Sunteți pe pagina 1din 73

Curs 3

Spectroscopia de fluorescenta

Introducere in fluorescenta
Luminiscenta este emisia de radiatie luminoasa, care apare in urma revenirii moleculelor de pe
nivele electronice excitate in starea fundamanetala.
In functir de natura starii excitate luminicenta se clasifica in:
1. Fluorescenta
2. Fosforescenta
3. Chemiluminiscenta - excitatia este cauzata de reactii chimice
In starile excitate de singlet, electronul din orbitalul excitat este in pereche (in opozitie de spin)
cu al doilea electron din orbitalul fundamental. In consecinta, revenirea la starea fundamentala
este permisa de regulile de spin si se produce rapid prin emisia unui foton. Rata de emisie a
fluorescenta este tipic 108 s-1, astfel incat timpul de viata al fluorescentei este de 10 ns (10 x 10 -9
s).
Fosforescenta este emisia de lumina din starea de triplet excitat, in care electronul din orbitalul
excitat are aceeasi orientare de spin ca si electronul din starea fundamentala. Tranzitiile catre
nivelul fundamental sunt interzise si rata de emisie este lenta (10 3 la 10 s-1), astfel incat timpul de
viata al fosforescentei este de msec la sec.

Spectre de fluorescenta
Procesele care se produc intre absorbtia si emisia luminii sunt
ilustrare de diagrama Jablonski simplificata.
Nivelele electronice singlet fundamental, primul si al doilea singlet
sunt reprezentate in diagrama Jablonski. Pentru fiecare dintre aceste
nivele electronice poate exista un numar de nivele energetice
vibrationale.
Din aceasta diagrama sunt eliminate pentru inceput, procese de
tipul:
a. stingerea fluorescentei;
b. transferul energetic;
c. interactiile cu solventul.
Tranzitiile intre stari sunt reprezentate prin linii verticale, pentru a
ilustra natura instantanee a absorbtiei luminii.
Tranzitiile se produc intr-un timp de aprox. 10-15 sec, un timp prea
scurt pentru o deplasare semnificativa a nucleelor. Acesta este
principiul Frank-Condon.

Spectre de fluorescenta
Spectrele de emisie sunt foarte variabile functie de:
A. Structura chimica a fluoroforului
B. Solventul in care este dizolvat.
Diagrama Jablonski simplificata

Spectre de fluorescenta
La temperatura camerei, energia termica nu este adecvata pentru a
popula semnificativ starile excitate vibrationale. Absorbtia si emisia se
produc cel mai adesea pentru molecule cu energie vibrationala mica.
Cea mai mare diferenta energetica intre starile excitate S0 si S1 este
prea mare pentru popularea S1 datorita energiei termice. Din acest
motiv, se utilizeaza lumina si caldura pentru a induce fluorescenta.
Dupa absorbtia luminii, se produc mai multe procese:
i. Un flourofor este de obicei excitat la un nivel vibrational fie din S1 fie
din S2.
ii. Doar in cazuri foarte rare, moleculele in faze condensate se
relaxeaza rapid la nivelul vibrational cel mai mic S1. Acest proces se
numeste conversie interna si se produce de obicei in 10-12 sec sau
mai putin. Avand in vedere ca timpul de viata al fluorescentei este in
jurul valorii de 10-8 sec, conversia interna este deja terminata cand
incepe emisia.
iii. emisia fluorescenta rezulta in general din echilibrarea termica a
starilor excitate.

Procese:
absorbtie
conversie interna (IC)
fluorescenta
intersystem crossing (ISC)
fosforescenta
fluorescenta intarziata
tranzitie triplettriplet
relaxare vibrationala

Timpi caracteristici:
absorptie: 10-15 s
Relaxare vibrationala: 10-12-10-10 s
intersystem crossing: 10-10-10-8 s
internal conversion: 10-11-10-9 s
Timpul de viata al starii excitate: 10 -10-10-7 s
(fluorescenta)
Timpul de viata al starii excitate :10 -6 s
(fosforescenta)

Fluorescenta - emisia unui foton in timpul relaxarii de la S1 la S0.


Deoarece cu foarte putine exceptii (emisia de fluorescenta pentru azulena are loc de
pe S2, iar pentru indol are loc simultan de pe S1 si S2) emisia de fluorescenta apare
de pe S1 pe S0, ea nu depinde de lungimea de unda absorbita (presupunand ca o
singura specie exista in stare fundamentala)

Tranzitia 0-0 este de obicei aceeasi pentru absorbtie si pentru fluorescenta.

Spectrul de fluorescenta este localizat la lungimi de unda mai mari (numere de


unda mai mici) decat spectrul de absorbtie (legea Stokes).

Uneori spectrul de absorbtie se suprapune partial peste spectrul de fluorescenta (la


temperatura camerei un numar mic de molecule se pot afla pe un nivel vibrational
mai mare dect cel fundamental.

La temperatura joasa aceasta suprapunere dispare.

Deplasarea Stokes

Deplasarea Stokes (exprimata in numere de unda)


= diferenta dintre pozitia maximului de absorbtie si
pozitia maximul de fluorescenta.
= a - f
Daca momentul de dipol a unei molecule
fluorescente este mai mare in starea excitata decat
in starea fundamentala, deplasarea Stokes creste
odata cu polaritatea solventului.
Detectia speciilor fluorescente este mai usoara
daca deplasarea Stokes este mai mare.
Lungimea radiatiei emise este mai mare deoarece
energia este mai mica E = h c/l

Conversia interna reprezinta tranzitie neradiativa intre doua stari electronice de


aceeasi multiplicitate.

Acest proces este urmat de o relaxare vibrationala neradiativa catre cel mai de jos
nivel vibrational al starii electronice excitate. Excesul de energie vibrationala poate
fi transferat solventului in timpul ciocnirii moleculelor excitate cu moleculele
solventului din jur.

Cand o molecula este excitata pe un nivel de energie mai mare decat cel mai jos
nivel al starii electronice excitate, relaxarea vibrationala (conversie interna daca
nivelul de singlet excitat este mai mare decat S1) determina molecula excitata sa
ajunga la nivelul vibrational cu v = 0 al starii de singlet S1 ntr-un timp de ordinul
10-13-10-11 s.

Este posibila si conversia interna de la S1 la S0, doar ca este mai putin eficienta
decat conversia de la S2 la S1 datorita diferentei de energie mult mai mare intre S1
si S0. De la S1 la S0 pot sa apara tranzitii neradiative.

Fluorescenta steady-state - spectroscopia de fluorescenta

iluminare constanta a probei si inregistrarea


spectrelor de emisie sau de excitare

spectrele prezinta dependenta intensitatii


functie de lungimea de unda

forma si intensitatea spectrelor ne ofera


informatii despre starea probei studiata

In functie de mediul in care se afla un fluorofor


isi poate modifica spectrul de emisie
(creste/scade in intensitate, isi modifica pozitia
maximului)

Factori ce influenteaza fluorescenta


A. Randamentul cuantic (Quantum Yield)
Cu cat randamentul cuantic este mai mare, cu atat este mai usor de
observat un compus fluorescent (in special o sonda fluorescenta).
Randamentul de fluorescenta este raportul dintre numarul de fotoni emisi
(pe parcursul intregului timp de radiatie) si numarul de fotoni absorbiti.
B. Structura:
Aromatica
Atomii grei decresc fluorescenta
Structurile rigide se manifesta mai puternic
Fluorescenta creste cand moleculele adera la suprafata
C. Temperatura si efectul de solvent
Fluorescenta creste odata cu scaderea temperaturii
Solventii ce contin atomi grei descresc fluorescenta dar cresc
fosforescenta

Instrumente de masura

Instrumente de masura

Instrumente de masura- surse de lumina

Instrumente de masura- surse de lumina

Instrumente de masura- rezolutia de culegere a spectrului

Instrumente de masura- format L si format T

Format L

Instrumente de masura- format L si format T

Format T

Stingerea fluorescentei

Stingerea fluorescentei - aplicatii


F0/F=1+kSV[Q] ecuatia Stern-Volmer

Quenching of Trp emission by H2O2


DMPC 40 M, [indolicidin]/[DMPC]: 1/200

indolicidin in PBS
indolicidin in liposomes

3.0

Stern Volmer equation:


I0 / I

I0/I = 1+KSVx[Q]

2.5

2.0

KSV

1.5

PBS
0.014 mM-1
Liposomes 0.007 mM-1

1.0
0

50

100

[H2O2] / mM

150

200

Anizotropia fluorescentei. Polarizarea fluorescentei

Anizotropia fluorescentei

Anizotropia fluorescentei

r = (I I ) / (I + 2I )

Anisotropy of DPH emission


0.38

DMPC
DPPC
Amestec

0.36
0.34
0.32

0.30
0.28
0.26
0.24
0.22
0.20
0.18
0

10

20

30

40

Lipid

T tranzitie (
o
C)

DMPC

22.5

DPPC

39.6

50

60

70

Anisotropy of DPH emission

0.38

Tt

DMPC
DMPC+10% Cholesterol
DMPC+25% Cholesterol

0.36
0.34

Anisotropy

0.32
0.30
0.28
0.26
0.24
0.22
0.20

Lipid

T ( oC
)

DMPC

22.5

DMPC+10%
Chol

29

0.18
0

10

20

30

40
o

Temperature / C

50

Anisotropy of DPH emission

0.38

Tt

0.36

DPP C
DPP C+10% Cholesterol
DPP C+25% Cholesterol

0.34

Anizotropy

0.32
0.30
0.28
0.26
0.24
0.22

Lipid

T ( oC
)

DPPC

39.7

DPPC+10%
Chol

39.1

0.20
20

30

40

50
o

Temperature / C

60

70

Fluorescenta aminoacizilor aromatici

Dependenta spectrelor de fluorescenta de pH

Dependenta spectrelor de fluorescenta de solvent

Changes in Trp emission spectrum in presence of liposomes:


DMPC 40 M, [indolicidin]/[DMPC]: 1/200

700000

337 nm

Indolicidin in liposomes
Indolicidin in PBS

Fluorescence intensity / CPS

600000

500000

343 nm

400000

300000

200000

100000

0
300

320

340

360

/ nm

380

400

FRET fluorescence resonance energy transfer


dD-A < ~10nm

FRET fluorescence resonance energy transfer

FRET fluorescence resonance energy transfer

FRET fluorescence resonance energy transfer

FRET fluorescence resonance energy transfer

FRET eficienta FRET E = 1-I/I0

FRET donor: triptofan; acceptor TMA-DPH

Intensitatea fluorescentei / unitati relative

FRET donor: triptofan (gramicidina); acceptor TMA-DPH

fara TMA-DPH
0.083 M TMA-DPH
0.17 M TMA-DPH
0.25 M TMA-DPH
0.33 M TMA-DPH
0.42 M TMA-DPH

200000

150000

100000

50000

0
300

350

400

/ nm

450

500

FRET donor: triptofan (gramicidina); acceptor TMA-DPH

FRET donor: triptofan (OmpF); acceptor TMA-DPH

FRET donor: triptofan (OmpF); acceptor TMA-DPH

Energy transfer between Trp and DPH


DMPC 40 M, [indolicidin]/[DMPC]: 1/200
1000000

800000

Donor

700000

Energy transfer

600000
500000
400000

Accepto
r

300000
200000

80
70

60

350

400

450

500

/ nm

300

I
E 1
I0

0.3 M indolicidin + DMPC

100000

FRET efciency

Fluorescence intensity / CP S

900000

DMPC
DMPC+1.27 M DPH-HPC
DMPC+1.7 M DPH-HPC
DMPC+3.4 M DPH-HPC
0.2 M indolicidin

50
40
30
20
10
0
-10
-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

[acceptor]

2.0

2.5

3.0

3.5

Time- resolved spectroscopy

Spectroscopia rezolvata in timp (time-resolved spectroscopy)


studiul proceselor dinamice in materiale si compusi chimici prin
intermediul tehnicilor de spectroscopie. Cel
mai adesea,
procesele studiate se produc in urma iluminarii unui material, dar
in principiu tehnica poate fi aplicata oricarui proces care conduce
la o modificare a proprietatilor unui material. Cu ajutorul laserilor
in pulsuri, este posibil sa studiem procesele care se produc intr-o
scala de timp mai mica de 109 sec.

Fluorescenta time-resolved

masoara scaderi (decays) ale intensitatii


fluorescentei sau ale anizotropiei functie de timp;

proba este expusa la pulsuri de lumina, durata


fiecarui puls fiind mai mica decat timpul de scadere al
probei;

scaderea intensitatii e inregistrata cu ajutorul unui


sistem de detectare de mare viteza care permite
inregistrarea intensitatii sau a anizotropiei pe o scala
a timpului de ns.

Pentru un fluorofor care prezinta un singur timp de


scadere , scaderea intensitatii e data de formula

I (t ) I o e

Iar daca este timpul de corelare a rotatiei, atunci


scaderea anizotropiei este data de:

r (t ) ro e

Biomoleculele prezinta insa scaderi multi-exponentiale datorate:


Unui numar mai mare de cromofori (ex: proteinele);
Comportamentului diferit in functie de mediul in care se afla;
Transfer de energie;
Existenta unor molecule care sting fluorescenta;
Existenta mai multor forme de organizare a proteinelor (monomeri multimeri).

Avantajele TRF fata de spectroscopia de fluorescenta in stare


stationara:
-deosebeste mai bine intre starile fluoroforilor din proba (fiecare
stare este caracterizata de propriu si de ponderea acestuia in
proba);
-se deosebeste mai usor intre stingerea statica si cea dinamica;
(stingerea statica nu afecteaza intrucat sunt inregsitrati doar
fluoroforii nestinsi, in cazul stigerii dinamice intreaga populatie
de fluorofori este afectata astfel incat se remarca o scadere a
mediu);
-FRET se analizeaza foarte bine prin TRF;
E = 1- DA/ D
-etc.

Modalitati de masurare a timpului de viata:


-frequency domain TRF

Modalitati de masurare a timpului de viata:


-frequency domain TRF

Modalitati de masurare a timpului de viata:


-time domain TRF

ideal

practic

Schema TRF

Metoda de detectare a fotonilor

rezolutie mare
sensibilitate mare (un
foton)
mediere rapida datorita
ratei de repetitie de
ordinul MHz

Convolutie-deconvolutie

Sursele de lumina

Lampi cu descarcare in gaz (Mercur, Deuteriu, Xenon): consum


mare de putere si disipare de caldura, produce un spot mare in
proba, policromatice (300 - 800 nm) folosite in general pt
steady-state;

LED-uril: putere mica, banda spectrala mica (10-100 nm),


pulsuri scurte (sub ordinul ns) cu o rata de repetitie mare de la
40 pana la 100 MHz;

Laserul Ti:Safir: - putere mare, pulsuri scurte, rata de repetitie


mare, banda spectrala mare ;

Laserul supercontinuu (cu lumina alba): cuprinde lungimi de


unda de la 400 la 2000 nm, pulsuri scurte, rata de repetitie e
fixa.

Detectori pt TRF

Photo-Multiplier Tube ( PMT): castig mare (106 sau mai mlt),


sensibilitate mare;

Micro-Channel Plate PMT (MCP-PMT): placa cu sute de


canale paralele, canalele au un diametru de 10 m si sunt
invelite cu un material conductor; prezinta un castig mare
(peste 106); asigura pulsuri rapide;

Avalanche Photodiode (APD): amplificare liniara de la 1 la


500, regiunea activa 0,1 10 mm;

Single-Photon APD (SPAPD): fotonul genereaza o avalansa


in interiorul diodei, dezavantajul fiind ca dupa fiecare foton
circuitul de stingere trebuie sa readuca la normal dioda;
poate fi folosit doar pt numararea de fotoni;

Camere CCD: prezinta acelasi fotocatod ca si PMT


prezentand o sensibilitate de detectie asemanatoare.

NATA (N-acetil-L-triptofanamida) prezinta o


singura exponentiala de scadere (proteina
cu un singur triptofan)

L(tk) este IRF functia de raspuns a


instrumentului - depinde de forma pulsului
de excitare si de cum este detectat de
instrument

Scaderi multi-exponentiale
Amestec de indol cu p-terphenyl

Cele 2 substante prezinta timpi de


viata distincti:
p-terphenyl 0.93 ns
indolul 3.58 ns

Anizotropia

I // I
r
I // 2 I

Ribonucleaza T1

Anizotropia monomer/tetramer

Imunoglobulina E (legatura dansil-lisina)

Modificarea anizotropiei Melitinei in urma asocierii cu alte


molecule

Bibliografie:
Principles of Fluorescence
Spectroscopy
Joseph Lakowicz