Sunteți pe pagina 1din 42

CLOSTRIDIUM

PERFRINGENS
INSTRUIRE

GENUL CLOSTRIDIUM
Bacteriile din genul Clostridium sunt:
anaerobe,
mobile in marea lor majoritate,
sporul depaseste in diametrul transversal
pe cel al celulei vegetative.

Genul Clostridium cuprinde specii:


patogene
nepatogene.

Speciile patogene pot fi clasificate in functie de


mecanismele patogenitatii in:
specii predominant sau exclusiv toxigene (C.tetani, C.botulinum)
specii predominant toxigene si virulente (C.chauvoei, C.septicum,
C.perfringens, C.novyi)

specii ocazional patogene (C.histollyticum, C.sordellii, C.bifermentans,


C.sporogenes)

specii saprofite nepatogene (C.butiricum, C.putrefaciens,


C.tetanomorphum, C.tetani)
3

Istoric
1892 Welch si Nuttal au izolat si descris, dintr-un cadavru uman,
un germen care astazi este incadrat in specia Clostridium perfringens,
1893 - Fraenkel evidentiaza prezenta bacteriei intr-o leziune de
gangrena umana,

Mai tarziu au fost izolate bacterii asemanatoare din infectii ale


ovinelor, acestea au fost descrise sub diferite nume si omologate ca
biotipuri
1926, Dalling - agentul dizenteriei anaerobe a mieilor= tip B,
1930, McEwen- C.paludis ,agentul unei enterotoxiemii la oi = tip C,
1932, Bennetts C.ovitoxicus prezent in infectii similare = tip D ,
1943, Brosworth- agentul unor enterotoxiemii la vitei = tip E,
1949, Zeissler, Raszfeld -Sternberg si Oaklei -agentul unor
enterotoxiemii la om =tip F.

Caractere morfologice
Bacil scurt si gros de 3-9/0,9-1,3 microni,

capete retezate,
dispus in frotiuri izolat sau in lanturi scurte,
neciliat,
Capsulat , capsula greu evidentiabila, se
coloreaza prin metoda Casares Gill, nu prin
metode uzuale.

Germen sporulat,
sporii sunt ovali cu pozitie subterminala,
gram pozitiv.
5

Bacili relativ scurti cu capete taiate


drept, gram pozitivi.
6

Caractere culturale

Anaerob,mai tolerant fata de prezenta unor


cantitati reduse de oxigen comparativ cu ceilalti
anaerobi.
Aspecte culturale:
pe medii lichide:
turbiditate intensa cu productie de gaz si miros ranced,

pe medii solide:
in suprafata
colonii rotunde cu diametru de 2-5 mm,
cu suprafata neteda si
margini regulate cu centru mai opac,
de culore gri si
periferia transparenta,
in profunzime
colonii de forma lenticular-discoidala,
productie de gaz abundenta, dilacerand mediul .

Colonii de C.perfringens de culoare


neagra in mediu SC.
8

Fermentarea mediului cu tioglicolat.

Proprietati biochimice
Actiune lecitinazica
intensa,
evidentiabila pe baza opacifierii agarului cu galbenus de ou.

Reducerea nitratilor
depinde de compozitia mediului,
pozitiva numai in conditiile unor slabi donatori de hidrogen.

Fermenteaza numeroase substante


hidrocarbonate:

glucoza,
fructoza,
lactoza,
galactoza,
maltoza,
zaharoza,
hidrolizeaza amidonul

10

Proprietati biochimice
Comportarea fata de globulele rosii este in
functie de:
echipamentul toxic,
biotip.

Hemoliza intensa si completa


este produs de majoritatea tulpinilor,

Hemoliza partiala
datorata toxinei (lecitinaza C),
frecventa la tulpinile de tip A,

Sunt nehemolitice:
tulpinile de tip A care produc toxinfectii alimentare
o parte din tulpinile de tip C
11

Proprietati biochimice
C.perfringens:
lichefiaza gelatina,
produce H2 S,
cuaguleaza laptele turnesolat,
nu produce indol.

12

Proprietati antigenice
Toate tulpinile de C.perfringens poseda
antigene somatice comune,
antigene specifice de biotip
fapt care permite diferentierea intre biotipuri prin
reactii serologice (seroneutralizare)

In cadrul unor biotipuri s-au putut


identifica mai multe tipuri antigenice:
biotipul A cuprinde 8 tipuri serologice (dupa
Moustardier, 1968),
Pentru diferentierea tipurilor reactia cea mai
adecvata este seroneutralizarea,
Imunofluorescenta directa

13

Ecologie
Germen saprofit, prezent in:
sol,
apa marilor si oceanelor,
tubul digestiv al animalelor (ovinelor,
suinelor, etc),
diferite alimente
carne ,
legume ,
furaje.
14

Sensibilitatea fata de diferiti


factori de mediu
Sporii majoritatii biotipurilor sunt distrusi
la
100 de C in 2-3 minute (exceptie: tip F -sporii
rezista la aceasta temperatura pana la 2 ore).

Antibioticele cele mai active sunt:


penicilina
eritromicina
cloramfenicolul

S-au identificat bacteriofagi specifici fata


de Clostridium perfringens.
15

Patogenitate
Mecanismele patogenitatii.
virulent si toxigen,
secreta o toxina foarte activa "in vivo" si "in vitro,"
elaborarea toxinei "in vitro" este conditionata de:
tulpina ,
mediul de cultura,
temperatura de incubare (nivel optim de 37-40C).

Toxina
are structura proteica,
costituita din mai multi factori:
notati cu literele alfabetului grecesc,
12 factori cu activitate biologica diferita.
16

Patogenitate
Apecierea patogenitatii tulpinilor se face pe

baza
activitatii hemolitice,
activitatii lecitinazice.

Pe baza distributiei si proportiei factorilor toxici

s-au identificat 6 biotipuri (A,B,C,D.E,F).


Pentru tipizarea tulpinilor de C.perfringens se

foloseste reactia de seroneutralizare cu seruri


antitoxice specifice de biotip.

17

Infectia naturala
Germen conditionat patogen,
comensal al mucoaselor tubului digestiv,
provoaca infectii la diferite specii de animale
caracterul infectiei depinde de:

biotip,
patogenitatea tulpinii,
factorii de mediu,
varsta animalelor (sunt afectate animalele nounascute)

forma anatomoclinica a bolii este o


o enterita,
o enterotoxiemie.

18

Infectia naturala
Ovinele
sunt specia cel mai frecvent afectata si
pentru care infectia cu C.perfringens au
cele mai importante implicatii economice,
datorita
procentului ridicat de pierderi de morbiditate si
mortalitate la miei si uneori la oile adulte.

La miei infectia poarta numele de dizenteria


anaeroba si este produsa de tipul B. Mai rar
se izoleza la miei tipurile C si D.
19

Bovinele

Infectia naturala

fac mai rar infecti clinice cu C. perfringens


comparativ cu ovinele,
cel mai des sunt afectati viteii la care se
izoleaza tipurile C si A

Suinele
se infecteaza cu tipul C boala
este mai frecventa la purcei
se caracterizeaza prin:
enterita necrotica,
enterotoxiemii (la animalele adulte).

20

Infectia naturala
Cabalinele se infecteaza
de regula cu tipul A (se izoleza din leziunile de
gangrena gazoasa)
rareori cu tipul B semnalat in enterotoxiemii la
manji.

Alte animale care fac boala sunt


nurcile,
iepurii,
galinaceele.

Omul este de asemenea receptiv


dominant este tipul A.

21

Diverse medii de cultura si


reactivi pentru
C.perfringens

Agar cu sulfit si cicloserina ( SC )


Emulsie de galbenus de ou
Mediu lichid cu tioglicolat
Mediu cu sulfit lactoza
Mediu cu lactoza gelatina
Mediu cu nitrat pentru mobilitate
Reactiv pentru detectia nitritului si
altele.

22

Metoda orizontala pentru


numararea Clostridium
Perfringens
SR EN ISO 7937/2005

Mod de lucru
Se cantaresc 10 g de proba de analizat,
Se adauga 90 ml de ser fiziologic
peptonat .
Se fac dilutiile inseriate
Se transfera, cu ajutorul unei pipete
sterile cate 1 ml din suspensia initiala
cat si din dilutii in centrul unei cutii Petri
24

Mod de lucru
Se toarna 10-15 ml agar SC in fiecare cutie
si se amesteca bine inoculul rotind usor
cutiile.
Cand mediul s-a solidificat se adauga inca un
strat de 10 ml agar SC.
Se pun cutiile in anaerostat se incubeaza la
35-37C timp de 20 2 ore.
Se procedeaza la fel cu dilutiile decimale
succesive.
O incubare mai lunga poate determina o
25
inegrire mai puternica a cutiilor.

Numararea si selectarea
coloniilor
Se retin cutiile Peri care contin mai
putin de 150 de colonii la toate
dilutiile.
Se numara coloniile negre de
Costridium perfrigens prezumtive.
Se selecteaza pentru confirmare 5
colonii caracteristice.

26

Confirmare biochimica
Procedeul de confirmare folosind
mediul LS
Se insamanteaza fiecare colonie
selectata in mediu cu tioglicolat.
Se incubeaza in conditii anaerobe la
35-37 C timp de 18-24 de ore.
Dupa incubare se transfera imediat 5
picaturi de cultura in mediul LS.
27

Confirmare biochimica
Se incubeaza la 46 C timp de 18- 24 de
ore, in baie de apa.
Eprubetele sunt citite pentru producerea
de gaz si prezenta culorii negre.
Eprubetele cu mediul LS sunt citite pentru
producerea de gaz si prezenta de colonii
negre(precipitat de sulfura de fier).
Eprubetele in care tuburile Durham cotin
gaze in mai putin de din inaltimea lor si
cele care au un precipitat negru sunt
considerate pozitive.
28

Confirmare biochimica
In caz de indoiala cand in tubul Durham in
mediul inegrit exista gaze in mai putin de
din inaltime se transfera imediat cu o
pipeta sterila 5 picaturi din cultura
anterioara a mediului LS intr-o alta
eprubeta cu mediu LS.
Se incubeaza la 46C 18-24 de ore in baie
de apa.
Se citeste eprubeta dupa acelasi principiu.
In toate celelalte cazuri, eprubetele
29
trebuie considerate negative.

Confirmare biochimica
Bacteriile care formeaza colonii
caracteristice in mediu SC si care dau
o confirmare pozitiva cu mediul LS
sunt considerate ca fiind Clostridium
perfringens .

30

Exprimarea rezultatelor
Metoda de calcul ISO 7218
Se calculeza numarul N de Clostridium
perfringens prezent in 1 ml sau 1 g produs:

N = a/ V(n1+0,1 n2) d
a - suma coloniilor de Clostridium perfringens
numarate dupa identificare in toate cutiile Petri din
doua dilutii succesive
V -volumul de inocul depus in fiecare cutie,in ml
n 1- numarul de placi selectate la prima dilutie,
n 2 -numarul de placi selectate la a doua dilutie ,
d- gradul de diluare care corespunde la prima dilutie
31
selectata.

Bacili relativ scurti cu capete taiate


drept, gram pozitiv.
32

Colonii de C.perfringens de culoare


neagra in mediu SC.
33

Colonii de C.perfringens in mediu SC

34

Colonii de C.perfringens pe mediu SC.

35

Fermentarea mediului cu tioglicolat.

36

Bulion LS cu producere dec gaze si


inegrirea mediului.
37

Metoda alternativa
Confirmare biochimica

Procedeul de confirmare
folosind mediul nitrat pentru
determinarea mobilitatii si
mediul lacoza-gelatina
Necesita colonii caracteristice bine izolate.
Se inoculeaza 5 colonii caracteristice in
mediul de tioglicolat lichid, dezaerat.
Se face incubarea in conditii anaerobe, la
35-37C, timp de 18-24 ore.
Se striaza coloniile pe placute cu mediu SC.
Se selecteaza din fiecare cutie Petri o
colonie caracteristica pentru confirmare.
39

Inocularea si citirea mediului


lactoza-gelatina
Se inoculeaza fiecare colonie selectata in
mediul lactoza-gelatina, proaspat dezaerat.
Se incubeaza in conditii anaerobe la 35-37C,
timp de 24 h.
Se examineaza eprubetele pentru prezenta
gazului si a culorii galbene, ceea ce indica
fermentarea lactozei.
Eprubetele sunt racite timp de o ora la 5C si se
verifica lichefierea gelatinei.
Se reincubeaza, in caz de solidificare, pentru 24
h si se verifica din nou lichefierea gelatinei.
40

Interpretare
C.perfringens:
Produc colonii negre in mediul SC,
Sunt imobile,
Reduc nitratul in nitrit,
Produc acid si gaz din lactoza,
Lichefiaza gelatina in 48 h.
Reactia este imediata si intensa
(culturile care dau o reactie slaba pentru
nitrit -roz- trebuie eliminate)
41

Succes!
42