Procedee chimice, microbiologice

i toxicologice
g avansate
de control i analiz
S.l.dr.ing.
S
l dr ing Iulia Bleoanca
Iulia.Bleoanca@ugal.ro

fghfjhfjh

METODE MICROBIOLOGICE CLASICE VS. METODE RAPIDE

I AUTOMATIZATE.
METODE RAPIDE DE IZOLARE A MICROORGANISMELOR

IZOLAREA MICROORGANISMELOR N CULTURI

Tehnicile de izolare presupun o serie de operatii:
prelevare probe biologice din medii naturale
inoculare in medii de cultura specifice
cultivare in conditii optime
studiul coloniilor izolate
repicare pentru obtinerea culturilor pure

Culturi pure de microorganisme

y
y
y

Cultur: populaie de microorganisme

cultivat n condiii predefinite
Cultur pur cultur alctuit dintr-un
singur tip de
d microorganism
Cultur mixt cultur format din mai
mult
lt de
d un singur
i
ti
tip de
d microorganism
i
i
I l
Izolare
a microorganismelor
i
i
l
din culturi mixte

Cultur mixt

Cultur pur

Cultur mixt

Cultura pura:

Biomasa de celule rezultata prin reproducerea unei singure celule

aflata ntr-un mediu nutritiv steril cu volum limitat.
O cultura pura contine celule apartinand unei singure specii,
respectiv unei singure tulpini.
M
t d clasice:
l i
Metode

I. Metode bazate pe separarea fizico-chimica a celulelor

II. Metode biologice

I. Procedee fizice de izolare

1. Metode prin raspandire
a. Metoda Koch specifica izolarii drojdiilor

Recoltarea microorganismelor din medii

naturale
Fixarea distantat a celulelor, prin
raspandire, in mediu nutritiv

Obtinerea coloniilor izolate

multiplicarea celulelor

prin

a. Metoda Koch specifica izolarii drojdiilor

b. Metode scarificate

Tehnica striurilor

c. Metoda Drigalski
Metoda de raspandire
in placi

2. Metode de diluare

tehnica dilutiilor decimale

a.

Metoda Lindner
Izolarea drojdiilor
Metoda precisa

Sub control microscopic

Se realizeaza dilutii corespunzatoare

Se plaseaz 9 picaturi pe o lamela sterila care se plaseaz cu picaturile in jos
pe o lama cu excavatie

Se identific pictura care conine o singura celula

Se absoarbe cu o hartie de filtru steril i se introduce ntr-o eprubeta cu
mediu steril; termostatare; cultura pura

a.

Metoda Naumov
Izolarea culturilor pure de mucegai

M d specific;
Metoda
ifi

SSe recolteaz
l
o cantitate
i
redusa
d
d substrat
de
b
bi l i se realizeaza
biologic;
li
dil ii
dilutii
corespunzatoare

Se plaseaz picaturi pe capacul interior al unei placi Petri; se adauga

mediu fluidificat si temperat; se termostateaz;

Se identific pictura de mediu care conine colonia dorit

II. Metode biologice

a. Metoda Burri
Se separa microorganismele
S
i
i
l n ffuncie
i d
de necesarull de
d oxigen
i
Se inoculeaz microorganismele n mediu cu agar
(fluidificat i temperat)
p si se solidific n ppoziie
vertical
Mediul se transfer n tub drept
Medii recomandate:
9
carne-ficat agar
9Tripticaz- glucoz-extract de drojdie
Citirea rezultatelor
MO aerobe la suprafata mediului drept
MO facultativ aerobe pe toat nalimea tubului
MO microaerofile- pe ultima 1/3 din nalimea tubului
MO strict anaerobe pe 2/3 din inaltimea tubului

b. Folosirea mediilor selective

Substane cu efect antifungic: (actidiona,

nistatin), sau antibacterian ( polimixin,
penicilin)

Favorizeaza dezvoltarea unui grup restrans

de microorganisme ce apartin
aceleeasi specii

Ex. pentru izolarea

sterptomicetelor: medii cu amidon
i glicerol (sursa de carbon) i
arginin sau azotati (sursa de azot)

Se pot utiliza o serie de substante

chimice cu efect inhibitor fat de
g
celelalte microorganisme

Mediii de cultur
Medi
cultur selective
selective

Staphylococcus aureus

Mediii de cultur
Medi
cultur selective
selective
AquaCHROM ECC

Prezenta/Absenta E.coli si coliformilor in

probe de 100mL apa

Mediii de cultur
Medi
cultur pentru diferentierea tulpinilor
ChromAgar
g

Mediii de cultur
Medi
cultur selective
selective si diferentiale

EMB - Eosin methylene blue agar

Coloranti- eozina si albastru de metil, ce inhiba dezvoltarea
bacteriilor G(+)
La tulpinile care pot fermenta lactoza se observ o
modificare a culorii coloniilor
y

Verificarea purittii culturilor izolate

Studiul caracterelor macroscopice
Studiul caracterelor microscopice
Probleme la aplicarea tehnicii striurilor

Neomogenizarea
Neo oge a ea ep
eprubetei
ubete cu bbiomasa
o asa inainte
a te de recoltare
eco ta e nuu este
prelevata biomasa
Utilizarea ansei neracite la prelevarea biomasei sunt omorate
microorganismele
i
i l
Nesterilizarea ansei intre etapele de efectuare a striilor nu se vor forma
colonii
Efectuarea unui numar mic de striuri nu se vor forma colonii

Probleme de izolare manual

Contaminarea placii prin scoaterea completa a capacului, apropierea fetei

d placa
de
l pentru a vedea
d cum au fost
f realizate
l striurilel
Imposibilitatea recoltarii corecte a biomasei cauzata de distanta insuficienta intre
colonii contaminarea culturii

Tehnica de recoltare deficitara din partea operatorului contaminarea

culturii

Expunerea biomasei la mediul inconjurator contaminarea culturii

Prelevator de colonii Colony Pickier

PM--1s
PM
1 (Microtec
((M
M
Microtec)
)
y
y
y
y
y

y
y
y

Sistem de banc compact

Si t
Sistem
complet
l t automatizat
t
ti t de
d
prelevare a coloniilor
Sistem automat de schimbare a acului
(ANCS)
Camera de inalta rezolutie (6 milioane
de pixeli)
Sistem automat de trasabilitate pentru
colonii (transfer in format Excel)
Transfer automat de colonii lipsit de
contaminare
Imbunatateste eficienta in laborator
Reduce cheltuielile de munca pentru
sarcini de rutina si stress-ul de efectuare a
unei munci repetitive

Setari in programul de prelevare a

coloniilor
l l
y
y
y
y

y
y

Numar de godeuri
utilizate (96, 384)
Numar de oscilatii ale
acului
Conditii de prelevare
Stabilirea pozitiei de
start si a godeurilor
cu probe
b oarbe
b
(blank wells)
Parametrii de
sterilizare a acului
Adancimea de
patrundere a acului

Sistem de schimbare automata a acului

ANCS
y

Sterilizare:
- periere
- clatire
l i cu etanoll
- incalzire la 400C

Sistemul Pickolo de prelevare

automata a coloniilor

1. Colony pickers - QPix colony picking

1
http://www.youtube.com/watch?v=iK65vJyvmJc
2. Robot Bacteria Colony Picking
http://www.youtube.com/watch?v=WJ-qVBjVDB8
3 Colony Picking Robot
3.
http://www.youtube.com/watch?v=udx6eQKdJHk&feature=related
4. SciRobotics Pickolo: Colony-picker for Tecan robots by Robiotec Ltd.
http://www.youtube.com/watch?v=oI5ws2xP6ig&feature=related

Identificarea coloniilor de prelevat

y

Se ia in considerare:
-forma coloniilor,
- marimea coloniilor
- distanta dintre colonii

Sistemul Pickolo de prelevare automata a

coloniilor
l l - Analiza imaginii

Tehnici indirecte de evaluare a numarului de microorganisme

Metoda culturala Koch

Numararea cu citometre

Metode directe de numarare a bacteriilor

Metoda Breed

Se calculeaza :

Diluare/numarare prin intermediul inoculatorului spiral

y

Inoculator Spiral (Interscience)

Diluare clasica vs. diluare automata

Sablon pentru numararea coloniilor

Numararea microorganismelor cu inoculatorul spiral

Aplicati regula lui 20.
y Numarati coloniile din sectoare situate diametral
opus pentru a minimiza erorile de numarare.
y Calculati numarul de microorganisme cu formula:
y

N = (C1 + C 2) : V