Sunteți pe pagina 1din 12

TEMA 23: PRINCIPIILE DIAGNOSTICULUI DE LABORATOR AL INFECIILOR DE

ETIOLOGIE VIRAL
1. Virusurile. Natura. Particularitile biologice. Taxonomia i clasificarea.
Reprezint structuri acelulare cu potenial infecios
Dimensiuni de rangul nm (20-400 nm)
Genomul viral este constituit dintr-un singur tip de AN (ADN sau ARN)
Sunt lipsite de metabolism propriu, fiind parazii obligai intracelulari
Nu cresc i nu se divid, se reproduc n celule vii
Nu cultiv pe medii artificiale, numai pe celule vii
Rezisten natural la antibiotice
CLASIFICAREA VIRUSURILOR
Dup tipul AN (cu genom ARN/ADN)
Dup dimensiuni (mici 20-50 nm, medii 50-150 nm, mari peste 150 nm)
Dup tipul de simetrie a capsidei (helicoidal, cubic, mixt)
Dup compozitia chimic (simple, complexe)
Dup gazd (om, animal, insect, bacterie)
Dup sensibilitatea n mediul extern, substane chimice, etc
Order (-virales)
Family (-viridae)
Subfamily (-virinae)
Genus (-virus)
Species (-virus)
Virusuri ADN : Parvoviridae, Hepadnaviridae, Adenoviridae, Herpesviridae, Poxviridae
Virusuri ARN+: Picornaviridae, Caliciviridae, Togaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae,
Retroviridae
Virusuri ARN- : Rhabdoviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae,
Arenaviridae, Filoviridae
Virusuri ARNd.c. : Reoviridae
Virion unitate structural infecioas a virusului
Viroid ARNm.c., circular, asociat cu boli la plante
Prion protein termostabil infecioas, cauzeaz la om boala Kuru, Creutzfeldt-Jacob,
sindromul Gerstmann-Straussler, scrapie la oi

2. Forma, compoziia chimic i structura virionului. Noiuni generale de viroizi i


prioni.

COMPOZIIA CHIMIC I
STRUCTURA VIRIONULUI
Virusurile simple acid nucleic (AN) i nveli proteic capsida (ansamblu numit
nucleocapsid)
Virusurile complexe nucleocapsid i un nveli extern, lipoglicoproteic (supercapsid,
peplos)
Acidul Nucleic ADN sau ARN, mono- sau bicatenar, liniar, circular sau fragmentat.
ARN monocatenar : ARN+ (caten cu sens, funcie de ARNm) sau ARN- (caten fr
sens, este necesar prezena enzimei polimeraza)
Funcia AN asigurarea replicrii i expresia genomului pentru sinteza proteinelor virale

I: Double-stranded DNA (e.g. Adenoviruses, Herpesviruses, Poxviruses)


II: Single-stranded (+) sense DNA (e.g. Parvoviruses)
III: Double-stranded RNA (e.g. Reoviruses)
IV: Single-stranded (+) sense RNA (e.g. Picornaviruses, Togaviruses)
V: Single-stranded (-) sense RNA (e.g. Orthomyxoviruses, Rhabdoviruses)
VI: Single-stranded (+) sense RNA with DNA intermediate in life-cycle (e.g. Retroviruses)
VII: Double-stranded DNA with RNA intermediate (e.g. Hepadnaviruses)
Capsida format din uniti proteice, capsomere, aranjate simetric.
Simetrie helicoidal capsomerele se fixeaz pe catena de AN, form de bastona
Simetrie cubic (icosaedric) capsomerele se aranjeaz n jurul AN, formnd un
icosaedru (poliedru regulat cu 20 fee triunghiulare i 12 vrfuri), eikos=20
Simetrie mixt (bacteriofagii, poxvirusurile)
Funcia capsidei protecia AN, rol antigenic, adeziune
Supercapsida structur glucido-lipido-proteic, derivat din membrana celulei gazd.
Lipidele provin din membrana celular, iar glicoproteinele sunt de origine viral (ex.:
hemaglutinina, neuraminidaza)
Funcie protecie, antigene de suprafa, adeziune
Unele virusuri conin enzime polimeraze, transcriptaze, etc.
Aciunea factorilor fizici, chimici
Virusurile sunt foarte sensibile la cldur, desicare, raze UV. Detergenii i solvenii
inactiveaz virusurile cu supercapsid.
Pot fi conservate prin liofilizare sau la -80C
3. Multiplicarea (replicarea virusurilor). Fazele i etapele ciclului replicativ viral.

REPRODUCEREA VIRUSURILOR
I ADSORBIA virusului la celula-gazd prin intermediul receptorilor specifici (tropism)
II PENETRAREA virusului n celul
Pinocitoz (viropexis)
Fuziunea membranelor
Translocare
Injectarea AN n citoplasm (bacteriofagii)
III DECAPSIDAREA ( cu enzime celulare). Din acest moment urmeaz faza de eclips.
IV BIOSINTEZA (sinteza proteinelor i replicarea AN)
Are loc n citoplasm (virusuri cu ARN) sau n nucleul celulei (virusuri cu ADN)
Biosinteza virusurilor ADN
ADNdc -> transcrierea ARNm -> replicarea, translaia (precoce, tardiv) -> sinteza
proteic
Biosinteza virusurilor ARN
ARN+ -> replicare, translaie -> sinteza proteic
ARN- -> transcriere ARNm -> replicare, translaie -> sinteza proteic
Retrovirusuri (ARN+) -> transcriere -> ADN- -> ADNdc -> transcriere ->
ARNm -> replicare, translaie, sinteza pr. (sau integrare n cromosom)

V. MORFOGENEZA (asamblarea) i maturizarea virionilor


Proteinele capsidale particip la formarea nucleocapsidei (n nucleu sau citoplasm) iar
glicoproteinele sunt inserate n MCP, substituind proteinele celulare. n aceast faz
apar incluziunile virale sau corpusculii elementari.
VI. ELIBERAREA virionilor (liza celulei, nmugurire, exocitoz). Nr lor poate atinge 100.000
per/celul
Ciclul reproductiv viral are durata variabil de la cteva ore pn la cteva zile (ex.: 8h
poliovirus, 72h citomegalovirus).
Interferena viral fenomen n care, consecutiv infeciei unei celule cu 2 virusuri,
multiplicarea unuia este inhibat (virus interferat / virus interferent)

RELAII VIRUS-CELULA GAZD


Infecie viral productiv, citocid
Virusul este infecios iar celula permisiv (receptiv). La nivelul ma/o corespunde infeciilor
acute, aparente sau inaparente (grip, rujeol ...)
Infecii virale persistente
Celulele infectate supravieuiesc, cu producerea permanent sau intermitent a virusului.

1. Infecii abortive (cu virioni defectivi) infecia nu se exprim, are loc transformarea
celulelor prin proteine virale. Ele devin int pentru efectorii imunitii (macrofage, Tlimfocite) n cursul unor infecii cronice (PESS post-rujeolic)
2. Infecii integrate (virusuri ADN sau copii de ADN ale Retrovirusurilor). Consecine:
Transformarea malign a celulei gazd
Infecii lente - manifestarea infeciei dup o perioad de incubaie ndelungat cu expresia
integral a genomului viral (ex.: HIV-SIDA)
Infecii latente - reactivri ocazionale, repetate ale infeciei cu exprimarea integral a
informaiei genetice virale (ex.: infecia herpetic)
Infecii cronice perioade de remisie i acutizare, virusul este prezent permanent, chiar n
absena simptomelor (ex.: hepatita viral B)

4. Metodele de cultivare a virusurilor: pe animale de laborator. Selectarea


animalelor, cile de infectare. Avantajele i dezavantajele metodei; n ou
embrionate de gin. Structura oului embrionat de gain. Metodele de inoculare
(nchis i deschis). Avantajele i dezavantajele metodei; n culturi celulare.
Tipurile de culturi de celule. Infectarea culturilor de celule.
CULTIVAREA VIRUSURILOR
Virusurile sunt cultivate pentru:
Stabilirea diagnosticului etiologic
Testarea infeciozitii virusurilor
Testarea preparatelor antivirale
Producerea vaccinurilor
SISTEME DE CULTIVARE
Culturi de celule
Ou embrionat de gin
Animale de laborator

Animalele de laborator se utilizeaz limitat (receptivitate selectiv, preexistena infeciilor,


cost avansat). Se recurge numai cnd nu exist alte posibiliti (VHB, HIV, Coxsackie,
etc). Constituie modele de cercetare sau de control al vaccinurilor. Animalele utilizate
curent oriceii albi nou-nscui, dar pot fi utilizai obolani, cobai, maimue, etc.
Regulile de lucru cu animalele de laborator (selectare, inoculare, examinare) sunt identice
cu cele din infeciile bacteriene.

Oul embrionat de gin (5-13 zile) reprezint un mediu de celule nedifereniate, cu


multiplicare activ, steril i lipsit de mijloace de aprare antiinfecioas. Se utilizeaz n
prepararea unor vaccinuri virale (ex.: gripal)
- Iniial se verific viabilitatea embrionului la ovoscop n camera obscur.
Prelevatul se inoculeaz steril cu seringa n cavitatea amniotic sau alantoidean, sau pe
membrana chorioalantoidean (utiliznd metoda deschis sau nchis).
Orificiul se parafineaz i se incubeaz la 35-37C timp de 48-72 ore
Culturile de celule (1949 - Enders, Weller, Robbins).
Celule provenite din esuturi adulte sau embrionare, normale sau tumorale. Plasate ntr-un
mediu adecvat (nutrieni, pH, t) rmn viabile i se multiplic. Pentru cultivarea
virusurilor se utilizeaz culturile n monostrat celular.
Tipurile de culturi de celule (CC):
Culturi primare (primar tripsinizate). Sunt obinute din esuturi adulte sau embrionare de
origine animal sau uman. Suport 4-6 pasaje (subcultivri)
Culturi diploide. Obinute din esut embrionar (MRS5, fibroblaste umane). Pot fi
subcultivate 40-50 generaii
Linii continui de celule. Obinute din esut tumoral. Pot fi subcultivate nelimitat.
HeLa carcinom de col uterin
KB tumoare a rinofaringelui
Hep-2 tumoare canceroas a laringelui
Obinera culturilor de celule primar tripsinizate:
Prelevarea esutului (ex.: rinichi de maimu)
Fragmentarea i splarea cu sol. fiziologic
Dezagregarea tisular cu enzime proteolitice (tripsina)
Separarea celulelor prin centrifugare
Dozarea suspensiei - 105 106 celule/ml
ntroducerea celulelor n mediu nutritiv i repartizarea n recipiente sterile
Incubarea pn la formarea monostratului celular (inhibiie de contact)
Monostratul poate fi infectat cu virus sau servete drept surs de celule pentru o nou
cultivare (pasaj)
Mediile de cultur pentru culturi de celule (Eagle, Hanks, 199, hidrolizat de lactalbumin,
etc), conin AA, Vit, factori de cretere, sruri minerale, rou fenol pentru
monitorizarea pH (vireaz n galben n mediu acid)
Mediile de cretere (pentru cultivarea CC) sunt mbogite cu ser sangvin (uman, animal)
Mediile de ntreinere se utilizeaz pentru meninerea monostratului n procesul
reproducerii virale. Nu conin ser.
CC reprezint sistemul virus-gazd predilect n virologia clinic i cercetare.
Inocularea CC

Se aleg tuburi cu monostrat bine format


Se nltur mediul de cretere, se spal cu sol. Hanks
Se inoculeaz 0,1 0,2 ml de prelevat
Peste 30-60 min n tuburi se toarn cte
1 ml mediu de ntreinere
Se ntroduc n termostat la temperatura adecvat 3 - 4 zile
5. Metodele de diagnostic ale infeciilor cauzate de virusuri (viroze)
METODELE DE DIAGNOSTIC AL VIROZELOR
METODE DIRECTE
Examenul virusoscopic (evidenierea direct a virionului sau a componentelor lui n
prelevate)
Examenul virusologic (izolarea i identificarea virusului)
Detectarea Ag virale n prelevat
Identificarea genomului viral (hibridizarea AN, amplificarea genic PCR)
METODE INDIRECTE
- Serodiagnosticul (creterea de cel puin 4 ori a titrului Ac n dinamic)
EXAMENUL VIRUSOSCOPIC
Microscopia optic depistarea n prelevat a incluziunilor virale specifice (corpusculii
Guarnieri n variol, Babe-Negri n rabie) sau nespecifice, citoplasmatice sau
nucleare. Se prepar frotiuri sau frotiuri-amprente colorate Romanovschi-Giemsa
sau cu fluorocrom
Microscopia electronic
Imunoelectronomicroscopia mai sensibil, mai specific. Se examineaz complexele
imune virus Ac
Imunofluorescena (direct i indirect) utilizat n diagnosticul rapid al virozelor
6. Materialele de examinare (prelevate) de la pacieni. Regulile de recoltare i
ambalare, condiiile de transportare n laborator.

7. Metoda virusoscopic de examinare a prelevatelor n viroze.


EXAMENUL VIRUSOSCOPIC
Microscopia optic depistarea n prelevat a incluziunilor virale specifice (corpusculii
Guarnieri n variol, Babe-Negri n rabie) sau nespecifice, citoplasmatice sau
nucleare. Se prepar frotiuri sau frotiuri-amprente colorate Romanovschi-Giemsa
sau cu fluorocrom
Microscopia electronic

Imunoelectronomicroscopia mai sensibil, mai specific. Se examineaz complexele


imune virus Ac
Imunofluorescena (direct i indirect) utilizat n diagnosticul rapid al virozelor

8. Metoda virusologic n diagnosticul virozelor. Pregtirea probelor pentru


examinarea n metoda virusologic.
EXAMENUL VIRUSOLOGIC
Prelucrarea prealabil a prelevatelor:
Omogenizarea (dup necesitate)
nlturarea elementelor celulare, inclusiv bacteriene (centrifugare, ultrafiltrare)
Tratarea cu antibiotice pentru prevenirea creterii bacteriilor i fungilor contaminani
(penicilin - 500 UA/ml, streptomicin
500 UA/ml, nistatin - 20 UA/ml)
9. Izolarea virusului de culturi de celule, ou embrionate de gin, animale de
laborator; indicarea virusului de culturi de celule (incluzii, ECP, proba de culoare,
RHA, RHAds, proba plajelor), n oul embrionat (RHA, decesul embrionului,
modificri pe MCA), pe animalele de laborator (simptome clinice, deces, RHA,
modificri histopatologice); identificarea virusului (definirea genului, speciei).
ETAPELE DIAGNOSTICULUI VIRUSOLOGIC
Izolarea virusului
Evidenierea (indicarea) reproducerii virale
Identificarea virusului
Izolarea virusului se realizeaz prin inocularea cu material de examinat a animalelor de
laborator, embrionilor de gin sau a culturilor de celule. Alegerea sistemului de
cultivare se efectueaz n funcie de particularitile biologice ale agentului
etiologic probabil i posibilitile laboratorului.
Indicarea virusului
n culturi de celule
ECP modificri degenerative i distrugere celular, rezultat al multiplicrii virale (rotunjire
sau retracie celular, citoliz, apariia vacuolelor sau granulelor n citoplasm,
picnoza nucleului, fuziunea membranelor, etc). ECP poate fi studiat la
microscopul optic pe celule necolorate sau colorate cu hematoxilin-eozin,
Giemsa, fluorocrom.
3. Incluziuni virale
Reprezint acumulri paracristaline de virioni sau de componente virale n aria de
replicare i asamblare a virusurilor (citoplasm, nucleu). Coloraia Giemsa, hem-eozin,

fluorocrom. Localizarea, forma i afinitatea tinctorial (bazofile, acidofile) sunt


particulariti diagnostice pentru unele viroze.
4. Hemaglutinarea (Reacia de HA)
Unele virusuri posed n componena capsidei, n special a supercapsidei, glicoproteine
care pot adera la suprafaa hematiilor hemaglutinine (HA).
RHA este caracteristic pentru virusurile cu HA acumulate n mediul de ntreinere. n
acest caz mediul de ntreinere aglutineaz eritrocitele unor specii de mamifere sau
psri.
5. Hemadsorbia (Reacia de HAd) RHAd este caracteristic virusurilor cu HA n poziie
intracelular. n procesul asamblrii acestor virusuri, HA lor se afl deja nserate n MCP
la nivelul viitorului mugure. Dac la aceast etap n recipientul cu monostrat celular se
adaug suspensie de hematii i se menine 15-20 min la t caracteristic fiecrui virus, la
microscop pot fi urmrite hematiile fixate la suprafaa celulelor infectate (RHAd).
6. Proba culorii
- Metabolismul celular neafectat virajul culorii mediului din rou n galben (pH acid)
Metabolismul celular inhibat culoarea mediului nu se modific
7. Interferena
Ex.: V.rubeolic nu produce ECP, dar determin fenomenul de interferen. Pentru
detectarea V.rubeolei se infecteaz CC cu virus citopatogen. Lipsa multiplicrii acestui
virus confirm prezena V.rubeolic
Indicarea virusului n oul embrionat de gin
Oule se rcesc 18 ore la +4 grade C pentru o vazoconstricie maxim, apoi aseptic se
taie coaja, se recolteaz lichidul alantoic sau amniotic, iar MCA i embrionul se
ntroduc n cutii Petri sterile. Se observ:
Moartea embrionului
Apariia modificrilor (hemoragii, pustule) pe MCA
Acumularea de HA n lichide
Indicarea virusului pe animale de laborator
Boala manifest a animalului, deces
Urmrirea virusului n organele-int:
Hemaglutinare
Infeciozitatea omogenatelor
Examene histopatologice (leziuni inflamatorii, degenerare, incluzii virale specifice: corp.
Babe-Negri n neuronii infectai cu V.rabic, etc)
Identificarea virusurilor
Determinarea genului, speciei i serotipului de virus prin stabilirea structurii antigenice.
Se efectueaz cu ajutorul serurilor imune specifice antivirale n diferite reacii serologice:
RN

RIHA/RIHAd
RFC
RIF
RIE (ELISA)
ARI, etc

10. Metoda serologic - recoltarea, pstrarea, examinarea serurilor perechi n RIHA,


RIHAds, RPG, RIF, RFC, RN, AIE. Citirea i interpretarea rezultatelor.
DETECTAREA AG VIRALE N PRELEVATE
Avantaje: simplitatea i rapiditatea examenului, nu necesit meninerea infeciozitii
virusului
Dezavantaje: sensibilitate direct proporional cu cantitatea virusului din prelevat
Se utilizeaz Ac policlonali de origine uman (seruri imune) sau Ac monoclonali (de
origine murin)
Reacii: RHAI, RLA, RIF, RIE (ELISA), Western-blot, ARI, etc.

11. Identificarea genomului viral prin tehnici de biologie molecular.


IDENTIFICAREA GENOMULUI VIRAL
(punerea n eviden a AN virali din prelevate n cursul infeciilor virale acute sau cronice
i monitorizarea tratamentului).
Pot fi examinate toate esuturile i lichidele biologice.
Hibridizarea acizilor nucleici fr amplificare
Hibridizarea dup amplificare (PCR i variantele ei)
DIAGNOSTICUL SEROLOGIC
Esena: depistarea Ac sintetizai de gazd n rspuns la o infecie viral.
Dup o primo-infecie are loc inducerea formrii Ac, iar dup o reinfecie sau reactivare
titrul Ac crete n dinamic.
n serodiagnosticul virozelor este obligator de a examina 2 probe de ser de la bolnav
(seruri-perechi): prima prelevat la debutul bolii, a doua prelevat peste 15 zile.
Ac sunt depistai n ser, uneori n LCR, exsudate, lichid articular, etc.
Pentru depistarea Ac se utilizeaz Ag virale de referin (suspensie viral inactivat,
proteine virale native sau recombinante, oligopeptide sintetice).
Tehnici utilizate: RFC, RIHA, RHAI, RN, RIFI, ARI, AIE (ELISA), etc.

Semnificaie diagnostic prezint trecerea titrului de Ac de la 0 la pozitiv (seroconversie,


primo-infecie) sau creterea titrului Ac de cel puin 4 ori n cursul infeciei. Ambele
seruri vor fi testate n aceeai zi, prin tehnici identice i n acelai laborator.
TERAPIA ANTIVIRAL
Dificulti:
Toxicitate (imposibil de a distruge virusul fr afectarea celulei!)
Apariia mutantelor rezistente
Activitate asupra virusului n faz de multiplicare
Costul avansat al tratamentului
Primele preparate antivirale anticanceroase.
Preparatele antivirale contemporane:
- Nu manifest activitate virucid, doar inhib reproducerea viral
Sunt dirijate contra etapelor reproducerii virale
Adeziunea virusului la celul
Mecanismul blocarea receptorilor celulari (HIV-oligopeptidul T, care reproduce gp120;
CD4 solubili)
Dificulti: afinitate redus, degradare rapid
Fuziunea, penetrarea
Reprezint peptide sintetice (pentafuzida-T20, T1249) blocheaz fuziunea virusului HIV cu
membrana celular (dificultate injecii s/c zilnice)
Decapsidarea
Amantadina, rimantadina inhib decapsidarea virusului gripal A
Utilizare limitat dezvoltarea rezistenei
Replicarea
Mecanismul blocheaz activitatea enzimelor virale de reproducere (transcriptaze,
polimeraze, replicaze)
Avantaj nu influeneaz componentele celulei-gazd
Analogi nucleozidici
Se disting de nucleozidele naturale prin modificarea componentului glucidic sau a bazei
purinice sau pirimidinice. Blocheaz elongarea catenei de ADN n curs de
formare.
Antiherpetice (aciclovir, ganciclovir, penciclovir, idoxuridin)
Anti-HIV (zidovudin, didanozin, zalcitabin, stavudin, lamivudin, etc)
Anti-HBV (entecavir, LdT, LdC faz de cercetare)
2. Analogi nucleotidici
Cidofovir - CMV, HSV
Adefovir - HIV, HBV, HSV, CMV

Tenofovir HIV, HBV


3. Analog al pirofosfatului
Foscarnet HSV, CMV (HIV, HBV -?)
4. Inhibitori nenucleozidici ai RT HIV (nevirapin, delavirin, efavirenz)
Blocarea activitii polimerazelor virale se realizeaz prin:
Competiie cu substratul natural al enzimei
ngrmdirea steric a centrului activ al enzimei
Incorporarea n catena de ADN n curs de sintez
Blocarea procesului de elongare a catenei de ADN prin incapacitatea de a fixa un alt
nucleozid pe analogul su artificial
Asamblarea, eliberarea
Inhibitori ai proteazei HIV (sanquinavir, ritonavir, indinavir, amprenavir, lopinavir, nelfinavir,
etc) toxicitate, rezisten
Inhibitori ai neuraminidazei virusurilor gripale (zanamivir, oseltamivir). Activ contra gripei
A i B (efect preventiv, curativ, rezisten rar)
INTERFERONII (IFN)
IFN ansamblu de proteine capabile s confere celulelor o stare de rezisten la o infecie
viral.
IFN tip 1 (clasic, antiviral):
IFN-alfa (leucocitar)
IFN-beta (fibroblastic)
Inductori ai IFN 1: virusuri, LPS, ARN bicatenar
IFN-gamma, tip 2, imun, produs de LT activate, NK. Manifest activitate imunomodulatoare
IFN acioneaz asupra ciclului de replicare viral prin intermediul celulei: interaciunea
IFN-alfa cu receptorul su induce sau stimuleaz expresia unor gene celulare, rezultnd
o activitate antiviral (blocarea translaiei ARNm viral, degradarea ARNm viral). Este
posibil i blocarea asamblrii i nmuguririi virusului (HIV)
IFN mresc expresia moleculelor clasa I a CMH, iar IFN-gamma i a celor de clasa II
IFN mresc activitatea macrofagelor i manifest activitate antiproliferativ
IFN-gamma activeaz celulele NK
Utilizarea terapeutic a IFN hepatite B i C cronice, infecii herpetice, sarcomul Kaposi,
limfome, leucemii
Alte citokine (TNF-a, IL-2, IL-4, IL-10, IL-12) sunt la etapa de testare in vitro.
TERAPIA CELULAR (CMV, EBV)
Fondat pe administrarea CTL (limfocite Tc) autologe.

Prelevarea sngelui de la bolnav


Izolarea CTL specifice
Clonarea i proliferarea CTL in vitro
Reinjectarea la pacient
VIITOR: fototerapia, imunizarea intracelular (introducerea unei gene ce codific un
anticorp antiviral)