Sunteți pe pagina 1din 13

Caracterizarea nanoparticulelor de ZnO

in vederea evaluarii riscurilor asupra


mediului si calitatii vietii
A.Bragaru, M. Kusko, E. Vasile*, M. Simion, M. Danila, T. Ignat, I. Mihalache, R. Pascu, F. Craciunoiu
Diana Savu**
Laboratorul de Nanobiotehnologii, IMT Bucuresti, Romania
e-mail: adina.bragaru@imt.ro
* UPB Bucuresti
** IFIN-HH Magurele

A 12-a
A
12-a ediie
ediie aa Seminarului
SeminaruluiNaional
Naionaldede
Nanotiin
Nanotiin
i Nanotehnologie,
i Nanotehnologie,
Biblioteca
BibliotecaAcademiei
AcademieiRomne,
Romne,
Bucureti
Bucureti

16 mai 2013

FP7 Engineered Nanoparticles Risk Assesment (ENPRA) (2009-2012) (www.enpra.eu) :

Evaluarea riscului NPs presupune expunerea si identificarea pericolelor, hazardului !


Principalele componente ale evaluarii riscului:
- identificarea pericolului (hazardului) (hazard identification)
- evaluarea raspunsului in functie de doza (dose-response assesment)
- expunerea riscului (risk exposure)
- evaluarea si managementul riscului (risk and management assesment)

Primul pas: o analiza mai in detaliu pentru fiecare tip de NPs, in functie de aplicatia dorita

(Fubini et al.

Nanotoxicology 4, (2010) 347-363) :

- dimensiunea/forma (distributia de dimensiune);


- aria suprafetei;
- cristalinitatea;
- proprietatile electrice;
- compozitia chimica reactivitatea suprafetei, grupele functionale de la suprafata, gradul de stabilitate;
- solubilitatea si gradul de aglomerare;

Urmatorul pas: evaluarea riscurilor expunerii NPs prin efectuarea testelor de toxicologie in vitro
(S. Arora et al., Toxicology and Applied Pharacology 258 (2012) 151-165)

- studiu pulmonar, renal, hepatic, cardio-vascular, urmarindu-se:


- stresul oxidativ;
- genotoxicitatea;
- apoptoza;
- hemoliza;
- etc;
A 12-a
A
12-a ediie
ediie aa Seminarului
SeminaruluiNaional
Naionaldede
Nanotiin
Nanotiin
i Nanotehnologie,
i Nanotehnologie,
Biblioteca
BibliotecaAcademiei
AcademieiRomne,
Romne,
Bucureti
Bucureti

16 mai 2013

Studii privind evaluarea gradului de toxicitate al ZnO-NPs s-au efectuat pe diferite


dimensiuni, DAR exista inca probleme nerezolvate referitoare la influenta dimensiunilor mici
de NP (5-10 nm) asupra toxicitatii (Lin et al., J Nanopart Res 11 (2009)2539 )

Scopul acestui studiu de a caracteriza proprietatile fizico-chimice ale

ZnO-NPs cu dimensiuni < 10 nm, si de a studia gradul de stabilitate


al dispersiilor formate din aceste NPs, primele etape pentru
viitoarele studii de toxicologie (Jiang et al., J Nanopart Res 11 (2009)7789)

ZnO-NPs denumirea comerciala Zincox, de la Nanogate AG, companie partenera


in proiectul FP7 Project NanoSustain (2010-2013)

A 12-a
A
12-a ediie
ediie aa Seminarului
SeminaruluiNaional
Naionaldede
Nanotiin
Nanotiin
i Nanotehnologie,
i Nanotehnologie,
Biblioteca
BibliotecaAcademiei
AcademieiRomne,
Romne,
Bucureti
Bucureti

16 mai 2013

Caracterizarea nanoparticulelor
Caracterizare morfologica
Dimensiunea medie: 8.5-10 nm

Corelare buna a rezultatelor


masuratorilor :
- spectroscopie UV-Vis - 7.8 nm
-SEM - 8.5-10.0 nm
-TEM - 6-14 nm
- XRD - 8.6-9.5 nm
Determinarea proprietatilor optice - (a
spectroscopia UV-Vis
)

Determinarea structurii cristaline - XRD

100 g/mL ZnO aq. sol.


50 g/mL ZnO aq. sol.
25 g/mL ZnO aq. sol.

3.5

(002)

ZnO NP

(100)
(200)
(110)

I [counts]

cut-off ~ 396 nm

2.5

(101)

10

peak~ 365 nm

3.0

Absorbance (a.u.)

2.0
1.5

(103)

(201)

(210)
5

(004)

(203)

(202)

0.5

(211)

(114)
(212)
(105) (213)
(300)

(104)

(302) (205)
(220)
(006)

0.0
200

D Scherer eq=9.5 nm

(102)

10

1.0

DHW = 8.9nm
DWPPF = 8.6nm
WPPF = 0.16%

(112)

(214)

(204)

300

400

500

600

Wavelength (nm)

A 12-a ediie a Seminarului Naional de Nanotiin i Nanotehnologie,


A 12-a ediie a Seminarului Naional de Nanotiin i Nanotehnologie,
Biblioteca Academiei Romne, Bucureti
Biblioteca Academiei Romne, Bucureti

20

30

40

50

60

70

80

90

100 110 120 130 140 150


o

2 [ ]

16 mai 2013

Evaluarea gradului de stabilitate a dispersiilor de ZnO-NPs


Diametrul hidrodinamic (dh ) si potentialul zeta ( ) prima etapa in evaluarea efectelor asupra mediului si
sanatatii umane inaintea studiilor in vitro si in vivo (Murdock et al. 2008)

Dispersii apoase de ZnO-NPs


2000

Zeta potential (mV)

1800

Hydrodinamic diameter (nm)

25 g/ml
50 g/ml
100 g/ml

80

25 g/ml
50 g/ml
100 g/ml

1600

1400

1200

60

40
IEP=8.9
20

IEP=9.1
IEP=9.3

1000

-20
800

-40
7.0

7.5

8.0

8.5

9.0

9.5

10.0

10.5

11.0

7.0

pH

Cresterea concentratiei
Concentratie
(g/ml)
25
50
100

PDI
0.465
0.483
0.580

7.5

8.0

8.5

9.0

9.5

10.0

10.5

11.0

pH

Cresterea dh

+
pH 7-9, valori pozitive
Zn(OH )

pH 9.5-11.5, valori negative


Zn(OH )

pH IEP

Valorile max ale dh in apropierea IEP, unde apar aglomerari


A 12-a
A
12-a ediie
ediie aa Seminarului
SeminaruluiNaional
Naionaldede
Nanotiin
Nanotiin
i Nanotehnologie,
i Nanotehnologie,
Biblioteca
BibliotecaAcademiei
AcademieiRomne,
Romne,
Bucureti
Bucureti

si Zn(OH )24

dh - scade
- creste
cresterea [ZnO]

scade
16 mai 2013

Evaluarea efectului cresterii tariei ionice asupra stabilitatii dispersiilor


Influenta concentratiei si pH-ului asupra dh si in momentul cresterii tariei ionice (IS) (510-4, 10-3, 10-2 si 10-1 M NaCl)
40

-1
10 M
-2
10 M

1250

-3
10 M

1000

750

-5
10 M

500

-4
5x10 M

20

Zeta potential (mV)

Hydrodinamic diameter (nm)

30

1500

9.3

-5

10

pH

10

11

-4

-3

10 M

9.1

9.0

8.9

-2

8.8

10 M

8.7

-1

10 M

1 E -5

1E -4

1E -3

0 .0 1

0.1

Ion ic stre ng th (M )

-10
-20
-30
-40

12

10

11

12

pH

1800

35

Hydrodynamic diameter
Zeta potential

1600

30

Variata dh si cu IS la pH 8 si 50 g/ml ZnO-NPs

1400
25
1200
20
1000
15
800
10

600
400

Zeta potential (mV)

Hydrodinamic diameter (nm)

9.2

5x10 M

-50

IE P

10 M
Isoelectric point

1750

1E-5

1E-4

1E-3

0.01

0.1

Ionic strength
(M)
10-5
510-4
10-3
10-2
10-1

Hydrodinamic diameter
dh
PDI
Average
(nm)
error %
751.6
0.165
0.3
519.6
0.254
5.5
1239.3
0.320
1.8
1475.3
0.335
4.1
1638.4
0.450
2.5

Zeta
potential
(mV)
31.01
30.93
16.42
13.83
7.62

Ionic strength (M)

A 12-a
A
12-a ediie
ediie aa Seminarului
SeminaruluiNaional
Naionaldede
Nanotiin
Nanotiin
i Nanotehnologie,
i Nanotehnologie,
Biblioteca
BibliotecaAcademiei
AcademieiRomne,
Romne,
Bucureti
Bucureti

16 mai 2013

Investigarea morfologica privind efectul cresterii tariei ionice asupra stabilitatii


dispersiilor
Procesul de agregare intre ZnO-NPs dispersate in sol NaCl
10-3 M NaCl

10-1 M NaCl

Forma se schimba, ZnO-NPs forma poliedrica

A 12-a
A
12-a ediie
ediie aa Seminarului
SeminaruluiNaional
Naionaldede
Nanotiin
Nanotiin
i Nanotehnologie,
i Nanotehnologie,
Biblioteca
BibliotecaAcademiei
AcademieiRomne,
Romne,
Bucureti
Bucureti

16 mai 2013

Concluzii

Analiza rezultatelor privind ZnO-NPs sub forma de pulbere si dispersie diametrele


hidrodinamice masurate pentru fiecare concentratie preparata - sunt de 10 ori mai mari
decat cele ale pulberilor
Explicatia: formarea de specii instabile Zn(OH)2 si

Zn(OH )3

Zn(OH )4

Rezultatele indica influenta puternica pe care o exercita mediul de dispersie/taria


ionica asupra gradului de stabilitate al ZnO-NPs, analiza cat mai completa a acestora
putand asigura un control privind dozajul in timpul testelor de bio-toxicitate

A 12-a
A
12-a ediie
ediie aa Seminarului
SeminaruluiNaional
Naionaldede
Nanotiin
Nanotiin
i Nanotehnologie,
i Nanotehnologie,
Biblioteca
BibliotecaAcademiei
AcademieiRomne,
Romne,
Bucureti
Bucureti

16 mai 2013

Studii de toxicitate asupra efectelor biologice induse de ZnO-NPs


Prepararea probelor pentru experimentele in vitro: pulberea ZnO suspendata in ser fiziologic (2 mg/ml); sol stoc 30 min
dispersare in baie de apa cu ultrasunete si 15 min autoclavate la 121C; [ZnO] = 200-0.5 g/ml in MEM, MEM,DMEM cu 10 si
20% FCS
2 linii celulare: fibroblaste de soarece (L929) si celule melanoma de soarece (B16)
Medii de cultura: (i) L929 - MEM cu 2 mM Glutamina+20%FCS si MEM cu 2 mM Glutamina+10%FCS (ii) B16 - DMEM + 10%FCS.
In toate mediile de cultura folosite s-a adaugat streptomicina 100g/ml si penicilina 100 unitati/ml.

Testul MTS (determinarea viabilitatii celulare) si testul de supravietuire clonogenica

-pentru melanoma B16, curba dozaefect se situeaza in acelasi domeniu de


valori ca si L929, cu IC50 de 22.2 g/ml.
- in conditiile experimentale folosite in
acest studiu, nu putem trage o concluzie
relativa la sensibilitatea semnificativ
diferita a celulelor canceroase in
comparatie cu celulele normale atunci
cand sunt expuse la ZnO-NPs.

- modificari morfologice si inhibarea viabilitatii, relatie doza-efect de tip logaritmic;


- Concentratia medie letala (IC50 ) calculata pentru ZnO-NPs - 10.1 g/ml pentru L929 crescute in MEM cu 10%FCS si 30.2 g/ml pentru celulele
crescute in alphaMEM cu 20%FCS

Suplimentarea mediului de cultura cu un procent mai mare de ser fetal are un efect de protectie impotriva efectului citotoxic indus de nanoparticule.
A 12-a
A
12-a ediie
ediie aa Seminarului
SeminaruluiNaional
Naionaldede
Nanotiin
Nanotiin
i Nanotehnologie,
i Nanotehnologie,
Biblioteca
BibliotecaAcademiei
AcademieiRomne,
Romne,
Bucureti
Bucureti

16 mai 2013

Testul de supravietuire si proliferare colonogenica


- abilitatea unei singure celule de a se divide si a produce o colonie

Masurarea gradului de apoptoza indus de incubarea


celulelor cu nanoparticule
celulele L929 marcate si analizate prin microscopie de fluorescenta s-au
dovedit a fi viabile

Celulele incubate 24h


(37C, 5%CO2), inainte de
a fi expuse ZnP-NPs
pentru 20 h. Dupa
incubarea de 24 de ore,
mediul de cultura a fost
extras si inlocuit cu 200 l
sol ZnO-NPs diferite
concentratii; Drept control
s-a folosit celule incubate
doar in mediu de cultura,
fara nanoparticule

Efectul expunerii la ZnO-NPs asupra integritatii


reproductive (formare de colonii) a celulelor
L929; Punctele reprezinta numarul de colonii
gasite dupa 8 zile de expunere la ZnO

Pentru celulele L929 - deteriorare semnificativa a


integritatii reproductive a celulelor odata cu cresterea
dozei de ZnO-NPs dupa 8 zile

Doza de 6 g/ml - pierderea totala a capacitatii reproductive


a celulelor dupa 8 zile de incubare cu ZnO-NPs
A 12-a
A
12-a ediie
ediie aa Seminarului
SeminaruluiNaional
Naionaldede
Nanotiin
Nanotiin
i Nanotehnologie,
i Nanotehnologie,
Biblioteca
BibliotecaAcademiei
AcademieiRomne,
Romne,
Bucureti
Bucureti

Celule apoptotice L929 in MEM induse


dupa 20 de ore de incubare in prezenta
de ZnO-NPs

- in domeniul de doze < 10 g/ml nivelul de celule


apoptotice indus este neglijabil, apoptoza astfel pare sa nu
fie unul dintre mecanismele de inducere a toxicitatii
- Pentru concentratii mai mari de ZnO nu s-a mai putut pune in
evidenta apoptoza cu metoda folosita in experiment
16 mai 2013

Evaluarea genotoxicitatii induse de nanoparticulele de ZnO


- Genotoxicitatea indusa de ZnO-NPs asupra celulelor L929 a fost testata prin metodele cometei alcaline si formarea de micronuclei;
- ZnO-NPs nu induc o alterare semnificativa a ADN-ului prin cresterea nivelului de micronuclei formati, neexistand o dependenta a
numarului acestora de timp, in domeniul 0.5 20 g/ml;

Determinarea genotoxicitatii prin masurarea nivelului de micronuclei la celule L929 si B16


incubate 20h cu ZnO-NPs

In cazul testului cometei - rezultatele - un efect de inducere a deteriorarii


ADN-ului intr-o maniera dependenta atat de concentratia ZnO-NPs cat si
de timpul de incubare in prezenta acestora. Diferente semnificative apar
la 40 de ore de expunere

A 12-a
A
12-a ediie
ediie aa Seminarului
SeminaruluiNaional
Naionaldede
Nanotiin
Nanotiin
i Nanotehnologie,
i Nanotehnologie,
Biblioteca
BibliotecaAcademiei
AcademieiRomne,
Romne,
Bucureti
Bucureti

16 mai 2013

Concluzii
- toxicitatea nanoparticulelor studiate pare sa nu fie indusa prin apoptoza

- parametrul supravietuire clonogenica evidentiaza un efect puternic de scadere a capacitatii proliferative cu doza
de expunere

- Monitorizarea viabilitatii a doua tipuri de celule (L929 si B16) prin testul MTS indica un efect citotoxic
dependent atat de doza cat si de timpul de expunere la ZnO-NPs

Sunt necesare experimente suplimentare pentru o adaptare mai buna


a metodologiilor folosite in acest studiu la caracteristicile dispersiilor
de nanoparticule pentru care se urmareste raspunsul toxic

A 12-a
A
12-a ediie
ediie aa Seminarului
SeminaruluiNaional
Naionaldede
Nanotiin
Nanotiin
i Nanotehnologie,
i Nanotehnologie,
Biblioteca
BibliotecaAcademiei
AcademieiRomne,
Romne,
Bucureti
Bucureti

16 mai 2013

Va multumesc!
adina.bragaru@imt.ro
Acknowledgement
Aceste studii au fost realizate cu sprijinul proiectului finantat de Uniunea Europeana FP7/2001-2013
NanoSustain - Development of sustainable solutions for nanotechnology based products based on hazard
characterization and LCA

Multumiri Dr. Adrian Dinescu pentru caracterizarea SEM

A. Bragaru, M. Kusko, E. Vasile, M. Simion, M. Danila, T. Ignat ,I. Mihalache, R. Pascu, F. Craciunoiu, Analytical characterization of
engineered ZnO nanoparticles relevant for hazard assessment, J Nanopart Res (2013) 15:1352, DOI 10.1007/s11051-012-1352-0

A 12-a
A
12-a ediie
ediie aa Seminarului
SeminaruluiNaional
Naionaldede
Nanotiin
Nanotiin
i Nanotehnologie,
i Nanotehnologie,
Biblioteca
BibliotecaAcademiei
AcademieiRomne,
Romne,
Bucureti
Bucureti

16 mai 2013