FACULTATEA DE MEDICIN I

FARMACIE
SPECIALIZAREA - MEDICIN DENTAR

FIZIOLOGIE
LUCRARI PRACTICE

FIZIOLOGIA SNGELUI
I.

EXPLORAREA SERIEI ERITROCITARE

1. Numararea eritrocitelor

2. Dozarea hemoglobinei sangvine. Metoda

Drabkin
3. Determinarea hematocritului
4. Determinarea vitezei de sedimentare a
hematiilor
5. Indicii eritrocitari
II.

EXPLORAREA SERIEI LEUCOCITARE

Formula leucocitar
Transfuzia: grupele sangvine
sistemul Rh
Hemostaza fiziologic

I. EXPLORAREA SERIEI
ERITROCITARE
1. Numararea eritrocitelor

Definitie: Eritocitele(hematiile), sunt celule

anucleate de forma unor discuri biconcave, fara
ribozomi si fara mitocondrii. Au rol in homeostazia
gazelor respiratorii si contribuie la mentinerea
echilibrului acido-bazic.
Principiu:
- numararea la microscop a eritrocitelor aflate intr-un
volum determinat de lichid, diluat in proportie
cunoscuta
- dilutia are rolul de a face posibila numararea
elementelor care sunt in nr foarte mare si de a
impiedica coagularea
- in functie de dilutie se calculeaza nr. de hematii /mm

necesare:
-Materiale
lichid de dilutie
:izoton ptr a impiedica hemoliza (sol.
Hayem, sol. Withby, sol Na Cl 9)
- pipeta Potain(tub capilar gradat si o bula de dilutie
cu o perla mobila)
- camera de numarat (Burker-Turk)
- microscop
- lamele
- vata, alcool medicinal 96C, ace de seringa de unica
folosinta
Principiu de lucru :
Metoda manuala
- se numara direct la microscop ( in camera de
numarat), eritrocitele dintr-un volum cunoscut de
sange, diluat intr-o proportie cunoscuta

 Metoda automata principiu

- o suspensie de eritrocite intr-un volum
impedantei electrice

cunoscut de reactiv trece printr-un

orificiu ( fanta) prevazut cu electrozi
intre care se aplica un curent constant.
- trecerea prin orificiu a fiecarui
eritrocit, nonconductor, va determina o
scadere brusca de tensiune denumita
puls.
- pulsurile sunt numarate electronic si
exprimate ca numar de eritrocite.

Valori normale:
RBC (red blood cells)
4-5,5 mil/mm sau 4-5,5 x 10/l
( valoare medie);
barbati = 4,9 0,7 mil/mm;
femei = 4,3 0,6 mil/mm

2. Dozarea hemoglobinei (Hb)

sangvine
Metoda Drabkin
Definitie : Hemoglobina reprezinta 95% din masa
proteica eritrocitara si ocupa aproximativ 35 % din
volumul eritrocitar.

Principiu: Hb in prezenta unei solutii de cianura de

potasiu si fericianura de potasiu se transforma in

cianmethemoglobina de culoare brun-roscata.
Intensitatea culorii este proportionala cu concetratia de
Hb ce se determina spectrofotometric

Materiale necesare :

- reactiv Drabkin ( contine cianura si fericianura de

potasiu);
- sange proaspat sa recoltat pe anticoagulant (Na2 EDTA);
- spectrofometru.

 Tehnica :
- in doua eprubete se introduc:

- In eprubeta martor : reactiv Drabkin 5ml

- In eprubeta proba : reactiv Drabkin 5ml + sange
20 ( l)
se omogenizeaza continutul eprubetei proba;
se lasa in repaus la temperatura camerei 20
minute;
se citeste extinctia probei fata de martor la 540
nm;
concentratia de Hb , corespunzatoare extinctiei, se
determina din tabele.

Valori normale:
- barbati: 15 2g/ dl;
- femei: 14 2 g / dl.

3. Determinarea
Hematocritului

Definitie: Hematocritul (Ht), volumul procentual

eritrocitar, reprezinta concentratia eritrocitelor in 100ml
sange integral, dupa centrifugare.
Principiu :
- se recolteaza sange pe, care se separa prin centrifugare,
in sangele recoltat pe anticoagulant, eritrocitele din
plasma si se determina raportul volumelor lor
- recoltarea se face din:
a) vena si sange capilar micrometoda microHt
b)vena macrometoda Wintrobe
Materiale necesare
- vata, alcool medicinal 96C
- materiale necesare recoltarii sangelui prin punctie
venoasa : garou, seringa si ac de unica folosinta
- anticoagulant:Na2EDTA, amestec de oxalati Wintrobe
sau heparina
- tuburi de Ht
- pipete Pasteur
- centrifuga 4000rot/min

Tehnica de lucru
a)Macrometoda
se recolteaza 3-5ml sange prin punctie
venoasa pe subst. anticoagulanta
- se pune cu pipeta Pasteur in tubul de
hematocrit pana la diviziunea 100
- se centrifugheaza tuburile 20min la
4000rot/min, sau 30 min la 3000rot/min
b) Micrometoda
- se incarca tubul capilar heparinat prin
capilaritate cu sange
- se centrifugheaza20min la 4000rot/min,
sau 30 min la 3000rot/min

Citirea rezultatelor

Dupa centrifugare se masoara :

Inaltimea H a coloanei totale de sange
Inaltimea h a coloanei de eritrocite
Rezultatele sunt exprimate procentual conform formulei :
Ht(100%)=h/H x 100

Valori normale( normocitemie):

- barbati : 457% (0,38 0,52 l/l); raport eritro-plasmatic
= 45/55
- femei : 425% (0,37-0,47 l/l); raport eritro-plasmatic=
40/60
- nou-nascuti : 56%
- copii : 35 45%
Ht arterial si cel capilar Ht venos
Ht somatic = 0,91x Ht venos

 Variatii patologice
- valori crescute ale Ht definesc policitemia (poliglobulie ,
deshidratarea etc.)
- valori scazute ale Ht definesc oligocitemia (anemii, hiperhidratare,
etc.)
Pentru apreciere corecta, reultatele obtinute la determinarea Ht, se
coreleaza cu cele ale volemiei:
normovolemie
- normocitemie - starea fiziologica
- oligocitemie anemii
- policitemie poliglobulie fiziologica de altitudine
poliglobulie patologica : boli cardiace
si pulmonare
hipovolemie
- normocitemie - hemoragii acute
- oligocitemie anemii grave(Biermer), casexie
- policitemie - deshidratare extracelulara
hipervolemie
- normocitemie fiziologica : de la gravide in trimestrul III
patologica : hipertensiunea arteriala
- oligocitemie dupa perfuzii cu plasma, in ciroze
- policitemie - HTA cu insuficienta respiratorie )

4. Determinarea vitezei de sedimentare

a hematiilor (VSH)
Principiu :
- in sangele recoltat pe anticoagulant, lasat in repaus ,
se produce separarea plasmei de elementele figurate
ce sedimenteaza, in virtutea gravitatiei.
- in sangele circulant elementele figurate se gasesc in
suspensie dispersate in plasma.
Materiale necesare
- vata, alcool medicinal 96C;
- materiale necesare recoltarii sangelui prin punctie
venoasa : garou, seringa si ac de unica folosinta;
- eprubete de hemoliza;
- pipete Westergreen cu diviziuni mm de la 0-200,
gradatia incepand de sus, cu stativul corespunzator ;
- anticoagulant : citrat de sodiu 3,8 % , solutie sterila;
- pipete gradate de 1 si 2 ml

Tehnica de lucru

- intr-o eprubeta de hemoliza se introduc 0,4 ml citrat

de Na 3,8% cu ajutorul unei pipete gradate de 1ml
- Intr-o eprubeta curata de pune o cant de 2-3ml de
sange recolatat prin punctie venoasa fara aplicare de
garou daca este posibil
- Se aspira 1,6 ml sange cu ajutorul unei pipete de 2
ml si se adauga in eprubeta de hemoliza
- Se omogenizeaza prin cateva miscari de rasturnare
- Se aspira sange in eprubeta Westergreen pana la
diviziunea 0
- Extremitatea inferioara pipetei W. se fixeaza pe dopul
de cauciuc de la partea inferioara a suportului
- Estremitatea superioara a pipetei W. se fixeaza cu
ajutorul clemei de resort
- Pozitia pipetei in stativ trebuie sa fie perfect verticala
- Se noteaza ora fixarii in stativ a tubului

Citirea rezultatelor
Citirea rezultatelor se face
dupa 1, 2 si 24 ore
Rezultatele - se exprima
in mm
Valori normale ale VSH:
- Barbat : 2 - 7mm/ora si
7 - 15 mm/2 ore
- Femeie: 4 - 9mm/ora si
12 - 17mm/2 ore
- In timpul sarcinii:
35mm/ora
(valoare
medie)
- Nou-nascut : 0,5mm/ora
- Copii mici si sugar : 912mm/ora

Valori crescute ale

VSH:
- Boli infectioase sau
inflamatoare
- Leucoze,reticuloze
- Mielom
- Boala Hodgkin
- Nefroze
- Infarct miocardic
- Macroglobulinemia
Waldenstrom
Valori scazute ale
VSH:
- Hepatita epidemica
- Stari alergice

Variatii fiziologice:
- in timpul menstruatiei la femei creste
V.S.H-ul
- in sarcina (mai ales in ultimile luni)
- la copii,
comparativ
un adult
Pentru
a evita
rezultatelecu
eronate
, trebuie
-

respectate urmatoarele conditii:

sangele se recolteaza dimineata pe nemancate ;
determinarea se face dupa imediat dupa recoltare (in
primele 2-3 ore)
conservarea sangelui creste V.S.H-ul
se utilizeaza ca anticoagulant citratul de sodiu,
deoarece oxalatul de sodiu creste V.S.H-ul
pozitia pipetei trebuie sa fie perfect verticala,
inclinarea acesteia crescand V.S.H-ul
temperatura camerei trebuie sa fie cuprinsa intre 2027 C deoarece temperaturii creste V.S.H-ul
sa se evite hemoliza

5. Indici Eritrocitari

Valorile Hb , Ht si ale numarului de eritrocite stau la

baza calcularii indicilor eritrocitari , utili pentru
studiul eritrocitelor in functie de marime si continutul
in Hb si pentru diagnosticul morfologic al anemiei

A. Volumul eritrocitar mediu

(VEM, MCV mean corpuscular volume)

Definitie : indica volumul mediu al unui eritrocit.

V.E.M.(fl) = [Ht (l/l) x 1000 ] / E(10/l) sau
V.E.M(l) = [Ht (%) x 10] / E(mil/mm)

Valori normale : - 80- 100 fl ( femtolitri) sau m normocite

Valori patologice: - sub 80 fl microcite
- peste 100 fl macrocite

B. Concentratia medie de Hb
eritrocitara
( CHEM, MCHC mean corpuscular hemoglobin
concentration)
Definitie : reprezinta concentratia medie de Hb / 100
ml eritrocite.

C.H.E.M. = [Hb(g/dl) x 100] / Ht(%)

Valori normale: 32- 36 g Hb/100ml
eritrocite.

C. Hemoglobina eritrocitara medie

(HEM , MCH mean corpuscular hemoglobin)
Definitie : reprezinta cantitatea de Hb/eritrocit.
H.E.M. = [ Hb (g /dl) x 10 ] / E(mil / mm)
Valori normale : 27 32 pg

D. Indicele de distributie eritrocitar

( RDW red cell distribution width)
Definitie : reprezinta deviatia standard a mediei
volumelor eritrocitare rapoarte la V.E.M si se
determina
cu ajutorul histogramelor curbe de distributie %
a
marimii celulelor.
- se utilizeaza la aprecierea anizocitozei
valabilitatea crescuta a volumului eritrocitelor
- cu cat anizocitoza este mai marcata , cu atat
RDW va fi mai mare.
Valori normale: 11,5- 14,5 %.

DIAGNOSTICUL DIFERENTIAL AL
ANEMIILOR

Frotiu sange periferic :

anizocitoza (variatii de volum)
- anizocromie ( variatii de incarcare cu Hb )
- poichilocitoza ( variatii de forma)
-

suspiciune clinica confirmare anemie tip morfologic

punctie biopsie
Dozare: nr.E

medulara
Hb
Ht

ERITROCITARI

INDICI

 Anemie
de Fe)
- V.E.M.

hipocroma microcitara - anemia feripriva (deficit

- C.H.E.M.
- H.E.M.

Anemie normocroma normocitara - anemia aplastica

( insuficienta maduvei osoase hematogene)
N
- C.H.E.M. N
- H.E.M.
N
Anemie normocroma macrocitara anemia megaloblastica
(deficit de B12 si acid folic)
- V.E.M.

- V.E.M.

C.H.E.M. N
- H.E.M.

II.

EXPLORAREA SERIEI
LEUCOCITARE

Maduva hematogena contine celule stem

pluripotente,care se diferentiaza de celulele
progenitoare angajate ,ce vor da nastere diferitelor
tipuri de celule sangvine.
Se descriu
- celulele progenitoare mieloide : din care diferentiem
eritrocitele, o parte de leucocite (granulocitele
neutrofile, eozinofile, bazofile si monocitele) si
trombocitele
- celule progenitoare limfoide : din care rezulta
limfocitele B si T.
Celulele adulte apartinand seriei leucocite vor actiona
impreuna in vederea apararii organismului impotriva
agresivitatii infectioase (virale,bacteriene sau
parazitare).

 Principiu de lucru :
Metoda manuala :
- numaratoarea directa la microscop a leucocitelor din
volumul cunoscut de sange ,diluat intr-o proportie
cunoscuta.
- celulele se numara in dispozitive speciale numite
hemacitometre (camere de numarat).

Metoda automata (metoda de impedanta

electrica)
- o suspensie de leucocite dintr-un volum cunoscut de
sange,trec printr-un orificiu;
- un curent electric constant este aplicat de electrozii de
platina aflati de-o parte si de alta a orificiului;
- deoarece fiecare celula este nonconducatoare ea va
produce la trecerea prin orificiu o modificare brusca de
tensiune = un plus;
- aceste pulsuri vor fi numarate electronic.

 Valoarea normala(V.N.) : 5000 9000

leucocite/mm
Variatii ale numarului de leucocite:
Leucocitoza = cresterea numarului leucocitelor
in sangele periferic care poate fi:
- fiziologica (temporara) la sugari, in sarcina,
dupa un efort fizic, perioadele postprandiale, la
altitudine, stres emotional,etc.;
- patologica in boli infectioase
,leucemii,alergii,etc.
Leucopenia = scaderea numarului de leucocite
in sangele periferic care poate fi:
- fiziologica la varstnici, in somn, la surmenati
fizic;
- patologica in distrugeri ale maduvei
hematoformatoare dupa tratamente cu radiatii
ionizante, medicamente citostatice, etc.

Seria leucocitara cuprinde 3 linii

1.
SERIA GRANULOCITARA cuprinde elemente
celulare:
polinucleare granulatii : neutrofile, acidofile, bazofile.
Granulocitul nesegmentat = granulocitul tanar
- are nucleul in forma de potcoava,datorita condensarii
cromatinei nucleare;
- citoplasma este acidofila si contine granulatii
diferentiate neutrofile, eozinofile, bazofile.
Granulocitul segmentat = granulocitul adult
- are nucleul segmentat;
- cu cat celula este mai matura,cu atat are mai multe
segmente.
a)Granulocitul segmentat neutrofil
- are citoplasma slab acidofila (roz-palid), cu granulatii
neutrofile specifice, mici, punctiforme si numeroase;
- nucleul este segmentat in 2-5 lobi legati intre ei prin
punti fine
- are rol in apararea antimicrobiana prin microfagocitoza
- are rol secretor : interleukina l (substanta pirogena)
enzime lizozomale.

b)Granulocitul segmentat eozinofil:

- are in citoplasma granule mari, egale,
eozinofile, portocalii;
- nucleul prezinta 2 segmente;
- are rol in fagocitoza bacteriilor, fungilor,
complexelor antigen-anticorp,etc;
- are rol in apararea parazitara;
- are rol in bolile alergice.
c) Granulocitul segmentat bazofil
- contine granulatii caracteristice bazofile
care ocupa toata citoplasma,uneori
suprapunandu-se peste nucleu;
- nucleul este complet segmentat;
- are rol in procesele inflamatorii (capacitate
de fagocitoza mai redusa).

2. SERIA LIMFOCITARA
- dupa marime limfocitele pot fi : mici,medii si mari;
- forma limfocitelor este rotunda sau usor ovala, cu
diametrul de 2 m;
- nucleul este mare si ocupa cea mai mare parte a
celulei fiind intens colorat;
- citoplasma este slab bazofila (albastru-deschis);
- are rol in raspunsul imun, declansat de
patrunderea in organism a unor straine sau a
unor macromolecule proteice;
- acest raspuns este caracterizat prin productia de :
anticorpi (imunitate umorala) de catre limfocitele
B
produsii celulari citotoxici (imunitate celulara)
limfocitele T.

3. SERIA MONOCITARA

monocitele sunt cele mai mari celule din

seria leucocitara (10 25 m);
nucleul este nesegmentat,reniform si nu
prezinta nucleoli;
citoplasma este abundenta, intens bazofila
(albastru inchis);
are rol in macrofagocitoza particulelor
coloidale, a celulelor degenerate;
are rol in raspunsul imun ca celule accesorii
(prezentatoare de antigen)

FORMULA LEUCOCITARA
Definitie : reprezinta distributia procentuala a diferitelor
tipuri de leucocite pe un frotiu de sange periferic, dupa
numararea a cel putin 200 de elemente.

Materiale necesare:
-

vata, alcool medicinal 96C, ace de seringa de unica

folosinta
- microscop
- lamele
- coloratie May Grunwald - Giemsa

Principiu de lucru :
Metoda manuala

- se realizeaza un frotiu din sangele periferic proaspat

recoltat si se coloreaza cu May-Grnwald-Giemsa
- peste frotiu se pune o picatura de ulei de cedru pentru
fixare
- limfocitele au tendinta de a se grupa in centru, iar PMN
neutrofilele si monocitele se disperseaza spre margini in
franjuri

- se vor obtine urmatoarele coloratii:

-

granulocitele neutrofile : granulatii brune

granulocitele eozinofile : granulatii portocalii
granulocitele bazofile : granulatii albastru inchis-negru
nucleii: violaceu
citoplasma : PMN neutrofilelor roz
limfocitelor, monocitelor albastra
hematiilor - roz-rosiatic
se priveste la microscop, folosind obiectivul cu imersie;
se numara la microscopul optic 200 de leucocite de pe
un frotiu;
se indentifica tipurile de leucocite pe baza criteriilor
morfologice (aspectul nucleului,granulatii
citoplasmatice);
se determina raportul procentual intre acestea.

- se
izoleaza si
se efectueaza
Metoda
automata
: automat raportul
procentual dintre tipurile de leucocite din sangele
periferic, in functie de volum, prezenta granulatiilor
citoplasmatice si complexitatea segmentarii
nucleului, cu obtinerea histogramelor.

Valorile normale ale formulei leucocitare

determinate prin metoda automata sunt :
- Segmentate neutrofile : adult 52-74% copil 25-40%
eozinofile : adult 0-4%
copil 1-4%
bazofile : adult 0-1% copil 0-1%
- Limfocite adult 25-35% copil 50-70%
- Monocite adult 1-8%
copil 1-8%

 La copiii mici, valorile lor se egaleaza in

jurul varstei de 5-6 ani, apoi se inverseaza,

ajungand treptat la valorile adultului.
Variatiile formulei leucocitare
NEUTROFILE
Neutrofilia
-

cresterea numarului de neutrofile peste valoarea normala ;

prezenta elementelor neutrofile tinere in sange periferic fiind
dovada unei activitati medulare intense sau a citolizei accentuate;
fiziologica: eforturi fizice mari, graviditate, stres;
patologica: infectiile acute, intoxicatii endogene (uremie) si
exogene
leucemia mieloida cronica, actiunea agentilor fizici
(traumatisme, arsuri)

Neutropenia
scaderea numarului neutrofilelor sub limita normala;
apare dupa actiunea unor medicamente ( citostatice,
tranchilizante antiinflamatoare, antibiotice), radiatii, agenti
chimici toxici (benzen).

 EOZINOFILE
-

Eozinofilia
cresterea numarului de eozinofile;
se intalneste in: alergii , parazitoze, afectiuni
dermatologice.
Eozinopenia
scaderea numarului de eozinofile;
apare in stari de hiperactivitate adrenocorticoida.

BAZOFILE
Bazofilie
- cresterea numarului de granulocite;
- apare in boli contagioase, leucemia mieloida
cronica.

 LIMFOCITE
-

Limfocitoza
cresterea numarului de limfocite;
fiziologica la copii ;
patologica in afectiuni virale acute, mononucleoza
infectioasa, leucemia limfatica cronica.
Limfopenie
in limfopoeza insuficienta , infectii virale, SIDA

MONOCITE
Monocitoza
- apare in mononucleoza infectioasa , infectii
bacteriene (endocardita, TBC), afectiuni virale
( hepatita , gripa , rujeola), convalescenta infectiilor
bacteriene si virale.

 Transfuzia
Grupele sanguine
Hemostaza fiziologic

DETERMINAREA GRUPELOR
SANGVINE
Eritrocitele (E) umane au un nr mare de antigene - Ag pe
suprafata lor. Ag sunt grupatemin peste 17 sisteme ce definesc
grupele sangvine, dintre care cele mai importante sunt ABO si
Rh.
SISTEMUL ABO
Landsteiner - 1901
Antigene/aglutinogene (Ag) : A si B - exprimate pe eritrocite
- apar in aIII-a luna de viata intrauterina
- ating expresia imunologica completa la 6-12 luni
- sunt glicoproteine
- au precursor comun subst. H
Anticorpi/aglutinine (Ac) : - si aflati in plasma
- apar in plasma la cateva luni de la nastere
- sunt de tip Ig M, si nutrec bariera materno-placentara

REGULA LUI LANDSTEINER

Niciodata in sangele unui individ nu se vor gasi concomitent
Ac impotriva Ag proprii.
Hemaglutinarea repr. adunarea eritrocitelor in gramezi
vizibile cu ochiul liber
Hemoliza repr reactia de distrugere a eritrocitelor cu
eliberarea Hb.

Grupa
sangvi
na

Ag (pe
E)

Ac (in
plasma)

Frecven
ta

O/I

si

36%

A / II

41%

B / III

16%

AB / IV

AB

7%

Metode de determinare a grupelor

sangvine
Metoda Beth-Vincent-Tzank
Principiu: - se pune in contact pe lama ser hemotest, care contine Ag
cunoscute, cu sange de grup necunoscut
- aparitia hemagutinizarii in picatura de ser cu Ac cunoscuti indica
prezenta Ag
corespunzator
Materiale necesare: - ser hemotest O/I(contine Ac si ) sau anti AB
- ser hemotest A/II(contine Ac ) sau anti B
- ser hemotest B/III(contine Ac ) sau anti A
- 2 lame de sticla, pipete, ac steril, vata, alcool
Tehnica : - se folosesc 2 lame curate si uscate
- pe prima lama se pune :- la stanga o picatura de ser hemotest O/I
- la mijloc o picatura de ser hemotest A/II
- la dreapta o picatura de ser hemotest B/III
- se recolteaza sange: - se dezinfecteaza pulpa degetului cu alcool
- se punctioneaza cu acul steril
- sangele care apare se recolteaza pe cele 4 colturi ale
celeilalte
lame

- se omogenizeaza fiecare picatura de ser cu

cate un colt al lamelei
- raportul volumetric sange/ser 1/10; 1/20
- lama se roteste usor 2-4 min ptr a se
amesteca serul cu sangele
- rezultatele se citesc in urmatoarele 3 min,
max in 10 min
- se observa absenta sau prezenta
hemaglutinarii

CARACTERIZAREA SISTEMULUI
Rh
Sistemul Rh este un mozaic antigenic, cuprinzand
trei perechi de antigene : Cc , Dd , Ee .
Antigenitatea cea mai mare o are antigenul D
85% din populatia de rasa alba au antigenul Rh (D)
= Rh+
Anticorpii anti Rh nu se gasesc normal in plasma ,
apar la persoanele cu Rh (D)- dupa contactul cu
antigenul D prin izoimunizare:
- transfuzii cu sange Rh (D)+;
- mame Rh(D)- cu sarcina cu fat Rh (D)+
Acesti anticorpi , numiti si imuni , sunt de tip IgG
Ac anti Rh strabat bariera materno-placentara
determind hemoliza eritrocitelor fetale Rh (D)+.

DETERMINAREA FACTORULUI Rh
Principiu: se pun in contact Ac antiRh (D) cu sangele de cercetat.
Materiale necesare: -ser antiRh (D):
-hematii Rh (D)+
-hematii Rh (D)- in suspensie in ser propiu , sangele fiind recoltat
anticoagulant:
-cutii Petri , lame de sticla , pipete:
-material necesar pentru recoltarea sangelui prin intepare:
-termostat.

fara

Tehnica:
- sangele de cercetat se obtine prin punctionarea pulpei degetului, in
conditii sterile
- se recolteaza 0,5-1ml sange,care se introduce in eprubeta de hemoliza .
- dupa coagulare ,cheagul se sparge si se obtine o suspensie de hematii in
serul
propriu.
- la mijlocul unei lame de sticla se pune o picatura de ser anti Rh , in care
se
amesteca o picatura de sangele de cercetat (raportul volumeric intre
picatura de
sange si picatura de ser trebuie sa fie 1/10-1/20).

- pe a doua lama , martor , se pune o picatura de ser anti-Rh la mijloc

si alta, la
capatul din dreapta.
- in picatura din mijloc se pune si se amesteca o picatura hematii Rh
(D)+ , iar
in cea din dreapta o picatura hematii Rh(D)- lamele se aseaza in cutia Petri , tapetata cu hirtie de filtru umezita si
se
introduc in termostat (37C).
- rezultatul se citeste dupa 6 min , citirea se va repeta la 30 si 60 min.

Interpretare:
- daca hematiile de pe prima lama sunt aglutinate , exista antigenD =>
grupa Rh (D)+;
- daca hematiile de pe prima lama n-au aglutinat , nu exista antigen
D=>
grupa Rh (D)-.
Aprecierea rezultatelor se face comparativ cu lama martor.

HEMOSTAZA FIZIOLOGIC
Hemostaza fiziologica reprezinta ansamblul de fenomene la care
participa factori celulari , tisulari , vasculari si umorali care
asigura oprirea unei hemoragii rezultat in urma lezarii peretelui
capilar.
Hemostaza fiziologica prezinta doua caracteristici :
- este efectiv numai in vitro
- opreste numai hemoragiile vaselor mici.
Procesul hemostatic prezinta doi timpi:
1. Hemostaza primara sau timpul vasculo-plachetar induce
oprirea provizorie a sangerarii , permitand realizarea conditiilor
necesare formarii cheagului definitiv .
TIMPUL VASCULAR este primul care intra in actiune , fiind
determinat de leziunea peretelui capilar ; consta intr-o
vasoconstrictie localizata la nivelul arteriolelor si a sfincterelor
precapilare.
TIMPUL PLACHETAR incepe imediat dupa timpul vascular ; se
realizeaza prin aderarea si agregarea trombocitelor la locul
leziunii peretelui vascular , urmata de procesul de metamorfoza
vascoasa care are rezultat formarea trombusului alb
trombocitar temporar.

2. Hemostaza secundara sau coagularea

-

realizeaza hemostaza definitiva ;

poate fi definita ca o modificare a stari fizice a sangelui
care trece din stare lichida in stare de gel , transformare
care implica o succesiune de reactii enzimatice in cascada
acestea incep cu leziunea peretelui vascular si se termina
cu formarea cheagului stabil de fibrina.

Explorarea hemostazei se realizeaza prin :

- teste screening, care se utilizeaza in vederea
evidentierii unei afectari a hemostazei
- teste specifice, care se efectueaza in vederea identificarii
cu precizie a defectului hemostatic

3.EXPLORAREA SERIEI TROMBOCITARE

Numararea trombocitelor

Metoda manuala
Principiu: - se realizeaza direct in hemocitometru, utilizand
sange recoltat
intr-o proportie cunoascuta, cu solutie
care lizeaza celelalte
elemente saturate ( solutie
Weed) ( eroare 15-30%).
Metoda automata (metoda impedantei electrice)
Principiu: - o suspensie de trombocite este fortata sa
traverseze un
orificiu ingust prevazut cu doi electrozi
intre care se aplica un
curent continuu.
- trecerea fiecarui trombocit determina o scadere brusca de
tensiune numita puls , care sunt numarate electronic si
redate
ca numar de trombocite /mm.
Normal: numarul de trombocite = 150000-350000/mm
Patologic: <150000/mm - trombocitopenie
>350000/mm - trombocitoza

Studiul morfologiei trombocitelor

Principiu: analiza morfologica se realizeaza pe frotiul de
sange periferic
colorat May-Grnwald-Giemsa.
trombocitele au aspect heterogen :
- zona centrala sau granulomerul continand granulatii
azurofile izolate sau aglomerate ,
- zona periferica sau hialomerul fiind omogena si palid
colorata in albastru sau violet.
Interpretare: pentru aprecierea orientativa a numarului de
trombocite :
- grupe de 15-25 elemente - numar normal de trombocite;
- grupe de 4-6 elemente - trombopenie;
- gupe foarte mari de elemente - trombocitoza.

TESTE DE EXPLORARE A HEMOSTAZEI

PRIMARE
1. Testul fragilitatii capilare ( testul Rumpell-Leede)
Principiu: rezistenta sau fragilitatea capilarelor se apreciaza
prin numarul de
petesii ( hemoragii mici , punctiforme)
aparute in zona investigate in
conditiile cresterii
temporare a presiunii intracapilare .
Materiale necesare: tensiometru
Tehnica: - se aplica manseta tensiometrului la nivelul bratului si
se exercita o
o presiune egala cu media
artimetica dintre tensiunea arterial maxima
si minima ,
timp de 5minute;
- dupa incetarea compresiunii, se numara petesiile aparute pe
o suprafata
de 2,5 cm2 la nivelul plici cotului, sub
marginea inferioara a mansetei
tensiometrului.
Interpretare: - normal :<10 petesii (testul-)
- patologic:10 petesii (testul +) indica o fragilitate capilara crescuta :
10-19 petesii=test slab pozitiv (+)
20-29 petesii=test moderat pozitiv(++);
30-39 petesii=test pozitiv (+++);
>40 petesii=test intens pozitiv (++++).

Fragilitatea crescuta apare in:

afectiuni ale peretelui vascular
- vasculopatii congenitale (ex.: purpura vasculara idiopatica )
- dobandite (ex. scorbut, purpura vasculara alergica);
trombocitopenii (scaderea numarului de
trombocite<100.000/mm3)

2.Timpul de sangerare ( TS )
Metoda Duke
Principiu: - se masoara timpul necesar pentru oprirea spontana
a sangerarii produse
prin incizia superficial a
tegumentelor la nivelul lobului urechii.
Materiale necesare: - ace sterile (hipodermice);
- vata si alcool;
- hartie de filtru(2/20);
- cronometru.

Tehnica:

- se dezinfecteaza tegumentele lobului urechii;

- se efectueaza o incizie cu lungime de 1,5-10 mm si
profunzime de
3mm;
- picaturile de sange care apar spontan sunt absorbite
din 30 in 30 sec.
din momentul inciziei, pe o banda de
hartie de filtru, pana la oprirea
sangerarii.
Interpretare: - TS ( min )=numarul de picaturi de sange de pe
hartia de filtru/2
- normal: TS=1,5-4 minute
- patologic: TS > 6 minute ( valorile de 4-6 min
necesita o
determinare la
cealalta ureche)

TESTE DE EXPLORARE A HEMOSTAZEI

SECUNDARE
1. Timpul de coagulare global ( TC ) Metoda Lee si White
Principiu: TC exploreaza ambele mecanisme ale coagularii ( intrinsec si
extrinsec ), si repr.
timpul necesar coagularii sangelui dupa
contactul acestuia cu suprafata rugoasa a
sticlei.
Materiale necesare: - material steril pentru recoltarea sangelui ;
- eprubete , termostat , cronometru.
Tehnica: - se recolteaza 2-3ml sange venos in conditii sterile intr-o
eprubeta de hemoliza si se
porneste cronometrul;
- eprubeta cu sange venos se incubeaza la 37C si se examineaza prin
inclinare din 30
in 30sec
- cronometrul se opreste in momentul aparitiei cheagului sangvin.
Interpretare : normal : TC in eprubeta - 8-10 minute
patologic: TC scurtat - sindrom de hipercoagulabilitate,
TC prelungit - sindrom de hipocoagulabilitate
din:
insuficienta hepatica
hipoprotrombinemie;
hemofilii;
afibrinogenemie, hipofibrinogenemie;
deficit de vitamina K.
Observatie :TC este o metoda de sensibilitate redusa.

2. Timpul Quick( TQ) / Timpul de protrombina

Principiu : TQ exploareaza mecanismul extrinsic al coagularii si repr. timpul
de coagulare al
plasmei oxalate dupa aditia de troboplastina tisulara.
Materiale necesare: - plasma oxlata;
- tromboplastina tisulara (obtinuta din creier de iepure)=factorul III;
- solutie CaCl2 0,025M;
- eprubete de hemoliza , pipette , termostat , cronometru.
Tehnica: - se pipeteaza intr-o eprubeta plasma oxalata 0,1ml ( se incubeaza
1ml la 37C );
- se adauga 0,1ml tromboplastina si 0,1l solutie CaCl2 incalzita la 37C si se
incepe
cronometrarea;
- eprubeta se urmareste din doua in doua secunde ;
- cronometrul se opreste la aparitia primelor filamente de fibrina.
- se lucreaza paralel si o proba de la un martor normal.
Interpretare: normal:
TQ=12-15 secunde
patologic : TQ scurtat - sindrom de hipercoagulabilitate
TQ prelungit: - insuficienta hepatica;
- deficit de vitamina K
- afibrinogenemie , hipofibrinogenemie;
- hipoprotrombinemie.
TQ este normal in hemofilie.

OBSERVATIE
TQ exploreaza factorii plasmatici ai coagularii dependent de
vitamina K sintetizati exclusiv la nivelul ficatului (II,VII,IX,si X).
Pentru diferentierea deficitului de vitmina K de insuficienta
hepatica se poate utiliza
Testul Koller : - se determina TQ
- se administreaza parenteral timp de doua zile vitamina
K
(10mg/zi)
- se repeta TQ.
Interpretare: - daca TQ revine la normal - deficit de vitamina K;
- daca TQ ramane prelungit - insuficienta hepatica.
TQ se utilizeaza la urmarirea tratamentului cu anticoagulante
administrate parenteral (dicumarinice antivitamine K )

Pentru a elimina variatiile tehnice ale testarii

timpului de protrombina , au fost introduse
urmatoarele exprimari:
Rata de protrombina (PR)
PR = TQ pacient(s) / TQ martor normal (s)
INR (international normalized radio)
ISI
INR=PR
ISI - (international sensibility index) este un parametru ce tine cont de
sensibilitatea
tromboplastinei folosite in fiecare laborator , in functie de specia de
provenienta
- valoarea sa variaza intre 1si 3 , ideal fiind 1.
OBSERVATIE:
INR - permite compararea datelor provenite din labortoare diferite ,
chiar in alte tari
- permite monitorizarea pacientilor care calatoresc frecvent in
diferite regiuni ale
lumii
- precum si o mai eficienta comunicare intre medici.

3.Timpul de tromboplastina partial acivata (APTT)

Principiu : APTTexploareaza mecanismul intrinsec al coagularii.
APTT repr. timpul necesar coagularii plasmei aplachetare in
prezenta unui cefalinei (extract cloroformic de
tromboplasina
tisulara din creier) si a caolinului
(activator standardizat al factoruluiXII).
Tehnica: - intr-o eprubeta de hemoliza tinuta la la 37C se pipeteaza:
0,1ml plasma+1ml cefalina+0,1ml solutieCaCl 2+ 0,1ml
suspensie de caolin
- se porneste cronometrul ;
- cronometrul se opreste la aparitia primelor filamente de fibrina.
Interpretare: - normal : APTT - 20-50 sec ( valorile depind de
reactivii folositi in
fiecare laborator )
- patologic : APTT prelungit ( mai mare cu 10s decat limita
maxima a normalului)
- deficit ai factorului cogularii VIII,IX,XI - hemofilie;
- hipofibrinogenemie;
- hipoprotrombinemie.
OBSERVATIE: APTT normal in deficitul de factor VII.

4. Timpul de trombina (TT)

Principiu: TT exploreza faza finala a coagularii,respectiv
transformarea
fibrinogenului in fibrina ,
suprimand primele doua faze ale coagularii prin
adaosul
de trombina la o plasma aplachetara.
Materiale necesare: - plasma aplachetara de la pacienti;
- solutie proaspata de trombina ;
- eprubeta de hemoliza , pipete , termostat , cronometru.
Tehnica: - intr-o eprubeta de hemoliza tinuta la37 C se pipeteaza :
0,1ml plasma+0,1ml solutie trombina
- se porneste cronometrul;
- cronometrul se opreste la aparitia cheagului.
- se lucreaza in paralel si o proba de martor normal.
Interpretare: - normal : TT - 20-30 sec. (valorile depid de reactivii
folositi in fiecare laborator)
- patologic: TT prelungit in: - hipofibrinogenemii, prezenta
de anticoagulanti circulanti.
OBSERVATIE
TT se foloseste pentru urmarirea tratamentului cu heparine
nefractionate.

6. Determinarea concentratiei de fibrinogen

Se utilizeaza : - tehnici gravimetrice;
- tehnici fotometrice;
- tehnici imunologice (ex.RIA).
Normal : fibrinogenemia=2,5-3,5g/l
Patologic: <2,5g/l - hipofibrinogenemie.

Teste screeening in principalele tulburari ale

hemostazei

Nr.Tr TS T
.
Q

APT
T

Defect

Cauze frecvente

cale
extrinseca

Afectiuni hepatice
Avitaminoza K
Tratament cu anticoagulante
dicumarinice

cale
intrinseca

Hemofilie
Tratament cu heparina

nr.
trombocite

Trombopenie

N/

functie
trombocite

Trombastenie

3.EXPLORAREA SERIEI TROMBOCITARE

Numaratoarea trombocitelor
METODA MANUALA
Principiu: se realizeaza direct in hemocitometru, utilizand sange recoltat
intr-o proportie cunoascuta, cu solutie care lizeaza celalate elemente
saturate ( solutie Weed) ( eroare 15-30%).
METODA AUTOMATA(metoda impedantei electrice)
Principiu: o suspensie de trombocite este fortata sa traverseze un orificiu
ingust prevazut cu doi electrozi intre care se aplica un curent continuu.
Trecerea fiecarui trombocit determina o scadere brusca de tensiune
numita puls , care sunt numarate electronic si redate ca numar de
trombocite /mm3.
NORMAL:numarul de trombocite=150000-350000/mm3
PATOLOGIC: <150000/mm3 =>trombocitopenie
>350000/mm3=>trombocitoza
Sudiul morfologiei tromocitelor
Principu: analiza morfologica se realizeaza pe frotiul de sange periferic
colorat May-Grnwald-Giemsa.Trombocitele au aspect heterogen , zona
centrala sau granulomerul continand granulatii azurofile izolate sau
aglomerate , iar zona periferica sau hialomerul fiind omogena si palid
colorata in albastru sau violet.
Interpretare: pentru aprecierea orientativa a numarului de trombocite :
-grupe de 15-25 elemente=>numar normal de trombocite;
-grupe de 4-6 elemente => trombopenie;
-gupe foarte mari de elemente=>trombocitoza.