LUCRAREA PRACTICA NR.

12
Determinarea activitatii enzimatice a invertazei (zaharazei)
Invertaza este o enzima ce catalizeaza reactia de hidroliza generala:
- D- fructofuranozid + H2 O

alcool

+ D- fructoza

In cazul particular :
invertaza
Zaharoza + H2 O

glucoza + fructoza

Substratul este zaharoza care este un diglucid, format dintr-o molecula de - Dglucopiranoza si - D- fructofuranoza legata la nivelul hidroxililor semiacetalici.
HO- H2C
O
HO-H2C

HO-H2C

O HO

invertaza
O
HO- H2C

H2 O

CH2 -OH
CH2- OH

glucoza

fructoza

Zaharoza
Invertaza hidrolizeaza legatura , - 1,2- glicozidica cu formare de - glucoza si fructoza, de la capetele nereducatoare ale resturilor de - D- fructofuranozide .Ea are
denumirea sistemica : -D-fructofuranozid fructohidrolaza si codul E.C.3.2.1.26. Invertaza
are mai multe denumiri printre care: zaharaza, - fructozidaza, - D- fructofuranozidaza.
Invertaza se gaseste la drojdii, la unele plante (usturoi, pere, frunze de vita de vie), la
anumite insecte (albine), la animale si la om. n corpul omului, invertaz se produce la nivelul
intestinului subire. Reacia de invertirea a zaharozei, proces fr de care nu poate avea loc
absorbia zahrului prin monoglucidele componente, se face cu consum de calciu, acesta fiind
motivul pentru care zahrul rafinat este decalcifiant. Omul i poate procura invertaz i din
exterior, mai ales din mierea natural.Secreia i activarea invertazei, este stimulat de
amilaz, de calciu i de fructoz i este inhibat de ctre glucoz. Insuficiena invertazei
secretate de intestinul uman, conduce la un grad mai mic sau mai mare de intoleran la
zaharoz, dar i la surmenaj sau astenie. De cele mai multe ori, invertaza intestinal este
"epuizat" din cauza consumului mare de produse care conin zahr rafinat. Deficitul de
invertaz se poate asocia cu o insuficien a amilazei. n funcie de gradul insuficienei,
simptomele merg de la o digestie greoaie pn la diaree acid, rebel cu scaune pufoase.
Aceasta enzima este utilizata in industria alimentara ca aditiv, sub simbolul E1103.

Principiul metodei
Invertaza hidrolizeaza zaharoza, transformand-o intr-un amestec echimolecular de
glucoza si fructoza numit zahar invertit.Monoglucidele eliberate reduc acidul 3,5dinitrosalicilic la acid 3- amino-5- nitrosalicilic, compus colorat ce se determina
spectrophotometric la = 546 nm.
Intensitatea coloratiei este proportionala cu cantitatea de glucide eliberate in urma
reactiei de hidroliza, deci si cu activitatea enzimatica.
COOH

COOH
OH

O2 N

OH

NO2

O2N

ac.3,5- dinitrosalicilic

NH2

ac. 3- amino-5- nitrosalicilic

Reactivi si solutii
1) Solutie tampon acid aceticacetat de sodiu, 0,02 M, pH = 4,5
2) Solutie zaharoza 0,25 M, preparata in tampon 1.
3) Solutie zahar invertit 0,0025 M
4) Acid 3,5- dinitrosalicilic
5) EPT (1g drojdie se mojareaza fin, se lasa la extras 1 h in 10 ml apa distilata, se
centrifugheaza, iar supernatantul reprezinta EPT; acesta se va dilua de 500 ori inaintea
utilizarii)
Mod de lucru
Amestecul de reactie consta din : 1ml solutie zaharoza, 1 ml preparat enzimatic, se
incubeaza 15 min la 370 C, se stopeaza reactia cu 2 ml DNS, se fierbe amestecul apoi 5 min,
se raceste, se aduce la volum final de 10 ml (adica se adauga peste amestec 6 ml apa distilata),
se lasa in repaus 30 min, dupa care se citeste extinctia la = 546 nm.
Concomitent cu proba se va face si un martor in care se vor adauga aceeasi reactivi si
in aceleasi cantitati cu deosebirea ca reactia enzimatica se stopeaza la timpul zero si nu mai
este necesara incubarea.
Construirea curbei etalon
Sol. zahar
invertit
0,0025M(ml)
Apa
distilata(ml)
DNS(ml)

E1

E2

E3

E4

E5

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,8

1,6

1,4

1,2

1,0

5 min fierbere
apa
distilata(ml)

E546 nm
C zahar invertit
(moli)

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Calcularea si interpretarea rezultatelor

Cu diferenta dintre densitatea optica a probei si cea a martorului se face apoi
interpolarea pe curba de etalonare, iar acea valoare a concentratiei citita (CX) de pe curba se
introduce in formula:
AE = Cx x 500 x 1/15 =[moli zahar invertit /ml/min]
AES =AE / Cp (moli zahar invertit/ mg proteina)