Sunteți pe pagina 1din 38

UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI CLUJ-NAPOCA

Facultatea de Biologie i Geologie

Dana Cristina uteu

STUDII DE TAXONOMIE MOLECULAR LA UNELE


SPECII DE PLANTE ENDEMICE SAU RARE DIN
ROMNIA
- Rezumatul tezei de doctorat -

Coordonator tiinific
Prof. Dr. Octavian Popescu

Cluj-Napoca
2012

CUPRINS REZUMAT

OBIECTIVELE PREZENTULUI STUDIU

Pag. 1

INTRODUCERE

Pag. 2

CONSIDERAII TEORETICE

Pag. 2

1. Filogenia i analizele filogenetice (selectiv)

Pag. 2

2. Markeri moleculari utilizai n filogenia i taxonomia plantelor

Pag. 3

(selectiv)
3. Caracterizarea din punct de vedere taxonomic, morfologic, ecologic i

Pag. 3

al variabilitii fenotipice a plantelor studiate (selectiv)


CONTRIBUII PERSONALE

Pag. 8

4. Materiale i metode (selectiv)

Pag. 8

5. Rezultate i discuii (selectiv)

Pag. 9

5.1. Rezultate la genul Pulmonaria

Pag. 9

5.2. Discuii la genul Pulmonaria

Pag. 10

5.3. Concluzii la genul Pulmonaria

Pag. 11

5.4. Rezultate la genul Onosma

Pag. 11

5.5. Discuii la genul Onosma

Pag. 15

5.6. Concluzii la genul Onosma

Pag. 17

5.7. Rezultate la genul Eritrichium

Pag. 17

5.8. Discuii la genul Eritrichium

Pag. 21

5.9. Concluzii la genul Eritrichium

Pag. 22

5.10. Rezultate la specia Primula leucophylla

Pag. 22

5.11. Discuii la specia Primula leucophylla

Pag. 26

5.12. Concluzii la specia Primula leucophylla

Pag. 27

5.13. Rezultate la specia Primula intricata

Pag. 27

5.14. Discuii la specia Primula intricata

Pag. 30

5.15. Concluzii la specia Primula intricata

Pag. 32

Bibliografie selectiv

Pag. 33

CUPRINSUL TEZEI DE DOCTORAT

Pag. 35

CUVINTE CHEIE

Pag. 36

Rezumatul tezei de doctorat

Obiectivele prezentului studiu


Obiectul studiului l reprezint speciile/subspeciile endemice pentru Romnia sau
endemitele daco-balcanice i unele specii rare. n cadrul fiecrei specii de plante au fost
stabilite unul sau mai multe obiective:
Pulmonaria filarszkyana
Obiectivul 1: Identificarea unor markeri moleculari barcode capabili s diferenieze speciile
Pulmonaria rubra i Pulmonaria filarszkyana;
Obiectivul 2: Investigarea relaiilor filogenetice dintre Pulmonaria rubra i Pulmonaria
filarszkyana;
Onosma pseudoarenaria
Obiectivul 1: Investigarea relaiilor filogenetice dintre Onosma arenaria i Onosma
pseudoarenaria;
Obiectivul 2: Estimarea diversitii genetice a populaiilor de Onosma arenaria i Onosma
pseudoarenaria din Romnia;
Eritrichium jankae
Obiectivul 1: Investigarea relaiilor filogenetice dintre Eritrichium nanum i Eritrichium
jankae;
Primula leucophylla
Obiectivul 1: Identificarea unor markeri moleculari barcode capabili s diferenieze speciile
Primula elatior i Primula leucophylla;
Obiectivul 2: Investigarea relaiilor filogenetice dintre Primula elatior i Primula leucophylla;
Obiectivul 3: Redefinirea arealului speciei Primula leucophylla pe baza analizelor
moleculare;
Primula intricata
Obiectivul 1: Investigarea relaiilor filogenetice dintre Primula elatior i Primula intricata.

Rezumatul tezei de doctorat

Introducere
Prezentul studiu se nscrie pe direcia de revizuire taxonomic prin metode moleculare
a unor specii de plante al cror statut taxonomic este discutabil. Speciile/subspeciile endemice
sau rare selectate pentru studiu sunt caracterizate de un statut taxonomic incert, ele fiind
considerate, doar pe baza caracterelor morfologice i n absena unor studii genetice, de ctre
diferii autori ca avnd un statut taxonomic fie de specie distinct, fie subspecie sau chiar
varietate a unei alte specii. ntruct diferenele dintre caracterele morfologice care fac
distincia dintre specii/subspecii sunt minore i pot fi urmarea unor polimorfisme individuale
determinate de factorii de mediu i nu a unor diferene interspecifice, s-a considerat oportun
realizarea unor studii de genetic molecular care s contribuie la elucidarea statutului lor
taxonomic. Taxonii problematici selectai pentru studiu sunt urmtorii: Pulmonaria
filarszkyana, Onosma pseudoarenaria, Eritrichium jankae (familia Boraginaceae), Primula
leucophylla i Primula intricata (familia Primulaceae), iar statutul lor taxonomic va fi discutat
prin prisma relaiei lor cu speciile ale cror subspecii sau varieti sunt considerai a fi:
Pulmonaria rubra, Onosma arenaria, Eritrichium nanum i Primula elatior.

Consideraii teoretice
1. Filogenia i analizele filogenetice (selectiv)
Principiul pe care se bazeaz filogenetica este acela c membrii unui grup sau clade
mprtesc o istorie evolutiv comun i sunt mai nrudii ntre ei dect cu membrii altui
grup. Filogenia molecular presupune utilizarea macromoleculelor biologice (proteine, acizi
nucleici) pentru a obine informaii asupra istoriei evolutive a taxonilor i asupra legturilor
lor de nrudire.
Metodele filogenetice de construire a arborilor implic parcurgerea mai multor etape,
ulterior obinerii setului de date: alinierea secvenelor, determinarea modelului de substituie,
construirea arborelui i evaluarea arborelui. Exist dou grupe majore de metode de construire
a arborilor filogenetici, i anume: metode bazate pe distan i metode bazate pe analiza de
caractere. Cele mai cunoscute metode fenetice sunt UPGMA (Unweighted Pair Group
Method with Arithmetic means), NJ (Neighbor Joining) i ME (Minimum Evolution), iar

Rezumatul tezei de doctorat


cele mai cunoscute metode bazate pe analiza de caractere sunt: MP (Maximum Parsimony),
ML (Maximum Likelihood) i Bayesian inference.

2. Markeri moleculari utilizai n filogenia i taxonomia


plantelor (selectiv)
Tipurile variate de markeri moleculari difer n ceea ce privete principiul,
metodologia i aplicaiile, ceea ce creaz problema selectrii markerului cel mai potrivit
pentru rezolvarea temei de cercetare propuse. Dei n filogenetica plantelor, cel mai ridicat
grad de ncredere n arborii generai este dat de congruena dintre informaiile procurate de la
cele trei genomuri: plastidial, nuclear i mitocondrial (Savolainen i Chase, 2003), totui,
multe studii se bazeaz pe utilizarea informaiilor provenite de la un singur genom, o
explicaie posibil fiind lipsa unor markeri genetici potrivii. Deoarece filogeniile
intraspecifice clar rezolvate pe baza a mai multor sisteme de date independente sunt dificil de
obinut i costisitoare, se ajunge la utilizarea a ctorva sisteme de markeri mai mult sau mai
puin optime, aceasta reprezentnd un compromis ntre nivelul de variabilitate suficient de
ridicat al markerilor i utilitatea lor pentru a rezolva genealogii clare (Eidesen i colab., 2007).
Cei mai utilizai markeri moleculari n taxonomia i filogenia plantelor se clasific n
urmtoarele dou categorii: proteine i acizi nucleici. Din prima categorie fac parte
izoenzimele iar din cea de a doua fac parte microsateliii, SNP-urile, genele specifice,
regiunile necodificatoare i alte regiuni. Printre principalele metode de detecie a markerilor
moleculari ADN se numr secvenierea, genotiparea, tehnica RFLP, tehnica AFLP i tehnica
RAPD.

3. Caracterizarea din punct de vedere taxonomic, morfologic,


ecologic i al variabilitii fenotipice a plantelor studiate
(selectiv)
Pulmonaria rubra (denumire popular mierea ursului, plmnari) este un endemit
carpatico-balcanic caracteristic fgetelor montane din Carpai. Este o specie frecvent din
etajul montan mijlociu pn n cel subalpin, prin pduri i buruieniuri, n fgete, brdeto3

Rezumatul tezei de doctorat


fgete i brdete. n etajul alpin inferior se gsete sporadic prin buruieniurile de sub
jnepeniuri i tufriuri de Alnus viridis, pn la circa 2000 m altitudine (Tuber, 1982).
n ceea ce privete variabilitatea speciei, cei mai muli autori consider c specia P.
rubra are dou subspecii: P. rubra subsp. eurubra (P. rubra subsp. rubra) (fig. 1) i P. rubra
subsp. filarszkyana (Srbu i colab., 2001; Guuleac, 1960; Beldie, 1979). Totui, Borza
consider P. filarszkyana ca fiind doar o varietate a Pulmonariei rubra (Borza, 1947), n timp
ce Ciocrlan (2000) consider specia P. filarszkyana ca fiind o specie distinct, fr legturi
taxonomice cu P. rubra.

Fig. 1. Pulmonaria rubra subsp. rubra (foto: Dana uteu).

P. filarszkyana (P. rubra subsp. filarszkyana) este o specie endemic, aparinnd


Carpailor de Est (Beldie, 1979) care se difereniaz de P. rubra prin indumentul mult mai
scurt (1 mm) i mai moale (Guuleac, 1960). n general se consider a fi rspndit n
pdurile ntunecoase de molid i ntre jnepeni, n munii Maramureului, Rodnei i
Suhardului.
Onosma arenaria (denumire popular otrel) este o plant robust, hispid, bogat
foliat, cu aspect verde cenuiu. n timp ce la nivel de continent este rspndit peste tot, cu
excepia regiunilor nordice, n Romnia are o distribuie controversat, unii autori considernd
c se ntlnete n locuri nisipoase, coline aride, stepe, dune fixate fie din regiunile Baia Mare,
Cluj, Hunedoara, Timioara, Bucureti, Constana, Iai (Grinescu i Nyrdy, 1960) fie doar
n Delta Dunrii (Teppner, 1996).
n ceea ce privete variabilitatea speciei, Ciocrlan (2000) consider c prezint dou
subspecii: O. arenaria subsp. arenaria i O. arenaria subsp. pseudoarenaria, cea din urm
considerat un endemit pentru Transilvania.
4

Rezumatul tezei de doctorat


Onosma pseudoarenaria (O. arenaria subsp. pseudoarenaria) este o specie heliofil
care habiteaz n zona colinar (fig. 2), pe soluri uscate, nisipoase i se caracterizeaz prin
populaii compuse din indivizi puini, deoarece se nmuleste greu din cauza fructelor
sclerificate, ceea ce i confer statutul de specie vulnerabil (Dihoru i Negrean, 2009). Difer
de O. arenaria prin urmtoarele caracteristici: numrul de cromozomi (2n=26 i nu 2n=20 ca
i n cazul O. arenaria), setule de 4-5 ori (nu de 8-10 ca i n cazul O. arenaria) mai scurte
dect setele iar spaiul dintre pernie este glabru (nu acoperit de periori rari i scuri ca i la
O. arenaria).
Este rspndit n regiunile Cluj, Braov, Hunedoara (Grinescu i Nyrdy, 1960).
n timp ce unii autori (Ciocrlan, 2000, 2009) o consider specie subordonat speciei
O. arenaria, ali autori (Rauschert, 1976) i subordoneaz 8 subspecii din Europa Central i
din Peninsula Balcanic, printre care i Onosma pseudoarenaria subsp. pseudoarenaria
considerat un endemit transilvnean, iar Flora Europaea consider aceast specie ca
reprezentnd un endemit pentru Romnia i neavnd subspecii subordonate, subspeciile
alocate de Rauschert fiind considerate specii independente (Ball i Riedhl, 1972).

Fig. 2. Onosma pseudoarenaria n habitatul natural de la Suatu, jud. Cluj (foto: Liviu Filipa).

Eritrichium nanum (denumire popular ochiul arpelui) este o plant rar, cu populaii
srace, care se ntlnete pe stncriile i bolovniurile calcaroase expuse la soare din etajul
alpin i subalpin (fig. 3). Se ntlnete n Alpi Centrali i de Sud i n Carpaii de S-E (Chater,
1972).
Variabilitatea acestei specii este destul de discutat, unii autori considernd
subspeciile genului drept specii separate sau varieti. Flora Europaea (Chater, 1972) i

Rezumatul tezei de doctorat


Ciocrlan (2009) iau n considerare doar dou subspecii: E. nanum subsp. nanum i E. nanum
subsp. jankae.

Fig. 3. Eritrichium nanum subsp. nanum n habitatul natural din Piatra Iorgovanului (stnga; foto: Dana uteu) i
n Munii Ciuca (dreapta; foto: Liviu Filipa).

Eritrichium jankae (Eritrichium nanum subsp. jankae) este considerat o specie


endemic pentru Romnia (Beldie, 1967; Grinescu, 1960; Borza, 1947; Ciocrlan, 2000;
Chater, 1972). Difer morfologic de E. nanum subsp. nanum prin inflorescena i frunzele
ndesuit alb argintiu lanate, prin tulpini de 5-7,5 cm (nu de 1-5 cm ca i la subsp. nanum), prin
frunzele late de 3-4,5 mm (nu de 1,5-3 mm ca i la subsp. nanum), precum i prin caliciul
puin mai lung, dar are acelai numr de cromozomi.
Se gsete n Munii Rodnei, Ciuca, Brsei, Bucegi, Iezer, Fgra, Cpnii i
Godeanu (Ciocrlan, 2009).
Primula elatior (denumire popular ciuboica cucului) este o specie ierbacee, peren,
diploid 2n=22 (Jacquemyn i colab., 2004). Se ntlnete n pduri mixte de foioase aflate n
zone temperate din Europa de Vest i Central, n nord gsindu-se pn n Danemarca i sudul
Suediei i n est pn n Asia Central (Woodell, 1969). n Romnia este o specie comun
(Nyrdy i Guuleac, 1960).
Variabilitatea Primulei elatior a fost subiectul unor lungi dezbateri n lumea tiinific
i nc nu s-a ajuns la un consens n ceea ce privete formele i varietile acestei specii. Cei
mai muli autori i atribuie acestei specii, printre multe forme, varieti i subspecii, i
subspeciile leucophylla i intricata (Ciocrlan, 2000; Valentine i Kress, 1972; Wright Smith
i Fletcher, 1947).
Primula leucophylla (Primula elatior subsp. leucophylla) prezint o morfologie (fig.
4) asemntoare cu P. elatior, de care se deosebete cu greu. Caracterele care o difereniaz

Rezumatul tezei de doctorat


de aceasta sunt urmtoarele: frunze gri tomentoase pe dos i caliciul de 6-8 mm lungime
(Valentine i Kress, 1972; Ciocrlan, 2000).
Este considerat un endemit al Carpailor Orientali, fiind rspndit n Munii
Maramureului, Rodnei, Giurgeu, Suhard, Postvaru, Ceahlu, Raru, Obcinele Bucovinene
(Nyrdy i Guuleac, 1960), dup unii autori ntlnindu-se i n masivul Piatra Craiului,
Munii Climani, Ciuca, Nemira i Vrancei.

Fig. 4. Primula leucophylla n Munii Ceahlu (foto: Liviu Filipa).

Primula intricata (P. elatior subsp. intricata) se ntlnete n pajitile umede din
regiunea subalpin i alpin, n Munii Pirinei, Alpi i peninsula Balcanic (Nyrdy i
Guuleac, 1960). n Romnia, este o specie rar care habiteaz n Munii Bucegi i Munii
Brsei (Beldie, 1979; Nyrdy i Guuleac, 1960).
Difer de P. elatior prin bracteele mai lungi, lobii corolei mai profund emarginai iar
capsula este de lungimea caliciului (10-12 mm, spre deosebire de P. elatior unde capsula
ntrece cu mult caliciul) (Nyrdy i Guuleac, 1960).
Statutul ei taxonomic este nc dezbtut, unii autori o consider o specie distinct
(Grenier i Godron, 1853; Nyrdy i Guuleac, 1960; uteu i colab., 2011), alii o consider
o varietate a P. elatior (Pax i Knuth, 1889), iar alii o consider drept o subspecie a P. elatior
(Ldi, 1927; Ciocrlan, 2000; Valentine i Kress, 1972; Beldie, 1979; Wright Smith i
Fletcher, 1947).

Rezumatul tezei de doctorat

Contribuii personale
4. Materiale i metode (selectiv)
Strategia de recoltare a materialului biologic
Materialul biologic folosit la analize a fost recoltat din mai pn n septembrie, ntre
anii 2006-2010 din mai multe locaii. S-a ncercat recoltarea unui numr de minim 5 indivizi
din fiecare populaie, care au fost introdui imediat n tuburi pline cu silicagel. n paralel, au
fost recoltate i vouchere care au fost folosite la determinarea fr dubii a speciei colectate.
Ulterior, aceste vouchere au fost puse la presat n ierbar. Adiional, n cadrul analizei speciilor
P. elatior - P. leucophylla - P. intricata s-a folosit i material de ierbar provenit din colecia
Herbarului Cluj-Napoca aflat n incinta Grdinii Botanice Alexandru Borza.
Extracia ADN-ului
S-a realizat prin mai multe metode, i anume: un protocol adaptat dup Doyle i Doyle
(1987, 1990), un protocol adaptat dup Mengoni (Mengoni i colab., 2000) i prin utilizarea
unui kit comercial: DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen).
Analiza microsateliilor cloroplastici
S-a bazat pe utilizarea a ase amorse dintre cele descrise de Weising i Gardner
(1999): ccmp 2, ccmp 3, ccmp 4, ccmp 6, ccmp 7 i ccmp 10. Aceast analiz a fost utilizat
doar pentru testarea polimorfismului n cazul unor populaii aparinnd genurilor Onosma i
Pulmonaria. Interpretarea rezultatelor s-a realizat prin analiza prezenei sau absenei benzilor
corespunztoare amplificrii cu fiecare amors n parte din gelul de poliacrilamid.
Analiza PCR-RFLP
Analiza PCR-RFLP s-a realizat pe trei regiuni din genomul cloroplastic: trnD-T, trnCD i psbA-trnS (dup Demesure i colab., 1995). Aceast analiz a fost utilizat doar pentru
testarea polimorfismului n cazul unor populaii aparinnd genurilor Onosma i Pulmonaria.
Interpretarea rezultatelor s-a realizat prin analiza prezenei sau absenei benzilor
corespunztoare amplificrii cu fiecare amors n parte din gelul de poliacrilamid.
Analiza AFLP
Analiza AFLP s-a realizat la toi indivizii din unele populaii din genurile Primula,
Eritrichium i Onosma. Pentru diferitele genuri de plante luate n lucru s-au folosit combinaii
diferite de amorse sugerate n literatura de specialitate. Scoringul fragmentelor a fost realizat
cu programul GeneMapper v.4.0 (Applied Biosystems) pentru a produce o matrice bazat pe
prezen/absen. Cu ajutorul scriptului n platforma R, AFLPdat, (Ehrich, 2006) s-au estimat
8

Rezumatul tezei de doctorat


proporia locilor polimorfi, diversitatea genetic a lui Nei (Nei, 1987) i indexul de raritate. Pe
baza distanei Nei i Li (Nei i Li, 1979) a fost generat un arbore Neighbor Joining cu ajutorul
programului Splistree v. 4.10 (Huson i Bryant, 2006). Analiza varianei moleculare
(AMOVA) a fost obinut prin utilizarea programului ARLEQUIN v. 3.5 (Excoffier i
Lischer, 2010). Tot n cadrul programului Arlequin a fost calculat i FST (fixation index).
Analiza Principal Coordinate (PCO) s-a efectuat cu programul PAST (Hammer i colab.,
2001) utiliznd doi indici: indicele Simpson i indicele euclidean.
Secvenierea
S-a realizat secvenierea Sanger la toate cele patru genuri de plante n studiu:
Pulmonaria, Onosma, Eritrichium i Primula. S-a efectuat secvenierea att a regiunii ITS1
aparinnd genomului nuclear ct i a unor regiuni aparinnd genomului cloroplastic: intronii
trnL, trnG, rpl16, rps16, spacerii intergenici rpl32-ndhF, rps16-trnK, trnL-trnF, trnD-trnE,
trnS-trnfM, psbD-trnT, trnH-psbA, trnS-trnG, trnT-trnL. Secvenele obinute au fost
asamblate i editate manual utiliznd programul BioEdit v.7.0.9.0 (Hall, 1999). Ulterior,
analiza secvenelor a fost realizat cu programul Mega 4.1 (Tamura i colab., 2007).
Construcia arborilor s-a realizat prin metodele NJ, ML, ME, UPGMA folosind modelul
Kimura 2P (1980).

5. Rezultate i discuii (selectiv)


5.1. Rezultate la genul Pulmonaria
Analiza microsateliilor cloroplastici nu relev polimorfism ntre populaiile de Pulmonaria
rubra i Pulmonaria filarszkyana pentru niciuna dintre amorsele utilizate.
Analiza PCR-RFLP nu relev niciun polimorfism ntre populaiile de Pulmonaria rubra i
Pulmonaria filarszkyana pe baza amorsele DT i AS, dar evideniaz un polimorfism la
nivelul benzilor 2 i 5 datorat inseriei/deleiei unui fragment pentru amorsa CD.
Analiza secvenierii
Din cele 13 regiuni selectate s-a reuit amplificarea i secvenierea doar a 8 regiuni:
ITS1, rpL16, trnG, trnL, rpl32-ndhF, psbD-trnT, trnD-E i trnH-psbA. Secvena concatenat
a acestor markeri, cu lungimea de aproximativ 5000 nucleotide a fost utilizat pentru
construcia de arbori prin metodele ME (fig. 5), ML, NJ, UPGMA.

Rezumatul tezei de doctorat

Fig. 5. Dendrogram la genul Pulmonaria, construit prin metoda ME, pe baza secvenelor ITS1, rpL16, trnG,
trnL, rpl32-ndhF, psbD-trnT, trnD-E i trnH-psbA.

5.2. Discuii la genul Pulmonaria


Investigarea relaiilor filogenetice dintre Pulmonaria rubra i Pulmonaria filarszkyana
Arborii construii prin metodele ME (fig. 5), ML, NJ i UPGMA sunt congrueni i
prezint dou grupri: prima alctuit de populaiile de P. officinalis i cea de-a doua alctuit
din populaiile de P. rubra i P. filarszkyana. Grupul compus din populaiile de P. officinalis
se separ cu o valoare maxim de bootstrap, statutul taxonomic al acestei specii fiind clar
delimitat i prin caractere morfologice. n cadrul celui de al doilea grup, subgruparea alctuit
de P. filarszkyana este unitar, cele trei populaii avnd toate acelai haplotip indiferent de
markerii utilizai. Acest fapt este de neles dac se are n vedere proximitatea dintre punctele
de colectare, toate aparinnd judeului Maramure. Arealul acestui taxon fiind limitat la
cteva locaii din Carpaii de Est, permite existena unui flux genic nentrerupt ntre locaii.
Taxonul P. rubra se separ n dou subgrupri. Prima subgrupare (alctuit din populaiile din
Valea Cepelor, Arieeni i Valea Ierii) se datoreaz unei proximiti n poziia punctelor de
colectare, dar, n ciuda acestei proximiti, toate cele trei populaiile au haplotipuri uor
diferite. A doua subgrupare (alctuit din populaiile din Retezat, Giurgeu-Hma i Prul
Vii Seci) adun populaii din zone/judee ndeprtate ale rii, ceea ce poate fi explicat prin
faptul c traseul fluxului genic dintre populaiile de P. rubra se face de-a lungul arcului
carpatic. P. rubra este o specie marcant a asociaiei Fagetum dacicum, asociaie caracterizat
prin fgete pure sau aproape pure. La nivelul arcului carpatic aceast asociaie continu
aproape nentrerupt, ceea ce nlesnete fluxul genic. Pe de alt parte, populaiile din Carpaii
10

Rezumatul tezei de doctorat


Occidentali sunt separate de cele din Carpaii Orientali i Meridionali prin vi precum valea
Mureului i valea Someului care pot reprezenta bariere geografice pentru fluxul genetic. n
plus, nici pdurile de fag nu continu nentrerupt ntre grupa Carpailor Occidentali i restul
grupelor carpatice.
Dei grupul compus din populaiile de P. filarszkyana este bine delimitat n cadrul
gruprii comune cu P. rubra, totui plasarea acestui taxon n aceast grupare susine mai mult
punctul de vedere conform cruia P. filarszkyana este o subspecie a Pulmonariei rubra i nu o
specie distinct cum este cazul speciei P. officinalis.
5.3. Concluzii la genul Pulmonaria
La genul Pulmonaria, utilizarea microsateliilor cloroplastici nu este suficient,
rezoluia lor nefiind suficient de fin.
Analiza markerilor PCR-RFLP a evideniat polimorfism ntre taxonii P. rubra i P.
filarszkyana atunci cnd se utilizeaz regiunea trnC-trnD.
Studiile bazate pe analiza secvenelor indic faptul c taxonului P. filarszkyana ar
trebui s-i revin statutul de subspecie a speciei Pulmonaria rubra.

5.4. Rezultate la genul Onosma


Analiza microsateliilor cloroplastici nu relev polimorfism ntre populaiile de Onosma sp.
studiate pentru niciuna dintre amorsele utilizate.
Analiza PCR-RFLP nu relev niciun polimorfism ntre populaiile de Onsosma sp. pe baza
amorsei DT, dar evideniaz un polimorfism pentru amorsele CD i AS. Polimorfismul
evideniat de amorsa CD este greu de decelat din cauza diferenelor mici dintre benzi, iar
stabilirea haplotipurilor se realizeaz pe baza amorsei AS. Polimorfismul generat de perechea
de amorse AS este vizibil la banda numrul 5 i reprezint inseria/deleia unui fragment de
nucleotide.
Analiza secvenierii
Pe baza secvenei ITS1 de aproximativ 350 pb au fost construii arbori prin metodele
ME (fig. 6), ML, NJ, UPGMA.
Din cele 13 regiuni selectate s-a reuit amplificarea i secvenierea doar a nou
regiuni: rpL16, trnG, trnL, rpl32-ndhF, psbD-trnT, trnD-E, trnT-L, rps16-trnK i trnH-psbA,
cu lungimea concatenat de aproximativ 6000 nucleotide, care au fost utilizate pentru
construcia de arbori filogenetici. Arborii au fost construii prin metodele ME (fig. 7), ML,
NJ, UPGMA.

11

Rezumatul tezei de doctorat

Fig. 6. Dendrogram la genul Onosma, construit prin metoda ME pe baza secvenei ITS1.

Fig. 7. Dendrogram la genul Onosma, construit prin metoda ME, pe baza secvenelor rpL16, trnG, trnL, rpl32ndhF, psbD-trnT, trnD-E, trnT-L, rps16-trnK i trnH-psbA.

12

Rezumatul tezei de doctorat


Analiza AFLP
Cu ajutorul scriptului n platforma R, AFLPdat, s-au determinat proporia locilor
polimorfi, diversitatea genetic a lui Nei i indicele de raritate (tabelul 1).
Tabelul 1. Proporia locilor polimorfi, diversitatea genetic i indicele de raritate pentru
populaiile genului Onosma.
Specia
Onosma viridis
Onosma visianii
Onosma arenaria

Onosma
pseudoarenaria

Cod
populaie
Ors-OV
BC-OVs
CD-OA
LD-OA
Cb-OP
C-OP
Del-OP
GS-OP
Go-OP
IC-OP
OM-OP
PH-OP
Sf-OP
S-OP

Proporia
markerilor variabili
0,0660
0,1718
0,1762
0,0748
0,2334
0,2951
0,2070
0,2290
0,1277
0,1938
0,1806
0,1806
0,2731
0,1497

Diversitatea
genetic
0,0440
0,0845
0,0819
0,0352
0,1002
0,1353
0,0845
0,1027
0,0851
0,0886
0,0809
0,0771
0,1490
0,0722

Indicele de
raritate (DW)
21,1819
192,8069
28,2933
59,9596
17,7642
29,4634
19,3396
30,9598
5,3400
31,9461
21,0883
44,7643
12,1602
16,4296

Pe baza matricei AFLP a fost generat un arbore Neighbor Joining (fig. 8).

Fig. 8. Dendrogram la genul Onosma, construit prin metoda NJ, pe baza matricei AFLP.

13

Rezumatul tezei de doctorat


Rezultatele analizei Principal Coordinate (PCO) pe baza matricei AFLP folosind
indicele euclidean sunt prezentate n figura 9.

0.16

Coordinate 2

11%

0.12
0.08
0.04
0
-0.04
-0.08
-0.12
-0.16
-0.2
-0.36 -0.3 -0.24 -0.18 -0.12 -0.06
Coordinate 1

0.06 0.12

36%

Fig. 9. Rezultate PCO utiliznd indicele euclidean la genul Onosma pe baza matricei AFLP (negru O.
pseudoarenaria, verde O. viridis, mov O. arenaria, albastru O. visianii).

Analizele varianei moleculare (AMOVA) s-au realizat cu partajarea varianei genetice


totale pe diferite nivele (n cadrul populaiilor, ntre populaii i ntre grupe de populaii).
Aadar, s-au realizat mai multe moduri de definire ale grupelor i pentru fiecare din acestea sa calculat variana molecular pe diferite nivele. Rezultatele obinute n cazul cnd nu se
definete niciun grup sunt trecute n tabelul 2.
Tabelul 2. Rezultatele AMOVA fr definirea grupurilor la genul Onosma.
Sursa variaiei
ntre populaii
n cadrul populaiilor

Procentul de variaie
63,68083
36,31917

FST
0,63681

n cazul n care s-au definit trei grupuri, primul corespunznd speciei O. visianii, al
doilea corespunznd speciei O. viridis (toate cele patru populaiile) i al treilea fiind un grup
comun O. arenaria i O. pseudoarenaria, s-au obinut rezultatele evideniate n tabelul 3.

Tabelul 3. Rezultatele AMOVA cu definirea a trei grupuri la genul Onosma.


Sursa variaiei
ntre grupuri
ntre populaiile din cadrul
grupurilor
n cadrul populaiilor

Procentul de variaie
51,95108
25,69971
22,34921

14

FST
0,77651

Rezumatul tezei de doctorat


n cazul n care s-au definit patru grupuri, primul corespunznd speciei O. visianii, al
doilea corespunznd speciei O. viridis (toate cele patru populaiile), al treilea corespunznd
speciei O. arenaria (cele dou populaii) i al patrulea corespunznd speciei O.
pseudoarenaria (toate cele 12 populaii) s-au obinut rezultatele evideniate n tabelul 4.
Tabelul 4. Rezultatele AMOVA cu definirea a patru grupuri la genul Onosma.
Sursa variaiei
ntre grupuri
ntre populaiile din cadrul
grupurilor
n cadrul populaiilor

Procentul de variaie
48,31
24,38

FST
0,72692

27,30

5.5. Discuii la genul Onosma


Investigarea relaiilor filogenetice dintre Onosma arenaria i Onosma pseudoarenaria
Arborii generai pe baza secvenei ITS1 construii prin metodele ME (fig. 6), ML, NJ
i UPGMA, prezint o structur identic indiferent de metoda utilizat. n cadrul subsubgrupului format din populaiile de O. arenaria i O. pseudoarenaria, se observ o separare
slab a celor doi taxoni, pe baza unei singure transversii. Dei secvenele ITS au rezolvat cu
succes probleme taxonomice intragenerice la genuri strns nrudite cu genul Onosma
(Weigend i colab., 2009; Cohen i Davis, 2009; Mansion i colab., 2009; Selvi i colab.,
2009), n acest caz rezoluia lor este foarte sczut, situaie semnalat i de Kolarik i colab.
(2010) care afirm c cei doi taxoni se grupeaz ntr-o singur clad cu rezoluie intern
sczut datorat unei lipse de variaie.
Arborii construii prin metodele ME (fig. 7), ML, NJ i UPGMA, pe baza secvenelor
concatenate a celor nou regiuni cloroplastice arat o situaie diferit fa de arborii generai
pe baza secvenei ITS1. Populaiile aparinnd taxonilor O. arenaria i O. pseudoarenaria nu
se mai separ cum a fost n cazul secvenei ITS1, singura populaie care se separ din acest
subgrup fiind populaia de O. pseudoarenaria subsp. tridentina colectat din Serbia. Aceast
diferen ntre rezoluia celor doi markeri poate fi explicat pe baza naturii lor. Se cunoate
faptul c ADN-ul cloroplastic din cauza naturii sale nerecombinante, a ratei de mutaie
sczute i a modului de transmitere maternal, pstreaz modelele genetice strvechi i
ilustreaz procese istorice precum izolarea refugial, divergena genetic, efectul fondatorului,
rutele de migrare pentru perioade mai mari de timp dect markerii nucleari motenii
biparental (Comes i Kadereit, 1998), pe cnd ADN-ul nuclear, datorit recombinrii i ratei
crescute de mutaie, ilustreaz procese genetice mult mai recente. Unii autori (Teppner, 1971)
afirm faptul c cele dou specii sunt relativ noi i s-au format prin hibridizare. Astfel, O.
pseudoarenaria probabil a provenit prin alotetraploidizarea unor taxon de tip Haplotricha cu
15

Rezumatul tezei de doctorat


12 cromozomi (exp. O. echioides) cu un taxon de tip Asterotricha cu 14 cromozomi (exp. O.
fastigiata), iar O. arenaria a provenit probabil prin retroncruciarea O. pseudoarenaria cu
unii taxoni de tip Haplotricha cu 12 cromozomi. Dat fiind istoria strns legat a celor doi
taxoni, este explicabil aceast lips de variaie la nivel de ADN cloroplastic, n timp ce la
nivel de ADN nuclear cele dou specii se difereniaz mai rapid una de cealalt. Diferenierea
populaiei de O. pseudoarenaria subsp. tridentina din Serbia fa de celelalte populaii de O.
pseudoarenaria este explicabil att prin faptul c este o subspecie, unii autori chiar
considernd-o specie valid (Ball i Riedhl, 1972), ct i prin semnalul biogeografic datorat
distanei geografice dintre populaii.
n ceea ce privete estimarea parametrilor diversitate genetic, proporia markerilor
variabili i indicele de raritate bazai pe matricea AFLP (tabelul 1), nu se obin rezultate
concludente, valorile fiind relativ egale pentru toate populaiile de Onosma. Singura specie
care se difereniaz clar pe baza indicelui de raritate este specia O. visianii, difereniere care
se poate datora att semnalului taxonomic ct i semnalului biogeografic, populaia fiind
colectat din Croaia.
n ceea ce privete arborele NJ generat pe baza matricei AFLP (fig. 8) se observ
urmtoarea situaie: populaiile de O. viridis i O. visianii se separ de restul grupului, ulterior
separndu-se i una de cealalt. Lungimea ramurilor n cazul acestor dou specii arat i mai
net separarea lor fa de grupul O. arenaria O. pseudoarenaria. n cadrul acestui grup, cele
dou populaii de O. arenaria se grupeaz distinct fa de O. pseudoarenaria cu o valoare
maxim de bootstrap. Lungimea acestei ramuri sugereaz nc o dat faptul c desprinderea
celor dou specii este relativ recent, dar c la nivel de genom nuclear ele sunt clar
difereniate. n cadrul aceluiai grup se mai observ diferenierea a dou populaii: populaia
din Serbia care este evident izolat genetic fa de restul populaiilor de O. pseudoarenaria i
populaia din Govjdia (judeul Hunedoara) care este situat ntr-o zon mpdurit, la poalele
Carpailor de Sud, i este evident de asemenea izolat genetic. Restul populaiilor de O.
pseudoarenaria formeaz subgrupuri distincte. Totui, n cazul populaiilor din Puli (judeul
Hunedoara), Izvorul Criului (judeul Slaj) i Suatu (judeul Cluj), valorile de bootstrap sunt
mari i arat izolarea genetic recent a acestor populaii.
Analiza AMOVA pe baza matricei AFLP atunci cnd nu se definesc grupuri arat o
variaie interpopulaional de 63,68% (tabelul 2) ceea ce sugereaz existena unor populaii
relativ distincte genetic care se pot grupa pe criterii taxonomice i/sau biogeografice. Acelai
fapt este susinut i de valoarea ridicat a indicelui FST (0,63681). n cazul n care se definesc
trei grupuri (tabelul 3), unul compus din populaia de O. visianii, al doilea compus din
16

Rezumatul tezei de doctorat


populaiile de O. viridis i al treilea compus din populaiile de O. arenaria i O.
pseudoarenaria se obine un procent de variaie ntre grupuri de 51,95% ceea ce arat o bun
separare i definire a grupurilor. i creterea valorii indicelui FST la 0,77651 sugereaz aceeai
difereniere clar a grupurilor. Atunci cnd se definesc patru grupuri (tabelul 4), unul compus
din populaia de O. visianii, al doilea compus din populaiile de O. viridis, al treilea compus
din populaiile de O. arenaria i al patrulea compus din populaiile de O. pseudoarenaria se
obine un procent de variaie ntre grupuri uor mai sczut dect n cazul precedent (48,31%)
ceea ce sugereaz c O. arenaria este delimitat de O. pseudoarenaria, dar aceast delimitare
este relativ recent comparativ cu delimitarea speciilor O. visianii i O. viridis fa de grupul
O. arenaria O. pseudoarenaria. Concomitent se observ i o scdere a indicelui FST
(0,72692), ceea ce arat aceeai delimitare mai puin evident a speciei O. pseudoarenaria
fa de O. arenaria, comparativ cu diferenierea clar fa de celelalte specii precum O.
visianii i O. viridis.
Analiza PCO pe baza matricei AFLP (fig. 9) arat o delimitare puternic a speciei O.
visianii fa de restul speciilor, o delimitare clar dar nu aa puternic a speciei O. arenaria, o
delimitare a speciei O. viridis n comun cu cele dou populaii de O. pseudoarenaria mai
divergente (cea din Serbia i cea din Govjdia) i o grupare comun a restului de populaii de
O. pseudoarenaria.
Aadar, majoritatea analizelor efectuate indic faptul c cele dou specii, Onosma
arenaria i Onosma pseudoarenaria, reprezint specii distincte dar relativ recent separate,
rezultat care confirm analizele palinologice i cariologice.
5.6. Concluzii la genul Onosma
Secvena ADNnr, ITS1, relev o uoar separare a taxonului O. arenaria de O.
pseudoarenaria pe baza unei singure modificri punctiforme.
Analiza secvenelor provenite de la nou regiuni aparinnd genomului cloroplastic nu
relev nicio separare a celor doi taxoni.
Rezultatele analizei AFLP separ clar cei doi taxoni.
Pe baza acestor rezultate, adugate la diferenierea cariologic i palinologic, reiese
c cei doi taxoni reprezint uniti distincte desprinse relativ recent una de cealalt.

5.7. Rezultate la genul Eritrichium


Analiza secvenierii
Pe baza secvenei ITS1 de aproximativ 350 pb au fost construii arbori prin metodele
ME (fig. 10), ML, NJ, UPGMA.
17

Rezumatul tezei de doctorat

Fig. 10. Dendrogram la genul Eritrichium, construit prin metoda ME pe baza secvenei ITS1.

Din cele 13 regiuni cloroplastice selectate s-a reuit amplificarea i secvenierea doar a
nou regiuni: rpL16, trnG, trnL, rpl32-ndhF, psbD-trnT, trnD-E, trnT-L, rps16 i trnH-psbA,
cu o lungime concatenat de aproximativ 5800 nucleotide, care au fost utilizate pentru
construcia de arbori filogenetici. Arborii au fost construii prin metodele ME (fig. 11), ML,
NJ, UPGMA.

Fig. 11. Arbore de consens 50% la genul Eritrichium, construit prin metoda ME, pe baza secvenelor rpL16,
trnG, trnL, rps16, rpl32-ndhF, psbD-trnT, trnD-E, trnT-L i trnH-psbA.

Analiza AFLP
Parametrii determinai cu scriptul AFLPdat: locii polimorfi, diversitatea genetic a lui
Nei i indicele de raritate sunt prezentai n tabelul 5.

18

Rezumatul tezei de doctorat


Tabelul 5. Proporia locilor polimorfi, diversitatea genetic i indicele de raritate pentru
populaiile genului Eritrichium.

Specia

Populaia

Eritrichium
jankae

GH-EJ
C-EJ
ALPI-EN
PC-EN
CZ-EN
CG-EN
BO-EN
Rei-EN

Eritrichium
nanum

Proporia markerilor
variabili
0,3957
0,5294
0,2459
0,3636
0,4759
0,3957
0,3689
0,2566

Diversitatea
genetic
0,2228
0,2852
0,1345
0,1903
0,3172
0,1803
0,1786
0,1381

Indicele de
raritate (DW)
25,7616
24,0836
94,9871
42,2113
18,4224
62,1173
39,5904
24,4530

Pe baza matricei AFLP a fost generat un arbore Neighbor Joining (fig. 12).

Fig. 12. Dendrogram la genul Eritrichium, construit prin metoda NJ, pe baza matricei AFLP.

19

Rezumatul tezei de doctorat


Rezultatele AMOVA n cazul n care s-au definit dou grupuri, primul corespunznd
populaiilor de Eritrichium nanum din Alpi i al doilea corespunznd populaiilor din Carpai
de E. nanum i E. jankae, sunt evideniate n tabelul 6.
Tabelul 6. Rezultatele AMOVA cu definirea a dou grupuri la genul Eritrichium.
Sursa variaiei
ntre grupuri
ntre populaiile din cadrul
grupurilor
n cadrul populaiilor

Procentul de variaie
53,48
9,60

FST
0,63086

36,91

n cazul n care se definesc trei grupuri, att pe criterii taxonomice ct i


biogeografice, primul grup coninnd populaiile de E. nanum din Alpi, al doilea grup
coninnd populaiile de E. nanum din Carpai i al treilea grup coninnd populaiile de E.
jankae, se obin rezultatele prezentate n tabelul 7.
Tabelul 7. Rezultatele AMOVA cu definirea a trei grupuri la genul Eritrichium.
Sursa variaiei
ntre grupuri
ntre populaiile din cadrul
grupurilor
n cadrul populaiilor

Procentul de variaie
29,9
15,4

FST
0,42897

54,7

Rezultatele analizei Principal Coordinate (PCO) pe baza matricei AFLP sunt


prezentate n figura 13.

Fig. 13. Rezultate PCO la genul Eritrichium pe baza matricei AFLP (negru populaiile de E. nanum i E.
jankae din Carpai, ptrat albastru populaiile de E. nanum din Alpi).

20

Rezumatul tezei de doctorat


5.8. Discuii la genul Eritrichium
Investigarea relaiilor filogenetice dintre Eritrichium nanum i Eritrichium jankae
Analiza secvenei nucleare ITS1 nu indic nicio separare ntre taxonii Eritrichium
nanum i Eritrichium jankae, toate populaiile aparinnd genului Eritrichium colectate din
Romnia prezentnd acelai ribotip. n schimb, la acest nivel se observ o separaie cert
biogeografic ntre populaiile colectate din Carpai i cele colectate din Alpii Elveieni. Toate
metodele de construire ale arborilor ME (fig. 10), NJ, ML, UPGMA genereaz acelai model
de separaie cu o valoare de bootstrap de 99 ntre populaiile aparinnd celor dou zone
geografice. Aceast separaie de criterii biogeografice este meninut i la nivel de markeri
AFLP. Arborele NJ generat pe baza matricei AFLP (fig. 12) nu indic nicio separare ntre
populaiile de Eritrichium din Romnia, dar le separ pe acestea de populaiile din Elveia cu
o valoare maxim de bootstrap.
Analiza secvenelor cloroplastice prezint o situaie oarecum diferit. n cadrul
arborilor generai pe baza acestor regiuni (fig. 11) se menine aceeai separaie observat la
nivelul secvenei nucleare ITS1 ntre populaiile de Eritrichium colectate din Carpai i cele
colectate din Alpii Elveieni, dar se mai observ o separaie ntre populaiile de Eritrichium
colectate din Romnia, populaia de Eritrichium colectat din Masivul Piatra Craiului
separndu-se de restul populaiilor din Romnia. Aceast populaie are un haplotip
intermediar ntre cel existent la populaiile din Alpi i cel existent la populaiile din Carpai.
n ceea ce privete proporia markerilor variabili i diversitatea genetic estimate pe
baza matricei AFLP (tabelul 5), ntre populaiile de Eritrichium nanum i E. jankae nu se
observ diferene marcante. n cazul indicelui de raritate se observ o valoare mare (94,98)
pentru populaiile din Alpi, ceea ce indic o divergen a acestora fa de populaiile din
Carpai, pe criterii biogeografice, dar nu se observ nicio separare a populaiilor de E. jankae
fa de cele de E. nanum.
n cadrul analizei AMOVA se observ o separaie clar ntre grupul format de
populaiile din Alpi i cel format din populaiile din Carpai, mai mult de jumtate din variaie
(53,48%) datorndu-se componentei intergrupuri (tabelul 6). Identic, creterea indicelui FST
de la 0,37392 atunci cnd nu se definesc grupuri la 0,63086 cnd sunt definite dou grupuri
(cel din Alpi i cel din Carpai), arat faptul c cele dou grupuri sunt bine delimitate. Atunci
cnd se realizeaz analiza AMOVA cu includerea unui grup format din cele dou populaii de
E. jankae (tabelul 7) se obine o valoare mult mai mic a varianei dintre grupuri (29,9%)
dect n cazul precedent, ceea ce indic faptul c grupurile nu sunt bine definite. Acelai lucru
este susinut i de scderea valorii FST de la 0,63086 la 0,42897.
21

Rezumatul tezei de doctorat


Analiza PCO (fig. 13) realizat pe baza matricei AFLP indic aceeai separare ntre
populaiile de Eritrichium din Alpi i restul populaiilor de Eritrichium din Carpai, nici n
acest caz populaiile de E. jankae nu se separ de restul populaiilor din Romnia.
Toate analizele efectuate indic faptul c taxonul E. jankae nu merit rangul de specie
dar nu i merit nici rangul de subspecie, cei doi taxoni nedifereniindu-se la nivel genetic.
Deoarece diferenierea morfologic ntre cei doi taxoni exist, se impune posibilitatea
considerrii taxonului E. jankae drept un ecotip nedifereniat genetic al taxonului E. nanum.
Dezvoltarea indumentului alb argintiu lanat la nivelul inflorescenei i frunzelor, i care duce
la ncetinirea evaporrii apei, poate fi o modificare aprut ca rspuns la factorii de mediu, i
anume climatul secetos n care se gsete E. jankae. Aadar, taxonul E. jankae poate
reprezenta doar un ecotip difereniat morfologic dar nu i genetic al taxonului E. nanum.
5.9. Concluzii la genul Eritrichium
Rezultatele analizelor bazate pe ITS1, ADNcp i AFLP nu indic separarea taxonului
E. jankae de taxonul E. nanum, dar indic separarea biogeografic a populaiilor de E. nanum
din Alpi fa de populaiile de E. nanum din Carpai, cu o excepie reprezentat de populaia
de E. nanum din Munii Piatra Craiului, care pe baza ADNcp are un haplotip intermediar ntre
cele dou grupuri.
Niciuna dintre analizele efectuate nu indic separarea taxonului E. jankae de taxonul
E. nanum, ci relev faptul c cei doi taxoni sunt identici din punct de vedere genetic.
Pe baza rezultatelor obinute, E. jankae reprezint, cel mai probabil, un ecotip
nedifereniat genetic al taxonului E. nanum.

5.10. Rezultate la specia Primula leucophylla


Analiza secvenierii
Secvenele provenite de la trei markeri moleculari: rpL16, psbD-trnT i trnH-psbA, cu
lungimea concatenat de aproximativ 2700 nucleotide, au fost utilizate pentru construcia de
arbori prin metodele ME (fig. 14), ML, NJ, UPGMA.
Analiza AFLP
Parametrii determinai cu scriptul AFLPdat: locii polimorfi, diversitatea genetic a lui
Nei i indicele de raritate sunt prezentai n tabelul 8.

22

Rezumatul tezei de doctorat

Fig. 14. Dendrogram la genul Primula, construit prin metoda ME, pe baza secvenelor rpL16, psbD-trnT i
trnH-psbA.

Tabelul 8. Proporia locilor polimorfi, diversitatea genetic i indicele de raritate pentru


populaiile genului Primula.
Specia

Primula elatior

Primula
leucophylla

Populaia
Ap-PE
Fg-PE
Pos-PE
Pcra-PE
Roc-PE
Rot-PE
Cear-PE
Tatr-Kob-PE
Tatr-Pol-PE
Tatr-Lil-PE
Alp-Pass-PE
Jul-PE
Alp-Alt-PE
Alp-Gross-PE
Ciuc-PL
Gho-PL
Clp-PL
Clt-PL

Proporia markerilor
variabili
0,1630
0,1545
0,2489
0,1888
0,2060
0,1673
0,1931
0,2017
0,2060
0,2017
0,1416
0,0944
0,1373
0,2017
0,1759
0,1330
0,0472
0,1201

23

Diversitatea
genetic
0,0781
0,0746
0,1270
0,0892
0,0987
0,0815
0,0969
0,0978
0,0995
0,1101
0,0695
0,0429
0,0660
0,1021
0,0866
0,0652
0,0472
0,0575

Indicele de
raritate (DW)
18,4976
25,3190
58,5491
20,7056
17,1952
14,0721
11,6968
21,5133
20,0620
21,0011
19,3688
17,8315
16,3522
17,0290
21,8210
14,7325
3,7617
15,6667

Rezumatul tezei de doctorat


Pe baza matricei AFLP a fost generat un arbore Neighbor Joining (fig. 15).

Fig. 15. Dendrogram la genul Primula, construit prin metoda NJ, pe baza matricei AFLP.

Rezultatele AMOVA obinute n cazul cnd nu se definete niciun grup sunt trecute n
tabelul 9.
Tabelul 9. Rezultatele AMOVA fr definirea grupurilor la genul Primula.
Sursa variaiei
ntre populaii
n cadrul populaiilor

Procentul de variaie
44,67
55,33

FST
0,44669

n cazul n care s-au definit dou grupuri pe criterii taxonomice, primul corespunznd
populaiilor de Primula elatior i al doilea corespunznd populaiilor de Primula leucophylla,
s-au obinut rezultatele evideniate n tabelul 10.
Tabelul 10. Rezultatele AMOVA cu definirea a dou grupuri pe criterii taxonomice la genul
Primula.
Sursa variaiei
ntre grupuri
ntre populaiile din cadrul grupurilor
n cadrul populaiilor

Procentul de variaie
14,94951
35,20986
49,84062

FST
0,50159

n cazul n care s-au definit trei grupuri pe criterii biogeografice, primul corespunznd
populaiilor de Primula elatior din Alpi, al doilea corespunznd populaiilor de P. elatior din
24

Rezumatul tezei de doctorat


Tatra i al treilea corespunznd restului de populaii de Primula din Carpaii de S-E, s-au
obinut rezultatele evideniate n tabelul 11.
Tabelul 11. Rezultatele AMOVA cu definirea a trei grupuri pe criterii biogeografice la genul
Primula.
Sursa variaiei
ntre grupuri
ntre populaiile din cadrul grupurilor
n cadrul populaiilor

Procentul de variaie
18,73280
30,21576
51,05144

FST
0,48949

n cazul n care s-au definit patru grupuri att pe criterii taxonomice ct i pe criterii
biogeografice, primul corespunznd populaiilor de Primula elatior din Alpi, al doilea
corespunznd populaiilor de P. elatior din Tatra, al treilea corespunznd populaiilor de P.
elatior din Carpaii de S-E i al patrulea corespunznd populaiilor de Primula leucophylla, sau obinut rezultatele evideniate n tabelul 12.
Tabelul 12. Rezultatele AMOVA cu definirea a patru grupuri pe criterii biogeografice i
taxonomice la genul Primula.
Sursa variaiei
ntre grupuri
ntre populaiile din cadrul
grupurilor
n cadrul populaiilor

Procentul de variaie
21,79270
25,79792

FST
0,47591

52,40938

Analiza Principal Coordinate (PCO) s-a realizat pe baza matricei AFLP. Cnd se
utilizeaz indicele euclidean se obin rezultatele prezentate n figura 16 - stnga, iar cnd se
utilizeaz indicele Simpson se obin rezultatele prezentate n figura 16 - dreapta.

Fig. 16. Rezultate PCO pe baza indicelui euclidean (stnga) i pe baza indicelui Simpson (dreapta) la genul
Primula pe baza matricei AFLP (negru - populaiile de P. elatior din Carpaii de S-E, cruce albastr - populaiile
de P. elatior din Tatra, ptrat albastru - populaiile de P. leucophylla, romb verde - populaiile de P. elatior din
Alpi).

25

Rezumatul tezei de doctorat


5.11. Discuii la specia Primula leucophylla
Investigarea relaiilor filogenetice dintre Primula elatior i Primula leucophylla
n ceea ce privete proporia locilor polimorfi i diversitatea genetic (tabelul 8) nu se
observ nicio separare a P. leucophylla de P. elatior. Valorile obinute pentru P. leucophylla
sunt destul de sczute dar, totui, exist populaii de P. elatior precum cea din Alpi, Soca
Valley, care prezint valori i mai sczute. Indicele de raritate are valori medii, nu arat nicio
izolare pentru populaiile de P. leucophylla fa de cele aparinnd speciei P. elatior.
Analiza Neighbor-Joining (fig. 15) prezint o structurare a populaiilor de P.
leucophylla, dar aceast grupare nu este susinut prin valori de bootstrap menionabile.
Analiza PCO a matricei AFLP relev o grupare pe criterii biogeografice i nu pe
criterii taxonomice. Astfel, populaiile de P. elatior din Alpi se separ de restul populaiilor
din Carpai (fig. 16). Utiliznd indicele Simpson la analiza PCO (fig. 16 - dreapta) se observ
o uoar separare a taxonului P. leucophylla n cadrul grupului din Carpai.
Analizele AMOVA bazate pe matricea AFLP fr definirea vreunui grup (tabelul 9)
arat o variaie mare intrapopulaional (55,33%) i o variaie mic interpopulaional, ceea ce
indic faptul c majoritatea sau chiar toate populaiile utilizate n studiu sunt destul de slab
separate ntre ele i sunt uniforme din punct de vedere genetic. Separaia moderat a
populaiilor este susinut i de valoarea FST de 0,44669. Atunci cnd se face o asamblare pe
criterii taxonomice, P. elatior vs P. leucophylla (tabelul 10), se observ c variaia dintre cele
dou grupuri este sczut (14,94%), ceea ce indic c grupurile nu sunt bine conturate. Cel
mai mare procent de variaie (49,84%) se datoreaz tot componentei intrapopulaionale.
Atunci cnd se realizeaz o asamblare n grupuri pe baza unor criterii geografice (tabelul 11),
se observ c procentul de variaie dintre grupuri crete uor (18,73%) sugernd faptul c
grupurile sunt mai bine definite, dar procentul de variaie cel mai mare se datoreaz tot
componentei intrapopulaionale (51,05%). Cea mai bun conturare a grupurilor se obine
atunci cnd se realizeaz o asamblare att pe criterii geografice ct i taxonomice (tabelul 12).
n acest caz, creterea procentului de variaie dintre grupuri la valoarea de 21,79% indic
existena unei slabe separri a taxonului P. leucophylla de specia P. elatior.
Analiza de secvene cloroplastice prezint n cazul arborilor generai prin metodele
ME (fig. 14), ML, NJ i UPGMA aproximativ aceeai grupare. n cadrul grupului format din
populaiile de P. elatior i P. leucophylla se disting clar anumite populaii de P. elatior:
populaiile din Postvaru, din Fgra, din Cearcnu i din Piatra Craiului. n cadrul
subgrupului format din restul populaiilor, se distinge sub-subgrupul P. leucophylla care
cuprinde toate populaiile aparinnd acestui taxon, dar acest sub-subgrup este mai slab
26

Rezumatul tezei de doctorat


separat de majoritatea populaiilor din grupul P. elatior dect unele populaii subalpine
calcifile de P. elatior din Carpaii de S-E.
Diferenierea genetic pe baza analizei AFLP i a datelor ADNcp ntre P. elatior i P.
leucophylla este slab. Delimitarea taxonului P. leucophylla drept o unitate taxonomic
distinct nu este susinut de rezultatul niciunei analize. Rezultatele studiului indic mai mult
posibilitatea ca P. leucophylla s fie un ecotip al P. elatior. Dezvoltarea indumentului care
ncetinete evaporarea apei din frunze poate fi o modificare aprut ca rspuns la factorii de
mediu, i anume climatul secetos n care se gsete P. leucophylla.
P. leucophylla, fiind ntlnit etajul montan superior-subalpin i n pajitile subalpine,
este separat ecologic la nivel altitudinal de P. elatior s. str. care are o distribuie larg n
cadrul Carpailor de S-E dar n etajul submontan-montan (Ciocrlan, 2009). Deoarece este un
taxon marginal ecologic, P. leucophylla este separat i din punct de vedere fenologic de P.
elatior s. str., acest separare fenologic putnd duce la o limitare a fluxului genetic dintre cei
doi taxoni ceea ce duce n timp la o difereniere n structura genetic.
5.12. Concluzii la specia Primula leucophylla
Nici analiza AFLP nici analiza ADNcp nu susin delimitarea taxonului P. leucophylla
ca o unitate taxonomic distinct de P. elatior.
Rezultatele studiului sugereaz c P. leucophylla ar reprezenta un ecotip adaptat la
condiiile de clim secetoas al speciei P. elatior.
Ecotipul P. leucophylla datorit izolrii ecologice i fenologice se afl n stadiul de
difereniere fa de specia P. elatior.

5.13. Rezultate la specia Primula intricata


Analiza secvenierii
Secvenele provenite de la trei markeri moleculari: ITS1, trnL i trnH-psbA, cu
lungimea concatenat de aproximativ 1200 nucleotide, au fost utilizate pentru construcia de
arbori prin metodele ME (fig. 17), ML, NJ, UPGMA.

27

Rezumatul tezei de doctorat

Fig. 17. Dendrogram la Primula intricata, construit prin metoda ME, pe baza secvenelor ITS1, trnL i trnHpsbA.

Analiza AFLP
Pe baza matricei AFLP a fost generat un arbore Neighbor Joining (fig. 18).

Fig. 18. Dendrogram la Primula intricata, construit prin metoda NJ, pe baza matricei AFLP.

28

Rezumatul tezei de doctorat


Cu ajutorul scriptului n platforma R, AFLPdat, s-au determinat proporia locilor
polimorfi, diversitatea genetic a lui Nei i indicele de raritate (tabelul 13).
Tabelul 13. Proporia locilor polimorfi, diversitatea genetic i indicele de raritate pentru
populaiile genului Primula, utilizate n studiul speciei Primula intricata.
Specia

Populaia

Diversitatea
genetic

Primula elatior

Ap-PE
Fg-PE
Tatr-Kob-PE
Jul-PE
Alp-Gross-PE

Proporia
markerilor
variabili
0,2356
0,2101
0,2675
0,1337
0,29298

0,1133
0,1031
0,1324
0,0611
0,1490

Indicele de
raritate
(DW)
32,6641
54,4281
63,3665
27,9473
32,3495

Primula leucophylla

Clt-PL

0,1401

0,0700

26,6714

Primula intricata

Alp-Pass-PI

0,1337

0,0687

167,1520

Rezultatele AMOVA obinute n cazul cnd nu se definete niciun grup sunt


prezentate n tabelul 14.
Tabelul 14. Rezultatele AMOVA fr definirea grupurilor la populaiile genului Primula,
utilizate n studiul speciei Primula intricata.
Sursa variaiei
ntre populaii
n cadrul populaiilor

Procentul de variaie
67,7
32,3

FST
0,67701

n cazul n care s-au definit dou grupuri pe criterii taxonomice, primul corespunznd
populaiilor de Primula elatior i Primula leucophylla i al doilea corespunznd populaiei de
Primula intricata, s-au obinut rezultatele evideniate n tabelul 15.
Tabelul 15. Rezultatele AMOVA cu definirea a dou grupuri pe criterii taxonomice la
populaiile genului Primula, utilizate n studiul speciei Primula intricata.
Sursa variaiei
ntre grupuri
ntre populaiile din cadrul
grupurilor
n cadrul populaiilor

Procentul de variaie
58,93
22,36

FST
0,81298

18,71

n cazul n care s-au definit trei grupuri pe criterii taxonomice, primul corespunznd
populaiilor de Primula elatior, al doilea corespunznd populaiei de Primula intricata i al
treilea corespunznd populaiei de Primula leucophylla s-au obinut rezultatele evideniate n
tabelul 16.
29

Rezumatul tezei de doctorat


Tabelul 16. Rezultatele AMOVA cu definirea a trei grupuri pe criterii taxonomice la
populaiile genului Primula, utilizate n studiul speciei Primula intricata.
Sursa variaiei
ntre grupuri
ntre populaiile din cadrul
grupurilor
n cadrul populaiilor

Procentul de variaie
43,92
30,53

FST
0,74457

25,55

Analiza Principal Coordinate (PCO) s-a realizat de asemenea pe baza matricei


AFLP utiliznd indicele Simpson (fig. 19).

Fig. 19. Rezultate PCO pe baza indicelui Simpson pentru populaiile genului Primula, utilizate n studiul speciei
Primula intricata pe baza matricei AFLP (negru - populaiile de P. elatior din Carpai, ptrat mov - populaiile
de P. elatior din Alpi, triunghi albastru - populaia de P. leucophylla, romb verde - populaia de P. intricata din
Alpi).

5.14. Discuii la specia Primula intricata


Investigarea relaiilor filogenetice dintre Primula elatior i Primula intricata
Rezultatele analizei AMOVA cnd nu se definesc grupuri (tabelul 14) indic faptul c
cea mai mare variaie se ntlnete ntre populaii (67,7%). Acest fapt sugereaz existena unor
populaii diverse unele de celelalte care pot fi uor separate n grupuri. Valoarea mare a
indicelui FST (0,67701) confirm acelai fapt. Variaia intrapopulaional de 32,3% indic o
relativ uniformitate n cadrul populaiilor. n cazul n care se definesc trei grupuri: P. elatior,
P. leucophylla i P. intricata (tabelul 16), cea mai mare cantitate de variaie genetic se
datoreaz componentei intergrupuri (43,92%) ceea ce sugereaz c grupurile sunt bine
difereniate ntre ele, cu un flux genetic sczut ntre ele. Variaia dintre populaiile din cadrul
grupurilor este de asemenea crescut, indicnd acelai fapt. De asemenea, creterea valorii
30

Rezumatul tezei de doctorat


indicelui FST la 0,81298 reconfirm acelai pattern. Rezultatul obinut poate fi datorat i
distanei mari dintre punctele de colectare ale populaiilor, aadar c pentru a avea certitudine
n ceea ce privete diferenierea grupurilor, s-a realizat nc o analiz AMOVA cu dou
grupuri: P. elatior mpreun cu P. leucophylla i separat P. intricata (tabelul 15). Rezultatul
arat clar faptul c mai mult de jumtate din variaia genetic (58,93%) este explicat prin
componenta variaiei dintre grupuri. Rezultatul susine clar separaia P. intricata fa de P.
elatior, mai mult dect este susinut separaia P. leucophylla fa de P. elatior, rezultatul
variaiei genetice dintre grupuri la definirea celor trei grupuri fiind mai mic dect n acest caz.
Concomitent, se nregistreaz i scderea valorii indicelui FST la 0,74457, ceea ce confirm
acelai fapt. Aadar grupul constituit din P. intricata este un grup compact, bine format,
sugernd existena unei specii distincte.
Analiza PCO (fig. 19) a matricei AFLP arat clar separarea P. intricata fa de grupul
constituit din P. elatior i P. leucophylla. Aceast separaie nu este o separaie pe criterii
geografice, populaiile de P. elatior din Alpi nu se grupeaz cu populaia de P. intricata din
Alpi, ci mai degrab se grupeaz cu P. leucophylla n cadrul unui grup P. elatior - P.
leucophylla.
Arborele generat prin metoda NJ (fig. 18) pe baza matricei AFLP arat o separaie
clar cu o valoare de bootstrap maxim a dou filogrupuri. Primul grup este constituit din
populaia de P. intricata din Alpi i al doilea este constituit din populaiile de P. elatior i P.
leucophylla. Populaia din Alpi de P. intricata este clar difereniat de restul populaiilor de
Primula att prin valoarea maxim de bootstrap dar mai ales prin lungimea ramurilor
arborelui NJ.
Rezultatele analizei diversitii genetice i a proporiei markerilor variabili (tabelul 13)
indic populaia de P. intricata ca fiind printre cele mai parcimonioase. n general,
diversitatea genetic este sczut n cadrul populaiilor mici i izolate ca o consecin a unor
procese precum driftul genetic, bootleneck-ul, consangvinizarea i efectul fondatorului
(Wright, 1931; Nei, 1975; Young i colab., 1996). Indicele de raritate (DW) este o msur a
divergenei i exprim numrul de markeri privai, iar n cazul speciei P. intricata aceast
valoare este maxim (167,1520), ceea ce o difereniaz nc o dat de grupul P. elatior.
Arborii generai prin analiza de secvene (fig. 17) indic faptul c cele dou populaii
de P. intricata nu fac parte din grupul P. elatior. n funcie de metoda utilizat, specia P.
intricata se grupeaz fie ntr-un grup comun cu specia P. acaulis, fie se grupeaz mai apropiat
de P. elatior dect de P. acaulis sau P. veris, dar totui, ea nu este inclus n grupul alctuit de
P. elatior i P. leucophylla. Secvenele aparinnd populaiilor de P. intricata sunt foarte
31

Rezumatul tezei de doctorat


divergene fa de cele aparinnd grupului P. elatior, din lungimea concatenat de 1200 de
nucleotide a celor trei markeri, peste 200 de situri informative se gsesc ntre P. intricata i
grupul P. elatior. Cele dou populaii de P. intricata, cea din Alpi i cea din Carpai, difer
ntre ele prin nou modificri punctiforme, fapt explicabil prin distana geografic dintre
punctele de colectare a celor dou populaii, care n plus mai fac parte din dou lanuri
muntoase cu o structur geologic i cu o istorie glaciar diferite.
5.15. Concluzii la specia Primula intricata
Rezultatele tuturor metodelor abordate i analizelor efectuate sunt convergente i
susin separarea P. intricata de grupul P. elatior.
Pe baza rezultatelor, studiul prezent consider c este necesar acordarea statutului de
specie independent fr legturi de subordonare taxonomic fa de P. elatior, speciei P.
intricata.

32

Rezumatul tezei de doctorat

Bibliografie selectiv
1. Ball, P. W., Riedhl, H., 1972. Onosma. In: Tutin, T. G., Heywood, V. H., Burges, N. A., Valentine, D.
H., Walters, S. M., Webb, D. A., (edit.), Flora Europaea, III. University Press, Cambridge.
2. Beldie, A., 1967. Flora i vegetaia Munilor Bucegi. Ed. Academiei Republicii Socialiste Romnia,
Bucureti.
3. Beldie, A., 1979. Flora Romniei. Determinator ilustrat al plantelor vasculare II. Ed. Academiei
Republicii Socialiste Romnia, Bucureti.
4. Borza, A., 1947. Conspectus florae Romaniae. Regionumque affinum. Tipografia Cartea
Romneasc, Cluj.
5. Chater, A. O., 1972. Eritrichium. In: Tutin, T. G., Heywood, V. H., Burges, N. A., Valentine, D. H.,
Walters, S. M., Webb, D. A., (edit.), Flora Europaea, III. University Press, Cambridge.
6. Ciocrlan, V., 2000. Flora ilustrat a Romniei. Pteridophyta et Spermatophyta. Ed. Ceres, Bucureti.
7. Ciocrlan, V., 2009. Flora ilustrat a Romniei. Pteridophyta et Spermatophyta. Ed. Ceres, Bucureti.
8. Cohen, J. I., Davis, J. I., 2009. Nomenclatural changes in Lithospermum (Boraginaceae) and related
taxa following a reassessment of phylogenetic relationships. Brittonia, 61:101-111.
9. Comes, H. P., Kadereit, J. W., 2003. Spatial and temporal patterns in the evolution of the flora of the
European Alpine System. Taxon, 52:451-462.
10. Demesure, B., Sodzi, N., Petit, R. J., 1995. A set of universal primers for amplification of polymorphic
non-coding regions of mitochondrial and chloroplast DNA in plants. Molecular Ecology, 4:129-131.
11. Dihoru, G., Negrean, G., 2009. Cartea roie a plantelor vasculare din Romnia. Ed. Academiei Romne,
Bucureti.
12. Doyle, J. J., Doyle, J. L., 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf
tissue. Phytochemical Bulletin, 19:11-15.
13. Doyle, J. J., Doyle, J. L., 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, 12:13-15.
14. Ehrich, D., 2006. AFLPdat: a collection of R functions for convenient handling of AFLP data.
Molecular Ecology Notes, 6:603-604.
15. Eidesen, P. B., Alsos, I. G., Popp, M., Stensrud, ., Suda, J., Brochmann C., 2007. Nuclear vs. plastid
data: complex Pleistocene history of a circumpolar key species. Molecular Ecology, 16:3902-3925.
16. Excoffier, L., Lischer, H. E. L., 2010. Arlequin suite ver 3.5: A new series of programs to perform
population genetics analyses under Linux and Windows. Molecular Ecology Resources, 10:564-567.
17. Freeland, J. R., 2005. Molecular Ecology. John Wiley & Sons, Chichester.
18. Grenier, J. C. M., Godron, D. A., 1853. Flore de France, ou Description des Plantes qui Croissent
Naturellement en France et en Corse, J.B. Baillire, Paris.
19. Grinescu, I., 1960. Eritrichium. In: Svulescu, T., (edit.), Flora Republicii Populare Romne, VII. Ed.
Academiei Republicii Populare Romne, Bucureti.
20. Grinescu, I., Nyrdy, E. I., 1960. Onosma. In: Svulescu, T., (edit.), Flora Republicii Populare
Romne, VII. Ed. Academiei Republicii Populare Romne, Bucureti.
21. Guuleac, M., 1960. Pulmonaria. In: Svulescu, T., (edit.), Flora Republicii Populare Romne, VII. Ed.
Academiei Republicii Populare Romne, Bucureti.
22. Hall, T. A., 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program
for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposia Series, 41:95-98.
23. Hammer, ., Harper, D. A. T., Ryan, P. D., 2001. PAST: Paleontological Statistics Software Package
for Education and Data Analysis. Palaeontologia Electronica, 4(1):9.
24. Huson, D. H., Bryant, D., 2006. Application of phylogenetic networks in evolutionary studies.
Molecular Biology and Evolution, 23(2):254-267.
25. Jacquemyn, H., Honnay, O., Galbusera, P., Roldn-Ruiz, I., 2004. Genetic structure of the forest herb
Primula elatior in a changing landscape. Molecular Ecology, 13:211-219.
26. Kimura, M., 1980. A simple method for estimating evolutionary rate of base substitution through
comparative studies of nucleotide sequences. Journal of Molecular Evolution, 16:111-120.
27. Kolarik, V., Zozomov-Lihov, J., Mrtonfi, P., 2010. Systematics and evolutionary history of the
Asterotricha group of the genus Onosma (Boraginaceae) in central and southern Europe inferred from
AFLP and nrDNA ITS data. Plant Systematics and Evolution, 290:21-45.
28. Ldi, W., 1927. Fam. Primulaceae, In: Hegi, G., (edit.), The Illustrate flora of Central Europe (in
German), 5(3). Carl Hanser, Mnchen.

33

Rezumatul tezei de doctorat


29. Mansion, G., Selvi, F., Guggisberg, A., Conti, E., 2009. Origin of Mediterranean insular endemics in
Boraginales: integrative evidence from molecular dating and ancestral area reconstruction. Journal of
Biogeography, 36:1282-1296.
30. Mengoni, A., Gonelli, C., Galardi, F., Gabbrielli, R., Bazzicalupo, M., 2000. Genetic diversity and
heavy metal tolerance in populations of Silene paradoxa L. (Caryophyllaceae): a random amplified
polymorphic DNA analysis. Molecular Ecology, 9:1319-1324.
31. Nei, M., 1975. Molecular population genetics and evolution. North-Holland, Amsterdam.
32. Nei, M., 1987. Molecular Evolutionary Genetics. Columbia University Press, New York.
33. Nei, M., Li, W. H., 1979. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction
endonuclease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 76:5269-5273.
34. Nyrdy, E. I., Guuleac, M., 1960. Primula. In: Svulescu, T., (edit.), Flora Republicii Populare
Romne, VII. Ed. Academiei Republicii Populare Romne, Bucureti.
35. Pax, F., Knuth, R., 1889. Primulaceae, In: Engler, A., (edit.), The Plant Kingdom (in German), Regni
vegetabilis conspectus, 10. W. Engelmann, Leipzig.
36. Rauschert, S., 1976. Zur Nomenklatur und Chorologie des Formenkreises von Onosma
pseudoarenarium Schur s. lat. Folia Geobotanica & Phytotaxonomica, 11:269-279.
37. Savolainen, V., Chase, M. W., 2003. A decade of progress in plant molecular phylogenetics. Trends in
Genetics, 19(12):717-724.
38. Srbu, I., Ivnescu L., tefan N., Mnzu C., 2001. Flora ilustrat a plantelor vasculare din estul
Romniei - determinator. Vol. II. Ed. Universitii Alexandru Ioan Cuza, Iai.
39. Selvi, F., Cecchi, L., Coppi, A., 2009. Phylogeny, karyotype evolution and taxonomy of Cerinthe L.
(Boraginaceae). Taxon, 58:1307-1325.
40. uteu, D., Puca, M., Bcil, I., Coste, A., Filipa, L., Stoica, I. A., Hurdu, B. I., Ursu, T., Coldea, G.,
2011. Does Primula intricata Gren. et Godr. Merit Species Rank? A Taxonomic Revision Based on
nrDNA, cpDNA and AFLP Data. Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca, 39(1):24-29.
41. Tamura, K., Dudley, J., Nei, M., Kumar, S., 2007. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis
(MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution, 24:1596-1599.
42. Tuber, F., 1982. Fgetele din Podiul Lipovei, n: Fgete carpatine. Semnificaia lor bioistoric i
ecoprotectiv: Lucrrile simpozionului din 30-31 mai 1979. Ed. Academiei Republicii Socialiste
Romnia, 198-205.
43. Teppner, H., 1971. Cytosystematik, bimodale Chromosomenstze und permanente Anorthoploidie bei
Onosma (Boraginaceae). esterreichische Botanische Zeitschrift, 119:196-233.
44. Teppner, H., 1996. Die Onosma Arten (Boraginaceae Lithospermeae) Rumniens n Beitrge zur
naturwissenschaftlichen Erforschung siebenbrgens VI.
45. Valentine, D. H., Kress, A., 1972. Primula L. In: Tutin, T. G., Heywood V. H., Burges, N. A., Moore,
D. M., Valentine, D. H., Walters, S. M., Webb, D. A., (edit.), Flora Europaea, III. University Press,
Cambridge.
46. Weigend, M., Gottsschling, M., Selvi, F., Hilger, H. H., 2009. Marbleseeds are gromwellsSystematics
and evolution of Lithospermum and allies (Boraginaceae tribe Lithospermeae) based on molecular and
morphological data. Molecular Phylogenetics and Evolution, 52:755-768.
47. Weising, K., Gardner, R. C., 1999. A set of conserved PCR primers for the analysis of simple sequence
repeat polymorphisms in the chloroplast genomes of dicotyledonous plants. Genome, 42:9-19.
48. Woodell, S. R. J., 1969. Natural hybridization in Britain between Primula vulgaris Huds (the primrose)
and P. elatior (L.) Hill (the oxlip). Watsonia, 7:115-127.
49. Wright, S., 1931. Evolution in Mendelian populations. Genetics, 16:97-126.
50. Wright Smith, W., Fletcher, H. R., 1946. The genus Primula: Section Vernales Pax. Transactions and
proceedings of the Botanical society of Edinburgh, 34:432-458.
51. Young, A., Boyle, T., Brown, T., 1996. The population genetic consequences of habitat fragmentation
for plants. Trends in Ecology and Evolution, 11:413-418.

34

Rezumatul tezei de doctorat

Cuprinsul tezei de doctorat


LIST DE ABREVIERI
INTRODUCERE
CONSIDERAII TEORETICE
Capitolul 1. Filogenia i analizele filogenetice
1.1. Consideraii generale asupra filogeniei
1.2. Etapele analizei datelor filogenetice
Capitolul 2. Markeri moleculari utilizai n filogenia i taxonomia
plantelor
2.1. Modul de motenire a genomului nuclear la plante
2.2. Organizarea i modul de motenire a genomului mitocondrial la
plante
2.3. Organizarea i modul de motenire a genomului plastidial la plante
2.4. Principalele categorii de markeri moleculari utilizate la plante
2.5. Metode de detecie a markerilor moleculari ADN
Capitolul 3. Caracterizarea din punct de vedere taxonomic, morfologic,
ecologic i al variabilitii fenotipice a plantelor studiate
3.1. Caracterizarea general a familiei Boraginaceae
3.1.1. Pulmonaria rubra vs. Pulmonaria filarszkyana
3.1.2. Onosma arenaria vs. Onosma pseudoarenaria
3.1.3. Eritrichium nanum vs. Eritrichium jankae
3.2. Caracterizarea general a familiei Primulaceae
3.2.1. Primula elatior vs. Primula leucophylla vs. Primula intricata
CONTRIBUII PERSONALE
OBIECTIVELE PREZENTULUI STUDIU
Capitolul 4. Materiale i metode
4.1. Strategia de recoltare a materialului biologic
4.2. Extracia ADN-ului
4.3. Verificarea i cuantificarea acizilor nucleici prin electroforez
4.3.1. Electroforeza n gel de agaroz
4.3.2. Electroforeza n gel de poliacrilamid
4.4. Analiza microsateliilor cloroplastici
4.5. Tehnica PCR-RFLP
4.6. Tehnica AFLP
4.7. Secvenierea
4.8. Analiza datelor
Capitolul 5. Rezultate i discuii
5.1. Rezultate i discuii la genul Pulmonaria
5.1.1. Rezultate referitoare la analiza microsateliilor cloroplastici
5.1.2. Rezultate referitoare la analiza PCR-RFLP
5.1.3. Rezultate referitoare la analiza secvenierii
5.1.4. Discuii: Identificarea unor markeri moleculari barcode capabili
s diferenieze speciile Pulmonaria rubra i Pulmonaria filarszkyana
5.1.5. Discuii: Investigarea relaiilor filogenetice dintre Pulmonaria rubra
i Pulmonaria filarszkyana
35

Pag. 1
Pag. 3
Pag. 5
Pag. 6
Pag. 6
Pag. 11
Pag. 17
Pag. 18
Pag. 19
Pag. 19
Pag. 21
Pag. 33
Pag. 39
Pag. 39
Pag. 41
Pag. 45
Pag. 49
Pag. 52
Pag. 54
Pag. 61
Pag. 62
Pag. 63
Pag. 63
Pag. 73
Pag. 78
Pag. 78
Pag. 79
Pag. 82
Pag. 84
Pag. 85
Pag. 91
Pag. 96
Pag. 99
Pag. 99
Pag. 99
Pag. 99
Pag. 99
Pag. 108
Pag. 110

Rezumatul tezei de doctorat


5.1.6. Concluzii pariale referitoare la genul Pulmonaria
5.2. Rezultate i discuii la genul Onosma
5.2.1. Rezultate referitoare la analiza microsateliilor cloroplastici
5.2.2. Rezultate referitoare la analiza PCR-RFLP
5.2.3. Rezultate referitoare la analiza secvenierii
5.2.4. Rezultate referitoare la analiza AFLP
5.2.5. Discuii: Investigarea relaiilor filogenetice dintre Onosma arenaria
i Onosma pseudoarenaria
5.2.6. Discuii: Estimarea diversitii genetice a populaiilor de Onosma
arenaria i Onosma pseudoarenaria din Romnia
5.2.7. Concluzii pariale referitoare la genul Onosma
5.3. Rezultate i discuii referitoare la genul Eritrichium
5.3.1. Rezultate referitoare la analiza secvenierii
5.3.2. Rezultate referitoare la analiza AFLP
5.3.3. Discuii: Investigarea relaiilor filogenetice dintre Eritrichium
nanum i Eritrichium jankae
5.3.4. Concluzii pariale referitoare la genul Eritrichium
5.4. Rezultate i discuii referitoare la genul Primula
5.4.1. Rezultate i discuii referitoare la specia Primula leucophylla
5.4.1.1. Rezultate referitoare la analiza secvenierii
5.4.1.2. Rezultate referitoare la analiza AFLP
5.4.1.3. Discuii: Identificarea unor markeri moleculari barcode capabili
s diferenieze speciile Primula elatior i Primula leucophylla
5.4.1.4. Discuii: Investigarea relaiilor filogenetice dintre Primula elatior
i Primula leucophylla
5.4.1.5. Discuii: Redefinirea arealului speciei Primula leucophylla pe
baza analizelor moleculare
5.4.1.6. Concluzii pariale referitoare la specia Primula leucophylla
5.4.2. Rezultate i discuii referitoare la specia Primula intricata
5.4.2.1. Rezultate referitoare la analiza secvenierii
5.4.2.2. Rezultate referitoare la analiza AFLP
5.4.2.3. Discuii: Investigarea relaiilor filogenetice dintre Primula elatior
i Primula intricata
5.4.2.4. Concluzii pariale referitoare la specia Primula intricata
5.5. Concluzii finale
BIBLIOGRAFIE
ANEXE

Pag. 111
Pag. 112
Pag. 112
Pag. 112
Pag. 113
Pag. 127
Pag. 132
Pag. 136
Pag. 137
Pag. 138
Pag. 138
Pag. 151
Pag. 155
Pag. 160
Pag. 161
Pag. 161
Pag. 161
Pag. 169
Pag. 174
Pag. 176
Pag. 180
Pag. 181
Pag. 181
Pag. 182
Pag. 187
Pag. 191
Pag. 193
Pag. 194
Pag. 196
Pag. 226

Cuvinte cheie

Pulmonaria, Onosma, Eritrichium, Primula, plante endemice, plante rare, markeri moleculari,
taxonomie molecular, AFLP, ADNnr, ADNcp.

36

S-ar putea să vă placă și