RESUMEN

Para realizar este mtodo se tiene que hacer una curva de calibracin con
disoluciones de concentracin conocida utilizando una solucin estndar de
glucosa para determinar las absorbancias y hacer una modelo para poder seguir e
interpolar las absorbancias de las muestras y conocer las concentraciones, para
preparar las muestras tomamos una solucin de muestra se le aadi cido
sulfrico y fenol que ayudan a formar complejos con las protenas, despus se
tom la medida de la absorbancia de las muestras y se determin la concentracin
de las protenas en las muestras problema.
INTRODUCCION
El anlisis de azcares es muy importante en tecnologa de alimentos por diversos
motivos. Para llevarlo a cabo existe una gran variedad de mtodos, basados en
distintos principios. Cuando se quiere determinar el contenido en azcares
reductores o en azcares totales, el empleo de los mtodos qumicos basados en
la reduccin del cobre es una opcin muy adecuada. A su vez, este tipo de
metodologa incluye una gran variedad de mtodos, entre los que cabe destacar el
mtodo de Fenol-sulfrico. En este objeto de aprendizaje se va a explicar la forma
de llevar a cabo los clculos para determinar el contenido en azcares totales de
una muestra, que ha sido analizada por el mtodo fenol-sulfrico.
Los carbohidratos se logran destruir por calor y por adicin de cido y son
particularmente sensibles a cidos fuertes y altas temperaturas. Bajo estas
condiciones una serie de reacciones complejas toman lugar empezando con una
deshidratacin simples, si se contina el calentamiento y la catlisis cida se
producen varios derivados del furano que condensan consigo mismos y con otros
subproductos para producir compuestos obscuros o compuestos coloridos
producto de la condensacin de compuestos fenlicos y con heterociclos con el
nitrgeno como heterotomo. La condensacin ms comn es con fenol y es un
mtodo fcil, eficaz y rpido.
Todos los azcares como oligosacridos y polisacridos pueden ser determinados,
recordando que estos bajo hidrlisis cida producen monosacridos. La forma en
que procede la reaccin no es estequiomtrica y depende de la estructura del
azcar, por lo tanto se realiza una curva patrn.
La intensidad del color naranja es proporcional a la cantidad total de carbohidratos
presentes. Esta absorbancia puede ser medida a 492nm y la concentracin total
de carbohidratos de las soluciones problema puede ser medida con respecto a
una curva estndar preparada.

1. Fundamento de la tcnica utilizada para determinar azucares

totales.
Se fundamenta en que los carbohidratos son particularmente sensibles a cidos
fuertes y altas temperaturas. Bajo estas condiciones una serie de reacciones

complejas toman lugar empezando con una deshidratacin simple, si se contina

el calentamiento y la catlisis cida se producen varios derivados del furano que
condensan consigo mismos y con otros subproductos para producir compuestos
coloridos producto de la condensacin de compuestos fenlicos y con heterociclos
con el nitrgeno como heterotomo. La condensacin ms comn es con fenol.
Este mtodo es fcil, eficaz y rpido. Todos los azcares como oligosacridos y
polisacridos pueden ser determinados, recordando que stos bajo hidrlisis cida
producen monosacridos.

2. las posibles interferencias de otros compuestos en la

cuantificacin de azucares.
Entre otros compuestos que pueden interferir en la cuantificacin de azucares
estn las protenas en altas cantidades de concentracin as como la influencia de
la luz, el aire y ciertos compuestos de metales como cobre y hierro.

3. Las medidas de precaucin que deben tenerse al trabajar con

fenol y cido sulfrico
FENOL.- Los riesgos principales que albergan los fenoles es que son txicos y
corrosivos por lo que pueden provocar quemaduras y afectar al SNC y es por eso
que se debe hacer uso de mascarillas, lentes y guantes de Viton, Butilo y/o
Neopreno (no se recomiendan de Goma Natural, Nitrilo, PVC o de PVA) as como
el equipo cotidiano en el laboratorio como bata, pantaln de mezclilla y zapato
cerrado. Entre los riesgos secundarios de este compuesto estn que es inflamable
por lo que se debe contar con extintores de polvo qumico seco; y reacciona
levemente produciendo CO y CO2. El rea de trabajo con fenoles debe ser
ventilada o en campanas de laboratorio con extraccin forzada.
En caso de inhalacin trasladar a la persona donde exista aire fresco, s hay paro
respiratorio emplear la reanimacin cardiopulmonar y suministrar oxgeno.
En caso de contacto con la piel u ojos se debe lavar el rea rpidamente con
abundante Agua mnimo durante 20 minutos.
En caso de ingesta se debe inducir al vmito, lavar la boca y dar a beber
abundante agua as como aplicar el antdoto contra Fenol.
CIDO SULFRICO.- Los riesgos principales que alberga el cido sulfrico es
que es muy fuerte y corrosivo adems que produce cidos voltiles y es
deshidratante por lo que se debe hacer uso del equipo descrito en los fenoles.
Entre los riesgos secundarios estn que reacciona con todos los metales
produciendo SO2 e hidrogeno gaseoso (altamente explosivo y txico), adems al
ser un oxidante fuerte reacciona violentamente con materiales reductores y bases.
Tambin se sabe que no es inflamable pero al entrar en reaccin con compuestos
de este tipo es capaz de generar calor e iniciar la ignicin.
En caso de ingesta, parte del cido naturalmente se exhala a manera de amoniaco
y parte se neutraliza minimizando el riesgo en el organismo. El cido restante se
1

disocia y pasa al torrente sanguneo en forma de ion Sulfato y finalmente se

elimina por orina y sudor. Para ayudar a minimizar el riesgo se debe dar a beber
agua o leche en cantidad de 2 vasos para diluir los contenidos estomacales y no
se debe inducir al vmito.
En caso de contacto con piel u ojos reaccionar de la misma manera que con los
fenoles con la excepcin de que se debe aplicar bastante jabn y no mucha agua.
Al mezclar este cido con agua se debe tener precaucin ya que genera una gran
cantidad de calor. Se recomienda agregar el cido al agua y no viceversa. Y el
agua no debe estar caliente.

4. Se calculo la cantidad de residuos peligrosos que se generaron

con esta tcnica para cuantificar azcares totales. Propone un
procedimiento para manejar estos residuos.
Para calcular la cantidad de residuos peligrosos generados con esta tcnica se
puede hacer una diferencia de lo que tenemos al principio menos el resultado
dado del espectrofotmetro.
Para el manejo de estos residuos se debe tomar en cuenta el material del bidn en
el cual se van a almacenar, es decir, que el material con el que este hecho no
reaccione con los residuos adems que hay que tener una temperatura estable as
como la gradiente de luz
Por ejemplo, el Fenol se debe almacenar en recipientes galvanizados, acero
inoxidable, y plstico, estos recipientes deben ser cerrados, grandes cantidades
de fenol deben almacenarse en tanques o bidones de acero inoxidables o de
acero inoxidable revestido de nquel, o una aleacin de nquel apropiada, no debe
utilizarse cobre, los envases de vidrio solo son adecuados para el manejo de
pequeas cantidades en el laboratorio.
El fenol no debe almacenarse junto a cloratos, nitratos u otros materiales
oxidantes y fuera del alcance de cualquier fuente de ignicin. Los bidones deben
estar ubicados en lugares de fcil acceso a todas las partes y con buena
ventilacin.
Durante su almacenamiento el fenol adquiere un color amarillo, rosado o pardo,
ocasionada por la accin del agua, la luz, el aire y los catalizadores como vestigios
de hierro o cobre.
OBJETIVO
Ensayar la cuantificacin de carbohidratos totales por el mtodo Fenol-cido
sulfrico para la aplicacin en diversas muestras de inters en el estudio de
alimentos.
REQUERIMENTOS
Material

Reactivos
2

20 tubos de ensaye 16 x50 mm con

tapa.
10 Microtubos de 1.5 mL
1 Gradilla
1 Pipeta graduada de 10 mL
1 Pipeta graduada de 5 mL.
1 Pipeta automtica de 1000l.
1 Pipeta automtica de 200 l.
10 Puntas de 1000l.
10 Puntas de 200 l
1 Celda de vidrio de 3.5 mL
1 Bao con hielo.
1 Cronmetro.
1 Par de guantes de ltex
1 Lentes protectores

10 mL de fenol al 5%
40 mL de H2SO4 concentrado.
1 mL Sulfato de zinc 10%
1 mL NaOH 0.5N
Equipo
Espectrofotmetro 490 nm.
Centrifuga para microtubos 10,000 rpm
Vrtex
Muestra
1mL Solucin de sacarosa 1%
1mL Solucin de almidn 1%
5 mL de medio de cultivo con sacarosa

CLCULOS
Preparacin de la Curva Estndar de Glucosa
Conc. De glucosa Sol. Estndar de
Agua
g/mL
Glucosa (100 g/mL)
(mL)
0
0
1.0
10
0.1
0.9
20
0.2
0.8
40
0.4
0.6
60
0.6
0.4
80
0.8
0.2
100
1.0
0.0
Cuadro 1 Cantidades a mezclar de agua con solucin estndar de Glucosa
para obtener las concentraciones de 0, 10, 20, 40, 60, 80 y 100 g/mL.
Dilucin para Sacarosa 1% y Almidn 1%
Como se tiene que realizar una dilucin de 1,000 veces, entonces se toma una
relacin de 1,000 (ya sean L, mL, etc.). En este caso se tom un factor de
100x100 por lo que se tiene una razn de 1:99 de muestra y agua
respectivamente, pero ests muestras son muy pequeas para las micropipetas
por lo que se toma un factor de dilucin de 20 dando una razn ms conveniente
de 20:1980 con los mismos reactivos.
Dilucin para El Medio Cultivo con Sacarosa
Dado que la dilucin en este caso es de 10,000 veces simplemente se realiza el
mismo paso anterior por duplicado. Es decir, ya que se tenga la nueva muestra
con 20:1980 se toma otra nueva muestra de 20 y se le aaden 1980 de agua.

Cabe mencionar que se puede tomar cualquier razn para las mezclas
dependiendo de la capacidad de la micropipeta con la que se cuente en el
laboratorio o de la cantidad de las sustancias.
PROCEDIMIENTO
Se preparara las mezclas como muestra el con el fin de obtener las
concentraciones de Glucosa (g/mL) de 0, 10, 20, 40, 60, 80 y 100. Estas se
enumeraron del 1 al 7.
Despus, se toma 1 mL de cada una de las mezclas, se les aadi 500 L de
Fenol 5% y 2,500 L de cido sulfrico concentrado a cada una y se mantuvo en
reposo durante 10 minutos.
Posteriormente, se agita cada una de las muestras y se ponen en agua fra (25 a
30 C) durante 15 minutos.
Para finalizar, teniendo las muestras listas, se lee la absorbancia de cada una de
las muestra en el espectrofotmetro a 490nm.
Se realiza la desproteinizacin de la muestra de Medio de Cultivo con Sacarosa.
Esto se llev a cabo tomando 500 L de la muestra, ponindola en un tubo,
aadiendo 250 L de Sulfato de Zinc al 10% y 250 L de NaOH 0.5N y dejando
reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Despus, se centrifuga la muestra de Medio de Cultivo con Sacarosa a 10,000
rpm durante 5 minutos y el sobrenadante resultante se transfiri a otro tubo de
centrfuga.
Posteriormente, se realizaron las diluciones necesarias de cada una de las
muestras y para determinar los azucares totales se les aadi 500 L de Fenol 5%
y 2,500 L de cido sulfrico concentrado a cada una de las muestras y se
mantiene en reposo durante 10 minutos a todas.
Para continuar, se agit cada una de las muestras y se pusieron en agua fra (25 a
30 C) durante 15 minutos. Teniendo las muestras listas, se lee la absorbancia de
cada una de las muestra en el espectrofotmetro a 490nm.
Lo que se va estudiar es la cantidad de azucares totales en un cultivo utilizando
una curva de calibracin con estndares de concentracin conocida utilizando el
mtodo de regresin lineal simple y correlacin para modelar una ecuacin que
describa la relacin entre la absorbancia y la concentracin de azucares totales
dada los siguientes datos de la curva de calibracin.
4

Concentracin
de glucosa
[g/mL]
X
1.5
1.2
0.9
0.6
0.3
0.0

Volumen
final mL

Fenol 5%
mL

H2SO4
mL

Absorbancia
490 nm
Y

1
1
1
1
1
1

0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5

2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5

0.43
0.361
0.272
0.158
0.086
0

Realizar la regresin lineal para obtener la ecuacin de la recta que nos ayude a
describir la relacin entre la absorbancia y la concentracin de glucosa [g/mL].
Se utiliza esta relacin basado en que la glucosa absorbe a esta longitud de onda
y entre mayor absorbancia tenemos mayor concentracin.
Resultados a obtener
Muestra
problema
Sacarosa
Almidn
Medio de Cultivo
Muestra

Absorbancia
490 nm
0.306
0.810
0.724
0.074

Concentracin de
glucosa g/mL
X
X
X
X

Referencias

Robert K. 1988. Harper Bioqumica Ilustrada. Editorial: El manual moderno. Mxico

Df.

Dubois, M.; Gilles A.; Hamilton, J.; Rebers, P. y Smith, F. 1956. Colorimetric
method for determination of sugars and related substances. Analitycal chemistry
28(3): 350-356.

Nielsen, S. 1998. Food Analysis. Kluwer Academic Publications

http://acasti.webs.ull.es/docencia/practicas/5.pdf