Determinarea acizilor amari din hamei

Analiza de acizi amari din bere i hamei prin

metoda HPLC/MS
Berea reprezint una dintre cele mai larg consumate bauturi din lume. Producia
anual la nivel mondial, msurat n sute de milioane de hectolitri, este o mrturie a
popularitii sale. In toat lumea 20000 de feluri de bere sunt mbuteliate n 180 de feluri,
de la normal, slab alcoolizat, pils, amar, crem de bere i bere neagr.
Dei exist multe tipuri diferite de bere, toate au n comun o caracteristic de
baz gust, amrciune. Gustul amar al berii deriv din acizii prezeni n sectorul
hameiului care sufer izomerizare n timpul procesului de preparare. n contrast cu
procesele tradiionale vechi, tehnici moderne de bere pot utiliza produsele din hamei, cum
ar fi extrase pentru a realiza volume mai mari de producie. Expunerea prelungit a berii
la aer este corelat cu reducerea gustului amar.
Berea a aprut acum cca. 6000 de ani. Vine cel mai probabil de la pine care s-a
udat i a nceput s fermenteze, de unde a aprut procesul de fermentare.
Se pare ca berea era asemntoare unei grsimi groase de culoare intunecat, fara
s conin o cantitate mare de alcool, nsa foarte hrnitoare. Datorit gustului deosebit, ea
ocupa un loc important in dieta oamenilor din acea vreme. Arheologii de la Universitatea
Cambridge au interprins un studiu al proceselor de pregtire a berii i cerealelor in
Egiptul antic. Obiectul de studiu a fost gsit in mormintele in care s-au pstrat ramaie
de mancare i bere. Calitatea acestora depinde de zahrul necesar pentru fermentaie.
Berea este o butur alcoolic obinut din 4 produse naturale: drojdia de bere,
mal, hamei i ap. Aceasta are aproximativ 5% alcool; aa-numita bere fr alcool are
ntre 0 i 0,5% alcool.
In zilele noastre pentru uurarea procesului seminele se pun la uscat, astfel inct
se obine malul. Malul se fierbe, se strecoar i se adaug drojdie. Potrivit reetei
tradiionale, pentru obinerea unei drojdii naturale se prepar un aluat din fain de grau,
iar aluatul se punea la copt pan cnd mijlocul se intrea. Dup care, bucile din aluatul
copt se puneau intr-un decoct de mal pentru pregtirea berii.
Hameiul este floarea de Humulus lupulus, un agent de stabilitate n bere. Acizii de
hamei au un efect antibiotic slab contra bacteriei gram-positive care favorizeaz
activitatea exclusiv a drojdiei de bere n fermentarea berii. Aroma dat de hamei,
depinde de varietate i utilizare; hameiul fiert cu berea ("hamei amrui") produce o
amrciune n timp ce hameiul adugat mai trziu d un fel de "arom de hamei"
(ultimele 10 minute din fierbere) i "arom de hamei" (ultimele 3 minute din fierbere sau
mai puin) cu un grad de amrciune mai sczut. Adugarea hameiului dup fierbere, un
proces cunoscut ca i "adugarea hameiului uscat" adaug puin amrciune. Hameiul
nefiert d doar o amrciune slab. Impactul amrciunii dup o anumit cantitate de
hamei este specificat n uniti de amrciune.
Inflorescena de hamei este de tip ament, popular denumit con. Conurile de
hamei sunt o materie prim important la fabricarea berii, fiind un agent de stabilitate n
bere. Acizii de hamei au un efect antibiotic slab contra bacteriei gram-pozitive care
favorizeaz activitatea exclusiv a drojdiei de bere n fermentarea berii.

Conurile de hamei conin: substane azotate (aminoacizi, albuminoide,

polipeptide), glucide, fibre, tanin, substane amare (acizi amari i rini), uleiuri volatile
(mircen, humulen, canben, etc), sruri minerale, flavonoizi (xanatohumol), glicozizi
flavonici (ai cvercetolului, ai camferolului), rezine, colin, fitoestrogeni, glicerin, lipide.
Cele mai bine reprezentate substane active din conurile uscate sunt: substanele
azotate- cca. 15%, substanele amare -cam 11%, taninul- 5%, substanele estrogenice
-cca. 1,5 %, rinile- 1,2%, uleiurile volatile -aproximativ 1%.
Acizii amari sunt alctuii din humilon i lupulon. Humulonul, pe parcursul
nclzirii soluiilor n care se extrage trece n izohumulon. Acizii amari au efect
antiseptic, iar berii i imprim spuma, gustul i aroma specific.
Taninul contribuie la culoarea i la limpezimea berii, prin faptul c este uor
tinctorial i precipit proteinele.
cizii amari sunt considerai a fi caracteristica primar de calitate a hameiului,
deoarece sunt o msur a potenialului amar.
Consumul specific mediu de hamei, exprimat n g/hl de bere este foarte variabil n
funcie de sortul de bere si de coninutul conurilor n acizi amari fiind de aproximativ
150g conuri uscate pentru un hl de bere. n prezent consumul specific se exprim mai
exact n g acizi alfa/hl de bere si se apreciaz c cca. 40% din producia mondial de bere
utilizeaz 5,5-5,6 g acizi alfa/hl de bere, pentru care este necesar o cantitate cca. 7300 t
acizi alfa/an. Pentru urmtorii 10 ani se estimeaz reducerea consumului specific la 5 g
acizi alfa/hl, ceea ce la un coninut mediu de 7,8% acizi alfa ar fi suficiente 60000 ha
hamei.
Compusii chimici din rsina de hamei, care au gust amar (acizii si mai puin
acizii ) trec n timpul brasajului n substane solubile denumite izo--acizi,cu o amreal
mai mare dect a acizilor , iar acizii nu se mai gsesc n bere dect n urme.
Izomerizarea acizilor n timpul fierberii mustului de bere este una dintre cele mai
importante reacii din chimia hameiului.
O cromatografie n faz invers a fost folosita pentru a separa acizii alfa din
hamei din produsele lor izomerizate din bere,iar spectrometrul de mas MS a fost apoi
utilizate pentru a determina coninutul de acid amar.
Cromatografia lichid de nalta performan (HPLC)
Aceast tehnic a devenii cea mai performant n analiza chimic, biomedical i
diagnostic laborator. Este utilizat pentru separarea i detecia unor compui biologic
activi (hormoni, vitamine, proteine, lipide, etc), instabili termic, n concentraii extrem de
mici, cu o viteza i precizie mult mrite n raport cu metodele clasice. Figura de mai jos
prezint schematic prile componente ale unui cromatograf de lichide de nalt
performan (HPLC): una sau dou pompe (2) ataate la un rezervor (1) de unde preiau
eluentul, un injector de introducere a proba (3), coloana de separare (4) ataata la un
detector (5) care identific componentele pe baza unei proprieti (de obicei absorbia n
UV sau VIS in ordinea ieirii din coloan i un nregistrator (6) care vizualizeaz
cromatograma.

Componentele unui cromatograf de lichide de malta performan (HPLC)

Separarea poate avea scop analitic i atunci are loc pe o coloan de oel de
dimensiuni mici (25 x 4 mm) sau preparativ, pe coloane de dimensiuni mai mari (30 cm x
10 mm). Proba este injectata in coloana HPLC care este ataat la pompe care mpinge
solventul cu o presiune mare (aprox. 40 mPa sau 100Barr). Debitul de curgere depinde de
aceast presiune i este de obicei cuprins intre 0,5 i 2 ml/min. Uneori, pentru o separare
mai performant, eluia se poate face cu amestecuri de solvent a caror concentraie
variaz n timp (gradient) i aceasta necesit utilizarea a dou pompe i a unei camere de
amestecare.
Atunci cnd separarea are ca scop preparativ se colecteaz pe rnd componentele
amestecului si se verific puritatea lor prin CSS sau printr-o alt separare HPLC.
Faza staionar. In funcie de umplutura coloanelor exist HPLC:

cu faz normal (NP-HPLC) n care faza staionar este polar: silicagel,

alumina, celuloza, Ca(OH)2, MgC03 sau

cu faz invers (RP-HPLC) n care faza staionar devine nepolar, prin

legare chimica deoctadecilsilan ODS = C18 sau octasilan C8.
Mecanismul pe baza cruia are loc separarea n aceste cazuri este diferit: dac
pentru sistemele NP-HPLC, separarea are la baz adsorbia diferit a componentelor
amestecului pe faza staiona. Pentru sistemele RP-HPLC procesul de separare are la baz
repartiia componentelor amestecului intre faza staionar nepolar i eluentul polar.
Tipul fazei mobile (eluentul) este dependent de natura fazei staionare. Astfel in
sistemele NP- HPLC unde faza staionar este polar se folosesc elueni nepolari (eter de
petrol, hexan puri sau in amestec cu aceton 1-15%) iar unde faza staionar este nepolar
(RP-HPLC) se folosesc amestecuri de solveni polari, cum sunt: acetonitrihil, metanolul,
acetatul de etil, apa.
In funcie de tipul probei de analizat se alege unul din aceste sisteme:

dac proba este preponderent nepolar se recomand utilizarea sistemului

NP-HPLC unde coloana conine faz staionar polar cu afinitate diferit pentru
moleculele nepolare, care vor fi primei eluate, cu solventul preponderent nepolar.


dac proba este preponderent polar se recomand utilizarea sistemului
RP-HPLC cu faza staionai nepolar i afinitate diferit pentru moleculele polare, ce vor
fi eluate primele, cu solveni polari.
Astfel, ordinea de eluie (caracterizat de tR - timpul de retenie a probei pe
coloan, exprimat m minute) a componentelor amestecului depinde de sistemul utilizat:
NP-HPLC (eluent nepolar): tR comp.nepolare <tR comp. polare ;
RP-HPLC (eluent polar): tR comp. polare < tR comp. nepolare;
Experimente si rezultate
Un eantion de granule de hamei a fost obinut de la o priz de start, bere locala.
Peletele au fost apoi zdrobite si pudra ce rezult este extrasa cu hexanl. Probele de bere
au fost extrase cu volum egal de hexan i de stors pentru a izola componenta hexan. n
ambele cazuri au fost probe de hexan evaporat i re-dizolvat n metanol pentru infuzie sau
n faz de lucru mobila pentru LC. ntruct ambii acizi alfa i produsii lor izomerizati au
aceeai masa molecular, distincia poate fi fcut numai prin utilizarea MS / MS modele
de fragmentare.
Conditiile LC utilizate in separare au fost, dup cum urmeaz Jones C 8 2.1 x 100
mm coloana de HPLC cu o faz mobil constnd in acetat de amoniu 2mm i metanol.
Utilizand un gradient de opt minute,metanolul utilizat a crescut de la 50% la 95% cu un
debit de 300 L / min. n timpul expunerii la aer, probele au fost extrase cu hexan.
Rezultatele au fost combinate pentru a forma un compus reprezentant care ilustreaz
reducerea acizilor amari in timpul expunerii la aer.
Lipsa de standarde disponibile n comer pentru alfa-acizi limiteaz analiza doar
la o comparaie relativ a concentraiilor de acid.
n mod similar putem face o comparatie intre diferite tipuri de beri prin
combinarea rezultatelor n grupuri caracteristice de locaie sau de tipului de bere. Pentru
un grup dat, intensitatea acizilor amari i raportul lor probabil depinde de soiul de hamei,
cantitatea de hamei utilizata i procesul de bere n sine. n cazul n care o cantitate mai
mare de hamei, cu un randament mai ridicat de acizi alfa ar produce o intensitate mai
mare de acizi amari, dar raportul ntre alfa i-alfa acizi ISO va depinde de diferiti factori
in procesul berii.
O comparaie a dou metode de preparare a eantioanelor a fost fcut prin
extragerea simultana a aceleai probe de bere cu hexan ca o prob i diluarea berii cu ap
distilat ca un al doilea eantion. Un alt pas, aceeai diluie de 1:20 a fost utilizata pentru
ambele probe, n cazul n care probele de evaporat hexan au fost diluate n faza mobil.
Comparaia rezultatelor arat c, n timp ce intensitatea de acizi alfa este aceeai,
nivelurile de acizi alfa-ISO sunt mai mari pentru proba diluat cu apa. Aceasta reflect
solubilitatea mai mare de acizi alfa-iso n ap. Ambele metode de pregtire furnizeaz
eantioane potrivite pentru analiz spectrometru de mas.
Pe baza rezultatelor de la metoda de diluare cu ap, o estimare a limitei de
cuantificare este de aproximativ 40000 bere diluata.

Concluzie
Metoda prezentata ne ofera o posibila aplicare in analiza cantitativa si in controlul
calitatii, precum si in procesul de dezvoltare a berii. De asemenea poate fi utilizata si in
analiza calitativa a impuritatilor si identificarea degradarilor prezente in produsele din
hamei.