Sunteți pe pagina 1din 28

33. Familia Enterobacteriaceae. Caractere generale.

(Gabriela Loredana
Popa)
33. 1. Definiie. ncadrare
Familia Enterobacteriaceae cuprinde un numr foarte important de genuri i
specii de microorganisme semnificative din punct de vedere medical. Aceast
familie reprezint probabil cea mai larg reprezentat grupare taxonomic, intens
studiat, att din punct de vedere al microbiologiei fundamentale ct i datorit
implicaiilor practice, clinice.
Numele acestei familii a fost propus n anul 1937, dar Serratia marcescens a fost
descris i a primit acest nume n 1823. Este adevrat c tulpinile de S.
marcescens, productoare de pigment caracteristic de culoare roie, sunt uor
de identificat i n acelai sens se estimeaz c prezena lor a fost luat n
discuie cu circa 3 secole nainte de Hristos. Salmonella typhi a fost descris n
1884, iar Yersinia pestis, dup nc 10 ani.
Dac n 1974, familia includea 12 genuri i 36 de specii, iar n 1994, 30 de genuri
i 107 specii, n momentul de fa familia Enterobacteriaceae cuprinde peste 40
de genuri de microorganisme semnificative din punct de vedere medical i peste
150 de specii (n cazul n care nu lum n considerare clasificarea genului
Salmonella n peste 2.390 de specii) (vezi i A.6.5.1. i capitolele 37-42).
33. 2. Caractere generale
33. 2. 1. Habitat
Enterobacteriile se pot gsi n ap, pe sol, pe plante sau pot coloniza n mod
normal intestinul omului i animalelor. Totui trebuie reinut c peste 90% din
flora intestinal normal uman este format de germeni anaerobi.
Unele dintre genuri (Shigella, Salmonella, Yersinia) cuprind specii patogene
pentru om, n timp ce altele (Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Proteus etc)
cuprind specii saprofite sau condiionat patogene (cu excepia anumitor tulpini,
patogene) i se gsesc n flora normal gastrointestinal, sau de ex. n flora
tractului respirator superior.
Cnd se utilizeaz termenul de bacterii enterice, unii autori includ i alte genuri
precum Pseudomonas sau Vibrio, care nu fac parte din familia
Enterobacteriaceae.
33. 2. 2. Caractere morfotinctoriale
Sunt bacili Gram-negativi (multe dintre specii avnd o dimensiune de
aproximativ 2-3 / 0,6m), cu capete rotunjite, care nu se pot diferenia prin
microscopie optic, mobili cu cili peritrichi (ex. Salmonella spp, Proteus spp.),
sau imobili (ex. Shigella spp., Yersinia pestis, Klebsiella spp.), nesporulai; unele
specii pot prezenta capsul (ex. Klebsiella pneumoniae).
33. 2. 3. Caractere biochimice i caractere de cultur

Sunt germeni nepretenioi care se pot multiplica pe medii simple, aerobi


facultativ anaerobi, utilizeaz fermentativ glucoza cu sau fr producere de gaz,
sunt oxidaz-negativi, catalaz-pozitivi, reduc nitraii la nitrii, se pot cultiva pe
medii obinuite formnd colonii de tip S, R (vechi) sau M (pentru speciile
capsulate), pot fermenta (ex. Escherichia coli, Klebsiella spp.) sau nu lactoza (ex.
Salmonella spp., Shigella spp.). De altfel, caracterele biochimice sunt foarte
importante n identificarea enterobacteriilor. n Tratatul de Microbiologie i Infecii
Microbiene (Topley and Wilsons, 2005), nu mai puin de 11 pagini de tabele
(1.319-1.329) sunt dedicate caracterelor biochimice ale enterobacteriilor (de
menionat c aceast prezentare reprezint o simplificare i prescurtare privind
acest subiect).
33. 2. 4. Structura antigenic
33. 2. 4. 1. Lipopolizaharidul (LPZ) caracteristic microorganismelor Gramnegative este format din:
- lipidul A, responsabil pentru activitatea toxic, format din uniti dizaharidice
de glucozamin fosforilat de care se ataeaz acizi grai cu lan lung de atomi
de carbon (ex. acidul -hidroximiristic cu 14 atomi de carbon), care este prezent
la toate enterobacteriile i care se gsete n natur numai n aceast structur
particular, lipidul A. De lipidul A se ataeaz:
- polizaharidul format dintr-un miez (core) similar la toate bacteriile Gramnegative i o serie de uniti terminale repetitive care difer de la specie la
specie (antigenul O). Antigenul O este termostabil, rezistent la alcool. Poate fi
detectat prin reacii de aglutinare cu antiseruri specifice. Antigenul O este
asimilat cu termenul de endotoxin. Formele R sintetizeaz un LPZ care nu
conine elementele repetitive ale polizaharidului O, caracteristice culturilor S.
Fa de antigenul O apar n special anticorpi din clasa IgM. Fiecare gen cuprinde
antigene O specifice, dar un microb poate avea mai multe structuri antigenice
diferite, de exemplu:
- pot exista antigene O comune la E. coli, Shigella;
- pot exista reacii ncruciate ntre E. coli, Klebsiella, Providencia, Salmonella;
- anumite structuri antigenice O de la E. coli reacioneaz ncruciat cu structuri
antigenice izolate de la genul Vibrio, cu structuri antigenice de grup sangvin sau
alte antigene de suprafa de la celulele animale.
33. 2. 4. 2. Antigenul H este de natur proteic; denaturat de alcool (50) i de
temperatur (70C). Este localizat la nivelul flagelilor (nu exist la speciile
imobile). Are antigenicitate mai mare dect antigenul O (dominant); de aceea,
pentru a putea aprea combinaia cu antigenul O, n anumite situaii, antigenul H
trebuie denaturat n prealabil. Antigenul H poate fi detectat prin reacii de
aglutinare cu antiseruri specifice (n special cu anticorpi din clasa IgG).
Anticorpii anti-H imobilizeaz bacteria, atenund virulena microorganismelor
mobile, fiind probabil cauza apariiei variaiei de faz la Salmonella. Variaia de
faz este proprietatea bacteriei de a altera exprimarea unui anumit tip de
antigen flagelar.
33. 2. 4. 3. Antigenul K se situeaz extern fa de antigenul O, la bacteriile
capsulate. Este un antigen polizaharidic, parial stabil la temperatur. Dac este

organizat o structur capsular, aglutinarea cu antigenul O va fi inhibat. Au


fost identificate i structuri asemntoare antigenului tipic capsular; spre ex. la
E. coli exist antigenul K1. Antigenul K este implicat i n patogenitate, favoriznd
rezistena la fagocitoz a bacteriei i contribuind la invazivitate.
33. 2. 4. 4. La Salmonella typhi exist n mod suplimentar antigenul Vi (de
virulen) care face parte din antigenele de nveli ale acestei bacterii, are
structur polizaharidic i este implicat n scderea complementului seric,
leucopenie, capacitatea de multiplicare intramacrofagic. Poate masca
antigenul O, acoperindu-l. Antigenul Vi se poate identifica prin reacii de
aglutinare cu antiseruri specifice.
Clasificarea antigenic a enterobacteriilor indic adesea prezena fiecrui
antigen specific, de exemplu E. coli O55:K5:H21 etc.
33. 2. 4. 5. Unele enterobacterii elaboreaz i exotoxine, spre exemplu toxina
SHIGA PRODUS DE SHIGELLA DYSENTERIAE TIPUL 1, VEROTOXINA PRODUS DE
E. COLI O157:H7 ETC.
33. 2. 4. 6. Majoritatea enterobacteriilor prezint fimbrii, de natur proteic
(exist 6 tipuri de fimbrii); unele enterobacterii prezint i proteine filamentoase
(ex. E. coli) care par s aib rol n patogenitate.
33. 2. 5. Caractere de patogenitate
Adezinele
Practic toate bacteriile Gram-negative prezint fimbrii (pili), indispensabili pentru
aderarea de mucoase, acesta fiind primul pas n vederea colonizrii i
multiplicrii iniiale.
Toxinele
a). Exotoxinele: toxina Shiga (Shigella shiga), toxina Shiga-like (la Shigella i la
unele tulpini de E. coli), toxina LT (termic labil) la E. coli (asemntoare cu
exotoxina vibrionului holeric) etc. Ar mai fi de menionat existena unor
citotoxine produse de E. coli care sunt alfa-hemolizine (exotoxine); betahemolizinele rmn legate de celul i inhib fagocitoza i chemotaxia
leucocitelor.
b). Endotoxinele (Antigen O) sunt incluse n peretele tuturor germenilor Gramnegativi, putnd determina n cazul unei eliberri masive (distrugerea brutal a
unui numr mare de bacterii) ocul endotoxic. Administrarea experimental a
lipopolizaharidului la animal determin febr, leucopenie, trombocitopenie, CID
(coagulare intravascular diseminat), activarea sistemului complement i
eliberarea de substane vasoactive proinflamatorii.
Achiziia de fier
O serie de enterobacterii sintetizeaz o component care are capacitatea de a
chela fierul (siderofor), complexul format fiind apoi recaptat de ctre bacterie (de
exemplu, aerobactina de la E. coli).
Structurile capsulare
Antigenele de tip K ale E. coli au structur proteic i sunt importante n
colonizare; diminu opsonizarea i fagocitoza. Antigenul K 1 este un polimer al

acidului N-acetil-neuraminic. Este similar cu structuri proprii gazdei i este slab


imunogen.
Klebsiella prezint un antigen K (i respectiv o capsul) bine reprezentat.
Antigenul Vi de la Salmonella typhi acoper (mascheaz) antigenul O i are
importan n invazivitate.
Plasmidele
Sunt importante pentru faptul c transmit att informaii genetice legate de
rezistena la antibiotice (factor R) ct i pentru virulen.
33. 3. Povestire adevrat
Un pacient de sex masculin, n vrst de 33 ani, este cunoscut cu diagnosticul de
leucemie acut promielocitar de circa 1,5 ani; se interneaz pentru
administrarea tratamentului chimioterapic i pentru realizarea unui transplant de
celule stem.
La circa 3 ore de la administrarea profilactic de imunoglobuline pe cale i.v., pe
un cateter fixat anterior, pacientul devine febril (temperatur 39,5C).
S-a recoltat snge pentru hemoculturi i dup aceasta s-a administrat o asociere
ntre o cefalosporin de generaia a 3-a i gentamicin. Sngele a fost
nsmnat n bulion snge, cu trecere oarb dup 18 ore, pe geloz-snge i
pe un mediu care coninea eozin i albastru de metilen. Dup nc 24 ore, apar
culturi (de tip S/M) pe ambele medii, se apreciaz c este vorba de colonii
lactoz-pozitive, iar examenul microscopic al coloniilor izolate relev prezena
unor bacili Gram-negativi.
Se realizeaz teste biochimice pe medii multi test, microorganismul fiind
glucoz-pozitiv i lactoz-pozitiv, hidrogen sulfurat-negativ, citrat-pozitiv, imobil,
indol-negativ, ureaz-negativ. Analiza preliminar orienteaz spre o
enterobacterie, dar, se face testul oxidazei care este pozitiv. Efectund i alte
testri, diagnosticul final a fost: infecie cu Agrobacterium radiobacter la un
pacient cu imunodepresie. Testarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice a
recomandat continuarea tratamentului cu imipenem.
Evoluia a fost favorabil, iar la 3 sptmni de la episodul acut s-a putut realiza
tratamentul chimioterapic i pacientul a fost pregtit pentru transplantul cu
celule stem.
Discuie
Nu orice bacil Gram-negativ, glucoz-pozitiv i lactoz-pozitiv este o
enterobacterie. Testarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice a revelat o
tulpin rezistent la majoritatea medicamentelor testate, prezentnd
sensibilitate numai la ticarcilin, imipenem i ciprofloxacin. Avnd n vedere
faptul c a fost vorba de o infecie la o gazd imunodeprimat, diagnosticul
bacteriologic i testarea sensibilitii le medicamentele antibacteriene sunt strict
necesare.
28. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de enterobacterii.
Coprocultura.
Familia Enterobacteriaceae cuprinde un important numr de genuri de
microorganisme semnificative din punct de vedere medical (28) i numeroase

specii (peste 100, n cazul n care nu lum n considerare clasificarea genului


Salmonella n peste 2000 de specii). Dintre genurile incluse n aceast vast
familie, vom aminti urmtoarele: Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia,
Klebsiella, Proteus, Citrobacter, Edwarsiella, Enterobacter, Morganella,
Providencia i Serratia. n capitolele urmtoare vom discuta numai despre
diagnosticul n infeciile produse de microorganismele aparinnd primelor 6
genuri enumerate. Enterobacteriile sunt bacili gram negativi care nu se pot
diferenia prin microscopie optic, mobili cu cili peritrichi (ex. Salmonella spp.,
Proteus spp.), sau imobili (ex. Shigella, Yersinia, Klebsiella), nesporulai; unele
specii prezint capsul (ex. Klebsiella pneumoniae).
Sunt germeni nepretenioi care se pot multiplica pe medii simple, aerobi
facultativ anaerobi, utilizeaz fermentativ glucoza cu sau fr producere de gaz,
sunt oxidazo-negativi, catalazo-pozitivi, reduc nitraii. Formeaz colonii de tip S,
R (n cazul culturilor vechi) sau M (pentru speciile capsulate), pot fermenta
lactoza (ex. Escherichia coli, Klebsiella) sau sunt lactozo negativi (ex. Salmonella,
Shigella, Yersinia). Pentru izolarea speciilor de enterobacterii putem folosi medii
selective, difereniale i selectivo-difereniale. Exist medii cu selectivitate mai
redus care inhib majoritatea bacteriilor gram pozitive i permite dezvoltarea
tuturor enterobacteriilor (ex. mediul Mac Conkey cu sruri biliare n concentraie
mic; se poate aduga i cristal violet), medii cu selectivitate medie care inhib
multiplicarea enterobacteriilor lactozo-pozitive (ex. mediul ADCL cu dezoxicolat,
citrat i lactoz, mediul Shigella-Salmonella cu sruri biliare i verde briliant sau
mediul XLD cu xiloz, lizin i dezoxicolat, preferat n multe dintre rile Uniunii
Europene) i medii cu selectivitate nalt (ex. mediul Wilson-Blair cu verde
briliant n concentraie crescut).
Caracterele biochimice sunt eseniale pentru identificarea enterobacteriilor.
Dup examinarea caracterelor de cultur (pe mediile selectivo-difereniale se
poate identifica i comportamentul enterobacterian n ceea ce privete
fermentarea lactozei), prin repicarea coloniilor suspecte pe medii potrivite (TSI,
MIU / MILF, Simmons etc), n ziua urmtoare se pot examina diferite caractere
biochimice (fermentarea zaharurilor, evidenierea unui anumit metabolit,
metabolizarea unui anumit substrat, utilizarea citratului ca unic surs de
carbon, identificarea unor enzime etc) sau alte caractere fenotipice (ex.
motilitatea). n momentul de fa exist baterii de teste i sisteme comerciale
care permit examinarea unei game extinse de caractere biochimice (ex. galeriile
API). Dorim s menionm c pentru fiecare test fenotipic exist o serie de
variaii care sunt prezentate procentual n tabele special dedicate.
Un alt aspect foarte util pentru identificare este reprezentat de studierea
caracterelor antigenice folosind seruri cunoscute (preparate pe animale de
laborator), cu ajutorul diferitelor reacii Ag-Ac (vezi i capitolele 15-20). Toate
enterobacteriile dein Ag O. Enterobacteriile mobile dein Ag H. Enterobacteriile
capsulate dein Ag K. Salmonella typhi prezint i Ag Vi, Yersinia pestis prezint
Ag F1 etc.
Infeciile enterobacteriene sunt destul de variate. Pot fi localizate la nivel digestiv
(dizenterie i sindroame asemntoare dizenteriei, sindroame asemntoare
holerei, toxi-infecii alimentare etc), la nivelul tractului urinar, la nivelul
aparatului respirator sau la nivelul sistemului nervos. Infeciile enterobacteriene

pot avea i alte localizri sau pot fi generalizate (de ex. n febra tifoid, febrele
paratifoide, pest).
n majoritatea infeciilor produse de enterobacterii diagnosticul este
bacteriologic, direct. n febra tifoid diagnosticul poate fi att bacteriologic ct i
imunologic (serologic).
Datorit faptului c n multe dintre aceste infecii produsul patologic este
reprezentat de ctre materiile fecale, n continuare vom discuta examenul
bacteriologic al materiilor fecale.
Coprocultura
n multe dintre infeciile produse de enterobacterii, care se manifest prin
sindrom diareic, utilizm coprocultura. n cele ce urmeaz vom discuta
coprocultura n general, nu numai din punctul de vedere al unei infecii
enterobacteriene.
Boala diareic acut
Boala diareic acut (BDA) a fost i rmne o entitate patologic foarte
rspndit la nivel mondial. Spre exemplu, n ara noastr n ultimii ani, numrul
de cazuri de boli diareice acute a fost de 85.055 n anul 2000, 81.268 n anul
2001 i respectiv 97.317 n anul 2002, cu o inciden de 446,5 0/0000 n 2002. n
aceeai perioad de timp, n fiecare an au decedat datorit BDA circa 100 de
pacieni.
Sindromul diareic include eliminarea a peste 3 scaune n 24 de ore iar scaunele
au consistena diminuat (pn la emiterea unor scaune apoase, cu pierderea a
pn la 20-30 litri / zi n holer). Materiile fecale pot avea aspect patologic (apos,
mucos, purulent, sanguinolent etc), culoare modificat, miros particular etc. De
regul sindromul diareic asociaz i alte semne i simptome digestive (dureri
abdominale, tenesme, grea, vrsturi etc) sau generale (febr, stare general
alterat etc). Foarte important i obligatoriu de reinut este c BDA duce la
pierderi de ap i electrolii iar intervenia cea mai important care trebuie avut
n vedere este reechilibrarea hidroelectrolitic.
Ageni etiologici
Boala diareic acut poate fi de etiologie infecioas i neinfecioas. n
continuare vom discuta pe scurt etiologia infecioas n general, nu numai cea
bacterian sau fungic. Este de menionat c marea majoritate a BDA infecioase
au etiologie viral.
Etiologia bacterian include:

Salmonella spp.

Shigella spp.

Escherichia coli (EPEC / enteropatogen, ETEC / enterotoxigen, EHEC /


enterohemoragic, EIEC / enteroinvaziv, EAEC / enteroagregant, DAEC / aderent
difuz)

Klebsiella spp.

alte enterobacterii (Yersinia enterocolitica, Citrobacter spp., Proteus spp.


etc)

Vibrio cholerae i ali vibrioni

ali bacili gram negativi (Aeromonas spp., Alcaligenes spp., Pseudomonas


spp. etc)


Bacillus cereus

Campylobacter jejuni

Clostridium perfringens, Clostridium difficile

Clostridium botulinum

Staphylococcus aureus etc


Etiologia fungic include:

Candida albicans (la pacieni cu SIDA) etc


Etiologia parazitar include:

Giardia lamblia

Entamoeba hystolitica i Entamoeba coli

Trichinella spiralis

Cryptosporidium parvum

Strongyloides stercoralis etc


Etiologia viral include:

rotavirusurile

virusurile Norwalk i asemntoare virusurilor Norwalk

calicivirusurile

astrovirusurile

coronavirusurile

enterovirusurile

adenovirusurile etc.
Gruparea agenilor etiologici n funcie de mecanismul patogenic
Att din punct de vedere diagnostic ct i pentru tratament poate fi important
elucidarea tipului de mecanism implicat. Astfel, BDA ar putea fi produse prin:

mecanism neinflamator, atunci cnd din punct de vedere microscopic n


preparatul ntre lam i lamel nu se evideniaz leucocite (ex. BDA produse de
Vibrio cholerae, ETEC, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus, Giardia
lamblia, rotavirusuri, virusuri Norwalk, Cryptosporidium parvum etc)

mecanism inflamator, atunci cnd din punct de vedere microscopic n


preparatul ntre lam i lamel se evideniaz leucocite polimorfonucleare (ex.
BDA produse de Shigella spp., EIEC, Salmonella enteritidis, Vibrio
parahaemolyticum, Entamoeba hystolitica etc)

mecanism de penetrare, atunci cnd din punct de vedere microscopic n


preparatul ntre lam i lamel se evideniaz leucocite mononucleare (ex. BDA
sau sindrom diareic produs de Salmonella typhi, Yersinia enterocolitica etc).
Dup cum se poate remarca, simpla recoltare a produsului patologic urmat de
realizarea unui preparat nativ (vezi capitolul 7) i examinarea microscopic a
acestuia pot da informaii importante cu privire la etiologia probabil precum i
atitudinea terapeutic de urmat. Este evident c ntr-o BDA pentru care agenii
etiologici sunt virali sau mecanismul patogenic include aciunea unei toxine este
contraindicat administrarea de antibiotice sau chimioterapice antibacteriene.
Indicaiile coproculturii n bacteriologie

atunci cnd este suspicionat o infecie cu Shigella spp., Vibrio cholerae,


E. coli (tipurile patogene), Campylobacter spp., Yersinia enterocolitica sau
Salmonella spp. n special la pacieni cu vrste extreme sau imunodepresie

dup circa 1 sptmn de la debutul febrei tifoide etc


atunci cnd BDA prezint riscul extinderii la nivelul unei colectiviti
(cree, grdinie, tabere, uniti de alimentaie public, staii de distribuie a apei
potabile etc)

atunci cnd BDA apare la pacieni care au fost tratai cu antibiotice iar
sindromul diareic persist i dup ntreruperea antibioticoterapiei

atunci cnd sindromul diareic persist mai mult de o sptmn sau are
loc o recdere

n scopul verificrii strii de sntate a persoanelor care lucreaz n uniti


de alimentaie public (conform normativelor stabilite de ctre ministerul
sntii)

n scop de cercetare etc.


Recoltarea i transportul materiilor fecale
Se vor respecta recomandrile menionate n capitolul 6, n special faptul c
recoltarea p.p. trebuie s se realizeze nainte de administrarea de medicamente
antimicrobiene. Se pot recolta i examina:

scaunul emis spontan reprezint produsul patologic utilizat cel mai


frecvent. Defecaia are loc ntr-un recipient de carton sau ntr-un container din
material plastic de unic ntrebuinare (care poate fi apoi decontaminat i
eliminat fr probleme). n acelai timp efectum i examinarea macroscopic a
p.p. din punctul de vedere al mirosului, culorii sau aspectului. Utilizm pentru
prelevare linguria recoltorului alegnd poriuni care permit cu o mai mare ans
izolarea agentului patogen (fragmente mucopurulente, poriuni cu snge,
flocoane riziforme etc) sau poriuni diferite dintr-un scaun n care nu se remarc
aspectele menionate anterior. Prelevm o cantitate de aproximativ 1 gram pe
care o suspensionm n mediul de transport (minim 2 ml n cazul scaunelor
apoase).

tamponul rectal este recomandat n cazul unei infecii cronice cu Shigella


spp., atunci cnd suspicionm portajul de Shigella spp. sau Salmonella spp.
Tamponul steril se introduce cu blndee i se preleveaz secreiile de la nivelul
mucoasei rectale, prin rotire, pentru a recolta material din criptele rectale. Apoi
introducem. tamponul n mediul de transport. Pentru a putea nchide recoltorul,
tiem n mod corespunztor tija tamponului.

sonda Nelaton se poate utiliza atunci cnd urmrim recoltarea p.p. de la


nivelul colonului sigmoid. Introducem cu blndee sonda pn la nivelul dorit
(circa 10-12 cm la copil i respectiv circa 15-20 cm la adult), adaptm la cellalt
capt al sondei o sering i aspirm p.p.de la nivel sigmoidian. Introducem p.p.
n mediul de transport.
n cazul n care p.p. nu poate fi prelucrat imediat sau n maxim 1 or, utilizm un
mediu de transport, transportul la rece (+4 C) sau transportul n mediu de
transport meninut la 4 C. Cel mai frecvent utilizm mediul Cary-Blair (vezi
capitolul 9). Acest mediu asigur supravieuirea enterobacteriilor patogene timp
de 24-48 de ore, inhibnd n acelai timp multiplicarea florei de asociaie. Atunci
cnd este suspicionat infecia cu V. cholerae, apa peptonat alcalin servete n
acelai timp drept mediu de transport i mediu de mbogire.
Examinarea materiilor fecale
Materiile fecale sunt examinate macroscopic i microscopic. Din punct de vedere
microscopic, de fiecare dat se vor realiza preparate native (ntre lam i

lamel). Materiile fecale sunt suspensionate ntr-o pictur de lugol sau de


albastru de metilen 1% iar preparatul se va examina iniial cu obiectivul 10,
apoi cu obiectivul 40. Spre exemplu, evidenierea a peste 40 PMN / cmp,
nsoite de macrofage i hematii, conduce la suspicionarea unei dizenterii
bacteriene. Frotiurile colorate pot fi utile n suspicionarea diagnosticului de
enterocolit cu Campylobacter spp. sau al colitei pseudomembranoase, post
antibioticoterapie.
Cultivarea materiilor fecale
n mod obinuit, pentru cultivare vom utiliza 3 medii diferite, respectiv o
eprubet cu bulion selenit acid de sodiu i 2 plci Petri, una cu mediu cu
selectivitate sczut (ex. Mac Conkey) i alta cu mediu cu selectivitate medie
(ex. ADCL sau XLD). Aceste medii selective sunt n acelai timp i medii
difereniale.
Alegem fragmente caracteristice din p.p. (mucus, puroi etc) i nsmnm 2-3
anse n mediul cu bulion selenit (mediu de mbogire n special pentru
Salmonella spp.). Realizm o suspensie omogen n mediul lichid. Prelevm o
ans (sau o pictur) din suspensie i o depunem pe mediul MacConkey. Modul
de nsmnare difer de cel prezentat n capitolul 10. ntindem p.p. n striuri
paralele pe o jumtate de plac, pn aproape de marginile plcii fr s le
atingem. Fr s sterilizm ansa, atingem ultimile 3-4 striuri i dispersm p.p. n
alte striuri paralele, perpendiculare pe primele, pe jumtate din mediul
disponibil, pn aproape de marginile plcii fr s le atingem. Atingnd din nou
ultimele 3-4 striuri, dispersm p.p. n mod similar pe mediul nc nensmnat.
Incubm timp de 18-24 de ore la 35-37 C.
n ziua urmtoare, pornind de la tubul cu bulion selenit nsmnm aa cum am
menionat mai sus o plac cu MacConkey i o plac cu ADCL (sau XLD); incubm
aceste plci timp de 18-24 de ore la 35-37 C. Examinm plcile nsmnate
precedent n vederea selectrii coloniilor suspecte.
Pe mediul MacConkey coloniile lactozo-pozitive au dimensiuni de 1-3 mm, sunt
roii, pot prezenta un halou opalescent, de regul sunt de tip S dar pot fi i de tip
M. Coloniile lactozo-negative au dimensiuni de 1-2 mm, nu sunt colorate, sunt
transparente, de regul sunt de tip S.
Pe mediul ADCL majoritatea bacteriilor lactozo-pozitive sunt inhibate; pot aprea
tardiv colonii de dimensiuni mai mici, roii, de tip S. Coloniile lactozo-negative au
dimensiuni de 1-2 mm, nu sunt colorate, sunt semitransparente, de tip S; dac
produc H2S centrul coloniei este de culoare neagr.
De regul urmrim apariia coloniilor lactozo-negative, iar pentru etapele de
identificare vom repica (fr a atinge mediul de cultur) 3 colonii n cazul n care
pacientul este copil i 3-5 colonii n cazul n care pacientul este adult. n cazul n
care nu exist colonii lactozo-negative, pentru identificare vom repica (fr s
atingem mediul de cultur) 10 colonii la copil i respectiv 10 colonii la adult
(dac se consider c identificarea este necesar, de ex. n izbucniri epidemice
de BDA).
Aadar, dup apariia coloniilor izolate pe mediile selectivo-difereniale trecem la
identificarea speciilor implicate patogenic pe baza caracterelor morfo-tinctoriale,
de cultur (vezi capitolul 11), biochimice (vezi capitolele 11 i 12), antigenice
(vezi capitolele 11-20, n special capitolul 17), de patogenitate, pe baza

sensibilitii la bacteriofagi i eventual pe baza unor caractere moleculare.


Pentru interpretare vom utiliza diferitele tabele disponibile n tratatele de
specialitate sau recomandrile productorilor n cazul utilizrii unor sisteme
comerciale de diagnostic. Pentru tulpinile considerate a fi implicate patogenic
vom realiza studiul sensibilitii la antibiotice i chimioterapice, de regul prin
metode difuzimetrice (antibiograma difuzimetric standardizat, comparativ, E
test).
Alte aspecte particulare urmeaz a fi prezentate n capitolele urmtoare.
34. Genul Escherichia. Escherichia coli (Gabriela Loredana Popa, Codrua Usein,
MI Popa)
34. 1. Definiie. ncadrare
Genul Escherichia, considerat genul tip pentru familia Enterobacteriaceae,
cuprinde germeni comensali care se gsesc ubicvitar (n ap, pe sol, etc). La
nivelul intestinului uman au rol n sinteza unor vitamine (simbioz). Sunt bacili
Gram-negativi mobili sau imobili, aerobi facultativ anaerobi, lactoz pozitivi.
Sunt grupai n ase specii: E. coli, E. blattae, E. fergusonii, E. hermannii, E.
vulneris i E. albertii. Cu excepia speciei E. blattae, izolat de la insecte, toate
celelalte specii de Escherichia au fost izolate din prelevate umane.
Specia tip, reprezentat de Escherichia coli, i-a cptat numele n 1919, n
memoria lui Theodor Escherich care, studiind flora intestinala copilului, a izolat-o
din materii fecale denumind-o Bacterium coli commune
34. 2. Caractere generale
34. 2. 1. Habitat
E. coli se gsete n intestinul animalelor homeoterme, inclusiv al omului, fiind
considerat component a florei intestinale normale. Acest rezervor primar a
fcut ca E. coli s fie selectat de Organizaia Mondial a Sntaii ca indicator
de poluare fecal (1). Studii ntreprinse n ultimii ani indic ns o mult mai mare
complexitate a populaiei genului Escherichia, ai crui membri pot circula i
persista autonom, n afara tractului gastrointestinal, fiind prezeni n rezervoare
secundare din mediul ambiant (2).
34. 2. 2. Caractere morfotinctoriale
Sunt bacili Gram-negativi drepi sau uor incurbai, cu capete rotunjite i
dimensiuni cuprinse ntre 2-5m / 0,5-1m (pot avea uneori aspect filamentos,
pot exista i forme cocobacilare). n majoritate sunt mobili, prin prezena
flagelilor (n preparatele native). Unele tulpini prezint capsul (antigene
capsulare de tip K).
34. 2. 3. Caractere de cultur
Se dezvolt bine pe medii simple de cultur; pe geloz se pot dezvolta colonii de
tip S, lactoz pozitive, convexe, umede, cu suprafa lucioas, margini netede,
uor emulsionabile n soluie salin fiziologic sau colonii de tip R, uscate, cu

marginile crenelate, care se emulsioneaz greu i neuniform n soluie salin


fiziologic; exist forme intermediare ntre coloniile S i R, dup cum exist i
colonii mucoide de tip M.
34. 2. 4. Caractere biochimice
Germenii sunt aerobi, facultativ anaerobi, se dezvolt n limite largi de
temperatur i pH. Asemenea celorlalte enterobacterii, specia E. coli este
catalaz pozitiv, oxidaz negativ i fermenteaz glucoza. Capacitatea
majoritii tulpinilor de E. coli de a fermenta lactoza este util n diferenierea de
alte enterobacterii (ex. Salmonella, Shigella). Tipic, tulpinile de E. coli testate pe
medii de identificare biochimica precum TSI, MIU si/sau MILF nu produc H 2S,
produc indol i lizindecarboxilaz, dar nu ureaz si fenilalanindezaminaz. n
plus, E. coli nu poate crete pe un mediu care are ca unic surs de carbon
citratul (caracter metabolic important pentru diferenierea de alte
enterobacterii).
Tulpinile EHEC/VTEC, de regul, nu fermenteaz sorbitolul.
34. 2. 5. Rezistena fa de factori fizici i chimici
Germenii supravieuiesc n mediul extern (sol, ap) luni de zile. E. coli este
distrus prin expunere la 60C n 30 minute. Este sensibil la aciunea
antisepticelor i dezinfectantelor uzuale.
34. 2. 6. Structur antigenic
Ca i n cazul celorlalte enterobacterii, diversele structuri antigenice situate la
suprafaa tulpinilor de E. coli servesc aa numitei serotipizri, metod util n
epidemiologia infeciilor cauzate de aceste microorganisme. Cele trei tipuri de
antigene detectate prin reacii serologice antigen-anticorp (ex. reacia de
aglutinare) sunt: antigenul O (somatic), antigenul H (flagelar) i antigenul K
(capsular). Antigenul O (LPZ) a fost descris la caracterele generale ale
enterobacteriilor i definete serogrupul (numerotarea grupului antigenic este de
utilitate epidemiologic; ex. serotipurile O55 i O111 sunt implicate n izbucniri
epidemice de meningit neonatal). Exist peste 170 de variante de Ag O.
n cadrul unui serogrup O, pe baza diversitii antigenelor H (prezente numai la
tulpinile mobile, care posed flageli) i K (prezente la tulpinile care posed
capsul) se definesc serotipuri. Serogrupurile i serotipurile se noteaz printr-o
combinaie de litere i cifre (ex. O55:K59:H6). Structurile de suprafa pot masca
prezena antigenului somatic O.
n majoritatea cazurilor, tipizarea serologic a tulpinilor de E. coli se rezum la
identificarea antigenelor O i H (ex. O157:H7).
Anumite serotipuri sunt asociate frecvent cu sindroame clinice bine definite, dar
trebuie menionat c nu antigenele de suprafa confer virulen bacteriei. Cu
toate acestea, definirea serotipului poate fi sugestiv pentru identificarea unor
clone virulente (ex. serotipul E. coli O157:H7, marker pentru subgrupul EHEC din
patotipul VTEC).
Datorit faptului c au fost identificate peste 170 de variante de antigen O, peste
50 de tipuri de antigen H, peste 90 de tipuri de antigen de tip K i o serie de
tipuri antigenice fimbriale (antigene F), prin combinaiile acestora rezult peste
1.000 de tipuri antigenice de Escherichia coli.

Unele dintre tulpinile de E. coli elaboreaz exotoxine (vezi 37.2.8 i 37.3).


Acestea pot fi, la rndul lor, structuri antigenice identificate in vitro prin reacii
antigen-anticorp.
34. 2. 7. Rspuns imun
Apare un rspuns imun umoral care nu are semnificaie nici n ceea ce privete
protecia fa de boal i cel mai adesea nici n diagnostic. De reinut ns c, un
titru nalt al anticorpilor anti O157, detectat la pacienii cu sindrom hemoliticouremic (SHU), poate fi util pentru diagnosticul indirect (imunologic) al infeciei cu
E. coli O157:H7 (3).
34. 2. 8. Caractere de patogenitate
Tulpinile de E. coli domin microflora facultativ anaerob a colonului la individul
sntos, marea majoritate ntreinnd cu aceasta relaii de simbioz benefice
ambilor. Ele pot produce infecii n condiiile n care gazda este imunodeprimat
sau cnd depesc bariera intestinal i ajung n zone normal sterile.
Exist ns i tulpini de E. coli care au o virulena intrinsec, putnd declana
variate procese infecioase la indivizii imunocompeteni. Tulpinile patogene de E.
coli sunt clasificate n aa numite patotipuri. Ele genereaz simptomatologii
similare prin mecanisme de patogenitate comune.
n prezent sunt descrise ase patotipuri de E. coli implicate n sindromul diareic
(patotipuri intestinale) (4) i un patotip implicat n infecii extraintestinale (ex.
infeciile tractului urinar, meningite, septicemii, etc.) i denumit E. coli cu
patogenitate extraintestinal (ExPEC) (5). Patotipurile intestinale sunt: E. coli
enteropatogen (EPEC), E. coli enterotoxigen (ETEC), E. coli enteroinvaziv (EIEC),
E. coli productor de verotoxine (VTEC), E. coli enteroagregativ (EAEC) i E. coli
cu aderen difuz (DAEC). n cadrul patotipului VTEC se distinge, pentru a se
sublinia n principal asocierea cu manifestri clinice severe (ex. colita
hemoragic), subgrupul de tulpini de E. coli enterohemoragic (EHEC), care are ca
prototip serotipul O157:H7.
Tulpinile patogene de E. coli produc factori de virulen, care afecteaza variatele
procese desfurate la nivelul celulelor gazdei (ex. sinteza de proteine, funcia
citoscheletului, diviziunea celular, secreia de ioni, funcia mitocondriilor,
apoptoza etc.). Aceti factori de virulen sunt codificai de structuri genetice
localizate n cromozom sau pe plasmide i intervin n mecanismele de
patogenitate folosite de bacterie pentru a nvinge sistemele de aprare ale
gazdei.
Adezinele sunt structuri de aderen aflate pe fimbrii/pili (ex. fimbriile P din
tulpinile de E. coli uropatogene, factorii de colonizare CFA din tulpinile de ETEC,
etc.) sau la suprafaa membranei externe (ex. adezinele afimbriale Afa din
tulpinile de DAEC) bacteriene. Ele reprezint factori de virulena importani, care
permit bacteriei s colonizeze zone din organismul uman (ex. intestin subire,
tract urinar, vagin), in care nu rezid n mod normal.
Toxinele sunt o alt categorie de factori de virulen. Endotoxinele fac parte din
structura membranei externe (lipidul A din complexul LPZ) i sunt invariabil
prezente la toate bacteriile Gram negative, nu numai la E. coli, indiferent de
potenialul lor de patogenitate. Eliberate n urma distruciei peretelui bacterian

i manifest efectele toxice, fiind implicate n apariia febrei i ocului toxic din
septicemii. Exotoxinele sunt sintetizate i secretate n cursul metabolismului
bacterian, fiind specifice nu numai speciei, ci diverselor patotipuri de E. coli. n
prezent se cunosc structura si funciile a numeroase toxine responsabile de
patogenitatea tulpinilor de E. coli (ex. enterotoxina termolabil i termostabil
produse de tulpinile ETEC, verotoxinele 1 i 2 sintetizate de tulpinile VTEC,
enterotoxina termostabil enteroagregativ 1 a tulpinilor EAEC, etc.).
Multe dintre tulpinile ExPEC implicate n producerea meningitei neonatale sau a
infeciilor urinare prezint capsul, o alt component important pentru
patogenitatea speciei. Rolul principal al capsulei este de a inhiba aciunea
complementului seric i fagocitoza, conferind astfel rezisten bacteriei.
Antigenul polizaharidic capsular K1 este prezent n 80% din tulpinile de E. coli
izolate din cazuri de meningit neonatal (6).
29. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de Escherichia coli.
Urocultura.

Dup ce o serie de date sugerau asemnarea din punct de vedere molecular


ntre speciile genurilor Escherichia i Salmonella, cunotinele actuale pledeaz
pentru o grupare a speciilor din genurile Escherichia i Shigella. Cu toate
acestea, vom prezenta n continuare separat diagnosticul de laborator n
infeciile produse de microorganismele aparinnd genurilor clasice. Genul
Escherichia cuprinde germeni comensali care se gsesc ubicvitar (n ap, pe sol,
etc) iar la nivelul intestinului uman au rol n sinteza unor vitamine (simbioz).
Sunt bacili gram negativi mobili sau imobili, aerobi facultativ anaerobi, lactozo
pozitivi. Specia tip este reprezentat de Escherichia coli.
Cu toate c majoritatea tulpinilor de E. coli sunt saprofite sau condiionat
patogene (fiind implicate n infecii oportuniste cu localizri n afara tractului
digestiv, spre ex. peritonite, colecistite, infecii ale plgilor, endometrite,
pneumonii etc) exist i anumite tulpini dotate cu caractere patogenice
particulare. Dintre aceste tipuri de E. coli (patotipuri) se disting trei grupri mai
importante:

tipuri patogene implicate n boli diareice acute (BDA)

E. coli enteroagregativ (EAggEC) implicat n apariia unei BDA apoase,


persistent, cu mucus, n special la sugari

E. coli enterohemoragic (EHEC), spre exemplu serotipul O157:H7, care


elaboreaz dou citotoxine i este implicat n apariia unei BDA apoas, care
poate deveni sever i se poate nsoi de o complicaie grav, sindromul
hemolitic uremic

E. coli enteroinvaziv (EIEC) care elaboreaz una sau mai multe enteroxine
producnd un sindrom dizenteriform

E. coli enteropatogen (EPEC) care determin diaree la copilul mic, uneori


de gravitate maxim (ex. diaree malign la nou nscut)

E. coli enterotoxigen (ETEC) care elaboreaz dou enterotoxine


(termolabil i termostabil) i produce un sindrom holeriform


E. coli aderent difuz (DAEC) care produce diaree apoas, persistent, la
copii n vrst de 1-5 ani

tipuri (grupuri) patogene implicate n infecii ale tractului urinar (ITU)

tipul patogen implicat n infecia meningeal la nou nscut.


Indiferent de localizarea infeciei, diagnosticul de laborator microbiologic este
bacteriologic, direct.
Diagnosticul de laborator microbiologic n infeciile cu localizare digestiv
1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze
respectnd regulile cunoscute. Produsul patologic este reprezentat de obicei de
scaunul diareic dar am putea recolta i lichid de vrstur sau un anumit aliment
incriminat. Materiile fecale se examineaz macroscopic i se trimit ctre
laborator aa cum am menionat n capitolul precedent. n continuare vom
discuta diagnosticul unei infecii produs de EHEC (ex. O157:H7) dar, subliniem
faptul c n practica medical, pornind de la p.p. reprezentat de materiile fecale,
putem izola orice microorganism implicat etiologic n BDA, dup caz. Materiile
fecale pot avea aspect hemoragic iar la examinarea macroscopic a p.p. putem
observa prezena unor lambouri de mucoas epitelial. Transportul se va realiza
aa cum am menionat n capitolul nr. 28.
2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea
preparatului nativ, ntre lam i lamel; remarcm prezena hematiilor i
leucocitelor PMN.
3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel
nct s se poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va
identifica (vezi capitolul nr. 28). n vederea izolrii EHEC, pe lng mediile
menionate n capitolul precedent se recomand utilizarea mediului MacConkey
cu D-sorbitol, deoarece spre deosebire de majoritatea tulpinilor de E. coli EHEC
nu fermenteaz sorbitolul (sau l fermenteaz tardiv). n acest sens, coloniile
suspecte, repicate (fr a atinge mediul) n vederea identificrii vor fi necolorate,
cu dimensiuni de 1-3 mm, de regul de tip S (coloniile sorbitol-pozitive vor avea
o culoare roz).
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai
multor caractere:

Caractere morfotinctoriale: Sunt bacili gram-negativi.

Caractere de cultur:

Produc colonii de tip Scu caracterele menionate mai sus.

Caractere biochimice (pentru EHEC se vor examina la nivelul centrului de


referin; procesarea unor culturi n care este prezent EHEC necesit msuri
suplimentare de siguran):

Fermenteaz glucoza (cu producere de gaz), sunt lactozo-pozitivi, nu


fermenteaz (sau fermenteaz tardiv) sorbitolul, nu produc H 2S

Pot produce indol, sunt ureaz-pozitivi, mobili (dar exist i tulpini imobile)
etc.

Se pot folosi mediile multi-test convenionale (TSI, MIU, MILF) sau galeriile
multi-test API 10 S, API 20 E, API Rapid 20 E sau alte variante

Alte teste ce pot fi studiate n scopul identificrii germenilor:

Testarea caracterelor antigenice: Ag somatice pot fi identificate prin reacii


de aglutinare sau latex aglutinare (se pot utiliza i seruri monovalente anti O157

i respectiv anti H7); toxinele pot fi identificate prin tehnici de tip ELISA, latex
aglutinare, latex aglutinare pasiv inversat (VET-RPLA), sau prin
seroneutralizarea efectului citotoxic pe celule Vero

Testarea caracterelor de patogenitate: EHEC produce enterocolit


hemoragic letal la purcel; se poate studia efectul citopatic pe celule Vero

Teste de biologie molecular (PCR, detectarea genelor de patogenitate


pornind de la p.p. sau de la coloniile izolate pe MacConkey cu D-sorbitol).
5. Antibiograma este recomandat de regul numai pentru supravegherea
apariiei fenomenului de rezisten la antibiotice i chimioterapice; se realizeaz
prin metode difuzimetrice.
Urocultura
Tractul urinar este n mod normal necontaminat, n schimb uretra distal poate
prezenta o flor microbian foarte variat, fiind contaminat cu
microorganisme provenind din zona genital sau de la nivelul colonului. Dintre
aceste microorganisme putem izola de la nivelul uretrei distale stafilococi
coagulazo-negativi, E. coli, Klebsiella spp., Proteus spp., bacili difteromorfi,
enterococi, streptococi, neisserii saprofite, Mycoplasma spp., Ureplasma spp. sau
Fusobacterium spp. La acelai nivel ar putea fi identificate i tulpini de Candida
spp., Clostridium spp., diferii coci gram pozitivi sau gram negativi anaerobi,
lactobabili, mycobacterii netuberculoase, stafilococi aurii etc. Colonizarea
microbian a uretrei distale explic motivul pentru care n marea majoritate a
cazurilor vom realiza urocultura cantitativ.
Cu toate c indiferent de grija cu care vom recolta p.p. (urina) acesta va fi
contaminat, prin aprecierea cantitativ a numrului de uniti formatoare de
colonii n urina proaspt recoltat, din mijlocul jetului, putem s precizm dac
pacientul are sau nu infecie urinar. Mai multe studii au artat c atunci cnd se
demonstreaz prezena a 105 bacterii / ml, aceasta indic o infecie a tractului
urinar (ITU) n aproximativ 80% dintre cazuri n timp ce o valoare de 10 4 bacterii /
ml indic ITU n mai puin de 30% dintre cazuri.
Datorit acestor rezultate, n practica medical se consider c ne aflm n
situaia unei ITU atunci cnd numrul de bacterii / ml urin este 10 5 / ml.
Cu toate acestea, dorim s subliniem c interpretarea rezultatului nu trebuie
realizat mecanic i decizia final n ceea ce privete identificarea bacteriei,
efectuarea testrii sensibilitii la antibiotice i respectiv redactarea buletinului
de analiz ar trebui s fie luat avnd n vedere aspectul macroscopic al urinii
(ex. purulent), rezultatul examenului microscopic al sedimentului urinar (ex.
prezena de PMN), numrul de uniti formatoare de colonii / ml urin i
elemente clinice (ex. disurie, miciuni mai frecvente, febr), cu alte cuvinte
colaborarea ntre clinic i laborator este esenial. Spre exemplu, n cazul unor
elemente sugestive, chiar dac numrul de bacterii este de 10 4 / ml, putem lua
decizia s repetm urocultura iar izolarea aceleiai bacterii poate indica prezena
ITU. Pe de alt parte, izolarea a peste 10 4 uniti formatoare / ml n cazul
stafilococilor sau levurilor este luat n considerare iar prezena n urin a
Listeria monocytogenes la femeile nsrcinate sau prezena n urin a Salmonella
typhi sunt semnificative indiferent de numrul UFC / ml.

Pentru a sublinia nc o dat importana etapei de recoltare i transport a urinei


amintim faptul c urina reprezint un foarte bun mediu de cultur pentru
majoritatea bacteriilor care pot contamina p.p. iar o prob de urin care are
iniial (n momentul recoltrii) 103 bacterii / ml, dup 2 ore la temperatura
camerei va conine 105 bacterii / ml.
Clasificarea ITU se poate face dup mai multe criterii. ITU joase includ cistita dar
dup unii autori i uretrita, prostatita i epididimita. ITU nalte includ pielonefrita
acut, necroza papilar (complicaie a pielonefritei acute sau care poate aprea
n absena infeciei), abcesul renal sau pielonefrita cronic (dup unii autori).
Invazia tractului urinar poate avea loc pe cale ascendent, limfatic sau
hematogen.
Exist o serie de factori care favorizeaz apariia ITU, dintre care amintim:
obstruciile care duc la staz urinar (adenom sau carcinom de prostat, tumori
de vecintate, stricturi uretrale sau ale colului vezical, compresiune uretral n
timpul sarcinii, corpi strini, calculi urinari, cateterizare urinar etc), refluxul
vezico-ureteral, ali factori funcionali.
Ageni etiologici
Microorganismele mai frecvent implicate n producerea unei infecii a
tractului urinar sunt n ordine descresctoare E. coli, Klebsiella pneumoniae,
Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Pseudomonas
aeruginosa, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Citrobacter freundii, Citrobacter
diversus, Enterococcus faecalis, stafilococii coagulaz-negativi. Adenovirusurile
pot determina cistite hemoragice la copii. Mai rar, n ordine descresctoare
etiologia ITU poate fi reprezentat de Staphylococcus aureus, Acinetobacter
calcoaceticus, streptococi b-hemolitici din grupele A, B, C sau G, Morganella
morgani, Providencia rettgeri, P. stuartii, Serratia liquefaciens, Serratia
marcescens, Candida albicans, Salmonella spp., Corynebacterium urealyticum.
Cu privire la E. coli, cel mai frecvent microorganism implicat n ITU, exist
anumite grupuri uropatogene, spre ex. O1, O2, O7 etc. n mod cert, exist
diferene n ceea ce privete etiologia ITU pe grupe de vrst, n funcie de sex
sau la pacienii spitalizai n comparaie cu pacienii pentru care se solicit
urocultura n ambulatoriu.
Realizarea uroculturii
Recoltarea i transportul produsului patologic
n ITU se pot recolta urin, snge (ex. n pielonefrita acut) sau chiar i LCR. n
continuare vom discuta despre recoltarea i transportul urinei.
n afar de recomandrile generale menionate anterio, trebuie s subliniem
unele aspecte particulare

n cazul n care nu se poate recolta prima urin de diminea, trebuie


ateptat pentru recoltare 3-4 ore dup miciune

Recoltarea se realizeaz dup splarea cu ap i spun a organelor


genitale i a perineului; exist recomandri specifice pentru sexul feminin i
masculin i respectiv pentru copilul mic

Este preferabil ca recoltarea s aib loc ntr-un spaiu corespunztor n


apropiere de laborator iar personalul medical trebuie s explice i eventual s
asiste recoltarea


Este contraindicat recoltarea urinei la domiciliu (pot exista erori de
recoltare iar prelungirea timpului de transport va conduce la multiplicarea
bacteriilor, aa cum am menionat mai sus); dup recoltare, n cazul n care urina
nu este prelucrat imediat (sau n cel mult 30 de minute dup recoltare), p.p.
trebuie meninut la temperatura frigiderului iar transportul trebuie realizat la +4
C

De regul se recolteaz urina din mijlocul jetului; dup splarea


organelor genitale i a perineului, prin miciune se elimin circa 100 ml urin
(ndeprtnd astfel o parte a germenilor de la nivelul uretrei distale) i abia apoi
se recolteaz 20-50 ml (preferabil 50 ml) urin n recipientul steril, dup care
miciunea continu

Exist i alte tehnici de recoltare, neinvazive sau invazive (puncie i


aspiraie suprapubian, cateterizare uretral, cu riscurile respective).
Examinarea macroscopic i microscopic a urinei
Realizm iniial examenul macroscopic; p.p. poate fi tulbure, opalescent, poate
prezenta un anumit miros etc. n vederea examenului microscopic al urinei
omogenizm urina prin rsturnare, de 2-3 ori. Punem o pictur de urin pe
lam, acoperim cu o lamel i examinm cu microscopul cu imersie (sau
microscopul cu contrast de faz). n cazul n care identificm prezena a cel puin
unei bacterii pe fiecare cmp, n fiecare dintre 5 cmpuri succesive, putem cu o
bun aproximaie s considerm c avem o bacteriurie de 10 5 bacterii / ml.
Alternativ se poate utiliza preparatul colorat Gram. Este necesar s apreciem
concomitent i prezena piuriei (peste 10 leucocite / mm 3 de urin). Au fost
imaginate o serie de alte teste pentru aprecierea piuriei i bacteriuriei, spre
exemplu testul Griess (detectarea nitriilor n urin), detectarea esterazei
leucocitare, teste bioluminiscente etc. Piuria i bacteriuria trebuie interpretate n
contextul clinic.
Examenul sedimentului urinar permite vizualizarea de celule epiteliale
(malpighiene, vezicale, uretrale etc), celule sanguine (leucocite, hematii), cilindrii
urinari (hialini, leucocitari, eritrocitari, epiteliali, granulari etc), cristale urinare,
levuri (eventual nmugurite, cu blastoconidii), Trichomonas vaginalis etc;
examenul sedimentului urinar este foarte util i trebuie realizat de fiecare dat.
Cultivarea urinei
n mod obinuit, pentru cultivare putem utiliza 3-4 medii diferite. Din motive de
economie am putea nsmna o jumtate de plac cu mediu MacConkey (fr
cristal violet), o jumtate de plac cu geloz-snge i cte un sector de plac cu
mediu agar telurit i respectiv agar cu eozin i albastru de metilen (EMB) n
cazul n care examenul microscopic al urinei este pozitiv. Dac examenul
microscopic este negativ, nsmnm doar o jumtate de plac Petri cu mediu
MacConkey.
O variant de nsmnare pentru mediile MacConkey i geloz-snge este
utilizarea unei anse calibrate de 1 l cu ajutorul creia prelevm urin prin
atingerea suprafeei p.p. dup omogenizare. nsmnm iniial un striu pe
centrul jumtii de plac dup care ntindem p.p. n striuri paralele,
perpendiculare pe primul striu. n final fr sterilizm ansa ntindem p.p n striuri
paralele n unghi de 45 fa de striurile precedente. Dup o incubare de 18-24

ore la 35-37 C, nmulind cu 1000 numrul de UFC dezvoltate, putem aprecia


care este numrul de bacterii / ml de urin.
Frecvent este utilizat nsmnarea urinei dup diluare (ex. 1/100) cu ajutorul
pipetei gradate. nsmnm de ex. pe o plac cu mediu MacConkey 0,1 ml de
urin diluat 1/100, incubm n condiiile cunoscute i dup apariia coloniilor
calculm numrul de bacterii / ml prin nmulirea numrului de UFC inversul
diluie inversul volumului nsmnat.
Interpretarea rezultatelor uroculturii cantitative

Izolarea unei bacterii cu o concentraie de peste 10 5 / ml de urin confirm


ITU la brbat sau la femeie (cu simptome caracteristice); n cazul c pacienta
este asimtomatic, certificarea ITU este dat de izolarea aceleai bacterii n a
doua prob de urin

Izolarea a dou bacterii diferite, fiecare cu o concentraie de peste 10 5 / ml


de urin, impune repetarea recoltrii i nsmnrii; n cazul n care rezultatul
este similar i pentru a doua prob de urin este posibil ITU mixt (n caz
contrar este o foarte probabil contaminare)

Izolarea a trei bacterii diferite, chiar i n cazul n care concentraiile pentru


fiecare n parte depesc 105 / ml de urin, impune repetarea analizei; extrem de
probabil este vorba de o contaminare sau de un p.p. recoltat cu mai mult timp n
urm i meninut la temperatura camerei i nu la frigider

Izolarea unei bacterii cu o concentraie de 10 4 / ml de urin conduce la


recomandarea repetrii analizei (exist i unele excepii, n care rezultatul este
considerat pozitiv, spre ex. pentru levuri n concentraie de peste 10 4 / ml de
urin, stafilococii coagulazo-negativi n concentraie de peste 510 4 / ml de urin
etc)

Lipsa multiplicrii bacteriene sau dezvoltarea de UFC n concentraie de


3
10 / ml de urin reprezint o urocultur negativ

Dorim s subliniem din nou c rezultatul microbiologic trebuie s fie


analizat n contextul clinic i corelat cu rezultatul microscopiei iar n cazul
anumitor bacterii (ex. Salmonella typhi) rezultatul este pozitiv indiferent de
concentraia UFC / ml de urin.
n cazul unei uroculturi pozitive, bacteria izolat se identific (pe baza
caracterelor morfotinctoriale, de cultur, biochimice, alte caractere) i se
testeaz sensibilitatea la antibiotice i chimioterapice, de regul prin metoda
difuzimetric (vezi capitolul 14).
Exist o serie de ncercri pentru optimizarea diagnosticului ITU, inclusiv
abordarea unor tehnici miniaturizate. Dintre acestea vom aminti metoda
imaginat n Institutul de boli infecioase Matei Bal (prof. Florin Cruntu),
metoda Uriline etc. Spre exemplu ultima dintre metode utilizeaz o lam de
plastic acoperit pe ambele pri cu mediu de cultur, protejat ntr-un tub de
plastic.
Principiu:
Mediul CLED de pe prima parte a lamei (Cysteine - Lactose - Electrolyte Deficient
agar) are culoare verde i permite numrarea coloniilor bacteriene (indirect a
numrului de UFC / ml urin) i identificarea prezumtiv. Concentraia sczut de
electrolii inhib invazia Proteus spp. Mediul MacConkey fr cristal violet de pe a
doua parte a lamei are culoare roz; inhib majoritatea bacteriilor gram pozitive.

Tehnica de lucru:
Deurubm capacul i extragem lama fr s atingem suprafaa agarului.
Imersm lama n proba de urin recoltat (dac urina nu este suficient
cantitativ, repartizm p.p. pe cele 2 pri ale lamei cu ajutorul unei pipete
Pasteur). ndeprtm excesul de urin pe o hrtie de filtru curat i punem la loc
n dispozitiv lama nsmnat. Incubm n poziie dreapt, timp de 18-24 ore la
35-37C. A doua zi citim rezultatele, comparnd numrul de colonii aprute pe
mediul CLED cu modelul productorului.
Interpretare:
n cazul n care numrul de UFC / ml este mai mare de 10 5 realizm teste
suplimentare pentru identificare i respectiv antibiograma. Alte elemente privind
interpretarea au fost prezentate anterior.
Control de calitate:

Pregtim o suspensie bacterian n soluie salin fiziologic steril cu 1056


10 bacterii pe ml din fiecare dintre tulpinile de referin

Staphylococcus aureus ATCC 25923

Escherichia coli ATCC 25922

Proteus mirabilis ATCC 12453

Inoculm suspensiile astfel pregtite pe suprafaa mediilor de cultur


Uriline, iar dup 18-24 ore incubare citim i interpretm rezultatele

Staphylococcus aureus: apar colonii doar pe mediul CLED. Fermentarea


lactozei este indicat de prezena culorii galbene n jurul coloniilor dezvoltate.

Escherichia coli: apar colonii galbene pe CLED i colonii roz pe MacConkey.

Proteus mirabilis: apar colonii translucide iar culoarea CLED este albastr;
pe Mac Conkey apar colonii incolore
35. Genul Klebsiella. Klebsiella pneumoniae. (Gabriela Loredana Popa, MI Popa, A
Muntean)
35. 1. Definiie. ncadrare
Microorganismele din genul Klebsiella sunt enterobacterii imobile, nesporulate,
caracterizate printr-o intens activitate metabolic asupra hidrailor de carbon pe
care i hidrolizeaz cu producerea de acizi i uneori de gaz. Glucoza este
degradat cu producere de gaz.
Specia tip a fost descris n 1885 sub numele de Bakterium lactis aerogenes.
Numele actual dateaz din 1954 fiind atribuit n onoarea microbiologului german
Edwin Klebs. Klebsiella pneumoniae este cunoscut i sub numele de Bacillus
Friedlnder.
Exist mai multe specii de exemplu K. pneumoniae, K. ozaenae, K.
rhinoscleromatis iK. oxytoca, aceste tulpini fiind i cele mai des implicate n
patologia uman. n ultima perioad se consider K. ozaenae i K.
rhinoscleromatis drept subspecii ale K. pneumoniae.
Recent, civa membri ai genului Klebsiella au fost reclasificai pentru a forma un
nou gen, Raoultella, pe baza informaiilor din studii genetice. Membrii acestui

nou gen pot fi implicai i n patologia uman, iar denumirea a fost adoptat la
nivelul comunitii tiinifice internaionale [1].
35. 2. Caractere generale
35. 2. 1. Habitat
Klebsiella pneumoniae este larg rspndit n natur (sol, ap), dar i n
intestinul omului i animalelor; n mediul spitalicesc se selecteaz tulpini
multirezistente ce pot coloniza tractul urinar sau respirator la adult sau tractul
intestinal la copil, mai ales dup terapia prelungit cu antibiotice cu spectru larg.
Mai multe studii au urmrit pattern-ul de colonizare cu cu Klebsiella
pneumoniaea indivizilor, cu scopul de a determina factorii de risc pentru infecii.
S-a demonstrat astfel c aproximativ o treime din persoanele testate prezint
portaj de Klebsiella n fecale. Spitalizarea i folosirea de antibiotice a crescut
numrul celor colonizai de bacterii din genul Klebsiella, ct i numrul acestor
bacterii per gram de fecale. Personalul medical prezint Klebsiella pe mini dup
ce ngrijesc pacieni (ntr-un studiu, 17% din asistentele unei secii de terapie
intensiv; rate i mai mari au fost nregistrate n cursul unui focar epidemiologic
activ 30 % [2]).
35. 2. 2. Caractere morfotinctoriale
Klebsiella pneumoniae cuprinde bacili Gram-negativi, capsulai (capsula are
dimensiuni de 2-3 ori mai mari dect diametrul bacteriei), imobili, nesporulai. Se
pot dispune n diplo, n special n organismul uman.
35. 2. 3. Caractere de cultur
Se cultiv cu uurin pe medii uzuale fr cerine nutritive speciale. Pe medii
gelozate s-au descris mai multe tipuri de colonii cel mai frecvent fiind tipul
mucos (M): colonii mari, opalescente, uneori cenuii, cu suprafaa umed care
dup o incubare prelungit prezint tendin la confluare i curgere pe
suprafaa mediului. Pe medii lactozate sunt lactoz-pozitive. Klebsiella
pneumoniae nu se dezvolt pe medii nalt selective i este parial inhibat pe
cele moderat selective. S-a raportat apariia unor tulpini ce dezvolta colonii
hipermucoide, aceste tulpini avnd i o virulen crescut [3].
35. 2. 4. Caractere biochimice
Pe mediile multitest germenii au urmtorul comportament enzimatic: pe mediul
TSI sunt glucoz-pozitivi i uneori fermenteaz glucoza cu producere de gaz, sunt
lactoz-pozitivi, nu produc hidrogen sulfurat; pe mediul MIU sunt imobili, indolnegativi i ureaz-pozitivi; pot crete pe medii avnd citratul drept unic surs
de carbon. Sunt germeni catalaz pozitivi, oxidaz negativi.
35. 2. 5. Rezistena fa de factori fizici i chimici
Sunt puin rezisteni la cldur (distrui n 5-7 minute la 100C); pe sol, n
alimente rezist un mare numr de zile. Dezinfectantele obinuite i distrug n
intervale de timp cuprinse ntre 30 de minute i 2 ore.
35. 2. 6. Structur antigenic
Particularitile morfologice ale klebsiellelor se reflect n structura antigenic.
Au fost descrise antigene somatice O (LPZ) specifice de grup i antigene

capsulare polizaharidice K, specifice de tip. Exist peste 80 de tipuri antigenice,


identificabile de ex. prin reacia de umflare a capsulei i (prin analize serologice
sau de microbiologie molecular).
35. 2. 7. Caractere de patogenitate
Klebsiella pneumoniae este un microorganism condiionat patogen, care poate fi
implicat n patologia uman prin multiplicare i invazivitate.
Factorii de patogenitate sunt reprezentai de capsula (antigenul K) care i confer
rezisten fa de fagocitoz i de endotoxina (antigenul O) eliberat dup
distrugerea bacteriei.
Sideroforii membranari sechestreaz Fe 2+ n focarul infecios, pentru a asigura un
nivel adecvat creterii bacteriene. Dei nu reprezint un rol central n
patogenitate, ntr-un model murin de peritonit, s-a demonstrat creterea
virulenei tulpinilor de Klebsiella prin introducerea genei care codific sideroforul
aerobactin.
Biofilmul reprezint o matrice extrem de bine organizata ce nconjoar bacteriile.
Ele favorizeaz aderarea bacterian pe suprafaa cateterelor.
Adezinele cele mai ntlnite la tulpinile de Klebsiella pneumoniae sunt fimbriile
de tipul 1 i 3. Exist o interrelaie ntre adezinele exprimate i cantitatea de
biofilm produs [4].
35. 3. Patogenie i patologie. Principalele afeciuni produse

Considerat iniial ca fiind agent etiologic al pneumoniilor, s-a dovedit c numai


1-3 % din pneumonii sunt produse de Klebsiella pneumoniae, dar aceste
pneumonii pot fi extrem de grave (pneumonii necrotice i hemoragice), n special
la pacieni cu un sistem de aprare deficitar.
Klebsiella pneumoniae poate fi implicat ntr-o mare varietate de boli precum
toxiinfecii alimentare de tip infecios, infecii ale tractului respirator superior,
infecii urinare etc. Din ce n ce mai frecvent acest microorganism apare n
infecii nosocomiale (de spital), la fel ca i Klebsiella oxytoca. Klebsiella ozaenae
a fost izolat din mucoasa nazal a pacienilor cu ozen (atrofie progresiv a
mucoasei cu pierderea mirosului) iar Klebsiella rhinoscleromatis s-a izolat de la
pacieni cu rinosclerom (granulom distructiv al nasului i faringelui).
Tulpini aparinnd serotipurilor 1-5 au fost izolate din abcese la nivel pulmonar,
hepatic, cerebral. Dintre acestea o tulpin de Klebsiella pneumoniae deosebit de
virulent a fost izolat n special n rile asiatice, aceast tulpin produce
majoritatea abceselor hepatice primare bacteriene [5-7]. ntr-un model murin,
secvena de evenimente ce a condus la constituirea unui abces bacterian primar
dup inoculare oral a fost:
colonizare intestinal (la 12 ore),
diseminare extraintestinal (ntre 12 i 24 ore),
replicare hepatic (la 36 ore),
metastazare septic (dup 48 ore).
S-a tentat identificarea unor gene care favorizeaz producerea abcesului
hepatic [8-10].
n ultima vreme tulpini de Klebsiella productoare de -lactamaze sunt tot mai
des responsabile de infecii nosocomiale mai ales la pacieni iimunocompromii.

De o importan particular sunt enzimele cu activitate -lactamazic cu spectru


extins (Extended Spectrum Beta Lactamaze, ESBL); tulpinile de Klebsiella
productoare de ESBL sunt recunoscute n patologia uman datorit dificultii
tratamentului curativ.
Tratamentul de prim linie pentru tulpinile de K. pneumoniae productoare de
ESBL a fost reprezentat de carbapeneme. n 1996 s-a identificat pentru prima
oar n SUA o tulpin productoare de carbapenemaze (Klebsiella pneumoniae
Carbapenemase - KPC).
35. 4. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de Klebsiella
Diagnosticul de laborator este bacteriologic (direct).
Cu toate c nu este cea mai reprezentativ entitate clinic pentru acest gen,
vom discuta n continuare diagnosticul pneumoniei produse de Klebsiella
pneumoniae. Diagnosticul complet include elemente clinice, paraclinice (ex.
examenul radiologic) i de laborator; diagnosticul bacteriologic fiind util n
stabilirea etiologiei i tratamentului antibiotic corespunztor.
Diagnosticul bacteriologic (direct) include etapele cunoscute.
1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze
respectnd o serie de reguli (ct mai aproape de debutul bolii, nainte ca
pacientul s fi primit antibiotice, ct mai rapid i corect din punct de vedere al
tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie, etc.). n
infeciile produse de Klebsiella pneumoniae se pot recolta materii fecale, urin,
snge, puroi, etc. n continuare vom discuta cazul n care p.p. este reprezentat
de sput (vezi i anexa nr. 6). Din punct de vedere macroscopic, sputa poate
avea un aspect mucoid, de culoare rou nchis, n jeleu de coacze.
2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea a minim
dou frotiuri din produsul patologic recoltat i transportat corespunztor, care se
vor colora cu albastru de metilen (AM) i respectiv Gram. Frotiurile se
examineaz la microscopul optic cu imersie i se noteaz prezena celulelor de
la nivel alveolar (ex. macrofage alveolare), prezena celulelor inflamatorii (ex.
leucocite) i prezena bacililor Gram-negativi, de dimensiuni relativ mari,
ncapsulai (nconjurai de o capsul voluminoas). Examinarea microscopic
trebuie s demonstreze calitatea produsului patologic i s realizeze o
identificare prezumtiv a microorganismului implicat (vezi i anexa nr. 6). n
coloraia cu albastru de metilen, capsula apare ca un halou n jurul klebsielelor.
Utiliznd anticorpi anti-capsulari, se poate realiza o identificare rapid inclusiv
direct, pe produsul patologic, prin reacia de umflare a capsulei (vezi i anexa
nr. 2).
3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel
nct s se poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va
identifica (vezi i anexa nr. 2). Klebsiella pneumoniae se poate dezvolta pe medii
de cultur obinuite n 18-24 ore, la 35-37C. Se prefer utilizarea unor medii de
cultur slab selective (ex. MacConkey). Klebsiella pneumoniae nu se dezvolt pe
medii nalt selective i este parial inhibat pe cele moderat selective. Pe mediile
solide Klebsiella pneumoniae formeaz colonii lactoz-pozitive, mari, de tip M
bombate, cremoase, n pictur de miere, care dau aspectul de curgere pe

suprafaa mediului de cultur, cu tendin de confluare. Se poate realiza i


inocularea la animale de laborator sensibile, oarecele alb (vezi i anexa nr. 2).
Exist medii de cultur selective/difereniale care pot ajuta n diagnosticul rapid
al infeciilor cu Klebsiella sau aducnd informaii epidemiologice de valoare
(izolarea de tulpini productoare de ESBL, datorit rezistenei la o doz de
antibiotic inclus n mediu). Valorile de sensibitilitate i specificitate a acestor
metode sunt foarte bune, dar trebuie s fie folosite cu pruden, pentru a nu
oferi rezultate fals-negative prin limitarea altor germeni posibili implicai n
procesul patogenic. [11]
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai
multor caractere:

Caractere morfotinctoriale: sunt bacili Gram-negativi, cu dimensiuni mari,


capsulai, capsula fiind voluminoas, dispui n lanuri scurte, perechi sau izolai.
n mediul de cultur pot pierde capsula.

Caractere de cultur: produc colonii lactoz-pozitive, de tip M, mari (2-3


mm la 24 de ore, peste 4 mm la 48 ore), bombate, vscoase, cremoase, n
pictur de miere, care dau aspectul de curgere pe suprafaa mediului de
cultur, cu tendin la confluare. Pe mediul MacConkey coloniile apar roii
(fermenteaz lactoza, cu producerea de gaz).

Caractere biochimice:

Klebsiella este un microorganism lactoz-pozitiv, ceea ce se poate


evidenia nc din etapa de izolare pe mediul MacConkey (vireaz culoarea
mediului n rou);

alte caractere biochimice se studiaz dup repicarea unor colonii pe medii


multi- test (TSI, MIU), pe mediul Simmons sau n sisteme multi-test comerciale de
tip API;

Klebsiella pneumoniae este glucoz-pozitiv (cu producere de gaz),


lactoz-pozitiv, nu produce H2S, imobil, ureaz-pozitiv, indol-negativ, care se
dezvolt folosind citratul ca unic surs de carbon; K. oxytoca e indol-pozitiv
acesta fiind un caracter ce poate fi folosit n schema de diagnostic de laborator
diferenial.

produce acetoin din glucoz, caracter evideniat prin reacia VogesProskauer (adugarea de hidroxid de potasiu duce la virarea n rou a unei
culturi bacteriene n care se afl acetoin, n prezena unui indicator de pH
precum alfa-naftol).

Caractere antigenice: se utilizeaz seruri cu anticorpi cunoscui pentru


identificarea tulpinilor de Klebsiella, prin tehnici de aglutinare, coaglutinare,
ELISA [12], Western Blot sau latex aglutinare. Exist peste 80 de tipuri de
antigen K la Klebsiella pneumoniae. Aceste reacii se practic n laboratoare de
referin.

Caractere de patogenitate: se poate utiliza inocularea la oarecele alb


(vezi i anexa nr. 2).

Alte caractere / teste utilizate n identificare care se pot utiliza (n centre


de referin):

testarea sensibilitii la bacteriofagi (unele dintre scheme au fost stabilite


n Institutul Cantacuzino);

gruparea n funcie de rezistena la antibiotice i chimioterapice;


bacteriocinotipie;

caractere testate prin metode ale biologiei moleculare (stabilirea


spectrului plasmidic, cu identificarea plasmidelor implicate n virulen etc.).
5. Antibiograma (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice n
vederea stabilirii tratamentului) este obligatorie i se realizeaz de obicei prin
metode difuzimetrice. Determinarea CMI i CMB poate fi necesar (vezi capitolul
7). Klebsiella pneumoniae reprezint unul dintre microorganismele cu o
rezisten remarcabil fa de antibiotice i chimioterapice. Cnd sunt detectate,
tulpinile productoare de -lactamaze i carbapenemaze necesit teste
moleculare pentru a determina cu exactitate substratul rezistenei.
36. Genul Proteus (Gabriela Loredana Popa, MI Popa)
36. 1. Definiie. ncadrare
Genul Proteus este format din germeni pleomorfi, foarte mobili, Gram-negativi,
care nu fermenteaz lactoza, produc ureaz, sunt nesporulai, necapsulai. Exist
2 specii principale, Proteus mirabilis i Proteus vulgaris (P. morganii a devenit
Morganella morganii, iar P. rettgeri a devenit Providencia rettgeri); celelalte 3
specii sunt P. myxofaciens, P. penneri i P. hauseri.
Majoritatea tulpinilor din genurile nrudite (Proteus, Morganella, Providencia) au
anumite caractere comune (ex. mobilitatea, rezistena la KCN, producerea de
indol).
36. 2. Caractere generale
36. 2. 1. Habitat
Germenii din genul Proteus sunt rspndii n natur ubicvitar, se pot identifica n
materiile organice n putrefacie, n alimente. Fac parte din flora intestinal
uman.
36. 2. 2. Caractere morfotinctoriale
Sunt bacili Gram-negativi cu un accentuat polimorfism (de unde i numele,
derivat din mitologia antic), pe frotiu putndu-se observa bacili, cocobacili,
forme filamentoase de pn la 50-80 m. Prezint un mare numr de cili
peritrichi care le confer mobilitatea caracteristic (dar exist i tulpini aciliate).
Sunt necapsulai i nesporulai.
36. 2. 3. Caractere de cultur
Cresc pe medii simple, inclusiv pe medii peptonate lichide, cu degajarea unui
miros caracteristic de putrefacie. Suport mari variaii de temperatur i de pH.
Pe mediile difereniale (cu lactoz) nu se pot obine colonii izolate, descriindu-se
fenomenul de invazie (migrare). Cultura se ntinde pe toat suprafaa plcii (sau
tubului) n strat continuu sub forma unor valuri succesive. Fenomenul de invazie
poate fi inhibat prin incorporarea n mediu de sruri biliare, tiosulfat de sodiu,
sulfit de bismut, sulfonamide, neomicin, crbune activat etc.
Dac pe o plac cu mediu solid se cultiv 2 tulpini diferite, n 2 puncte opuse,
acestea se vor dezvolta invadnd pn la un punct n apropierea liniei de
ntlnire, unde se va crea o linie de demarcaie ntre cele 2 tulpini (fenomenul
liniei de demarcaie).

Cultivarea unui produs patologic n lichidul de condens al unui tub cu geloz


nclinat incubat n poziie vertical, va conduce (n cazul n care n produsul
patologic exist o tulpin de Proteus spp.) la obinerea n 24 ore a unei culturi
pure de Proteus, datorit mobilitii acestor microorganisme (fenomenul de
crare).
36. 2. 4. Caractere biochimice
Sunt aerobi, facultiv anaerobi. Pe medii slab i moderat selective pe care
fenomenul de migrare a fost inhibat, speciile de Proteus dezvolt colonii de tip S,
lactoz-negative (vezi 36. 4.). Microorganismele din genul Proteus sunt glucozpozitive, lactoz-negative, produc H2S, sunt ureaz-pozitive, indol-pozitive
(exceptnd P. mirabilis i P. myxofaciens) iar pe mediul MIU se poate constata
mobilitatea.
36. 2. 5. Rezistena fa de factori fizici i chimici
Are o rezisten relativ crescut n mediu, n alimente etc i poate rezista n
soluii antiseptice sau n detergeni, ceea ce poate crea probleme deosebite n
mediul de spital. Rezist mai multe luni la temperaturi joase, inclusiv n
alimentele congelate. Rezistena la antibiotice i chimioterapice este
considerabil.
36. 2. 6. Structur antigenic
Prezint antigenul O (LPZ, endotoxina) specific de grup. Dup constatarea c
serul bolnavilor de tifos exantematic aglutineaz cu o tulpin de proteus s-a
demonstrat c genul include o serie de tulpini (OX-2, OX-19, OX-K) care au
nrudiri antigenice cu microorganisme aparinnd genului Rickettsia.
Antigenul flagelar, proteic, H este comun la mai multe tipuri.
36. 2. 7. Rspuns imun
Postinfecios apare un rspuns imun umoral care ns nu are utilitate practic.
36. 2. 8. Caractere de patogenitate
Proteus poate deveni patogen prin multiplicare i invazivitate, n condiii speciale
(prsirea habitatului natural, colonizarea unor gazde cu deficiene ale
sistemului imunitar).
La fel ca i ceilali germeni Gram-negativi, elibereaz de la nivel parietal, dup
distrugere, endotoxina (antigenul O, LPZ).
Mobilitatea deosebit i permite invadarea tractului urinar.
Producerea de ureaz alcalinizeaz urina i favorizeaz formarea de calculi (de
ex. de struvit). Existena calculilor favorizeaz apariia altor infecii urinare sau
cronicizarea acestora.
Rezistena la antibiotice i chimioterapice este remarcabil.
36. 3. Patogenie i patologie. Principalele afeciuni produse
De regul microorganismele din genul Proteus sunt implicate patogenic n
afeciuni ce apar n afara tractului digestiv. Exist totui i toxiinfecii alimentare
de tip infecios n care aceti germeni au reprezentat agenii cauzali.

n mod frecvent se discut despre infeciile cu proteus la nivelul tractului urinar,


dar sunt posibile mai rar i alte infecii (genitale, pleurezii, alte localizri n cursul
unei bacteriemii) de regul la pacieni cu status imun deficitar sau n spital
(infecii nosocomiale).

33. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme


din genul Proteus
Genul Proteus este format din germeni pleomorfi (de unde i numele genului),
foarte mobili, gram negativi, aerobi facultativ anaerobi, care nu fermenteaz
lactoza, produc ureaz, produc fenil-alanin-dezaminaz, sunt nesporulai,
necapsulai. Exist 2 specii principale, Proteus mirabilis i Proteus vulgaris.
De regul microorganismele din genul Proteus sunt implicate patogenic n
afeciuni ce apar n afara tractului digestiv (fac parte din flora microbian
intestinal). Exist totui i toxiinfecii alimentare de tip infecios cu Proteus spp.
n mod frecvent se discut despre infeciile tractului urinar (ITU), dar sunt
posibile i alte infecii (tegumentare, genitale, cu alte localizri n cursul unei
bacteriemii la pacieni cu status imun deficitar sau n spital / infecii
nosocomiale). Vom discuta n continuare diagnosticul de laborator al ITU.
Diagnosticul de laborator microbiologic este bacteriologic, direct, incluznd
urmtoarele etape.
1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze
respectnd o serie de reguli (ct mai aproape de debutul bolii, nainte ca
pacientului s fi primit antibiotice, ct mai rapid i corect din punct de vedere al
tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie etc). n
infeciile produse de Proteus spp. se pot recolta urin, puroi, diferite exsudate
purulente, materii fecale, lichid de vrstur, alimente, snge etc. n continuare
vom discuta cazul n care p.p. este reprezentat de urin (vezi i capitolul 29).
Din punct de vedere macroscopic, urina ar putea fi tulbure, purulent.
Transportul urinei trebuie realizat rapid, n maxim 30 minute, iar dac aceast
recomandare nu poate fi ndeplinit, p.p. trebuie transportat la rece (+ 4C).
2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea unui
preparat proaspt ntre lam i lamel, din sedimentul rezultat dup
centrifugarea urinei. Examenul microscopic al urinei este foarte important pentru
c este uor de realizat, este ieftin i permite observarea unor elemente care
orienteaz diagnosticul. Examinarea microscopic a urinei ar putea conduce la
economii importante (de timp, reactivi i materiale, medii de cultur); vezi i
capitolul 29. Proteus spp. prezint un mare numr de cili peritrichi care confer
mobilitatea caracteristic (exist i tulpini aciliate). Se poate realiza i un frotiu
colorat Gram din urina omogenizat. Germenii au un accentuat polimorfism pe
frotiu putndu-se observa bacili, cocobacili, forme filamentoase de pn la 30
m. Sunt necapsulai i nesporulai. Prezena a cel puin 1 leucocit / cmp
microscopic la examinarea cu obiectivul de imersie sugereaz piuria, care ntr-un
context clinic sugestiv ajut la definirea ITU. n cazul n care din urina
omogenizat prelevm cu ansa calibrat de 0,01 ml urin iar n frotiul rezultat
identificm cel puin 1-2 bacterii / cmp (n microscopia optic cu imersie) acest

rezultat sugereaz prezena a 105 bacterii (uniti formatoare de colonii) / ml i


respectiv infecia tractului urinar.
3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic trebuie realizat n aa
fel nct s se poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va
identifica (vezi i capitolele 9 i 10). Cresc pe medii simple inclusiv pe medii
peptonate lichide cu degajarea unui miros caracteristic de putrefacie. Suport
mari variaii de temperatur i de pH. Este necesar realizarea uroculturii
cantitative i demonstrarea prezenei a peste 10 5 bacterii / ml de urin. Pe
mediile simple uzuale, pe agar-snge, pe AABTL etc, nu se pot obine colonii
izolate, fiind cunoscut fenomenul de invazie (vezi i capitolul 11). Acest aspect
sugereaz prezena Proteus spp. n produsul patologic. Fenomenul poate fi
inhibat dac se realizeaz nsmnarea p.p. pe medii selectivo-difereniale (ex.
Mac Conkey sau ADCL). Pe aceste medii Proteus spp. produce colonii lactozo
negative, de tip S.
4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai
multor caractere:

Caractere morfotinctoriale: Sunt bacili gram-negativi, cu un accentuat


polimorfism (bacili, cocobacili, forme filamentoase de pn la 30 m),
necapsulai i nesporulai.

Caractere de cultur:

Fenomenul de invazie: reprezint un caracter de identificare preliminar


pentru Proteus spp., o bacterie foarte mobil; dac nsmnm o tulpin care
aparine acestui gen la periferia unei plci Petri cu mediu simplu (agarizat 2%),
de la locul nsmnrii cultura se dezvolt n valuri concentrice (se ntinde in
aproape n aproape) pe toat suprafaa mediului

Pe anumite medii selective, invazia este inhibat i se pot obine colonii


izolate (adugm la mediul de cultur acizi sau sruri biliare, tiosulfat de sodiu
etc); aceste colonii sunt lactozo negative i de tip S

Fenomenul liniei de demarcaie, reprezint un caracter util n studii


epidemiologice, n cazul n care tulpinile implicate aparin genului Proteus; dac
pe o plac cu mediu solid cultivm 2 tulpini diferite, n 2 puncte opuse, tulpinile
se vor dezvolta invadnd pn la un punct n apropierea liniei de ntlnire, unde
se va crea o linie de demarcaie ntre cele 2 tulpini (distan de 1-2 milimetri);
dac tulpinile nu sunt diferite va avea loc creterea n valuri fr demarcaie
cu dezvoltarea unei pnze de cultur continue

Fenomenul de crare, reprezint o variant de izolare n cultur pur a


unei tulpini de Proteus; cultivarea unui produs patologic n lichidul de condens al
unui tub cu geloz nclinat incubat n poziie vertical va conduce (n cazul n
care n p. p. exist o tulpin de Proteus spp.) la obinerea n 24 ore a unei culturi
pure de Proteus, care se va dezvolta n valuri suprapuse pn la partea
superioar a mediului de cultur.

Caractere biochimice:

Proteus spp. include microorganisme lactozo negative.

Alte caractere biochimice se studiaz dup repicarea unor colonii pe medii


multi test (TSI, MIU), pe mediul Simmons sau n sisteme multi test comerciale;
Proteus spp. este glucozo pozitiv (uneori cu producere de gaz), lactozo negativ,

produce H2S, mobil, ureaz pozitiv, se poate dezvolta folosind citratul ca unic
surs de carbon.

Proteus spp. produce fenil-alanin-dezaminaz.

Proteus mirabilis este indol negativ i ornitin decarboxilaz pozitiv n timp


ce Proteus vulgaris este indol pozitiv i ornitin decarboxilaz negativ.

Caractere antigenice:

Se utilizeaz seruri cu anticorpi cunoscui (anti-O i anti-H) pentru


identificarea tulpinilor de Proteus, prin tehnici de aglutinare (la nivelul
laboratoarelor de referin).

Alte caractere / teste utilizate n identificare (n centre de referin):

Testarea sensibilitii la bacteriofagi

Gruparea n funcie de rezistena la antibiotice i chimioterapice.


5. Antibiograma (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice n
vederea stabilirii tratamentului) este obligatorie i se realizeaz de obicei prin
metode difuzimetrice. Determinarea CMI i CMB poate fi necesar (vezi capitolul
14).

S-ar putea să vă placă și