
14,65
2
24,7
15,90
108,6
3
22,9
14,31
97,6
4
29,5
20,16
103,2
19,53
5
28,7
19,45
99,6
6
28,4
19,19
98,2
7
36,9
26,73
104,3
24,41
8
36,7
26,56
103,6
9
36,2
26,11
101,9
14

Nr.
det.
Concentraie
teoretic
(ng/mL)
Arie
pic
Date statistice
Concentraie
calculat
(ng/mL)
Media
SD
RSD
Regsire
(%)
102,0%
3,41
3,34%
Concluzie:
statistic a acestora se observ c pe un interval de 30% fa de
Exactitatea metodei
Pentru determinarea exactitii metodei se lucreaz prin
metoda adaosului standard: ntr-o soluie ce conine o cantitate
cunoscut de standard, se introduc volume de soluie de ocratoxin
astfel nct s se obin concentraii de 70%, 100% i 130% fa de
concentraia soluiei ce va fi testat (19,53 ng/mL). Procedeul s-a
repetat de trei ori utiliznd soluii etalon preparate separat.
Din punct de vedere experimental, s-a preparat mai nti o
soluie stoc de ocratoxin A din care, prin diluie s-au obinut
soluiile de lucru. Soluiile astfel preparate au fost injectate i
analizate prin HPLC n condiiile metodei. Cromatogramele obinute
au fost integrate, determinndu-se astfel aria picurilor.
picurilor corespunztoare ocratoxinei A s-a calculat concentraia (n
ng/mL) pentru fiecare prob n parte s-a determinat regsirea,
calculat ca procent din valoarea concentraiei teoretice, regsirea
medie precum i domeniul n care variaz regsirea (Tabelul nr. 6).
Tabelul nr. 6 - Exactitatea metodei (metoda I)
Nr.
det.
1
2
3
Concentraie
teoretic
(ng/mL)
Arie pic
14,65
23,4
24,0
23,1
Concentraie
calculat
(ng/mL)
14,75
15,28
14,48
Regsire
(%)
100,7
104,3
98,9
15

Nr.
det.
4
5
6
7
8
9
Concentraie
teoretic
(ng/mL)
19,53
25,63
Date statistice
Arie pic
29,4
29,3
28,6
35,4
36,6
37,2
Concentraie
calculat
(ng/mL)
20,08
19,99
19,37
25,40
26,47
27,00
Regsire medie
Minim
Maxim
Regsire
(%)
102,8
102,3
99,2
99,1
103,3
105,3
101,8%
98,9%
105,3%
Concluzie: exactitatea metodei de determinare a ocratoxinei

A prin HPLC, exprimat ca regsire medie, are valoarea de 101,8%.
Stabilitatea soluiei
Pentru a studia stabilitatea soluiei de ocratoxin A, a fost
analizat o prob n concentraia de 0,625 ng/mL timp de 7 zile, n
condiiile n care proba a fost meninut la temperatura camerei.
Concluzie Probele ce conin ocratoxina A, dup ce au fost
aduse n soluie metanolic, pot fi pstrate la temperatura camerei
pentru o analiz ulterioar timp de cel puin 7 zile, fr a suferi
degradri, aria picurilor corespunztoare ocratoxinei A
meninndu-i valoarea relativ constant, scderea ariei picului dup
7 zile fiind de sub 1%.
2. METODA II
Principiul metodei
Separarea i determinarea cantitativ a ocratoxinei A prin
metoda cromatografiei de lichide de nalt performan, pe coloan
Phenomenex Luna C18(2) 100 (150 x 4,6 mm) cu faz mobil
format din CH3CN:H2O:CH3COOH (n raport 99:99:2, v/v/v) cu
debitul 0,7 mL/min i detecie n fluorescen cu ex = 228 nm i
em = 423 nm.
Aparatur
- Cromatograf de lichide de nalt performan de tipul HP
1090 Series II prevzut cu detector de fluorescen tip HP 1046 A;
16

- Coloan cromatografic Phenomenex Luna C18(2) 100

(150 x 4,6 mm);
- Baie de ultrasunete Cole-Palmer;
- Balan analitic Adam.
Reactivi - identici cu cei utilizai la metoda I
Soluii standard
Se prepar soluia etalon stoc de OTA de concentraie 40
g/mL. Din soluia stoc se prepar soluia etalon de lucru de
concentraie 0,8 g/mL i din aceasta, prin diluie cu metanol, se
prepar soluii cu concentraii cuprinse ntre 6,25 ng/mL i 800
ng/mL
Condiii cromatografice
- Faz mobil: CH3CN:H2O:CH3COOH (n raport 99:99:2,
v/v/v);
- Debit faz mobil 0,7 mL/min;
- Volumul de prob injectat - 20 L;
- Temperatura coloanei 25 C;
- Detecie n fluorescen cu ex = 228 nm i em = 423 nm.
Validarea metodei
S-a urmrit verificarea performanelor analitice ale metodei n
termeni de parametri de validare n conformitate cu literatura de
specialitate [170, 171, 172, 173, 174]. n cadrul validrii ne-am
propus urmrirea urmtorilor parametri: selectivitate, specificitatea
metodei, determinarea liniaritii, limitei de detecie, limitei
inferioare de cuantificare, preciziei (precizia sistemului i precizia
metodei) i exactitii.
Determinarea specificitii
Pentru a determina specificitatea metodei s-a procedat la
identificarea ocratoxinei A prin injectarea unei soluii de concentraie
0,4 g/mL n metanol (Figura nr. 6).
Au fost efectuate analize pe solventul utilizat (metanol) la
prepararea soluiilor standard i a probelor. Dup cum era de ateptat
la timpul de retenie corespunztor ocratoxinei A nu s-au obinut
picuri interferente.
17

.
Figura nr. 6 - Cromatograma unei soluii standard de
OTA - 0,4 g/mL (metoda II)
Determinarea selectivitii
Selectivitatea metodei a fost demonstrat n cazul fiecrui tip
de aplicaie, pe categorii diferite de probe i s-a observat c nu apar
alte picuri la timpul de retenie a ocratoxinei A
Determinarea liniaritii
Pentru determinarea liniaritii au fost preparate soluii de
ocratoxin A n metanol, pe intervalul 6,25 - 800 ng/mL. Pentru
fiecare concentraie s-au efectuat un numr de 3 determinri i s-a
calculat valoarea medie a ariei picului corespunztor ocratoxinei A.
Valorile medii ale ariei picurilor au fost reprezentate grafic n
funcie de concentraie i s-a calculat ecuaia dreptei de regresie: Arie
pic= 0,6219 x concentraia + 7,1842.
Pe intervalul de concentraie 6,25 - 800 ng/mL, variaia ariei
picului ocratoxinei A este liniar (r2 = 0,9998, r2 = coeficient de
determinare), dar, avnd n vedere faptul c intenia este de a
determina concentraii ct mai mici de ocratoxin A din probe, am
calculat ecuaia curbei de calibrare pe intervalul 6,25-50 ng/mL
(Figura nr. 7).
18

Figura nr. 7 Dreapta de calibrare pe domeniul de

lucru (metoda II)
Prin prelucrarea statistic se obine ecuaia dreptei de
calibrare: Arie pic = 0,6340 x Concentraia + 6,7352,
coeficientul de determinare r2 = 0,9991
eroarea standard a dreptei de regresie SE = 0,3113.
Rezultatele obinute sunt prezentate n Tabelul nr. 7.
Tabelul nr. 7 - Evaluarea statistic a linearitii
(metoda II)
Parametru
Valoare
2
Coeficient de determinare (r )
0,9991
Coeficient de corelaie (r)
0,9996
Eroare standard (SE)
0,3113
Intercept
6,7352
Panta
0,6340
Din datele statistice obinute se observ c pe domeniul de
interes, 6,25 - 50 ng/mL, liniaritatea este foarte bun, coeficientul de
determinare avnd valoarea de 0,9991.
Pentru evaluarea liniaritii rezultatelor se reprezint grafic
variaia concentraiei calculate utiliznd ecuaia dreptei de calibrare
n funcie de concentraia teoretic (Figura nr. 8).
19

Figura nr. 8 - Liniaritatea rezultatelor (metoda II)

Dup cum se observ din Figura nr. 8, ntre concentraia
introdus teoretic i cea calculat folosind ecuaia dreptei de calibrare
exist o corelaie liniar, panta acestei drepte fiind unitar iar
interceptul avnd o valoare foarte mic (0,00005). Coeficientul de
determinare al acestei drepte are valoarea r2 = 0,9991. Avnd n
vedere faptul c interceptul are o valoare foarte mic, se poate afirma
c aceast dreapt trece prin origine. Pe de alt parte, dreapta ce trece
prin origine i are panta egal cu unitatea este prima bisectoare.
Aceasta nseamn c ntre concentraia introdus (teoretic) i cea
calculat utiliznd ecuaia dreptei de calibrare corelaia este foarte
bun.
S-au calculat limita de detecie (LD) i limita inferioar de
cuantificare (LQ) utiliznd valoarea erorii standard (SE) i a pantei
dreptei de regresie conform relaiilor (1) i (2):
3,3 SE 3,3 0 ,3123
LD =
=
= 1,6ng / mL (1)
Panta
0 ,6339
10 SE 10 0 , 3123
=
= 4 ,9ng / mL
LQ =
Panta
0 ,6339
(2)
Determinarea preciziei
n cadrul preciziei au fost studiate precizia sistemului,
precizia metodei i precizia intermediar.
20

a. Precizia sistemului
Pentru determinarea preciziei sistemului a fost analizat de 10
ori o prob ce conine ocratoxin A n concentraie de 25 ng/mL.
Datele experimentale obinute sunt prezentate n Tabelul nr. 8.
Tabelul nr. 8 - Precizia sistemului (metoda II)
Nr. det.
Arie pic
1
22,71
2
23,22
3
22,90
4
22,84
5
22,83
6
22,73
7
22,74
8
23,19
9
23,30
10
22,84
Medie
22,93
SD
0,22
RSD
0,96%
Dup prelucrarea statistic a datelor obinute se observ c
deviaia standard relativ (RSD) are valoarea 0,96% deci sistemul
este precis [174].
b.Repetabilitatea metodei
Pentru determinarea repetabilitii metodei au fost analizate
soluii pe un interval de 20% fa de concentraia de interes, pentru
un numr de 3 determinri la 3 nivele de concentraie. Folosind
ecuaia dreptei de calibrare se calculeaz concentraia pentru fiecare
prob n parte i procentul de regsire. Datele experimentale obinute
sunt prezentate n Tabelul nr. 9.
21

Tabelul nr. 9 - Repetabilitatea metodei (metoda II)

Concentraie
Concentraie
Nr.
Arie
Regsire
teoretic
calculat
det.
pic
(%)
(ng/mL)
(ng/mL)
1
19,22
19,69
98,5
20
2
19,10
19,50
97,5
3
19,66
20,38
101,9
4
23,30
26,13
104,5
25
5
22,80
25,34
101,4
6
22,90
25,50
102,0
7
26,38
30,98
103,3
30
8
25,88
30,20
100,7
9
25,26
29,21
97,4
Medie
100,8%
Date statistice
SD
2,52
RSD
2,50%
Din datele experimentale obinute se observ c metoda este
precis, deviaia standard relativ fiind RSD = 2,50%, fa de
maximul de 5% admis pentru determinri analitice [174].
c. Precizia intermediar
Pentru determinarea preciziei intermediare la determinarea
ocratoxinei A prin HPLC, ntregul experiment s-a efectuat utiliznd
aceeai reactivi n trei zile diferite, modul de lucru fiind identic ca i
n cazul determinrii repetabilitii metodei.
Pentru fiecare nivel de concentraie se prepar i se
analizeaz un numr de trei probe, msurndu-se experimental aria
picurilor.
corespunztoare picurilor ocratoxinei se calculeaz concentraia (n
ng/mL) pentru fiecare prob n parte. Se determin concentraia
22


de 5%.
Datele experimentale obinute la determinarea preciziei sunt
prezentate n Tabelul nr. 10.
Tabelul nr. 10 Precizia intermediar(metoda II)
Concentraie
Concentraie
Arie
Regsire
Nr.det.
teoretic
calculat
pic
(%)
(ng/mL)
(ng/mL)
1
19,5
20,13
100,7
20
2
19,1
19,50
97,5
3
19,4
19,98
99,9
4
23,1
25,81
103,2
25
5
22,7
25,18
100,7
6
22,9
25,50
102,0
7
26,4
31,02
103,4
30
8
25,9
30,23
100,8
9
25,4
29,44
98,1
Media
100,7%
Date statistice
SD
2,03
RSD
2,01%
Concluzie:
statistic a acestora se observ c pe un interval de 20% fa de
Exactitatea metodei
Pentru determinarea exactitii metodei au fost analizate
probe ntr-un domeniu de concentraie de 20% fa de concentraia
de interes. Au fost analizate 3 soluii de concentraii diferite, iar
pentru fiecare valoare a concentraiei au fost efectuate un numr de 3
determinri. Pentru fiecare analiz a fost determinat aria picului
corespunztor ocratoxinei A i s-a calculat concentraia folosind
ecuaia curbei de calibrare. S-a calculat regsirea pentru fiecare prob
n parte, valoarea medie i intervalul de regsire. Datele
experimentale obinute sunt prezentate n Tabelul nr. 11.
23

Tabelul nr. 11 - Exactitatea metodei (metoda II)

Concentraie
Concentraie
Regsire
Arie pic
teoretic
calculat
(%)
(ng/mL)
(ng/mL)
1
19,35
19,90
99,49
20
2
19,18
19,63
98,15
3
19,70
20,45
102,25
4
22,76
25,28
101,11
25
5
23,07
25,77
103,06
6
22,97
25,61
102,43
7
25,21
29,14
97,14
30
8
25,61
29,77
99,24
9
25,32
29,31
97,71
Media
100,1%
Date statistice
Min
97,1%
Max
103,1%
Din datele experimentale obinute se observ c pe domeniul
de concentraii studiat (20-30 ng/mL) regsirea medie este de
100,1% pe intervalul 97,1-103,1%, comparativ cu o limit de
10% prevzut de normele europene, de unde rezult c metoda
este exact [174].
Stabilitatea soluiei
Pentru determinarea stabilitii soluiei a fost analizat o
prob n concentraie de 0,4 g/mL n metanol timp de 7 zile n
condiiile n care proba a fost meninut la temperatura camerei.
Rezultatele obinute arat c proba poate fi meninut la temperatura
camerei 7 zile fr s aib loc degradarea ocratoxinei A, scderea
ariei dup 7 zile fiind de sub 1%.
Nr.
det.
24

C A PI TO LU L V
A PLI C A II A LE METO D EI H PLC D E
D ETER MI NA R E C AN TI TA TI V A
O CR A TOX IN EI A D IN PRO DU SE
A LI M EN TAR E
Dup instituirea i verificarea performanelor analitice ale
celor dou metode de analiz prin cromatografie de lichide de nalt
performan, acestea au fost aplicate cu bune rezultate la evaluarea
coninutului de ocratoxin A din diverse produse alimentare de
origine vegetal (cafea boabe, mlai, pine, bere, arahide, stafide, vin
i fin).
Identificarea ocratoxinei A s-a fcut, n cteva cazuri, n
paralel i prin cromatografie n strat subire, pentru confirmarea
suplimentar a prezenei acesteia n probe.
1. IDENTIFICAREA I DETERMINAREA CATITATIV A
OCRATOXINEI A DIN PROBE DE CAFEA BOABE
FOLOSIND METODA I
Probele au fost procurate din reeaua comercial a
municipiului Iai, din uniti ce comercializeaz produse vrac. S-au
analizat 40 de probe de cafea boabe (prjit) de diferite sorturi: cafea
Columbia, cafea Indonezia, cafea Brazilia, cafea Robusta, cafea
India, cafea decofeinizat, cafea prjit i mcinat (marc
nregistrat).
a. Identificarea ocratoxinei A prin cromatografie pe strat
subire (CSS)
Metoda de identificare a OTA prin CSS cuprinde etapele:
extracia ocratoxinei A cu amestec CH3OH : NaHCO3 soluie 3% (n
raport 80:20), spotarea extractului purificat pe placa cromatografic
alturi de etalonul de ocratoxin A, developarea plcii n sistemul de
solveni format din toluen - acetat de etil - cloroform - acid formic
(7:5:5:2); revelarea plcii i compararea valorii Rf-ului etalonului cu
cele ale probelor n scopul identificrii ocratoxinei A.
25

Sub lumin UV, = 366 nm, pe plcile cromatografice se

observ apariia unor spoturi cu fluorescen de culoare
verde-albastr specifice pentru OTA.
S-au calculat Rf -urile pentru soluia standard de ocratoxina A
i pentru probe. Valorile Rf-urilor probelor au valori apropiate de cea
a standardului de ochratoxin A. Astfel, s-a identificat ochratoxina A
prin CSS n probele 9 i 14. n probele 1, 11, 17 i 20 aceasta nu fost
identificat dar analiza HPLC ulterioar a pus n eviden prezena
OTA.
b. Determinarea cantitativ a ocratoxinei A prin HPLC
Determinarea cantitativ a ochratoxinei A din probele de
cafea boabe (prjit) s-a realizat prin Metoda I .
Probele de analizat au fost supuse extraciei cu un amestec
format din CH3OH:NaHCO3 soluie 3% n vederea separrii
ocratoxinei A. Extractul purificat se evapor la sec; reziduul obinut
se reia cu un volum de 0,6 mL faz mobil i se supune analizei
HPLC [214].
Procesul de extracie cantitativ a ocratoxinei A implic n
mod inerent imposibilitatea determinrii cantitii totale de
micotoxin din probele de analizat, i de aceea, pentru o apreciere
mai exact s-a determinat randamentul de extracie.
n urma analizei prin HPLC, cromatogramele obinute au fost
prelucrate, stabilindu-se timpii de retenie i aria picurilor
corespunztoare OTA. Folosind ecuaia dreptei de calibrare, Arie pic
= 1,1265 x conc. (ng/mL) + 6,7853 i innd cont de randamentul de
extracie s-a calculat coninutul n OTA pentru probele de cafea,
valori prezentate n Tabelul nr. 12.
Tabelul nr. 12 - Coninutul n OTA pentru probele de
cafea
Nr.
prob
P1
P2
26
OTA (g/kg)
Valoare
calculat/Valoare
corectat
absent*
1,57/2,00
Nr.
prob
P21
P22
OTA (g/kg)
Valoare
calculat/Valoare
corectat
0,76/0,97
absent*

OTA (g/kg)
Nr.
Nr.
Valoare
prob calculat/Valoare prob
corectat
P3
0,75/0,96
P23
P4
0,85/1,08
P24
P5
1,02/1,30
P25
P6
0,54/0,69
P26
*
P7
absent
P27
P8
1,30/1,66
P28
P9
1,37/1,75
P29
P10
9,06/11,59
P30
*
P11
absent
P31
P12
1,00/1,28
P32
P13
absent
P33
P14
1,20/1,53
P34
P15
0,27/0,34
P35
P16
0,36/0,46
P36
P17
absent*
P37
*
P18
absent
P38
*
P19
absent
P39
*
P20
absent
P40
*- sub limita de detecie a metodei.
OTA (g/kg)
Valoare
calculat/Valoare
corectat
absent*
absent*
absent*
absent*
absent*
absent*
absent*
absent*
absent*
absent*
absent*
absent*
absent*
absent*
absent*
absent*
absent*
0,88/1,12
Identificarea picurilor corespunztoare ocratoxinei A s-a

realizat prin compararea picului obinut n urma analizei soluiei
etalon de ocratoxin A cu cele obinute n urma analizei probelor. n
Figura nr. 9 este prezentata cromatograma pentru proba nr. 10.
27

Figura nr. 9- Cromatograma pentru proba 10

Din analiza datelor obinute n urma determinrii ocratoxinei
A din cele 40 de probe de cafea boabe prjit s-a constatat c ntr-o
singur prob (2,5% din numrul total de probe) ocratoxina A este
prezent ntr-o cantitate mai mare dect limita maxim admis de
legislaia n vigoare (5 g/kg); n 13 probe (32,5% din numrul total
de probe) ocratoxina A se gsete n concentraii sub limita maxim
admis iar ntr-un numr de 26 de probe (65% din numrul total
probe) ocratoxina A nu a fost detectat prin metoda aplicat. Din
numrul total de probe nu exist nici una n care coninutul de
ocratoxin A s se afle sub form de urme adic ntre limita de
detecie i limita de cuantificare.
2. IDENTIFICAREA I DETERMINAREA CANTITATIV A
OCRATOXINEI A DIN PROBE DE PINE FOLOSIND
METODA II
Probele de pine au fost achiziionate din reeaua comercial a
municipiului Iai. S-au analizat 20 de probe de pine de diverse
sortimente, de la productori diferii: 12 probe de pine alb, 3 probe
pine graham, o prob pine neagr, o prob pine neagr cu secar,
2 probe pine din fin de secar i o prob de pine integral.
a. Identificarea ocratoxinei A prin cromatografie pe strat subire
(CSS)
Metoda cuprinde etapele: extracia ocratoxinei A cu un
amestec format din cloroform: soluie acid fosforic 0,1 M (10:1),
spotarea extractului purificat pe placa cromatografic alturi de
etalonul OTA, developarea plcii n sistemul de solveni format din
28

toluen - acetat de etil - cloroform - acid formic (7:5:5:2); revelarea

plcii i compararea valorii Rf-ului etalonului cu cele ale probelor n
scopul identificrii ocratoxinei A.
Pe placile cromatografice nu au fost identificate spoturi
caracteristice ocratoxinei A. Dei prin CSS nu a putut fi identificat
ocratoxina A, prin metoda HPLC aplicat a fost identificat i
determinat cantitativ ocratoxina A, metoda HPLC avnd o
sensibilitate mult mai mare dect CSS.
b. Determinarea cantitativ a ocratoxinei A prin cromatografie de
lichide de nalt performan (HPLC)
Determinarea cantitativ a ochratoxinei A din probele de pine
s-a realizat prin Metoda II [211].
Probele de pine sunt supuse extraciei cu un amestec format
din 100 mL cloroform i 10 mL soluie acid fosforic 0,1 M. Se
filtreaz prin hrtie de filtru cantitativ iar faza organic se evapor
la sec. Reziduul obinut se reia cu un volum de 0,5 mL metanol
[212]. Deoarece n urma prelucrrii probei nu a fost extras toat
cantitatea de ocratoxin A s-a determinat i randamentul de extracie.
n urma analizei prin HPLC s-au obinut cromatogramele ce au
fost prelucrate i s-au stabilit timpii de retenie i aria picurilor
corespunztoare ocratoxinei A. n Figura nr. 10 este prezentat
cromatograma obinut n urma analizei probei nr. 2 pine.
Figura nr. 10 - Cromatograma pentru proba 2 - pine

Folosind ecuaia dreptei de calibrare, Arie pic = 0,6339 x
Concentraia + 6,7353 i innd cont de randamentul de extracie s-a
29

calculat coninutul n ocratoxin A pentru probele de pine, valori

Tabelul nr. 13 - Coninutul n ocratoxin A n probele
de pine
OTA (g/kg)
OTA (g/kg)
Nr.
Nr.
Valoare
Valoare
prob
prob
calculat/Valoare
calculat/Valoare
corectat
corectat
1.
1,13/1,22
11.
1,20/1,29
2.
2,67/2,88
12.
urme**
3.
absent*
13.
1,74/1,87
4.
1,46/1,57
14.
urme**
5.
absent*
15.
absent*
6.
absent*
16.
urme**
7.
1,45/1,56
17.
1,15/1,24
*
8.
absent
18.
urme**
9.
urme**
19.
1,99/2,14
10.
urme**
20.
1,46/1,57
*
- sub limita de detecie a metodei;
**
- ntre limita de cuantificare i limita de detecie a metodei.
A din cele 20 de probe de pine s-a constatat c n nici o prob
ocratoxina A nu este prezent ntr-o cantitate mai mare dect limita
maxim admis de legislaia n vigoare, 3 g/kg [104]. n 9 probe
(45% din numrul total de probe) ocratoxina A se gsete n
concentraii sub limita maxim admis, n 6 probe (30% din numrul
total de probe) sub form de urme iar n 5 probe (25% din numrul
total de probe) este absent.
Deoarece n urma analizelor efectuate ocratoxina A a fost
identificat ntr-un numr destul de mare de probe, i anume n 75%
dintre acestea, putem atrage atenia asupra pericolului pe care l
reprezint pentru sntatea populaiei consumul de pine
contaminat.
30


OCRATOXINEI A DIN PROBE DE MLAI FOLOSIND
METODA II
Analizele efeectuate au vizat 20 de probe de mlai care au fost
procurate din pieele agro-alimentare ale municipului Pacani, judeul
Iai, de la productori particulari.
a. Identificarea ocratoxinei A prin cromatografie pe strat subire
(CSS)
Principiul metodei const n: extracia ocratoxinei A cu un
amestec format din cloroform : soluie acid fosforic 0,1 M (10:1),
spotarea extractului purificat pe placa cromatografic alturi de
etalonul OTA, developarea plcii n sistemul de solveni format din
toluen - acetat de etil - cloroform - acid formic (7:5:5:2); revelarea
plcii i compararea valorii Rf-ului etalonului cu cele ale probelor n
scopul identificrii ocratoxinei A.
Sub lumin UV s-a observat apariia pe placa cromatografic
de spoturi cu fluorescen de culoare verde-albastr specifice pentru
ocratoxina A.
S-au calculat Rf-urile pentru soluia standard de ocratoxina A
i pentru probe. Valorile Rf-urilor probelor au valori apropiate de cea
a standardului de ochratoxin A.
n urma analizelor prin CSS s-a identificat ochratoxina A n
probele 4, 7, 8, 9 10, 12 i 13. n probele 6, 15 i 16 nu fost
identificat ocratoxina A dar prin analiza HPLC au fost determinate
concentraii reduse de ocratoxin A.
b. Determinarea cantitativ a ocratoxinei A prin cromatografie de
mlai s-a realizat prin Metoda II [211].
Proba se agit timp de 30 minute cu un amestec format din
100 mL cloroform i 10 mL soluie H3PO4 0,1 M; se filtreaz prin
hrtie de filtru cantitativ iar faza organic se evapor la sec.
Reziduul se reia cu 0,5 mL metanol i se supune analizei HPLC
[212]. n paralel s-a determinat i randamentul de extracie.
n urma analizei prin HPLC s-au obinut cromatogramele ce
au fost prelucrate i s-a stabilit aria picurilor corespunztoare
31

ocratoxinei A. n Figura nr. 11 este prezentat cromatograma pentru

proba nr. 7.
Figura nr. 11 - Cromatograma pentru proba 7 - mlai

Identificarea picului corespunztor ocratoxinei A s-a realizat n
funcie de timpul de retenie. Folosind ecuaia dreptei de regresie,
Arie pic = 0,6339 x Concentraia + 6,7353, i inand cont de
randamentul de extracie s-a calculat coninutul n ocratoxin A
pentru probele de mlai (Tabelul nr. 14).
Tabelul nr. 14 - Coninutul n ocratoxin A n probele de mlai
OTA (g/kg)
OTA (g/kg)
Nr.
Nr.
Valoare
Valoare
prob
prob
calculat/Valoare
calculat/Valoare
corectat
corectat
P1
urme**
P11
urme**
P2
absent*
P12
1,21/1,30
P3
urme**
P13
9,08/9,80
P4
1,73/1,86
P14
2,41/2,60
P5
absent*
P15
urme**
P6
urme**
P16
1,07/1,15
P7
1,69/1,82
P17
absent*
P8
1,39/1,50
P18
1,13/1,22
P9
1,56/1,68
P19
urme**
P10
1,45/1,56
P20
1,38/1,49
*
**
- sub limita de detecie a metodei;
- ntre LD i LQ.
32


A din cele 20 de probe de mlai s-a constatat c n 3 probe
micotoxina este absent (15% din probe), n 6 probe a fost
identificat sub form de urme (30% din probe), n 6 probe
concentraie ocratoxin A este sub limita maxim admis (50% din
probe) i ntr-o singur prob de mlai (5% din probe) concentraia
ocratoxinei A a depit limitele maxime admise de legislaia n
vigoare, 3 g/Kg.
Faptul c majoritatea probelor de mlai analizate sunt
contaminate cu ocratoxin A, sugereaz c impactul consumului de
mlai contaminat timp ndelungat poate fi major.
OCRATOXINEI A DIN PROBE DE FIN FOLOSIND
METODA II
Au fost analizate 12 probe de fin alb i 2 probe de fin
intermediar comercializate vrac. Probele de fin au fost
achiziionate de la productori particulari, din pieele agro-alimentare
ale municipiului Iai.
Determinarea cantitativ a ocratoxinei A prin cromatografie de
fin s-a realizat prin Metoda II [211].
Extracia ocratoxinei A din probele de fin se realizeaz cu
un amestec format din metanol: acid fosforic (raport 10:1). Extractul
se evapor la sec iar reziduul este reluat cu 0,5 mL metanol i supus
analizei HPLC.
n urma analizei prin HPLC s-au obinut cromatogramele ce
au fost prelucrate i s-a stabilit aria picurilor corespunztoare
ocratoxinei A.
n Figura nr. 12 este prezentat cromatograma obinut n
urma analizei probei nr. 1.
Folosind ecuaia dreptei de regresie, Arie pic = 0,6339 x
calculat coninutul n ocratoxin A pentru probele de fin, valori
33

Figura nr. 12 Cromatograma pentru proba nr. 1

de fin
Nr.
crt.
1.
2.
Nr. prob
OTA (g/kg)
Valoare corectat
P1
P2 - P18
1,44
absent*
* - sub limita de detecie a metodei.

n urma analizelor efectuate s-a constat o inciden sczut a
contaminrii cu ocratoxin A a probelor de fin, identificndu-se
prezena acesteia doar ntr-o singur prob, n concentraie de
1,44 g/kg, n celelate 17 probe (94,44%) ocratoxina A nefiind
detectat.
OCRATOXINEI A DIN PROBE DE BERE FOLOSIND
METODA II
Probele de bere au fost achiziionate din reeaua comercial a
municipiului Iai. Au fost analizate 20 probe de provenien diferit:
16 probe autohtone sau produse sub licen n Romnia i 4 probe
din import.
34

Determinarea cantitativ a ocratoxinei A prin cromatografie

de lichide de nalt performan (HPLC)
Determinarea cantitativ a ochratoxinei A din probele de bere
s-a realizat prin Metoda II [211]. Probele de bere sunt supuse
extraciei cu acetat de etil. Faza organic se evapor la sec. Reziduul
este reluat cu 0,5 mL metanol i supus analizei HPLC [213]. n urma
analizei s-au obinut cromatogramele ce au fost prelucrate i s-a
stabilit aria picurilor corespunztoare ocratoxinei A. n Figura nr. 13
se regsete cromatograma pentru proba nr. 4.
Figura nr. 13 - Cromatograma pentru proba 4- bere

calculat coninutul n ocratoxin A pentru probele de bere, valori
de bere
Nr. prob
P1
P2
P3
P4
OTA (g/kg)
Valoare calculat/Valoare
corectat
17,61/20,07
34,81/39,68
25,11/28,62
32,59/37,154
35

OTA (g/kg)
Nr. prob
corectat
P5
30,46/34,72
P6
31,75/36,19
P7
29,50/33,63
P8
33,45/38,13
P9 - P20
absent*
Legislaia UE dar i cea din Romnia nu prevede limit
maxim admis pentru ocratoxina A n bere. Probele de bere
analizate au dus la identificarea i determinarea cantitativ a
ocratoxinei A n 40% din cazuri. Valorile determinate s-au ncadrat
ntre 20,07 i 39,68 g/kg.
Rezultatele determinrilor sugereaz c un consum ridicat de
bere poate prezenta un risc potenial pentru sntatea populaiei prin
expunere la ocratoxina A.
OCRATOXINEI A DIN PROBE DE ARAHIDE FOLOSIND
METODA II
S-au analizat 20 de probe de arahide, ambalate sau
comercializate vrac, procurate din reeaua comercial a municipiului
Iai. Probele de arahide au fost de mai multe tipuri: 14 probe prjite,
3 probe coapte cu i fr sare i o prob de arahide crude.
arahide s-a realizat prin Metoda II [211].
Probele de arahide sunt supuse extraciei lichid-lichid n mediu
acid n vederea separrii ocratoxinei A: proba se agit timp de 30
minute la agitatorul magnetic cu un amestec format din 100 mL
cloroform i 10 mL soluie acid fosforic 0,1 M; se filtreaz prin
hrtie de filtru cantitativ iar faza organic se evapor la sec.
Reziduul obinut se reia cu un volum de 0,5 mL metanol i se supune
36

analizei prin cromatografie de lichide de nalt performan. n

paralel s-a determinat i randamentul de extracie.
n urma analizei HPLC s-au obinut cromatogramele ce au fost
prelucrate i s-a stabilit aria picurilor corespunztoare ocratoxinei A
n Figura nr. 14 este prezentat cromatograma obinut pentru proba
nr. 1.
Figura nr. 14 - Cromatograma pentru proba nr. 1

Folosind ecuaia dreptei de regresie i innd cont de
pentru probele de arahide, valori prezentate n Tabelul nr. 17.
de arahide
Nr.
prob
P1
P2
P3
P4
P5
P6
OTA (g/kg)
Valoare
calculat/Valoare
corectat
2,51/2,71
absent*
0,86/0,92
0,96/1,03
0,79/0,85
1,01/1,09
Nr.
prob
P11
P12
P13
P14
P15
P16
OTA (g/kg)
Valoare
calculat/Valoare
corectat
absent*
0,45/0,48
1,61/1,73
absent*
absent*
absent*
37

OTA (g/kg)
OTA (g/kg)
Nr.
Nr.
Valoare
Valoare
prob
prob
calculat/Valoare
calculat/Valoare
corectat
corectat
P7
absent*
P17
absent*
P8
absent*
P18
absent*
P9
absent*
P19
1,17/1,26
*
P10
absent
P20
1,04/1,12
n urma analizelor probelor de arahide ocratoxina A a fost
prezent n 9 probe (45%) n concentraii cuprinse 0,48 i 2,71 g/kg
iar n 11 probe (55%) a fost absent.
Legislaia din Romnia nu limiteaz coninutul de ocratoxin
A n arahide.
OCRATOXINEI A DIN PROBE DE STAFIDE FOLOSIND
METODA II
Probele de stafide au fost achiziionate din reeaua comercial
a municipiului Iai. Au fost analizate 15 probe - 4 probe vrac i 11
ambalate. Din totalul de 15 probe, 7 au fost aurii (P1-P7) i 8 brune
(P8-P15).
stafide s-a realizat prin Metoda II [211].
Probele de stafide, sunt supuse extraciei lichid-lichid n mediu
acid n vederea separrii ocratoxinei A. Proba se agit timp de 20
minute cu un amestec format din 100 mL cloroform i 10 mL soluie
acid fosforic 0,1 M; se filtreaz prin hrtie de filtru cantitativ iar
faza organic se evapor la sec. Reziduul obinut se reia cu un volum
de 0,5 mL metanol i se supune analizei prin HPLC.
n urma analizei s-au obinut cromatogramele ce au fost
prelucrate i s-a stabilit aria picurilor corespunztoare ocratoxinei A.
n Figura nr. 15 este prezentat cromatograma obinut n urma
analizei probei nr. 2 stafide.
38


Folosind ecuaia dreptei de regresie i innd cont de
pentru probele de arahide.
n urma analizei probelor de stafide ocratoxina A a fost
prezent ntr-o singur prob, proba 2 stafide aurii (Tabelul nr. 18).
Tabelul nr. 18 -Coninutul n OTA n probele de
stafide
OTA (g/kg)
Nr. prob
corectat
P2
1,01/1,09
P1, P3-P20
absent*
*- sub limita de detecie a metodei
Legislaia din Romnia prevede limite maxime pentru stafide
10 g/kg. n urma analizelor a fost identificat ocratoxin A ntr-o
singur prob, incidena acesteia precum i nivelul determinat fiind
cu mult sub media identificat la nivel european de 72,75% respectiv
3,078 g/kg [210].
39


OCRATOXINEI A DIN PROBE DE VIN FOLOSIND
METODA II
Probele analizate provin din vin produs n gospodrii
particulare pentru uz familial (14 probe) i de la ageni economici cu
profil viticol (4 probe). Din totalul de 18 probe, 9 sunt vinuri roz (P1
P9) i 9 vinuri albe (P10 P18).
Determinarea cantitativ a ochratoxinei A din probele de vin
s-a realizat prin Metoda II [211].
Extracia ocratoxinei A se realizeaz cu un amestec format din
cloroform: acid fosforic soluie 0,1 M n raport de 10:1, v/v. Astfel,
se aduce n plnia de separare un volum de 25 mL prob peste care se
adaug 75 mL cloroform i 7,5 mL soluie acid fosforic 0,1 M. Se
agit timp de 15 minute, se separ fazele iar faza organic se evapor
la sec. Reziduul este reluat cu 1 mL metanol i supus analizei HPLC.
n urma analizei prin HPLC s-au obinut cromatogramele ce au
fost prelucrate i s-a stabilit aria picurilor corespunztoare
ocratoxinei A. n Figura nr. 16 este prezentat cromatograma
obinut n urma analizei probei 2 de vin.

vin
40


calculat coninutul n ocratoxin A pentru probele de vin, valori ce
sunt prezentate n Tabelul nr. 19
Tabelul nr. 19 Coninutul n OTA n probele de vin
OTA (g/kg)
OTA (g/kg)
Nr.
Nr.
Valoare
Valoare
prob
prob
calculat/Valoare
calculat/Valoare
corectat
corectat
*
P1
absent
P10
57,73/62,34
P2
12,25/13,23
P11
6,04/6,52
P3
1,46/1,57
P12
absent*
P4
1,176/1,27
P13
absent*
P5
absent*
P14
absent*
P6
absent*
P15
1,10/1,18
*
P7
absent
P16
5,23/5,64
*
P8
absent
P17
8,72/9,41
P9
9,57/10,33
P18
3,21/3,46
* - sub limita de detecie a metodei.
A din cele 18 de probe de vin s-a constatat c n 8 probe micotoxina
este sub limita de detecie (44,44% din probe), n 3 probe
concentraie ocratoxinei A este sub limita maxim admis de 2
g/mL (16,67% din probe) i n 7 probe de vin (38,89% din probe)
concentraia ocratoxinei A a depit limitele maxime admise de
legislaia n vigoare
Avnd n vedere c peste jumtate din probe provin din vin
produs n gospodrii individuale pentru consumul familial (nu n
vederea comercializrii) putem afirma c impactul contaminrii cu
ocratoxin A este limitat. Totodat aceasta relev slaba informare i
educare a populaiei privind riscurile contaminrii cu fungi i
msurile ce trebuie luate pentru limitarea acesteia.
41

C A PI TO LU L VI
C ON C LU ZII G EN ER A LE
Lucrarea de doctorat intitulat Contribuii la studiul analitic
al ocratoxinelor cu aplicaii pe produse alimentare cuprinde dou
pri: o parte teoretic - stadiul actual al cunoaterii - ce conine un
numr de 3 capitole i o parte personal ce conine un numr de 2
capitole. Partea teoretic este precedat de introducere, scopul i
obiectivele tezei. Dup partea personal urmeaz bibliografia
utilizat i lista figurilor i tabelelor.
Partea teoretic prezint:
n Capitolul I sunt prezentate generaliti privind
micotoxinele, clasificarea micotoxinelor, efectele toxice i prevenirea
contaminrii alimentelor cu ocratoxina A.
Capitolul II este dedicat prezentrii ocratoxinelor. Se face
referire la structura chimic a ocratoxinelor, se prezint fungii
productori de ocratoxin, contaminarea alimentelor, metode de
prevenire i de decontaminare a acestora, biosinteza ocratoxinei A.
Totodat sunt prezentate aspecte privind toxicocinetica i toxicitatea
ocratoxinei A.
Capitolul III prezint proprietile fizico-chimice ale
ocratoxinei A, ocratoxinei B i ocratoxinei C, metode de extracie i
purificare a extractelor coninnd ocratoxin A din produse
alimentare i metode de determinare calitativ i cantitativ a
ocratoxinei A.
Partea personal prezint:
n Capitolul IV al tezei de doctorat se prezint instituirea a
dou metode de determinare cantitativ a ocratoxinei A prin
cromatografie de lichide de nalt performan. Este prezentat
verificarea performanelor analitice ale metodelor urmrind
parametrii de validare pentru cele dou metode de analiz instituite n
conformitate cu cerinele prevzute de literatura de specialitate. n
cadrul acestora s-au urmrit urmtorii parametri pentru fiecare
metod n parte: specificitatea, liniaritatea funciei de rspuns,
42

liniaritatea rezultatelor, limita de detecie, limita inferioar de

cuantificare, precizia (precizia sistemului, precizia metodei, precizia
intermediar) i exactitatea.
Astfel, n cadrul metodei I s-au urmrit urmtorii parametri
de validare:
Liniaritatea funciei de rspuns
S-a studiat liniaritatea funcie de rspuns (s-a urmrit
modificarea ariei picului n funcie de concentraia injectat). Funcia
de rspuns este liniar pe domeniul studiat (9,7656 - 1250 ng/mL),
coeficientul de determinare r2 = 0,9998. Pe domeniul de lucru ales
(9,7656 39,0625 ng/mL), ecuaia dreptei de regresie obinute s-a
calculat prin metoda celor mai mici ptrate.
Liniaritatea rezultatelor
A fost evaluat i liniaritatea rezultatelor, prin reprezentarea
grafic a variaiei valorilor concentraiei calculate pe baza ecuaiei
dreptei de regresie n funcie de concentraia introdus de ocratoxin
A. Valorile calculate indic o dependen liniar cu panta egal cu
unitatea, intercept = 0,00005 i coeficient de determinare r2 = 0,9995.
Au fost calculate limita de detecie LD = 0,54 ng/mL i limita
inferioar de cuantificare LQ = 1,66 ng/mL folosind estimarea
acestor limite pe baza deviaiei standard i a pantei dreptei de
regresie.
Precizia
Pentru estimarea preciziei s-au determinat:
- precizia sistemului (repetabilitatea injectrii) pentru un
numr de 6 determinri, valoarea deviaiei standard relative (RSD)
fiind de 2,94%;
- repetabilitatea (precizia metodei) pentru trei soluii
independente la trei nivele de concentraie diferite pentru care
valoarea deviaiei standard relative (RSD) este de 3,36% cu un
interval de ncredere a valorii medii cuprins n domeniul 98,28%
103,5%;
- precizia intermediar pentru trei soluii independente la
trei nivele de concentraie diferite pentru care valoarea deviaiei
43

standard relative (RSD) este de 3,34% cu un interval de ncredere a

valorii medii cuprins n domeniul 99,41% 104,66%.
Exactitatea
Pentru estimarea exactitii s-a determinat regsirea pentru un
numr de trei probe la trei nivele de concentraie diferite
obinndu-se o regsire medie de 101,8% pe intervalul 98,9
105,3%.
Studiul parametrilor de validare a dus la concluzia c metoda
este corespunztore i a fost aplicat cu bune rezultate la identificarea
i determinarea cantitativ a ocratoxinei A din probe de cafea boabe
(prjit).
n cadrul metodei II s-au urmrit urmtorii parametri de
validare:
Liniaritatea funciei de rspuns
S-a studiat liniaritatea funciei de rspuns (s-a urmrit
modificarea ariei picului n funcie de concentraia injectat). Funcia
de rspuns este liniar pe domeniul studiat (6,25 - 800 ng/mL),
coeficientul de determinare r2 = 0,9998. Pe domeniul de lucru ales
(6,25 50,00 ng/mL), ecuaia dreptei de regresie obinute s-a calculat
prin metoda celor mai mici ptrate.
Liniaritatea rezultatelor
A fost evaluat i liniaritatea rezultatelor, prin reprezentarea
grafic a variaiei valorilor concentraiei calculate pe baza ecuaiei
dreptei de regresie n funcie de concentraia introdus de ocratoxin
A. Valorile calculate indic o dependen liniar cu panta egal cu
unitatea, intercept = 0,00005 i coeficient de determinare r2 =
0,9991.
Au fost calculate limita de detecie LD = 1,6 ng/mL i limita
inferioar de cuantificare LQ = 4,9 ng/mL folosind estimarea acestor
limite pe baza deviaiei standard i a pantei dreptei de regresie.
Precizia
Pentru estimarea preciziei s-au determinat:
- precizia sistemului (repetabilitatea injectrii) pentru un
numr de 10 determinri, valoarea deviaiei standard relative (RSD)
fiind de 0,96%;
44

- repetabilitatea pentru trei soluii independente la trei nivele

de concentraie diferite pentru care valoarea deviaiei standard
relative (RSD) este de 2,50% cu un interval de ncredere a valorii
medii cuprins n domeniul 98,86% 102,74%;
- precizia intermediar pentru trei soluii independente la
trei nivele de concentraie diferite pentru care valoarea deviaiei
standard relative (RSD) este de 2,01% cu un interval de ncredere a
valorii medii cuprins n domeniul 99,14% 102,26%
Exactitatea
Pentru estimarea exactitii s-a determinat regsirea pentru un
numr de trei probe la trei nivele de concentraie diferite (2030
ng/mL) obinndu-se o regsire medie de 100,1% pe intervalul 97,1
103,1%.
Studiul parametrilor de validare a dus la concluzia c metoda
este corespunztore i a fost aplicat la identificarea i determinarea
cantitativ a ocratoxinei A din pine, mlai, fin, bere, arahide,
stafide i vin.
Capitolul V prezint rezultatele obinute n urma analizelor
efectuate asupra unor produse de origine vegetal comercializate i
utilizate n alimentaia populaiei din judeul Iai. Au fost utilizate
metodele pentru determinare cantitativ prin HPLC a ocratoxinei A
dezvoltate n lucrarea de fa i prezentate la capitolul IV.
Analizele efectuate asupra probelor de mlai au scos n
eviden prezena ocratoxinei A n 85% din probe, respectiv 17 din
cele 20 de probe analizate. Cantitile ce au putut fi determinate
(peste LD a metodei) s-au situat n intervalul 1,15-9,80 g/kg, cu o
concentrare a valorilor n intervalul 1,15-1,86 g/kg (82%).
Determinrile efectuate asupra probelor de fin nu au scos n
eviden probleme n ceea ce privete contaminarea cu ocratoxin A,
prezena acesteia fiind stabilit doar ntr-o prob din cele 18 analizate
respectiv n 5,6% din cazuri.
Analiza probelor de pine a dus la identificarea prezenei
ocratoxinei A ntr-un numr relativ mare din probe, 15 din cele 20
supuse determinrilor, respectiv 75%. Pentru 40% dintre probe nu a
putut fi stabilit cantitatea de ocratoxin A, valoarea acesteia fiind
foarte mic, sub limita de detecie a metodei. Cantitile ce au putut fi
45

determinate s-au ncadrat n limitele 1,22 - 2,88 g/kg, cu o valoare

medie a acestora de 1,71 g/kg.
Determinrile cantitative a ocratoxinei A n din probele de
cafea boabe (prjit) au evideniat prezena acesteia n 14 probe din
cele 40 analizate, respectiv n 35% din cazuri. Concentraiile
identificate s-au situat ntre valorile de 0,34 i 11,59 g/kg, cu o
valoare medie situat n jurul valorii de 1,91 g/kg.
Probele de bere analizate au dus la identificarea i
determinarea cantitativ a ocratoxinei A n 40% din cazuri. Valorile
determinate s-au ncadrat ntre 20,07 i 39,68 g/kg. Valoarea medie
a concentraie de ocratoxin A identificat pentru aceast analiz a
fost de 13,41 g/kg.
Identificarea i determinarea cantitativ a ocratoxinei A din
probe de arahide a evideniat prezena acesteia n 45% din probe, 9
probe din cele 20 analizate. Concentraiile identificate s-au situat
ntre 0,48 i 2,71 g/kg, valoare medie pentru acestea situndu-se n
jurul valorii de 1,24 g/kg.
Analizele efectuate probe de stafide au dus la identificarea i
determinarea cantitativ a ocratoxinei A n doar una (6,67%) din cele
15 probe analizate. Valoarea determinat a fost de 1,09 g/kg,
valoare ce se ncadreaz n limitele maxime admise de legislaie.
Analiza probelor de vin a scos n eviden contaminarea
substanial a acestora cu ocratoxin A, n 55% din probele fiind
remarcat prezena acesteia. Valorile identificate s-au situat ntre
3,46 i 62,34 g/kg, n 70% dintre cazuri valorile fiind peste
concentraiile maxime admise de normele naionale i europene.
n urma analizelor efectuate n cadrul tezei de doctorat asupra
diverselor categorii de produse alimentare s-a constat incidena
ridicat a ocratoxinei A n cazul unora dintre produsele analizate.
Cantitile determinate s-au situat n general sub limitele maxime
admise de legislaia n vigoare n ceea ce privete coninutul maxim
admis de ocratoxin A dar n unele produse s-au determinat i
cantiti peste limitele admise.
Consumul alimentelor contaminate cu ocratoxin A constituie
un risc pentru sntatea populaiei. Avnd n vedere faptul c cea mai
mare parte a produselor analizate fac parte din alimentaia zilnic,
46

cantitile ingerate pentru unele produse fiind destul de mari la

nivelul rii noastre, riscul determinat de consumul unor astfel de
alimente este cu att mai mare. Pentru reducerea impactului negativ
pe care l are utilizarea alimentelor contaminate cu ocratoxin A este
necesar desfurarea unor campanii de educaie preventiv pe
ntregul lan alimentar, de la productor i pn la consumatorul
final, instituirea unor msuri i reguli de bun practic n producerea,
prelucrarea i comercializarea produselor alimentare.
Perspective de cercetare
Lucrarea deschide o serie de perspective de cercetare ce pot fi
studiate n urmtorii ani:
- Avnd n vedere faptul c metoda de determinare prin
HPLC, dezvoltat i validat, a fost conceput pentru determinarea
unei singure micotoxine ocratoxina A iar n timpul analizelor s-a
observat pe cromatograme apariia unor picuri nc neidentificate,
putem aprecia c n viitor vor putea fi identificate i alte micotoxine
prezente simultan n produsele alimentare.
- Metodele prezentate n lucrare folosesc metoda
cromatogafiei de lichide de nalt performan cu detecie n
fluorescen. O alt perspectiv de cercetare este determinarea
cantitativ a ocratoxinei A prin metoda HPLC utiliznd un detector
spectometru de mas, astfel mrind sensibilitatea metodei i mrind
posibilitatea decelrii unor cantiti foarte mici de ocratoxin A.
- Realizarea unui studiu extins privind prezena micotoxinelor
n alimentele de baz cu standardizarea unor metode HPLC pentru
determinarea cantitativ a acestora i folosirea lor n controlul
alimentului.
- n cadrul tezei a fost identificat i determin cantitativ
ocratoxinei A n produse de origine vegetal dar ocratoxina A este
prezent i n produse de origine animal (rinichi de porc, ficat de
pui, lapte de vac etc.). De aceea o nou perspectiv de cercetare o
constituie determinarea nivelurilor de ocratoxin A n acest tip de
produse destinate consumului uman
47

BIBLIOGRAFIE SELECTIV
[1] Eskola M. Study on trichothcenes, zearalenone and ochratoxin A
in finnish cereals: occurrence and analytical technique. Academic
Disertation 2002;16.
[3] Schmidt H et al. Molecular typing of Aspergillus ochraceus and
construction of species specific SCAR-Primers based on AFLP.
Systematic and Applied Microbiology 2003; 26:138-146.
[4] Varga J. et al. Kinetics of ochratoxin A production in diferent
Aspergillus species. Acta Biologica Hungarica 2002; 53 (3):381388.
[43] Taniwaki MH. An update on ochratoxigenic fungi and
ochratoxin A in coffee in Advances in Food Mycology, Edited by
Hocking AD, Pitt JI, Samson RA, Thrane U, Springer, 189-202,
2006.
[104] *** Ordin 141/2004 privind aprobarea Normei sanitar
veterinar i pentru sigurana alimentelor privind anumii
contaminani din alimentele de origine animal i nonanimal.
[106] *** Ochratoxin A, Certificate of Analyses, Biopure,
www.biopure.at.
[107] Valeta H. Chromatografic methods for determination of
ochratoxin A in animal and human tissues and fluids. Journal of
Chromatography A 1998; 815: 75-92.
[141] *** Official Methods of Analysis of AOAC International, 17th
Edition, vol. II, 2000;
[170] Jaba E. Statistica, Bucureti: Ed. Economic, 1998.
[171] Roman L, Boji M, Sndulescu R, Muntean DL. Validarea
metodelor analitice, Bucureti: Ed. Medical, 2007.
[172] *** Guideline for Submitting Samples and Analytical Data for
Methods Validation. FDA 1987.
[173] Oprean R, Rozet E, Dew W, Boulanger B, Hubert PH. Ghid
de validare a procedurilor analitice cantitative, Cluj Napoca: Ed.
Medical Universitar Iuliu Haieganu, 2007.
[174] *** Q 2B Validation of analytical procedures: Methodology.
ICH, 1997.
48

[210] *** Task 3.2.7 "Assessment of dietary intake of Ochratoxin A

by the population of EU. Member States" 2002; http:/
europa.eu.int.comm/food/fs/scoop/3.2.7_eu.pdf.
[211] Bulea D, pac AF, Dorneanu V, Validarea unei metode HPLC
pentru determinarea ochratoxinei A. Rev. Med Chir. 2011;
115(2): 595-600.
[212] Bulea D, pac AF, Dorneanu V. HPLC determination of
ochratoxin A in bread and corn flour. Lucrri tiinifice. Seria
Horticultur 2011, 54(1): 525-530.
[213] Medina A, Valle-Algarra FM, Gimeno-Adelantado JV, Mateo
R, Mateo F, Jimnez M. New method for determination of
ochratoxin A in beer using zinc acetate and solid-phase
extraction silica cartridges. Journal of Chromatography A 2006;
1121:178183.
[214] Bulea D, pac AF, Dorneanu V. Determinarea ochratoxinei A
din boabe de cafea prin metoda HPLC. Fungi&Micotoxins 2008;
2(1): 157-163.
49

LISTA LUCRRILOR PUBLICATE IN EXTENSO

DIN TEZA DE DOCTORAT
1. Bulea Delia, pac Adrian Florin, Dorneanu Vasile, HPLC
determination of ochratoxin A in bread and corn flour.
Lucrri tiinifice. Seria Horticultur 2011; 54(1): 525-530;
2. Bulea Delia, pac Adrian Florin, Dorneanu Vasile, Validarea
unei metode HPLC pentru determinarea ochratoxinei A. Rev.
Med. Chir. Soc. Med. Nat. Iai 2011; 115(2): 595-600;
3. Bulea Delia, pac Adrian Florin, Dorneanu Vasile,
Determinarea ochratoxinei A din boabe de cafea prin metoda
HPLC. Fungi&Micotoxins 2008; 2(1): 157-163;
4. Bulea Delia, pac Adrian Florin, Apostu Mihai, Dorneanu
Vasile, Cuciureanu Rodica, HPLC determination of
ochratoxin A in beer, 13th Panhellenic Pharmaceutical
Congress, Atena, Grecia, 12 - 14 mai 2007, publicat in
extenso n CD-ul congresului;
5. pac Adrian Florin, Bulea Delia, Dorneanu Vasile,
Cuciureanu Rodica, Contribuii la determinarea ochratoxinei
A folosind cromatografia de lichide de nalt performan,
Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat. Iai 2005; 109, 4(1): 427-431;
6. Bulea Delia, pac Adrian Florin, Apostu Mihai, Onofrei
Marilena, Huzum Mihai, Cuciureanu Rodica, Cercetarea
prezenei ochratoxinei A n produse alimentare, Rev. Med.
Chir. Soc. Med. Nat. Iai 2005; 109, 4(1): 432-437;
7. Cuciureanu Rodica, Bulea Delia, Florica Iulia, HPLC
determination of ochratoxin A in cereal grains, 11th
Panhellenic Pharmaceutical Congress, 29 - 31 martie 2003
Atena, Grecia, publicat in extenso n CD-ul congresului.
-1-

CURRICULUM VITAE
DATE BIOGRAFICE
Nume i prenumele: BULEA DELIA
Data i locul naterii: 14 august 1974, Pacani, jud. Iai, Romnia
Stare civil: cstorit
STUDII LICEALE
Liceul Teoretic Mihail Sadoveanu Pacani, jud. Iai, 1989-1993
Diploma de bacalaureat, profilul Matematic-Fizic.
STUDII UNIVERSITARE
Facultatea de Farmacie, Universitatea de Medicin i Farmacie, Iai,
1993-1998, Examen de licen - sesiunea iulie 1990, Universitatea de
Medicin i Farmacie Gr. T. Popa, Iai, Diploma de licen n
Farmacie seria R Nr. 0036001, nr. 83/13.07.1999.
STUDII POSTUNIVERSITARE
2004-2005, Masterat cu tema Calitatea mediului i securitatea
alimentar, Facultatea de Farmacie, Universitatea de Medicin i
Farmacie Gr. T. Popa, Iai, Diplom de Master Seria E Nr. 0026479,
nr. 158/08.11.2006.
SPECIALIZRI
2001, (13-28 mai) - participant la proiectul de mobilitate Leonardo
da Vinci - cu tema Lassurance de la qualit des aliments facteur
dterminant maintenir la sant de la population, Facultatea de
Farmacie, Valencia, Spania;
2001-2002, Cursul postuniversitar de profesionalizare didactic
organizat de Departamentul de pregtire a personalului didactic,
Universitatea Al. I. Cuza Iai, Diploma de absolvire seria D, nr.
0022000, nr. 125/30.03.2005;
2003, (2 iunie) Seminarul New Analytical Methods for Pesticides
Residues in Foods and Agricultural Products organizat de Algirom
Scientific, Bucureti;
2003, (31 august-13 septembrie) Cursurile universitii de var
Universit Europenne d't - Environnement et Sant UEE-2003,
Nancy, Frana;
2009, (20 martie), Seminarul de Laborator I, organizat de ABL&EJASCO Romnia, Iai.
-1-

COMPETENE
ATESTAT nr. 522/15.04.2005 privind dreptul de exercitare a funciei
de farmacist diriginte, eliberat de Colegiul Farmacitilor din Romnia
(5-6 martie, 2005, Facultatea de Farmacie, Bucureti).
ALTE TITLURI I GRADE TIINIFICE SAU PROFESIONALE
farmacist specialist - specialitatea Farmacie clinic, confirmat prin
Ordinul MS nr. 1106/ 01.07.2011;
farmacist primar - specialitatea Farmacie general, confirmat prin
Ordinul MS nr. 1200/ 01.10.2009;
farmacist rezident - specialitatea Farmacie clinic, confirmat prin
Ordinul MS nr. 1402/ 15.11.2006;
farmacist rezident specialitatea Industrie farmaceutic i cosmetic,
confirmat prin Ordinul MS nr. 965/14.09.2005;
farmacist specialist - specialitatea Farmacie general, confirmare prin
Ordinul Ministrului Sntii nr. 431/12.05.2003;
FUNCII NDEPLINITE
01.10.2009 i n prezent ef lucrri, prin concurs, la Disciplina
Farmacodinamie i Farmacie clinic, Facultatea de Farmacie,
Universitatea de Medicin i Farmacie Gr. T. Popa Iai;
01.10.2008- 31.09.2009: detaat la Disciplina Farmacologie i
Farmacie clinic, Facultatea de Farmacie, Universitatea de Medicin i
Farmacie Gr. T. Popa Iai, conform Deciziei Nr. 940/24.10.2008;
2007-2008: ef lucrri, Disciplina Chimia mediului i alimentului,
Facultatea de Farmacie, Universitatea de Medicin i Farmacie Gr. T.
Popa Iai;
2004-2007: Asistent universitar, Disciplina Chimia mediului i
alimentului, Facultatea de Farmacie, Universitatea de Medicin i
Farmacie Gr. T. Popa Iai;
2001-2004: Preparator universitar, Disciplina Chimia mediului i
alimentului, Facultatea de Farmacie, Universitatea de Medicin i
Farmacie Gr. T. Popa Iai;
1998-2001: Farmacist Farmacia Gabriela Farm, Iai.
APARTENENA
LA
SOCIETI
TIINIFICE
SAU
PROFESIONALE
IASP International Association for the Study of Pain;
Asociatia de Algeziologie din Romnia;
Societatea Romn de Micologie Medical i Micotoxicologie;
Societatea de Medici i Naturaliti Iai, Secia Farmacie;
Societatea de tiine Farmaceutice din Romnia;
-2-

Societatea Romn de Istoria Farmaciei;

Colegiul Farmacitilor din Romnia.
GRANTURI. CONTRACTE DE CERCETARE TIINIFIC
2005-2006- membr n colectivul grantului CNCSIS Ochratoxinele
din alimente - factor de risc pentru sntatea populaiei cod 1222.
LUCRRI TIINIFICE
14 publicate in extenso (5 prim-autor, 9 co-autor)
12 - publicate sub form de rezumat (n volumele de rezumate ale
unor manifestri tiinifice naionale i internaionale)
PARTICIPARE LA MANIFESTRI TIINIFICE NAIONALE
Zilele medicamentului, Ediia a-XIX-a, cu participare internaional,
Iai, 13 - 15 mai, 2010;
Zilele medicamentului, Ediia a-XVIII-a, cu participare internaional,
Iai, 14 - 16 mai, 2009;
Conferina Naional de Fitoterapie, Ediia a IV-a, Iai, 14-16 mai,
2008;
Simpozionul Naional Medicamentul- de la concepere pn la
utilizare, Ediia I, Iai, 30 mai-1 iunie, 2007;
Al XIII-lea Congres Naional de Farmacie, Cluj-Napoca, 28-30
septembrie, 2006;
A XII-a Reuniune Naional de Istoria Farmaciei, Iai, 29 septembrie1 octombrie, 2005;
Simpozionul Naional Alimentaia actual implicaii toxicologice i
clinice, Iai, 7-9 aprilie 2005;
Zilele Medicamentului, Ediia a XIV-a, Iai, 12 13 mai, 2005;
Manifestarea Zilele Universitii de Medicin i Farmacie Gr.T.Popa
Iai, noiembrie, 2005;
Simpozionul 125 de ani de nvmnt medical superior la Iai, Zilele
Universitii de Medicin i Farmacie Gr. T. Popa Iai, 15-20
noiembrie, 2004;
Manifestarea Zilele Universitii de Medicin i Farmacie Gr.T.Popa
Iai, 25-29 noiembrie, 2003;
A II-a Conferin Naional de Fitoterapie, Iai, 8-9 mai 2003;
AL XII-lea Congres Naional de Farmacie, Bucureti, 17-19
octombrie, 2002;
Al III-lea Simpozion Naional de Magneziu (cu participare
internaional), Iai, 12-14 iunie, 2002;
Al IV-lea Simpozion Aspecte actuale privind calitatea alimentului,
Iai, 16 noiembrie, 2001.
-3-

PARTICIPARE
LA
MANIFESTRI
TIINIFICE
INTERNAIONALE
th
13 Panhellenic Pharmaceutical Congress, Atena, Grecia, 12-14 mai,
2007;
Europen Conference on Drug Delivery and Pharmaceutical
Technology, Sevilia, 10-12 mai, 2004;
th
11 Panhellenic Pharmaceutical Congress, Atena, Grecia, 29 - 31
martie, 2003;
ACTIVITATE N COMUNITATEA ACADEMIC
iulie 2010 ef sal examen admitere Facultatea de Farmacie;
ianuarie 2009- secretar la concursul pentru ocuparea postului de
preparator poziia 10 n statul de funciuni la disciplina Farmacologie
i Farmacie clinic.
ianuarie 2009- secretar la concursul pentru ocuparea postului de
preparator poziia 9 n statul de funciuni la disciplina Farmacologie i
Farmacie clinic;
octombrie 2008- secretar comisie admitere doctorat (interviu),
disciplina Farmacologie, coordonator Prof. dr. Mircea DG Pavelescu;
iulie 2008- secretar Comisie de admitere- Facultatea de Farmacie;
mai 2008- secretar seciunea postere -Conferina Naional de
Fitoterapie, Ediia a IV-a;
13.02.2008-1.10.2008- secretar catedra nr. 3, Facultatea de Farmacie;
septembrie 2007- secretar interviu admitere masterat Produse de
origine vegetal: medicament, supliment nutritiv, aliment;
iulie 2007- secretar Comisie de admitere- Facultatea de Farmacie;
ianuarie 2007- secretar concurs asistent la disciplina Chimie general
i anorganic;
iulie 2006- membru n Comisia central de admitere, Facultatea de
Farmacie;
iulie 2005-membru n Comisia central de admitere, Facultatea de
Farmacie;
aprilie 2005- membru n comitetul de organizare a Simpozionului
Naional Alimentaia actual implicaii toxicologice i clinice;
ianuarie 2005- secretar concurs preparator la disciplina Chimie
farmaceutic;
septembrie 2004- secretar Comisie susinere lucrri de licen,
Facultatea de Farmacie;
iulie 2004- membru n Comisia de supraveghere a examenului de
admitere, Facultatea de Farmacie;
-4-


ianuarie 2003- secretar concurs preparator la disciplina Chimia i
igiena mediului i alimentului;
noiembrie 2001- membru n comitetul de organizare a Simpozionului
Aspecte actuale privind calitatea alimentului;
2001- membru n Comisia de supraveghere a examenului de admitere,
Facultatea de Farmacie.
LIMBI STRINE:
englez
ALTE ACTIVITI:
responsabil protecia muncii- disciplina Farmacologie i Farmacie
clinic
responsabil PSI- disciplina Farmacologie i Farmacie clinic
membr n comisia de inventariere - disciplina Chimia mediului i
alimentului
responsabil protecia muncii- disciplina Chimia mediului i
alimentului
deinere gestiune biblioteca disciplinei Chimia mediului i alimentului
(17.01.2005-28.05.2008);
deinere gestiune substane toxice, precursori-disciplina Chimia
mediului
i
alimentului
(19.09.2003-15.09.2008).
-5-

Proiect

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Proiect

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Universitatea de Medicin i Farmacie Gr. T.

Bulea D. - Contribuii la studiul analitic al ocratoxinelor

CAPITOLUL I Consideraii generale privind micotoxinele.. 13

Bulea D. - Contribuii la studiul analitic al ocratoxinelor

Bulea D. - Contribuii la studiul analitic al ocratoxinelor

III.2.1. Date generale...................................................... 56

Bulea D. - Contribuii la studiul analitic al ocratoxinelor

CAPITOLUL IV INSTITUIREA A DOU METODE DE

Bulea D. - Contribuii la studiul analitic al ocratoxinelor

IV.2.4.3. Determinarea liniaritii ............................. 102

Bulea D. - Contribuii la studiul analitic al ocratoxinelor

V.2.1.3. Mod de lucru................................................ 137

Bulea D. - Contribuii la studiul analitic al ocratoxinelor

V.5.1.1. Material i metod....................................... 165

Bulea D. - Contribuii la studiul analitic al ocratoxinelor

Bulea D. - Contribuii la studiul analitic al ocratoxinelor

Bulea D. - Contribuii la studiul analitic al ocratoxinelor

A.STADIUL ACTUAL AL CUNOATERII

Bulea D. - Contribuii la studiul analitic al ocratoxinelor

Figura nr. 2 - Structura

Figura nr. 1 - Structura

Tabelul nr. 1 Structura chimic a ocratoxinelor

Bulea D. - Contribuii la studiul analitic al ocratoxinelor

Ocratoxina A (Figura nr. 2) este un metabolit toxic produs de

Bulea D. - Contribuii la studiul analitic al ocratoxinelor

Bulea D. - Contribuii la studiul analitic al ocratoxinelor

Bulea D. - Contribuii la studiul analitic al ocratoxinelor

Bulea D. - Contribuii la studiul analitic al ocratoxinelor

Figura nr. 3 - Cromatograma unei soluii standard de

Bulea D. - Contribuii la studiul analitic al ocratoxinelor

fiecare valoare a concentraiei au fost analizate un numr de 6 soluii.

Figura nr. 4 - Dreapta de calibrare pe domeniul de lucru

Bulea D. - Contribuii la studiul analitic al ocratoxinelor

Tabelul nr. 2 - Evaluarea statistic a linearitii

Figura nr. 5 - Liniaritatea rezultatelor (metoda I)

Bulea D. - Contribuii la studiul analitic al ocratoxinelor

Limita de detecie i limita inferioar de cuantificare

Bulea D. - Contribuii la studiul analitic al ocratoxinelor

b. Repetabilitatea (Precizia metodei)

Bulea D. - Contribuii la studiul analitic al ocratoxinelor

Bulea D. - Contribuii la studiul analitic al ocratoxinelor

Bulea D. - Contribuii la studiul analitic al ocratoxinelor

Concluzie: exactitatea metodei de determinare a ocratoxinei

Bulea D. - Contribuii la studiul analitic al ocratoxinelor

- Coloan cromatografic Phenomenex Luna C18(2) 100

Bulea D. - Contribuii la studiul analitic al ocratoxinelor

Bulea D. - Contribuii la studiul analitic al ocratoxinelor

Figura nr. 7 Dreapta de calibrare pe domeniul de

Bulea D. - Contribuii la studiul analitic al ocratoxinelor

Figura nr. 8 - Liniaritatea rezultatelor (metoda II)

Bulea D. - Contribuii la studiul analitic al ocratoxinelor

Bulea D. - Contribuii la studiul analitic al ocratoxinelor

Tabelul nr. 9 - Repetabilitatea metodei (metoda II)

Bulea D. - Contribuii la studiul analitic al ocratoxinelor

medie. Deviaia standard relativ trebuie s aib o valoare mai mic

Bulea D. - Contribuii la studiul analitic al ocratoxinelor

Tabelul nr. 11 - Exactitatea metodei (metoda II)

Bulea D. - Contribuii la studiul analitic al ocratoxinelor

Bulea D. - Contribuii la studiul analitic al ocratoxinelor

Sub lumin UV, = 366 nm, pe plcile cromatografice se

Bulea D. - Contribuii la studiul analitic al ocratoxinelor

Identificarea picurilor corespunztoare ocratoxinei A s-a

Bulea D. - Contribuii la studiul analitic al ocratoxinelor