UNIVERSIDADE DE FRANCA

FERNANDA DINIZ DE SOUSA

RELATRIOS AULAS PRTICAS

Trabalho apresentado a Universidade de Franca,

para a matria de Bacteriologia Geral,
de todas as aulas prticas feitas
Prof. Dr. Carlos Henrique G. Martins

FRANCA
2015

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Sumrio
COLORAO DE GRAM.................................................................. 5
INTRODUO...................................................................................5
OBJETIVO.......................................................................................5
MATERIAIS E REAGENTES....................................................................5
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL............................................................5
RESULTADO.....................................................................................5
CONCLUSO....................................................................................6
COLORAO DE ZIEHL-NEELSEN.................................................... 6
INTRODUO...................................................................................6
OBJETIVO.......................................................................................6
MATERIAIS E REAGENTES....................................................................6
PROCEDIMENTOS..............................................................................6
RESULTADO.....................................................................................7
CONCLUSO....................................................................................7
COLORAO DE PAREDE (MTODO DE ROBINOW)...........................7
INTRODUO...................................................................................7
OBJETIVO.......................................................................................7
MATERIAIS E REAGENTES....................................................................7
PROCEDIMENTOS..............................................................................7
RESULTADO.....................................................................................8
CONCLUSO....................................................................................8
MTODO DE IMPREGNAO PELA PRATA (FONTANA TRIBOMDEAU). .8
INTRODUO...................................................................................8
OBJETIVO.......................................................................................8
MATERIAIS E REAGENTES....................................................................8
PROCEDIMENTOS..............................................................................8
RESULTADO.....................................................................................9
CONCLUSO....................................................................................9
COLORAO DE ESPOROS (MTODO DE WIRTZ)..............................9
INTRODUO...................................................................................9
OBJETIVO.......................................................................................9
MATERIAIS E REAGENTES....................................................................9
PROCEDIMENTOS..............................................................................9
RESULTADO...................................................................................10
CONCLUSO..................................................................................10
COLORAO DE CPSULA (MTODO DE JH).................................. 10

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INTROCUO.................................................................................10
OBJETIVO.....................................................................................10
MATERIAIS E REAGENTES..................................................................10
PROCEDIMENTOS............................................................................10
RESULTADO...................................................................................10
CONCLUSO..................................................................................10
INTRODUO.................................................................................11
OBJETIVO.....................................................................................11
FEZES E URINA........................................................................... 11
MATERIAIS E REAGENTES..................................................................11
PROCEDIMENTO..............................................................................11
RESULTADO...................................................................................12
CONCLUSO..................................................................................12
SEMEADURA DE BACTRIAS EM DIFERENTES CONDIES DE
CULTURA E INCUBAO............................................................... 12
INTRODUO.................................................................................12
OBJETIVO.....................................................................................12
MATERIAIS E REAGENTES..................................................................12
PROCEDIMENTOS............................................................................13
RESULTADO...................................................................................13
CONCLUSO..................................................................................13
IDENTIFICAO BACTERIANA DA FAMLIA ENTEROBACTERIACEAE. .13
INTRODUO.................................................................................13
OBJETIVO.....................................................................................13
MATERIAIS E REAGENTES..................................................................13
PROCEDIMENTO..............................................................................14
RESULTADO...................................................................................14
CONCLUSO..................................................................................15
IDENTIFICAO DE COCOS GRAM POSITIVO.................................. 15
INTRODUO.................................................................................15
OBJETIVO.....................................................................................15
MATERIAIS E REAGENTES..................................................................15
PROCEDIMENTO..............................................................................16
RESULTADO...................................................................................16
CONCLUSO..................................................................................16
AVALIAO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE AGENTES FSICOS E
QUMICOS.................................................................................. 17
INTRODUO.................................................................................17
OBJETIVO.....................................................................................17
MATERIAIS E REAGENTES..................................................................17

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PROCEDIMENTO..............................................................................17
RESULTADO...................................................................................18
CONCLUSO..................................................................................18
ANTIBIOGRAMA DISCO DIFUSO................................................ 18
INTRODUO.................................................................................18
OBJETIVO.....................................................................................19
MATERIAIS E REAGENTES..................................................................19
PROCEDIMENTOS............................................................................19
RESULTADO...................................................................................19
CONCLUSO..................................................................................20
TESTES DE SENSIBILIDADE DOS ANTIMICROBIANOS......................20
INTRODUO.................................................................................20
OBJETIVOS....................................................................................20
MATERIAIS E REAGENTES..................................................................20
PROCEDIMENTO..............................................................................21
RESULTADOS.................................................................................21
CONCLUSO..................................................................................21
CONJUNO BACTERIANA........................................................... 21
INTRODUO.................................................................................21
OBJETIVO.....................................................................................21
MATERIAIS....................................................................................21
PROCEDIMENTOS............................................................................22
RESULTADO...................................................................................22
CONCLUSO..................................................................................22
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS................................................... 23

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Coloraes:
Colorao de Gram
Introduo

A colorao de Gram recebeu este nome em homenagem a seu descobridor, o

mdico dinamarqus Hans Cristian Joaquim Gram. Em 1884, Gram observou que as
bactrias adquiriram cores diferentes, quando tratadas com diferentes corantes.
Isso permitiu classific-las em dois grupos distintos: as que ficavam roxas, que
foram chamadas de Gram-positivas, e as que ficavam vermelhas, chamadas de
Gram-negativas. Aps descrio do mtodo, inmeras propostas de modificao
foram feitas.
O mtodo tintorial predominante utilizado em bacteriologia o mtodo de Gram. A
bacterioscopia, aps colorao pelo mtodo de Gram com diagnstico presuntivo,
de triagem, ou at mesmo confirmatrio em alguns casos, constituindo-se uma
pea importante e fundamental. Essa tcnica simples, rpida e tem capacidade de
resoluo, permitindo o correto diagnstico em cerca de 80% dos pacientes em
carter de pronto atendimento em nvel local.

Objetivo

Saber identificar se a bactria Gram positiva ou Gram negativa, qual o seu

arranjo e a sua forma, a partir do microscpio ptico.

Materiais e Reagentes

Lmina
Placa de Petri com a bactria
Bico de Bunsen
Ala de Platina
gua corrente
Cristal Violeta
Lugol
lcool-Acetona
Fucsina

Procedimento Experimental

Fazer um esfregao fino, uma bactria por lmina

Fixar o esfregao, passando a lmina trs vezes sob o bico de Bunsen.
Cobrir a lmina com Cristal Violeta (corante bsico) 1 minuto.
Escorrer o excesso e cobrir a lmina com Lugol (mordente) 1 minuto.
Lavar a lmina delicadamente em gua corrente.
Escorrer at desprender o corante com uma soluo lcool-acetona (1.1)
descorante
Lavar a lmina delicadamente em gua corrente
Cobrir a lmina com Fucsina (corante bsico) 30 segundos.
Escorrer e lavar a lmina delicadamente em gua corrente
Deixar secar e observar a lmina em objetiva de imerso.

Resultado.
Resultado
L. casei

Forma
Bacilo

Arranjo

Gram
Positiva

Diagnstico

Presuntivo

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S. aureus

Cocos

E. coli
Yersinia sp.
B.
Megaterium

Bacilo
Bacilo
Bacilo

Neisseria sp.
Streprococus
mutans

Cocos
cocos

Cacho de
uva

Estreptobacil
o

Positiva

Diplococo
Cadeia

Negativa
Positiva

Negativa
Negativa
Positiva

Gonococo
Meningococo

Nisseria
gonorrhoeae
Nisseria
meningitidis

Concluso

A realizao de identificao de bactrias, atravs da colorao de Gram, permitiuse distinguir se era positivo ou negativo, com ajuda pela cor, Gram-negativa,
vermelha e Gram-positiva, roxa. Conseguiu-se identificar a sua forma e arranjo.

Colorao de Ziehl-Neelsen
Introduo

A colorao de Ziehl-Neelsen baseasse na capacidade de algumas bactrias

(microbactria e actinomicetes) resistirem aos mtodos comuns de colorao
devido composio altamente lipdica da parede celular. Aps um processo de
colorao especial a quente uma vez coradas no sofrem ao de descorantes
fortes como soluo de lcool cido. Desta forma, a fucsina de Ziehl cora todas as
bactrias de vermelhos, e aps de descolorao com lcool-cido somente os
bacilos lcool-cido resistentes (BAAR) conservaro est cor. para facilitar a
visualizao cora-se o fundo com azul metileno, estabelecendose contraste ntido
entre elementos celulares e outras bactrias (azuis) e os BAAR (vermelhos).

Objetivo

Conseguir identificar as microbactrias, que so conhecidas como bacilos lcoolcido resistente (BAAR).

Materiais e Reagentes

Placa de Petri com a bactria

Lmina
Ala de Platina
Bico de Bunsen
Fucsina de Ziehl concentrada
lcool-cido Clordrico a 1%
gua corrente
Algodo
Fogo
Soluo diluda de azul de metileno
Microscpio

Procedimentos

Fazer um esfregao com Mycobacterium sp.

Fixar no calor
Corar com fucsina de Ziehl concentrada, aquecendo cuidadosamente a
lmina at a emisso de vapor, durante 5 minutos.
Escorrer o corante e diferenciar com lcool-cido clordrico a 1%.

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Lavar com gua corrente, delicadamente.

Corar com uma soluo diluda de azul de metileno 30 segundos
Lavar com gua corrente e secar.
Observa em objetiva de imerso.

Resultado
MICRORGANISMO
M. smugmatis

FORMA
Bacilo

ZIEHL-NEELSEN
BAAR

Concluso

A colorao de Ziehl Neelsen foi realizada com sucesso, j que conseguimos

identificar a micobactria, que forma de bacilos e aparece sempre em rosa.

Colorao de Parede (Mtodo de Robinow)

Introduo

O mtodo de Robinow & Murray reputado por seus autores como especfico para
demonstrar a parede celular de bactrias, fornece contraste ntido a essa estrutura
quando aplicado a bactrias Gram positivas. Todavia, em se tratando de bactrias
Gram negativas, no se consegue resultados satisfatrios porque todo o corpo
bacteriano se torna corado. Knaysi empregando um mordente preparado com cido
tnico e alumen de potssio, seguido de colorao com fucsina, conseguiu
evidenciar bem a parede celular. O processo, contudo, envolve uma delicadeza de
tcnica que acaba por torn-lo pouco prtico.
Procurando encontrar um mtodo que pudesse revelar a citada estrutura e que
reunisse praticabilidade a condio de eficincia para bactrias Gram positivas e
Gram negativas, fomos levados a ensaiar o emprego de um mordente cido, capaz
de transformar os componentes do citoplasma de corveis em no corveis, e, ao
mesmo tempo, impregnar a camada superficial de forma a torn-la suficientemente
ntida sob ao de um corante. Scanga reconhece no cido tnico a propriedade de
promover aquela modificao no citoplasma e verificamos que a adio de
pequenas propores de cloreto frrico favorece a alterao desejada.
Conseguimos nosso objetivo com um mordente composto de cido tnico e cloreto
frrico, em solues a 5% e 2% respectivamente. Bactrias submetidas a tal
mordente e depois coradas com Azul Vitria ou Verde Malaquita, exibiram, em bom
contraste, a camada superficial.

Objetivo

conseguir corar a parede celular, que tem melhor resultado em uma bactria
Gram-Positiva, j que sua parede celular mais fina que a Gram-Negativa.

Materiais e Reagentes

Lmina
Bactria B. megaterium 4h (BHI)
Ala de platina
Bico de Bunsen
Soluo de cido tnico
Violeta de genciana
gua
Microscpio.

Procedimentos
Fazer um esfregao em lmina (Bacillus Megaterium) 4h BHI

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Deixar secar
Mergulhar a lmina em uma soluo de cido tnico (sol. A) 20 minutos
Lavar com gua corrente
Cobrir o esfregao com violeta de genciana (sol. B) 30 segundos
Lava com gua corrente
Deixar secar
Observar com objetiva de imerso

Resultado
Bactria
B. megaterium

Forma
Bacilo

Arranjo
-

Concluso

A colorao de parede foi realizada com sucesso, pois conseguimos identificar a sua
forma, bacilo, que gram-positiva.

Mtodo de Impregnao pela Prata (Fontana

Tribomdeau)
Introduo

Desenvolvido em 1920, no um mtodo de colorao verdadeiro. Na realidade,

trata-se de uma tcnica de impregnao pela prata usada para auxiliar a
visualizao de bactrias espiraladas, as quais, geralmente, so muito finas e se
coram de forma insuficiente pelo Gram (ex.: Treponema pallidum e Leptospira
interrogans). A partir desta tcnica, as espiroquetas aparecem em cor marromescura ou negra, sobre um fundo amarelo-castanho ou marrom-claro.
As espiroquetas so bactrias presentes na placa bacteriana, que so facilmente
reconhecidas. Elas tambm so encontradas no clculo dentrio e nas bolsas
periodontais. Podem ser visualizadas atravs de vrios mtodos como o exame de
campo escuro, colorao pelo Giemsa, esfregaos com tinta da China,
demonstrao das espiroquetas em corte. Sendo que na prtica iremos utilizar o
mtodo de Fontana-Tribondeau que ser descrito mais detalhadamente frente.
As espiroquetas so divididas em duas famlias principais: Spirochaetaceae e uma
outra de importncia como patgenos humanos: Treponemaceae. Sendo que est
ltima tem como principais gneros: Treponema, Borrelia e Leptospira. E esta
famlia possui como caractersticas gerais: bacilos longos e delgados, espiralados e
GRAM negativo, apresentando flagelos que do mobilidade bactria.

Objetivo

Conseguir visualizar as espiroquetas e identifica-las.

Materiais e Reagentes

Lmina
Palito de dente
Sulco da Gengiva (Treponema sp)
Lquido de Rouge (Fixador A)
Soluo B
gua
gua destilada
Soluo impregnadora (soluo C)
Bico de Bunsen
Fogo
Microscpio

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Procedimentos
Com um palito de dente, colher amostras do sulco da gengiva dos dentes
posteriores
Fazer um esfregao em lmina
Deixar secar e fixar o esfregao em lquido de Rouge (fixador A) 1 minuto
Lavar cuidadosamente em gua corrente
Mordiar com soluo B, aquecendo at emisso de vapor
Lavar em gua corrente e aps com gua destilada
Cobrir com soluo impregnadora (soluo C) e aquecer at emisso de
vapores 30 segundos
Lavar em gua corrente e deixar secar
Observar em objetiva de imerso.

Resultado

Treponema sp................................. espiroquetas.

Concluso

A impregnao pela prata foi realizada com sucesso, j que conseguimos identificar
as espiroquetas, visualizadas na cor marrom-escura.

Colorao de Esporos (Mtodo de Wirtz)

Introduo

A parede dos esporos constitui uma barreira eficaz contra a entrada e sada de
materiais do esporo, mas por sua impermeabilidade, geralmente refringente e de
difcil colorao. A exposio prolongada ao corante verde malaquita, associado ao
aquecimento, permite a penetrao do corante e a colorao do esporo por um
verde intenso. Como contraste (contracorante), utiliza-se a safranina, que cora
outras estruturas em vermelho, facilitando a diferenciao dos esporos.
Um endosporo uma estrutura especial resistente, dormente, formada dentro de
uma clula que protege uma bactria das condies ambientais adversas. Embora
os endosporos sejam relativamente incomuns nas clulas bacterianas, podem ser
formados por alguns gneros de bactrias. Os endosporos no podem ser corados
pelos mtodos comuns, como a colorao simples e a colorao de Gram, pois os
corantes no penetram a parede do endosporo.

Objetivo

O objetivo conseguir distinguir o que so os esporos.

Materiais e Reagentes

Lmina
B. megaterium
Verde Malaquita
Ala de platina
Bico de Bunsen
Fogo
gua corrente
Safranina
Microscpio

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Procedimentos

Fazer um esfregao fino de B. megaterium

Deixar secar e fixar a lmina
Cobrir o esfregao com verde malaquita
Aquecer a lmina at a emisso de vapor 2 minutos
Lavar em gua corrente
Cobrir o esfregao com Safranina 1 minuto
Lavar em gua corrente
Deixar secar e observar em objetiva de imerso

Resultado

Os esporos foram corados de verde e as bactrias de vermelho, e os esporos so

esfricos.

Concluso

A colorao de esporos foi um sucesso, j que conseguiu ver os esporos e conseguir

diferencia-los.

Colorao de Cpsula (Mtodo de JH)

Introcuo

Muitos micro-organismos contm um revestimento gelatinoso denominada cpsula.

Na microbiologia mdica, a demonstrao da presena de uma cpsula um modo
de determinar a virulncia do organismo, o grau em que um patgeno pode causar
doena.
A colorao da cpsula mais difcil que outros tipos de procedimentos de
colorao, pois os materiais capsulares so solveis em gua e podem ser
desalojados ou removidos durante uma lavagem rigorosa. Para demonstrar a
presena de cpsulas, um microbiologista pode misturar as bactrias em uma
soluo contendo uma fina suspenso coloidal de partculas coradas (geralmente
com tinta nanquim ou nigrosina), para fornecer um fundo contrastante e ento
corar as bactrias com uma colorao simples, como a safranina. Devido sua
composio qumica, as cpsulas no reagem com a maioria dos corantes, como a
safranina, e desse modo aparecem como halos circundando cada clula bacteriana.

Objetivo

O objetivo conseguir visualizar as cpsulas.

Materiais e Reagentes

Lmina
Bico de Bunsen
Ala de platina
Fucsina 1%
Klebsiella pneumoniae
Eosina 1%
Microscpio

Procedimentos
Colocar 1 gota de fucsina 1% na lmina, misturar nesta gota uma alada do
crescimento de Klebsiella pneumoniae, sem espalhar a gota deixar em
repouso por 30 segundos
Acrescentar 1 gota de eosina 1%, bronogeneizar 1 minuto

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Fazer o esfregao com auxlio de outra lmina
Deixar secar
Observar em objetiva de imerso

Resultado

A cpsula visvel na cor rosa e por dentro se v em amarelo ou transparente.

Concluso

A colorao de cpsula foi um sucesso, pois foi fcil visualizar a cpsula, consegue
se deferenciar.

Tcnica de Isolamento por

Esgotamento:
Introduo

A maioria dos materiais infecciosos, como pus, escarro e urina, contm diversos
tipos de bactrias; da mesma forma que amostras de solo, gua ou alimento.
Quando esses materiais so semeados na superfcie de meio slido, as colnias
formam cpias exatas do organismo original. Uma colnia visvel teoricamente vem
de um nico esporo ou clula vegetativa ou de um grupo dos mesmos
microrganismos juntos em agregados ou cadeias. As colnias microbianas
frequentemente tm aparncia diferente, o que permite distinguir um
microrganismo do outro. As bactrias devem ser espalhadas de maneira
suficientemente ampla na placa para que as colnias possam ser separadas umas
das outras.

Objetivo

Visualizar os crescimentos das bactrias e as divises das colnias.

Fezes e Urina
Materiais e Reagentes

Fezes
Urina
Escarro
Meios de cultura: Placa
o MC
o MH
o CLED
o AS
o TSA
o cido Citrato
o SS
Caldos
o TSA
o BHI
o MH
o VB
o Selenito
o Motilidade

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Ala de platina
Bico de Bunsen
Placa de Petri
Agulha de prata

Procedimento
Na placa do meio de cultura de CLED, se faz um risco com urina no meio e
depois estreia-se a placa inteira.
Nos meios de cultura na placa, faz-se estrias com urina, fezes ou escarro.
Como a imagem a baixo:
No caldo de Motilidade, coloca-se a agulha com fezes exatamente no meio
do tudo, sem tremer, no chegando at o final.
No caldo TSA, faz-se estrias apenas na parte inclinada do tubo.
Nos outros meios, com uma alada da amostra, homogeneza-se no caldo.

Resultado

Meios:
MC urina colnia isolada
MH escarro isolou
CLED urina ficou amarelo, 1 bactria
AS fezes isolou
Citrato fezes no aconteceu nada, h presena de bactria
TSA urina uma colnia
SS fezes coliforme fecal, isolou em uma colnia
Caldos:
TSA fezes bactria cresceu, tudo inclinado
BHI urina turvou, cresceu
MH fezes turvou, cresceu
VB fezes turvou, cresceu
Selenito fezes turvou, cresceu
Motilidade fezes bactria cresceu na parte superior.

Concluso

Conseguimos visualizar as colnias isoladas nas placas, e o crescimento das

bactrias nos dois meios (gar e caldo) com as amostras fornecidas.

Semeadura de Bactrias em diferentes

condies de cultura e incubao.
Introduo

Tcnica de Isolamento por esgotamento.

Objetivo

Visualizar o crescimento das bactrias conforme a sua incubao e o meio.

Materiais e Reagentes

Bactria: Yersinia sp
Ala de platina
Bico de Bunsen
Meios:

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o gar sangue
o gar BHI
o gar EMB
o gar CLED
o gar SS
o gar-gar
o gar MH
o gar Mitis-Salivarius
Incubao:
o 37C aerbia (estufa bacteriolgica)
o Microaerofilia a 37C
o Anaerobiose (jarra + gerador de anaerobiose)
o 2 a 8C - geladeira
o Temperatura Ambiente
o 42 aerobiose

Procedimentos

Com uma alada da bactria escolhida, faz-se as estreias, em cada meio de

cultura.
Depois se dividiu as placas para se incubar.

Resultado

Yersinia sp.
Meio: gar Sangue
Cresceu em temperatura ambiente
Meio: gar BHI
Cresceu em Microaerofilia a 37C e no cresceu em 2 a 8C
Meio: gar EMB
No cresceu em Anaerobiose e 2 a 8C
Meio: gar CLED
Cresceu em Microaerofilia a 37 e temperatura ambiente
Meio: gar SS
Cresceu em Microaerofilia a 37
Meio: gar-gar
No cresceu em 37 Aerobiose
Meio: gar MH
Cresceu em temperatura ambiente e no cresceu em Anaerobiose
Meio: gar Mitis-Salivarius
Cresceu em 37C aerobiose

Concluso

A Yersinia sp uma bactria que cresce em temperaturas mais elevadas, em meio

gar-gar no se cresce bactria e em alguns meios tambm no cresceu. E a
bactria tambm no se cresce na temperatura baixa, na geladeira.

Bioquimismo bacteriano:
Identificao Bacteriana da Famlia
Enterobacteriaceae

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Introduo

O passo final para a identificao de uma bactria dado pelo Estudo do seu
bioquimismo. Para este estudo, crucial o isolamento das bactrias em questo,
impedindo a contaminao para que no haja erro de identificao. Podemos
realizar uma srie de testes, optando por aquele que nos parece mais adequado.
Enterobacteriaceae uma famlia de bactrias Gram-negativas muito abundante,
incluindo uma grande variedade de bactrias patognicas.

Objetivo

Identificao de bactrias por meio de indicadores de pH e por meio de testes

bioqumicos.

Materiais e Reagentes

Bactria 01
Semeaduras:
o Glicose (lquido)
o Lactose (lquido)
o Sacrose (lquido)
o Manitol (lquido)
o Sorbitol (lquido)
o Maltose (lquido)
o Malonato de sdio (lquido)
o Indol (lquido)
o Rafinose (lquido)
o Adonitol (lquido)
o Lisina (lquido)
o Ornitina (lquido)
o Arginina (lquido)
o Controle de aminocidos (lquido)
o DNase (placa)
o Motilidade (tubo, slido)
o Citrato (tubo, slido)
o Ureia (tubo, slido)
o Fenilalanina (tubo, slido)
o TSI (tubo, slido)
Ala de platina
Agulha de platina
Bico de Bunsen
Estante
Placa de Petri

Procedimento
Nas semeaduras em lquido, com uma alada da bactria se mistura com os
meios, sempre flambando a ala ao mudar de meio.
Na placa de DNase, com a ala, pegar um pouco da bactria e fazer um
crculo no meio da placa.
Na motilidade, com a agulha, introduzir no meio no encostando no final do
tudo, uma linha reta.
No citrato, com a agulha fazer um risco na parte inclinada
Na ureia, com agulha ou ala fazer estreias na parte inclinada
Na fenilalanina, com ala ou agulha fazer estreias na parte inclinada.
No TSI, com a agulha, introduzir no meio no encostando no fim do tubo,
uma linha, e na parte inclinada uma estria.

P g i n a | 15
Na Lisina, Ornitina, Arginina e no controle, coloca-se um leo vegetal estril.

Resultado

Motilidade positivo
Citrato negativo (o fundo ficou verde em cima ficou azul)
TSI H2S negativo
Glicose positivo
Lactose e Sacarose positivo
Ureia positivo (D)
Fenilalanina (cloreto frrico) negativo
Arginina negativo
Glicose negativo
Lactose negativo
Sacarose negativo
Manitol positivo
Sorbitol positivo
Maltose positivo
Ornitina positivo
Indol (Kovac's) positivo
Lisina negativo
Rafinose negativo
Adonitol negativo
DNase - negativo
Malanato de sdio pH neutro

Concluso

Aps os testes de bioqumicos, e comparar com a tabela, a bactria que eu escolhi

para fazer, foi Yersinia sp.

Antibiograma
Identificao de cocos Gram Positivo
Introduo

O antibiograma um exame de diagnstico que consegue identificar qual a

bactria que est causando a infeco no indivduo, indicando tambm qual o
antibitico mais indicado para o seu tratamento.
Quando um paciente tem uma infeco causada por bactrias, geralmente
receitado um antibitico capaz de eliminar estas bactrias, mas algumas infeces
nem sempre so causadas por um tipo conhecido de bactrias e, nesse caso,
receitar um antibitico que no seja eficaz contra esses micro-organismos pode
piorar a infeco.
Antibiograma por difuso em gar: neste procedimento so colocados pequenos
discos de papel que contm diferentes antibiticos na placa onde as bactrias
crescem. Aps algumas horas observa-se se existiu crescimento de bactrias em
voltas dos discos e na ausncia de crescimento bacteriano, descobre-se qual o
antibitico mais adequado.
O resultado do antibiograma pode demorar 4 a 5 dias e obtido atravs da anlise
do efeito dos antibiticos no crescimento das bactrias. O antibitico que inibir o
crescimento das bactrias o indicado para tratar a infeco, mas caso as bactrias
cresam e os antibiticos no tenham efeito, o resultado um antibiograma
negativo, sendo necessrio utilizar outras tcnicas para identificar a bactria e
combater a infeco.

P g i n a | 16

Objetivo

identificar o halo de inibio dos antibiticos, saber se resistente ou no. E por

meio dos testes Bioqumicos conseguir identificar a bactria escolhida.

Materiais e Reagentes

Bactria 03
Ala de platina
Discos:
o Polimixina
o Novabiocina
Tubo de ensaio
Bico de Bunsen
Plasma de coelho
Banho Maria
Escala de 0,5 McFarland
Swab
Soluo salina
Placa de MH
Tubo com H2O2
Palito estril
Placa de DNase
Xilol
Sacarose
Trealose
Maltose

Procedimento
O primeiro teste a se fazer foi o da Catalase: Com um palito estril pegar
um pouco do crescimento bacteriano e colocar no tubo com H2O2. Observar
formao de bolhas.
Positivo: Staphylococcus
Negativo: Streptococcus
Se o teste de Catalase der positivo fazer:
O segundo teste feito foi o Coagular:
Adicionar em um tubo 500L de plasma de coelho + uma
alada de crescimento bacteriano
Colocar em banho-maria a 37C e observar a formao de
cogulo a cada 30 minutos
Depois fez-se os Discos, polimixina e novobiocina.
Fazer um inoculo em soluo salina (escala 0,5 McFarland).
Semear com swab por toda a placa de MH.
Aplicar os discos de polimixina e novobiocina
Incubar a 37C por 24 horas.
Aps, fez-se o DNase: Com o auxlio de uma ala de platina, inocular as
colnias em forma circular central sobre o gar. Incubar por at 72 horas a
37C.
E o ltimo teste a se fazer foi o do Carboidratos: Com auxlio de uma ala de
platina, dissolver as colnias no caldo de cada carboidrato:
Xilol
Sacarose
Trealose
Maltose

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Se o teste de Catalase der negativo fazer:
Teste Camp: Fazer uma estria com Staphylococcus aureus. Fazer estrias
paralelas das bactrias a ser identificada sem encostar na estria de S.
aureus. Meio: gar Sangue
NaCl 65% (Caldo): com auxlio da ala, inocular as colnias no tubo.
Incubar.
Bile Escubina: Estriar as colnias na superfcie do gar. Incubar.
Discos de Bacitracina e Optoquina: Fazer um inoculo em soluo salina
(escala de 0,5 McFarland) semear com swab por toda a placa de gar
sangue. Aplicar o disco de Bacitracina e Optativa. Incubar.

Resultado

Catalase: Positivo
DNase: Negativo
MH: - novobiocina: 0mm - resistente
- poliximina: 16mm qualquer halo inibio.
Trealose: positivo
Maltose: positivo
Sacarose: positivo
Xilol: negativo
Coagulase: negativo

Concluso

Aps os resultados e os testes feitos, se compara com a tabela, e a bactria

escolhida foi S. saprophyticus.

Avaliao da atividade antimicrobiana de

agentes fsicos e qumicos
Introduo

Os agentes microbianos podem ser microbicidas, que matam os microorganismos,

ou microbiostico, que apenas inibem o crescimento destes.
O critrio de morte de um microrganismo em Microbiologia baseado em uma
nica propriedade: a capacidade de se reproduzir.
Agentes fsicos
O mtodo mais empregado para matar microorganismos o calor, por ser eficaz,
barato e prtico. Os microorganismos so considerados mortos quando perdem a
capacidade de multiplicar.
Eles so: calor mido, calor seco, pasteurizao, radiaes, indicadores biolgicos,
microndas, filtrao, presso osmtica, dessecao.
Agentes qumicos
Os agentes qumicos so apresentados em grupos que tenham em comum, ou as
funes qumicas, ou elementos qumicos, ou mecanismo de ao.
So eles: lcoois, aldedos e derivados, fenis e derivados, halognicos e derivados,
cidos inorgnicas e orgnicos, agentes de superfcie, metais pesados e derivados,
agentes oxidantes, esterilizantes gasosos.

Objetivo

Identificar o crescimento das bactrias nos agentes fsicos, e tambm conseguir

identificar o halo dos agentes qumicos na bactria escolhida.

Materiais e Reagentes

Tiras de algodo vermelha e preta

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Tubos com gua peptonada

Ala de platina
Bico de Bunsen
Estufa 45C
Temperatura Ambiente
Pipeta estril
C. albicans lquido
B. subtilis lquido
S. aureus lquido
P. aeruginosa lquido
Escala de McFarland
Swab
Placa de MH
C. albicans placa
Discos de papel de filtro com 50L de:
Proplis
Periogard
Plax
Listerine
Hipoclorito

Procedimento

Agente Fsico
Na tira de algodo preta se umedece com S. aureus e P. aeruginosa (2
vezes) e coloca uma em cada tudo com gua peptonada, identificando a
bactria, uma ir para a estufa de 45 e a outra ficar em temperatura
ambiente.
Na tira de algodo vermelha se umedece com C. albicans e B. subtilis (2
vezes) e coloca uma em cada tudo com gua peptonada, identificando a
bactria, uma ir para a estufa de 45 e a outra ficar em temperatura
ambiente.
Agente Qumico
Turvar a bactria C. albicans na escala 0,5 McFarland. Semear com swab na
placa de gar Mueller-Hinton, em campo sobrepostos
Umedecer os discos de papel de filtro com 50L de cada agente qumico:
o Prpolis
o Periogard
o Plax
o Listerine
o Hipoclorito
Colocar os discos nas placas espaados, e identificar o lugar e o agente
qumico na placa.

Resultado

Agente Fsico

B. SUBTILIS
S. AUREUS
P. AERUGINOSA
C. albicans

TEMPERATURA
AMBIENTE
Presente
Presente
Presente
Presente

Agente Qumico

ESTUFA DE 45
Presente
Presente
Presente
Presente

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Fungo: C. albicans
Listerine 0mm
Hipoclorito 36mm
Plax 11mm
Periogard 14mm
Prpolis 9mm

Concluso

Agente Fsicos
As bactrias sobreviveram nas temperaturas expostas, por mais que seja um
mesofilo, sobrevive a mais de 45C.
Agentes Qumicos
Por ter fatores que tenha interferncia como, o tanto de inoculo que passou na
placa, a concentrao dos agentes qumicos, a validade do produto, pode ter dado
algumas diferenas.
O Hipoclorito o que age com mais eficcia, o listerine por ser um antissptico
bocal, ele no conseguiu ser eficaz, pelo fato de C. albicans ser um fungo tambm
encontrado na boca, ele no fez efeito, mas pode ter tido interferncia porque o
produto estava vencido.

Antibiograma Disco Difuso

Introduo

O teste de disco-difuso em gar foi descrito em 1966, por Bauer e Kirby. O teste
fornece resultados qualitativos. um dos mtodos de suscetibilidade mais simples,
confivel e mais utilizado pelos laboratrios de microbiologia. O seu princpio bsico
a difuso do antimicrobiano na superfcie do gar, a partir de um disco
impregnado com o mesmo antimicrobiano
O teste realizado dispensando os discos de papel-filtro, impregnados com
antimicrobianos em concentraes fixas, sobre a placa de gar, aps a semeadura
do inculo bacteriano com aproximadamente 1 a 2 x 108 UFC/mL.
Antibiograma por difuso em agar: neste procedimento so colocados pequenos
discos de papel que contm diferentes antibiticos na placa onde as bactrias
crescem. Aps algumas horas observa-se se existiu crescimento de bactrias em
voltas dos discos e na ausncia de crescimento bacteriano, descobre-se qual o
antibitico mais adequado.

Objetivo

Conseguir identificar o halo dos antibiticos e com auxlio de uma tabela, saber se
resistente, intermedirio ou sensvel.

Materiais e Reagentes

Ala de Platina
Bico de Bunsen
Bactrias:
o Escheria coli (Gram negativa)
o Staphylococcus aureus (Gram positiva)
gar MH
Escala de McFarland
Discos para E.coli
o Sulfa + Trimetoprim SUT
o Tetraciclina TET

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o Cefalotina - CFL
o Ampicilina AMP
o Ciprofloxacina CIP
o Gentamicina GEN
o Tobramicina - TOB
Discos para S. aureus
o Penincilina PEN
o Cefalotina CFL
o Amicacina AMI
o Clorafenicol CLO
o Ampicilina AMP
o Oxacilina OXA

Procedimentos
Padronizado:
Meio de Cultura gar MH
Espessura de 4 a 6 mm
Inoculo 1,5x108 UFC/ml (comparao com a escala de 0,5
McFarland)
Em uma soluo salina, fazer um inoculo de E. coli comparando com a
escala de McFarland, com um swab espalhar por toda a placa de MH, e
colocar os discos de antibiticos.
Em uma soluo salina, fazer um inoculo de S. aureus comparando com
escala de McFarland, com um swab espalhar por toda a placa de MH, e
colocar os discos de antibiticos.

Resultado

E. coli
CIP 38mm sensvel
SUT 0mm resistente
TOB 23mm sensvel
AMP 0mm resistente
CFL 11mm resistente
GEN 24mm sensvel
TET 27mm sensvel
S. aureus
CFL 43mm sensvel
CLO 25,5mm sensvel
AMP 42mm sensvel
PEN 47mm sensvel
AMI 28 mm sensvel
OXA 31mm sensvel
TET 30mm sensvel

Concluso

Alguns antibiticos para a E. coli so resistente, no fazendo efeito, quando outros

so sensveis, fazendo um efeito melhor.
J no S. aureus os antibiticos testados so todos sensveis, tendo uma melhor
eficcia.

Testes de Sensibilidade dos antimicrobianos

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Introduo

A realizao do teste de sensibilidade aos antimicrobianos (TSA) uma das

principais tarefas executadas pelo laboratrio de microbiologia. Alm de orientar a
escolha da terapia antimicrobiana mais adequada, o TSA representa uma
importante ferramenta no monitoramento da evoluo da resistncia bacteriana e
age tambm como um mtodo auxiliar na implantao de medidas de controle que
evitem a disseminao de bactrias multirresistentes.
A tcnica de microdiluio em caldo corresponde miniaturizao da tcnica de
macrodiluio.
Em vez da utilizao de diversos tubos contendo meio de cultura e antimicrobiano,
a tcnica de microdiluio em caldo utiliza placas plsticas estreis, com 96 poos,
com o fundo em formato de U, para permitir melhor visualizao do crescimento
bacteriano.
Nesta placa, um nmero varivel de antimicrobianos, em torno de 12 drogas,
colocado em distintas concentraes (4 a 8 diluies logartmicas).

Objetivos
Materiais e Reagentes

Ala de platina
Bico de Bunsen
Placa de Petri
Estante
Placa de 96 poos
Caldo MH
E. coli
Gentamicina
Soluo salina 3ml
Soluo salina 4ml
Caldo MH 5ml
Escala 0,5 McFarland
Pipetas automticas
Ponteiras

Procedimento

Inoculo 01 Com uma alada de bactria colocar na soluo salina de 3 ml,

comparando com a escala de McFarland. (1,5x108 UFC/ml)
Inoculo 02 Transferir 0,5ml com a pipeta do inoculo 01 para uma soluo
salina de 4,5 ml (1,5x107 UFC/ml)
Inoculo 03 Transferir 1 ml com pipeta do inoculo 02 para o caldo MH de
5ml (2,5x106 UFC/ml)
Quando inocular na microplaca o inoculo estar com 5x105 UFC/ml no poo.
Na microplaca, na linha A, nas colunas 1 a 10 e 12 coloca 50L de Caldo.
Na linha A1, coloca 50L de Gentamicina, homogeniza
Na linha A2, coloca 50L de A1, e assim por diante, em cada pocinho da
linha A, colocar 50 L da coluna anterior.
Aps isso, nas colunas 1 a 10, da linha A, coloca-se 30L de caldo e 20L de
inoculo 03.
Na linha H e coluna 1, coloca-se 100L de caldo, que faz o controle do caldo
Na linha H, coluna 5, coloca-se 80L de caldo e 20L inoculo 03. Para
controle de cultura de E.coli.
Feito tudo isso, se joga resazulina nos poos.

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Resultados

Onde fica rosa tem vida, onde fica azul no tem vida.
O MIC deu no 5 poo, com concentrao 0,3688g/ml.

Concluso

O controle do antibitico Gentamicina, ficou azul, ento indica que ele eficaz, e
mata a bactria.
O controle do caldo ficou azul, indicando que no est infectado.
E o controle do inoculo tem que ficar rosa indicando vida da bactria.
Nos 5 primeiros poos ficou azul, indicando que a bactria estava morta e do 6 ao
10 poo ficou rosa, indicando vida.
Conclumos que a concentrao do antibitico para matar a bactria tem que ser
0,3688g/ml.

Conjuno Bacteriana
Introduo

Na conjugao bacteriana, pedaos de DNA passam diretamente de uma bactria

doadora, o "macho", para uma receptora, a "fmea". Isso acontece atravs de
microscpicos tubos proticos, chamados pili, que as bactrias "macho" possuem
em sua superfcie.
O fragmento de DNA transferido se recombina com o cromossomo da bactria
"fmea", produzindo novas misturas genticas, que sero transmitidas s clulasfilhas na prxima diviso celular.

Objetivo

O objetivo dessa prtica ver se teve ou no crescimento da bactria.

Materiais

Tubo de 9ml de caldo simples

Tubo de E. coli 100
Tubo de E. coli K12
2 Placas de EMB + Estreptoncina + Kanamicina
Placa de EMB
Placa de EMB + Estreptonicina (200g/ml)
Placa de EMB + Kanamicina (20g/ml)
Pipeta
Ala
Bico de Bunsen

Procedimentos

Em um tubo de 9ml de caldo simples adicionar 0,1ml de E. coli 100 e 0,9ml

de E. coli K12, aps 4 horas semear em uma placa de EMB + Estreptoncina
+ Kernamicina
Semear as bactrias do estudo nas placas: Placa de EMB, Placa de EMB +
Estreptonicina (200g/ml), Placa de EMB + Kanamicina (20g/ml) e Placa de
EMB + Estreptoncina + Kernamicina
Cada placa estar identificada onde semear a K12 e a 100, divida ao meio.
Caractersticas das Bactrias:
E. coli 100:
o Doador
o Resistncia a Kanamicina

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o
o
E. coli
o
o
o
o

Plasmidial
Lactose +
K12:
Receptora
Resistncia a Estreptonicina
Cromosonal
Lactose

Resultado

EMB + Kanamicina + Estreptonicina (4h aps)

Cresce apenas a K12
EMB
Cresce as duas, K12 e 100
EMB + Kanamicina
Cresce apenas a 100
EMB + Estreptonicina
Cresce apenas a K12
EMB + Kanamicina + Estreptonicina
No cresce nenhuma.

Concluso

Quando semeamos as duas bactrias no tubo e depois de 4h na placa BEM +

Kanamicina + Estreptonicina, a E. coli 100, que sendo uma doadora, doou a
resistncia a Kanamicina para a E. coli K12, que uma receptora, fazendo com que
ela consiga ficar resistente aos dois antibiticos e assim crescendo, j a 100 no
consegue crescer pelo fato de que sendo resistente a Kanamicina cresceria, mas ela
no resistente a Estreptonicina, a matando.
Na placa EMB cresce as duas bactrias j que o meio seletivo e inibem o
crescimento de algumas bactrias gram-positiva e os corantes servem como
indicadores de diferenciais da fermentao de carboidratos, portanto, servem para
diferenciar fermentadores e no-fermentadores de lactose.
Na placa EMB + Kanamicina, cresce apenas a E. coli 100 por conta dela ser
resistente a este antibitico, j a K12 morta.
Na placa EMB + Estreptonicina cresce apenas a E.coli K12 por ela ser resistente ao
antibitico, a 100 acaba morrendo.
J na placa EMB + Kanamicina + Estreptonicina no cresce nenhuma porque
resistente a um antibitico, mas no a outro, ento acaba morrendo.

Referncias Bibliogrficas
http://www.sobiologia.com.br/conteudos/Reinos/biomonera3.php
_Filoneto, M Pilonetto,C.V. manual de procedimentos laboratoriais em microbiologia
POPs em Microbiologia. Curitiba microscience, 1998.
_Farmacopia dos Estados Unidos do Brasil. 2 ed. So Paulo: Siqueira. 1959.
http://www.revistas.usp.br/rfmvusp/article/viewFile/62539/65337
http://www.epsjv.fiocruz.br/upload/d/cap3.pdf
http://www.tuasaude.com/antibiograma/
http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/controle/rede_rm/cursos/atm_racional/mod
ulo2/metodos5.htm
http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/controle/rede_rm/cursos/boas_praticas/mo
dulo5/microdiluicao.htm