CURS 8

BACILUL DIFTERIC. BACILUL TUBERCULOS.

Corynebacterium
Definitie
Genul Corynebacterim include mai multe specii de bacili Gram pozitivi (poate fixa colorantul neregulat si pot avea
incluziuni de polimetafosfat), uor incurbati, maciucati, aezati n V. L mici grmezi neregulate, sau n palisade,
nesporulati, necapsulari, imobili, aerobi, facultativ anaerobi, catalazo pozitivi.
In ultimii ani, studiile taxonomice au redefinit genul Corynebacterium mentinnd numai 23 de specii.
Speciile pot fi separate n trei grupe distincte dup habitat i patogenitate:
- Corynebacterii patogene pentru om i animal,
- Corynebacterii patogene pentru plante,
-Corycebacterii nepotogene.
Dintre Corynebacteriile patogene pentru om, grupul Corynebacterium diphtheriae reunete trei specii:
C. diphtheriae cu 4 biotipuri (gravis, mitis, intermedius i belfanti ),
C. ulcerans,
C. pseudotuberculosis.
C. diphtheriae are capacitatea de a elabora exotoxin n urma conversiei genetice.
Corynebacterium diphtheriae este agentul cauzal al difteriei.
Difteria este o boal infecioas grav, care n forma ei caracteristic se manifest printr-o leziune la poarta
de intrare, cel mai frecvent la nivelul amigdalelor, unde produce un exudat fibrinos, aderent: "falsa membran" de
culoare gri-maronie (diphthera = membran).
Ea se formeaz local sau se extinde acoperind faringele, obstructionand arborele traheo-bronic producand
crup laringian care poate provoca asfixie mecanic.
La adpostul falsei membrane, bacilii i continu multiplicarea i sinteza de toxin.
Tulpinile lizogene (infectate cu bacteriofag tox+) sintetizeaz toxina eliberat extracelular i difuzat n
organism pe cale sanguin i limfatic produce leziuni importante la nivel cardiac (miocardit), nervos
(demielinizare), renal (necroz tubular), suprarenalism, muscular i hepatic.
Diagnosticul de laborator este bacteriologic.Este un diagnostic de mare urgent.
* Habitat
B. difteric se izoleaz de la bolnavi, din "falsa membrnn, de pe mucoasa nazal, ocular, vulvar etc.
Poate infecta unele leziuni cutanate, poate fi identificat n ulceraiile profunde ale pielii, reprezentand difteria
cutanat.
B. difteric poate fi izolat din gtul sau nasul purttorilor sntoi unde poate persista timp indelungat, mai poate fi
izolat de la animale (cai, caini, maimue) purttoare sau bolnave.
* Caractere morfologice, tinctoriale
Cultivat pe medii elective, sunt bacili Gram pozitivi, la limit, cu dimensiuni de 3-8/0,5 m, uor incurbati,
mciucati, pleomorfi, aezai n unghiuri ascuite (V, L)sau cu aspect de litere chinezeti.
Prezint o colorabilitate inegal din cauza granulelor de polifosfati care apar evidente n special prin coloratia
metacromatic (corpusculii Babe-Ernst) sau dup decolorare prelungit n coloratii Gram.
* Caractere de cultur
B. difteric este un germen aerob facultativ anaerob care se dezvolt la 37 0 C, la un pH de 7,4 - 7,6, crete bine pe
mediul electiv Lffler (ser coagulat de bou, glucozat 1%).
Izolarea din produse patologice se face pe geloz snge i pe medii selective Tinsdale, Gundel-Tietz (care
contine:geloz-sange-cistein-telurit de K).
Pe mediul Tinsdale (care contine geloz-ser-cistin-telurit - thiosulfat),
C, diphtheriae produce dup 24-48 h de incubare la 37C, colonii mici negre cenuii inconjurate de un halou brun
(datorit H2S care rezulta din metabolism i reactioneaz cu srurile de telur).
B. pseudodifterici cresc sub forma de colonii negre, fr hafou brun,
C. ulcerans produce un halou foarte intens.
Pe mediul Gundel-Tietz n functie de aspectul coloniilor pot fi diferentiate trei tipuri biochimice (biotipuri) de C.
diphtheriae: gravis, mitis i intermedius , avnd proprietatea de a reduce teluritul de potasiu n telur metalic, de
culoare neagr.
Dup incubare 48 h la 37C i apoi 2-3 zile la temperatura laboratorului:
1

- tipul gravis produce colonii negre, mari, cu suprafata granulat cu aspect de margareta (margini crenelate, centru
ridicat i striuri radiale);
- tipul mitis produce colonii mai mici, negre, cu margini regulate:
- tipul intermedius colonii negre cu aspecte intermediare ntre primele dou: talie mai mare, suprafat granular,
centrul uor mamelonat, margini regulate, transparente.
Pe geloz-snge bacilii difterici produc colonii rotunde, friabile, cu suprafata uor granulara, de culoare alb-gri
perle.
Pe mediul Lffler bacilii difterici produc colonii albe, care seamn cu picturile de spermantet (substant gras cu
aspect de cear).
* Caractere biochimice i de metabolism
Pentru crestere, bacilul difteric are nevoie si de factori de crestere (vitamine, aminoacizi) care se gsesc n serul si
sngele introdus in aceste medii.
Tulpinile toxigene elaboreaz o exotoxin, specific, de natur proteic, responsabil de simptomele de toxiinfectie
difterica.
Bacilul difteric produce cistinaza care descompune cistina cu formare de hidrogen sulfurat, dar nu hidrolizeaz ureea
(ureazo-negativ).
Bacilul difteric, indiferent de biotip, fermenteaz constant glucoza, maltoza si levuloza si nu fermenteaz zaharoza si
manita.
Tipul gravis fermenteaz: dextrina, amidon, glicogenul.
Tipul mitis nu fermenteaz nici un polizaharid;
Tipul intermedius fermenteaz, uneori tardiv, numai dextrina.
* Rezistent la agenti fizici, chimici i biologici.
Bacilii difterici sunt rezistenti la uscciune, sensibil la antisepticele uzuale il distrug n cateva minute.
Este sensibil la: eritromicin, penicilin, bacteriofagi specifici.
* Caractere antigenice
Au fost descrise antigene somatice (la nivelul peretelui bacterian), dar nu s-a realizat o schem antigenic de
identificare, exotoxina este puternic antigenic si este comun tuturor tulpinilor de C. diphtheriae.
Filtratul de cultur reprezint toxina brut, coresupunde actiunii combinate a formolului si cldurii se detoxific,
transformndu-se n anatoxin, produs dotat cu calitti antigenice dar lipsit de orice urma de toxicitate.
* Imunitatea
Este preponderent antitoxica, se obtine dupa trecerea prin boala sau dupa vaccinarea profilactic cu antitoxina
difterica.
* Diagnosticul de laborator este bacteriologic
Se recolteaza produse patologice atat de la bolnavi cat si de la purtatori si se face prin izolarea, identificarea
germenului precum si stabilirea caracterului toxigen al tulpinii.
Recoltarea se face din exudate cu tampoane sterile dimineata pe nemancate, nainte de a face tratament cu antibiotic.
De la bolnavii sau suspectii de angina difterica se recolteaza trei tampoane din secretia faringo-amigdaliana
si un tampon nazal.
De la cazurile suspecte de difterie cu alte localizari se recolteaza un tampon din secretia faringoamigdaliana, un tampon din secretia nazala si un tampon din leziunea cutanata sau mucoasa suspectata.
De la contactii din focare de difterie sau de la purtatori sanatosi se recolteaza un tampon cu exudat nazal si
un tampon cu secretie faringo-amigdaliana.
* Diagnosticul bacteriologic
La bolnavi:
- tamponul nr. l (din cele trei) va servi pentru efectuarea frotiurilor colorate: Gram, albastru de metilen, Del
Vecchio-pentru evidentierea granulatiilor metocromatice, n solutie apoasa de albastru de metilen 10% se adauga
0,1% hidrat de K (KOH,);
- tamponul nr. 2 se va nsamanta pe mediile solide: Tinsdale, Gundel-Tietz, geloz-snge, Lffler;
- tamponul nr. 3 este incubat 16-18 h la 37 0 C n mediul de mbogaire O.S.T. (ou-ser-telurit), dup timpul de
incubare se fac treceri pe mediile solide de mai sus.
Tampoanele din celelalte secretii (nazale, oculare, din plagi etc) se mbogtesc n mediul O.S.T. i dupa
incubare in conditiile descrise se vor trece pe mediile solide corespunztoare.
Dup incubarea pe medii solide, 24-48 h, se vor face repicri una sau dou colonii reprezentative pe un tub
cu mediu Lffler, sau n sectoare cu mediu geloz sange si frotiuri din toate aceste medii si colorate Gram si Del
Vecchio, pentru stabilirea caracterelor morfologice microscopice.
Apoi se fac nsmntari din mediul Lffler pentru punerea n evident a caracterelor biochimice
2

(fermentarea zaharurilor n mediul Hiss cu indicator Andrade proba cistinazei H 2S, proba ureazei in mediul cu uree,
Blake-Cristensen).
Toxigeneza in vitro se face prin testul de precipitare in gel E.O.F. (Elek, Ouchterlony, Frobisher), sau in
vivo prin inoculare s.c. in cobai, a culturii , dup 24-48 h, cobaii mor cu evidentierea semnelor de intoxicatie
difterica.
Genul MYCOBACTERIUM
* Caractere generale
Germenii din acest gen apartin familiei Mycobacteriaceae.
Aceast familie cuprinde mai multe specii, fiind aproape toate saprofite cu exceptia speciilor : Mycobacterium
tuberculosis si Mycobocterium leprae.
In anul 1882 Robert Koch descoper bacilul tuberculozei tot in acelasi an Paul Ehrlich descoper acidorezistenta bacilului tuberculozei.
In anul 1884 Robert Koch obtine cultura baciluli tuberculozei pe ser coagulat.
In 1891 tot R. Koch semnaleaza fenomenul Koch si tuberculina. A. Calmette si C. Gurin in perioada 19081921 au cultivat prin treceri la 21 zile, n bulion cartof glicerinat si biliat o tulpin de Mycobocterium bovis virulent
izolat din lapte.
In urma acestor treceri s-a obtinut o tulpina fr patogenitate, dar capabil s determine rezistenta fa de
infecia tuberculoas, caracterele morfologice,tinctoriale, nutritionale, de cultur au rmas cele iniiale.
Aceast tulpin (tulpina BCG - bacilul Calmette i Guerin) a fost utilizat ca vaccin mpotriva tuberculozei ncepnd
din 1921, n 1927 se organizeaz laboratoare de producie a vaccinului BCG in 26 de tri , inclusiv n Romnia.
* Clasificare:
1. Micobacterii care nu se dezvolt pe medii de cultur si sunt strict patogene pentru om si ammale, sunt dou specii:
- Mycobacterium leprae (agentul Armauer Hansen, descoperit in 1873) este agentul etiologic al leprei umane;
- Mycobacterium leproemurium, agentul etiobgic al leprei obolanilor.
2. Micobacterii care se dezvolt lent (saptmni) pe medii de cultura si sunt patogene pentru om i animale
homeoterme (care isi pastreaz temperatura constant a corpului):
- M. tuberculosis, agentul etiologic al tuberculozei umane dar si cel al cinelui i pisicii:
- M. bovis produce tuberculoza la bovine, dar i la om;
,
- M. africanum patogen pentru om:
- M. muris care determin leziuni cazeoase ganglionare i subcutanate la unele roztoare.
3. Micobacterii care se dezvolta lent (sptmni) sau rapid (zile) pe medii de cultur, unele din micobacterii sunt
saprofite, iar altele sunt patogene sau conditionat patogene.
n raport cu pigmentatia coloniilor i ritmul de cretere micobacteriile se mpart n:
Grupa I - Micobacterii fotocromogene:
- culturile se dezvolt la 37oC n ntuneric nu sunt pigmentate, dac sunt expuse 30-60 min. la lumina zilei sau la o
surs de 30 W aezat la o distant de 50 cm i apoi rman n ntuneric 12-24 ore;
- culturile se pigmenteaz n galben sau portocaliu. Din aceast grup face parte M. tuberculosis.
Grupa II - Micobacteriile scotocromogene, se dezvolt la 370 C att la ntuneric cat i la lumin, culturile sunt
pigmentate n galben-potocaliu (M. sarofulaceum).
Grupa III - Micobacteriile necromogene: M. avium.
Grupa IV - Micobateriile cu cretere rapid ("rapid growers"), coloniile care apar dup cateva zile sub form "S'
sau "R" In 37C, cromogenitatea este variabil sunt conditionat patogene la om sau animale.
* Habitat
Bacilul tuberculos manifest un parazitism strict, el este prezent n leziunile omului sau animalelor bolnave de
tuberculoz, poate fi gsit n praful din ncperile n care a fost rspndit sputa bacilifer sau pe obiectele
contaminate de bolnav.
* Caractere morfologice i tinctoriale
Sunt bacili subtiri cu lungimea de 3-10 m i ltime de 0,1-0,2 m, uneori ramificati, drepti sau uor curbati sub
formn literelor: X, Y, Z, cu granulatii puse n evident prin coloraii speciale, imobili, nesporulati, necapsulati.
Structura peretelui este format din:
Lipide , care sunt in cantitate mare (intre 20-45 % din greutatea uscat a bacteriei) sub form de: - fosfolipide cardiolipina:
- acizi micolici;
- glicolipide - cord-factorul;
- peptidoglicolipidele - ceara D, aceasta n cantitate mai crescuta la tulpinile virulente (la celelalte bacterii
lipidele sunt de 3-10%).
3

 Proteine (tuberculoproteinele), tuberculina brut, cca. 1%, care ofera antigenicitate.

Polizaharidele care se leaga de lipidele si proteinele din perete.
* Rezistent
Bacilii rezist luni sau ani n praf, sunt sensibili la actiunea radiatiilor solare i UV, sunt sensibili la actiunea
antibioticelor: streptomicin, HIN, acidul para-amino salicilic, etambutol, rifampicin (sinerdol), dar pot ctiga uor
rezistent.
* Caractere de cultur
Spre deosebire de micobacteriile saprofite care se dezvolt uor i rapid pe mediile de cultur simple, micobacteriile
patogene se dezvolt lent pe medii speciale.
Adugarea glicerinei n mediile de cultur favorizeaz dezvoltarea bacilului tuberculos uman, n timp ce tipul bovin
este partial inhibat.
Pe mediile lichide micobacteriile formeaz un vl subtire, care se ngroa, se cuteaz, se fragmentenz i cade la
fundul recipientului, iar la suprafa se va forma un alt vl.
Bacilii tuberculoi de tip uman fac un vl mai gros dect cel bovin i alcalinizeaz la nceput mediul, apoi l acidific
progresiv.
Cel bovin alcalinizeaz mediul la nceput, dar ulterior nu-l mai acidific.
Pe mediile solide, care sunt mediile tip Lwenstein-Jensen (L-J), sau tip Ogawa, sunt medii selective contin:
- sruri mirerale,
- asparagin sau acid glutamic,
- amidon,
- glbenus de ou,
- glicerina si verde malahit.
Amestecul final se repartizeaz n tuburi de 18/180 si se coaguleaza n pozitie inclinat la 90 C.
Temperatura optima de dezvoltare a bacilului tuberculos este de 37C timp de 30-60 zile, bacilul este aerob, de
aceea se nsmanteaz pe mediul solid nclinat, dar o cantitate de 10 % C02, favorizeaza cresterea.
Coloniile micobacteriene apar tarziu, dup prima sptmn abia se vede o mic formatiune.
Numai dup 30-40 zile ajunge o colonie caracteristic de aspect verucos (conopidiform) de tip R", aceasta este
cretere eugonic a coloniilor rugoase.
Prezenta coloniilor mici de tip S" este o cretere disgonic i este caracteristic pentru Mycobacterrum bovis.
* Caractere biochimice
Sunt germeni aerobi, au enzima catalaz, se dezvolta un pH usor acid, tipul hominis este singurul care produce acid
nicotinic.
* Caractere de patogenitate
Virulenta micobocteriilor este data de existenta unel substante cord-foctor, care rezista la actiunea enzimelor
lizozomale, care lipseste la micobacteriile avirulente.
De asemenea au capacitatea de a se multiplica intracelular (intramacrofogic).
Produc n organismul afectat si fenomene de intoxicatie, care este un factor agravant.
* Diagnosticul de laborator este un : diagnostic bacteriologic
Se bazeaz prin punerea n evident a bacilului Koch n produsele patologice, n acest scop se folosesc 3 metode:
-examenul direct,
-cultivarea i
-inocularea la cobai.
* Diagnostic bacteriologic
Recoltaren produselor patologice se face n recipiente sterile cu capac ce se pot nchide ermetic.
n tuberculoza pleuro-pulmonar se recolteaz: sput, aspirat bronic sau cavitar, lichid de spalatura bronic,
piese de exerez chirurgical, lichid de spltur gastric, fecale, piese necroptice, lichid pleural.
n tuberculoza uro-genitala: urin, sange menstrual, biopsie de endometru, piese de exerez chirurgical.
n tuberculoza ganglionar: material din biopsie sau punctie.
n tuberculoza ostio-articular: lichid articular, ,puroi din abcese reci, fragmente osoase.
In meningita tuberculoas:lichid cefalorahidian.
Cel mai folositor produs este sputa, pentru c tuberculoza pulmonar este forma cea mai frecvent.
Tehnica de prelevare a sputei:
- trebuie s se fac n recipiente sterile de unica folosint, trebuie s se fac nainte de nceperea tratamentului
4

medicamentos.
- se recolteaz dimineata la sculare o cantitate de 5-10 ml, se va repeta in 3-4 zile, se poate pstra la 4C cu adaos de
carbonat de sodiu pulvis, 50 mg la 5 ml sput: sau fosfat trisodic (2-4 ml din sol 15% ).
- se vor respecta regulile de asepsie a personalului care asist sau transport probele.
Aspectul sputei: este purulent, nu se va lucra sputa mucoas, care de cele mai multe ori este saliv.
Examenul microscopic direct se efectueaz pe frotiuri colorate dup metoda Ziehl-Neelsen, se examineaz cu
obiectivul cu imersie, prezenta este dat prin apariia de bacili roii pe un fond albastru.
Cnd numrul de germeni este redus, frotiul se face dup omogenzarea si concentrarea produsului patologic.
Omogenizarea se face ntr-un balon de 250 ml, cu fund plat,peste sputa se adauga o cantitate egal sau de 2-3 ori
mai mare de NaOH 0,5%, la 60o C, 30 min.
Concentrarea prin flotare, se obtine prin adugare de apa distilat (AD) pna la jumtatea balonului; 2 ml de xilol
sau neofalina. Se agito energic 10 min, se adaug AD pn la jumatatea gtului balonului, se las n repaus 30 min,
timp n care se formeaz un inel cremos in care au fost concentrati bacilii tuberculosi din produs.
Stratul cremos este aspirat ntr-o pipeta Pasteur prevazuta cu o para de cauciuc, sau un pipetor automat. Pe 2-3
lame degresate, care sunt asezate pe o platina nclzita sau pe un geam deasupra bii, se depun succesiv, picturi din
materialul cremos, pana cand acesta se epuizeaz, apoi frotiul va fi uscat, fixat la flacar si colorat Ziehl-Neelsen.
Se va examina la microscop cu imersie i se va face o apreciere cantitativa:
- 0 bacili/ 300 cmpuri microscopice = absent b.a.a. r;
- 1-3 bacili/ 300 cmpuri = prezenta b.a.a.r se solicit repetare;
- 4-9 bacili/100 = prezenta b.a.a.r (+),
- 10-100 /100 = prezenta b.a.a.r (++),
- peste 100 bacili/100 cmpuri mic = prezenta b.a.a.r (+++).
Concentratia micobacteriilor tuberculozei n sput este totdeauna n raport direct cu dimensiunea i intensitate
leziunii.
Alte bacterii AAR posibil de ntlnit n frotiuri se deosebesc morfologic: nocardiile i actinomicetele sunt
filamentoase, cu ramificaii i extremitii ngroate.
Apoi produsul patologic se va nsmnia pe mediile de cultur amintite.
Controlul creterii pe mediile de cultur se face prin frotiuri colorate Ziehl-Neelsen.
Inocularea la cobai
Se practic n functie de posibilitti, n formele de tuberculoz extrapulmonar.
Se folosesc cobai sntoi de 300-400 g. Prelevatul patologic se injecteaz 1-2 ml sub cutan pe fata interna a
coapsei, animalele se urmresc zilnic timp de 90 zile.
La fiecare 15 zile animalele se vor cantrii i examina clinic, local, general.
Infectia tuberculoas la cobai se manifesta prin: scdere n greutate, producerea unui nodul care apoi se ulcereaz
(ancru), la locul inoculrii i adenopatie satelit.
Pentru stabilirea sacrificrii cobaiului se va face reactia la tuberculin, care se face ntr-o zon nepigmentat , se
injecteaz i.d., 0,1 ml din solutie 1/10 de tubercuin bruta
O escar n centrul unui halou inflamator persistent, observabil la 24-48 h reprezint o reactie pozitiv.
Dup sacrificarea animalului, de regul dup 5-6 sptmni de la inoculare se constat: ancru la locul de
inoculare, hipertrofia (inclusiv cazeificarea ganglionilor limfatici, inghinali, presacrati, mezenterici), leziuni
tuberculoase caracteristice (tuberculi-zone cazeoase ntinse) n splin, ficat, i plmni.
Se vor face frotiuri colorate adecvat i se vor face nsmntri pe mediul Lwenstein-Jensen.