Studiul activitii de formare a porilor de ctra peptida

alameticina prin tehnici de electrofiziologie

n acest experiment ne-am propus s investigm interaciunea dintre o peptid

antifungic model, alameticina, i bistraturi lipidice planare reconstituite. Aceast peptid
formeaz n membrane pori apoi conductori care, la aplicarea unei diferene de poten ial
electric, permit trecerea ionilor prin bistratul lipidic.
Am format n laborator membrane lipidice artificiale alctuite din fosfatidilcolin de
puritate 30%. Dup verificarea stabilitii acestor membrane, am adugat n sistem, de partea
cis a bistratului lipidic (legat la mas, V=0), un volum dintr-o solu ie stoc de alameticin.
Peptidele difuzeaz prin soluia electrofiziologic i se adsorb la nivelul membranei lipidice
artificiale. Datorit proprietilor lor de amfipaticitate, la interfaa dintre bistrat i mediul apos
vor adopta o structur secundar de -helix cu aminoacizi hidrofobi pe o parte i hidrofili pe
cealalt parte a helixului. Acest structur permite inseria peptidelor n interiorul membranei
i asocierea lor sub forma unor oligomeri transmembranari favorabili din punct de vedere
energetic, formai din cel puin 4 monomeri. Aceste structuri sunt de tipul unor canale ionice,
cptuite n interior de aminoacizi polari aflai n contact cu moleculele de ap i n exterior
de aminoacizi hidrofobi, aflai n contact cu lanurile hidrocarbonate ale lipidelor.
Aa cum este prezentat schematic n figura 1, numrul minim de monomeri care
formeaz un por este de 4.
O membran lipidic pur este impermeabil pentru ioni. n absena porilor, la
aplicarea unei diferene de potenial se nregistreaz un curent ionic rezidual foarte mic,
aproape de zero. Cnd patru monomeri se asociaz i formeaz un por, la aplicarea unei
diferene de potenial se nregistreaz un curent ionic cu o anumit amplitudine. Acesta a fost
definit ca fiind prima stare conductiv a peptidei alameticina. Acest reacie este reversibil.
Monomerii pot ulterior disocia, astfel nct porul dispare i curentul ionic ajunge din nou la
valoarea de zero. O alt situaie este cea n care un al cincilea monomer se asociaz unui por
format, transformndu-l astfel ntr-un por cu diametru mai mare, aflat n a doua stare
conductiv a alameticinei. Acest lucru se observ printr-un salt al curentului ionic de la
valoarea iniial la una cu amplitudine mai mare (figura 2).
Cercetrile au artat c se pot asocia astfel pn la 12 monomeri ns, cu ct porul este
mai mare, cu att este mai instabil.

Figura 1: Reprezentare schematic a oligomerilor de alameticin n prima, a doua,

respectiv a treia stare conductiv, vizualizai n sec iune transversl, paralel la planul
membranei. Monomerii de alameticin sunt simbolizai prin cercuri roii iar capetele polare
ale lipidelor prin cercuri portocali. Porul de alameticin n starea conductiv I are diametrul
dI (4 monomeri), n starea conductiv II are diametrul d II (5 monomeri), iar n starea
conductiv III are diametrul dIII (6 monomeri).

Inseria i formarea porilor transmembranari de ctre peptide este monitorizat prin

nregistrarea n timp a curentului ionic prin membrana lipidic n urma aplicrii din exterior,
de o parte i de cealalt a membranei a uor valori diferite ale diferenei de potenial.
Datorit caracterului dipolar al peptidei i a modului de inserie n membran cu
captul N-terminal, porii se formeaz doar sub aciunea unui cmp electric negativ. Dac
compartimentul unde se adaug peptida este legat la mas (V=0), peptida se inser la
stabilirea unui potenial negativ pe electrodul din compartimentul opus. Diferene de poten ial
pozitive nu determin apariia unor fluctuaii n curentul ionic nregistrat.

Figura 2: Fluctuaii ale curentului ionic mediat de porii de alameticin aflai n prima O I, a doua
OII, respectiv a treia stare conductiv O III. C reprezint starea nchis, atunci cnd nu exist niciun
canal n bistratul lipidic i curentul ionic este aproape zero. Diferen a de poten ial aplicat a fost
V = -80 mV.

nregistrrile de curent ionic arat faptul c activitatea peptidei se intensific odat cu

creterea diferenei de potenial aplicate. Formarea porilor de alameticin este voltaj
dependent (figura 3).

Figura 3: Curentul ionic nregistrat prin porii de alameticin la aplicarea unei diferen e de
potenial de -60 mV (stnga, sus), respectiv -90 mV (dreapta, sus). Vedere detaliat a fluctua iilor
de curent ionic mediat de porii de alameticin afla i n prima O I, a doua OII, respectiv a treia stare
conductiv OIII (jos).

De asemenea, n vederea detaliat din partea de jos a figurii, se observ c

amplitudinea strilor conductive corespunztoare unui singur canal de alameticin aflat n
prima, a doua, respectiv a treia stare conductiv este voltaj dependent i crete cu diferen a
de potenial aplicat. Acest lucru poate fi uor observat i n diagramele curent-tensiune care
dau dependena amplitudinii curentului corespunztor celor trei stri conductive de diferena
de potenial aplicat (figura 4).
Am construit aceste diagrame determinnd, pentru fiecare diferen de potenial
aplicat (-60, -70, -80, respectiv -90 mV), i pentru fiecare stare conductiv n parte, cte zece
valori ale amplitudinii curentului ionic prin por, pentru care am calculat valoarea medie i
eroarea standard.
Citirile amplitudinii curentului s-au fcut n softul de prelucrare dedicat Clampfit, iar
prelucrarea statistic i reprezentarea grafic s-au realizat cu ajutorul softului Origin.

Figura 4: Diagrame curent tensiune care arat dependena amplitudinii curentului corespunztor
strii conductive I (A), II (B), respectiv III (C) de diferen a de poten ial aplicat. Linia ro ie
reprezint fitarea liniar a acestor date prin origine.

Prin fitarea liniar a acestor date se obine o dreapt care trece prin origine i a crei
pant reprezint inversul rezistenei canalului de alameticin n fiecare dintre cele trei stri.
Curentul rezistiv rezidual prin bistratul lipidic poate fi neglijat deoarece este foarte mic n
comparaie cu cel mediat de porii de alameticin (rezistena bistratului este foarte mare).
Astfel, utiliznd legea lui Ohm pentru sistemul format de membran i porii de
alameticin, se poate determina rezistena electric a acestor canale (tabelul 1).

Tabel 1. Valorile rezistenei electrice a cananlului ionic de alameticin calculate prin fitarea
liniar a datelor din diagramele curent tensiune.

tg =1/R (pA/mV)

R (G)

Starea conductiv I

0.078 +/- 0.004

~13

Starea conductiv II

0.497 +/- 0.015

~2

Starea conductiv III

1.331 +/- 0.027

~0.8