Sunteți pe pagina 1din 17

Metode şi tehnici de purificare

1. Metode de precipitare sunt utile pentru concentrarea probelor supuse


prificării şi sunt ideale pentru etapele iniţiale de purificare. Pot fi folosite la
scară mare şi nu sunt influenţate de prezenţa compuşilor de interferenţă, ca
în cazul metodelor cromatografice.
In solutie , moleculele de proteina sunt foarte puternic hidratate, gruparile
ionice de la suprafata acesteia atragand si fixand foarte puternic numeroase
molecule de apa.
Adaugarea unei cantitati semnificative de saruri , ex. sulfat de amoniu, in
solutia ce contine proteina are ca rezultat aparitia unei interactii puternice dintre
ionii sarurilor respective si moleculele de apa, inclusiv a celor din vecinatatea
moleculelor proteice, efectul final fiind de indepartare a moleculelor de apa din
jurul proteinelor aflate in solutie. Acest efect se datoreaza, in parte, densitatii
mari de sarcini electrice din compozitia sarurilor comparativ cu cea din
structura proteinelor.
Aparitia interactiilor dintre ionii sarurilor adaugate in solutia proteica cu
moleculele de apa, va elimina in buna parte stratul de hidratare din jurul fiecarei
molecule proteice si va favoriza, de data aceasta, interactia dintre moleculele
proteice si, implicit, aparitia fenomenului de agregare proteica. Prin adaugarea
de cantitati suficient de mari de saruri, acest fenomen se va concretiza prin
precipitarea proteinei din solutia apoasa.
Proces se numeste “salting out” si este caracteristic anionilor sarurilor
divalente, cum ar fi sulfatul de amoniu.
In cazul in care precipitarea se realizeaza la temperaturi scazute (ex. in
gheata), proteina va precipita fara a se produce denaturarea acesteia, respectiv
mentinerea conformatiei acesteia. Proteina precipitata se poate colecta prin
centrifugare.
Precipitatul proteic poate fi redizolvat in solutie cu ajutorul unei solutii cu
continut scazut de saruri.
In acest caz are loc fenomenul invers, respectiv “salting in”, si anume
scaderea concentratiei de saruri din mediu va favoriza stabilirea de interactii
intre moleculele de proteina si moleculele de apa, va separa moleculele de
proteina unele de celelalte si va restabili solubilitatea proteinei in solutie.

1.1. Precipitarea cu sulfat de amoniu


Fenomenul de salting-out în prezenţa sărurilor în mod particular a
sulfatului de amoniu, se explică prin faptul că mărirea tăriei ionice a soluţiei
determină o reducere a efectelor de respingere dintre moleculele identice ale

1
unei proteine datorită încărcării electrice similare. Totodată se reduc şi forţele
ce menţin stratul de hidratare din jurul moleculei proteice. Când aceste forţe
sunt suficient de reduse, proteina va precipita, proteinele hidrofobe precipitând
la concentraţii de săruri mai mici decât cele hidrofile.
Sulfatul de amoniu este cel mai des folosit, fiind preferat datorită
solubilităţii mari, lipsei de toxicitate faţă de cele mai multe enzime, efectului de
stabilizare asupra activităţii acestora şi datorită preţului redus al reactivului.
Folosirea acestuia la scară mare este, totuşi, limitată datorită efectului de
coroziune, problemelor legate de colectarea precipitatului după centrifugare şi
posibilităţii de a elibera în mediu amoniac gazos, la valori alcaline de pH.
Rezultatele reproductibile pot fi obţinute numai în cazul în care se menţin
constante valorile de pH, temperatură şi concentraţie proteică.
Fracţionarea amestecurilor de proteine prin creşterea tăriei ionice este o
metodă eficientă de purificare parţială.
Ex. Dozare în supernatant

Sulfat de amoniu
(% de saturaţie) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Determinare (A280nm) 100 900 600 200 100 75 50 40 25 20
proteină 0

Determinare 200 200 200 190 170 100 30 5 0 0


specifică (unităţi)

Observaţii

Concentraţia de sulfat de amoniu se referă la % de saturaţie şi nu de


concentraţie procentuală a unei soluţii obişnuite. Pentru a determina aceste
procente de saturaţie se folosesc tabele speciale sau nomograma lui Dixon.
Rezultatele acestui experiment arată că:
- la 30% (NH4)2SO4 precipită aproximativ 80% din totalul de proteină din
probă, dar aproximativ 95% din proteina ţintă se află încă în soluţie;
-la 80% (NH4)2SO4 întreaga cantitate de proteină-ţintă este precipitată.
Concluziile experimentului:
- se adaugă 30% (NH4)2SO4, se centrifughează şi se îndepărtează precipitatul ce
conţine ~80% din proteina-contaminantă;
- se adaugă în supernatantul de la prima etapă de fracţionare (NH4)2SO4 până se
atinge 80% saturaţie. Se centrifughează şi se reţine precipitatul ce conţine 95%
din proteina-ţintă.

2
În acest caz concret, factorul de purificare este 5, iar randamentul de
purificare 95%.
Calculul Activitate specifică iniţială = 200U/1000mg prot = 0,2U/mg
Activitate specifică 80% = 190U/175mg prot = 1,08U/mg

Factor purificare = 5
Exemplul prezentat reprezintă un caz ideal deoarece la concentraţii
relativ mici de saturaţie în (NH4)2SO4 precipită cea mai mare parte dintre
proteinele-balast.
De obicei, însă, la concentraţii mici de (NH4)2SO4 precipită cantităţi mici
de proteine, cea mai mare parte dintre proteine fiind precipitate la concentraţii
mai mari.
Abordarea prezentată, care se bazează pe dozarea cantitativă a proteinei
şi a activităţii specifice în supernatantul obţinut pe parcursul etapelor de
fracţionare cu (NH4)2SO4 este folosită mai rar, datorită interferenţelor dintre
metodele de dozare (inclusiv metoda Lowry) şi ionul de amoniu din soluţie.
O altă modalitate de abordare, cea mai des folosită, este precipitarea
succesivă, dintr-un domeniu de saturaţie în altul, şi determinarea atât a
parametrilor de monitorizare, cât şi ai parametrilor purificării prin dozarea
proteinei şi a activităţii specifice în precipitatul obţinut la fiecare etapă de
fracţionare.

Ex.
Fracţie % activ. enzim. % proteină Factor purificare
saturaţie precipitată precipitată per etapă de fracţionare
(NH4)2SO4
(%)
0-40 4 25 4/25 = 0,2
40-60 62 22 62/22 = 2,8
60-80 32 32 32/32 = 1,0
supernatant 2 21 2/21 = 0,1
80%

În domeniul 40-80% saturaţie (NH4)2SO4 se regăseşte 94% din activitatea


enzimatică şi 54% din proteina totală, cu un factor de purificare de 1,7.
Deoarece în fracţia 40-60% se obţine un factor de purificare mai bun
decât în fracţia 60-80%, iar activitatea enzimatică recuperată în această fracţie
este aproape de 2 ori mai mare, se trece la o altă variantă, modificând domeniile
de fracţionare.

3
Fracţie % activ. enzim. % proteină Factor purificare
0-45% 6 32 6/32 = 0,2
45-70% 90 38 90/38 = 2,4
supernatant 70% 4 30 4/30 = 0,1

În fracţia 45-70% se recuperează 90% din activitatea enzimatică şi 38%


din proteina totală, cu un factor de purificare de 2,4, obţinându-se o probă mai
înalt purificată decât în cazul precedent.
Factorul de purificare din fracţia 45-70% este însă inferior celui din
fracţia 40-60%. De aceea, dacă se doreşte îmbunătăţirea acestuia se poate
continua optimizarea fracţionării.

Fracţie % activ. enzim. % proteină Factor purificare


0-48% 10 35 10/35 = 0,3
48-65% 75 25 75/25 = 3,0
supernatant 65% 15 40 15/40 = 0,4
Se obţine fracţia cu cea mai mare puritate, factorul de purificare fiind de
3, dar recuperarea este de doar 75%.
În funcţie de scopul urmărit se poate alege între:
- varianta cu puritate mare şi randamentul mic (în cazul procesul de purificare
se opreşte în această fază, puritatea fiind suficient de mare pentru scopul
propus);
- varianta cu randament mare şi puritate mică (în cazul în care se continuă
procesul de purificare folosind alte metode).

1.2 Precipitarea izoelectrică


Similară cu precipitarea cu sulfat de amoniu, această metodă se bazează
pe faptul că proteinele precipită când nu prezintă sarcini electrice la suprafaţa
moleculei – ceea ce se întâmplă la pH izoelectric – deoarece reacţiile de
respingere dintre sarcinile electrice de acelaşi fel sunt cele care menţin
proteinele în soluţie. În general, fiecare proteină este caracterizată de o singură
valoare a pH-ului izoelectric. De aceea, această metodă poate realiza o separare
eficientă şi rapidă a proteinelor balast.
În practică, dependenţa de pH a stabilităţii proteinei-ţintă este factorul
determinant în utilizarea metodei. Pe de altă parte, o serie de limitări ale
utilizării acesteia sunt impuse de posibilitatea de redizolvare a proteinei
precipitate la pH izoelectric.

4
O variantă a acestei metode presupune existenţa în mediul de reacţie a
unor factori (substraturi sau alţi liganzi) care măresc stabilitatea la pH a
proteinei-ţintă.

1.3. Precipitarea cu solvenţi


Solvenţii acţionează prin reducerea constantei dielectrice a mediului,
ceea ce se traduce prin reducerea solubilităţii proteinelor datorită favorizării
interacţiilor proteină-proteină în locul interacţiilor proteină-solvent.
Solvenţii utilizaţi în astfel de purificări sunt metanol, etanol, propan-2-ol,
acetonă.
La fel ca în cazul precipitării izoelectrice, sunt posibile două abordări:
- precipitarea proteinei-ţintă;
- precipitarea prin denaturare şi inactivare în prezenţa solvenţilor a
proteinelor nedorite, ce sunt apoi îndepărtate.
Solvenţii organici sunt puţin folosiţi la scară mare datorită costului lor,
inflamabilităţii, precum şi tendinţei proteinelor de a se denatura rapid în
prezenţa solvenţilor, când temperatura depăşeşte 00C.

1.4. Precipitarea la căldură


Se utilizează, în general, pentru îndepărtarea proteinelor contaminate şi
se bazează pe stabilitatea diferită a proteinelor la temperaturi ridicate. Metoda
este valabilă în cazul în care proteina dorită prezintă o stabilitate mare la
temperaturi ridicate comparativ cu contaminanţii, pentru perioade de timp de la
câteva minute la câteva ore. Şi în acest caz, se preferă prezenţa unor substanţe
care să protejeze proteina-ţintă.

Dializa
După precipitarea cu (NH4)2SO4 proteina-ţintă se găseşte precipitată. Pentru a
putea fi analizată şi, eventual, continuat procesul de purificare, trebuie
îndepărtată concentraţia mare de săruri ce se regăseşte în soluţie. Pentru aceasta,
se foloseşte dializa cu membrane semi-permeabile sub formă de săculeţe
(membrana se livrează sub formă de tuburi, din care se vor realiza săculeţe în
funcţie de dimensiunile necesare).
Principala caracteristică a acestor membrane este porozitatea, dar care au
dimensiuni ale porilor astfel încât ioni de săruri cu mase moleculare mici pot să
treacă prin membrană, pe când moleculele proteice mari nu pot (sunt reţinuţi în
săculeţ).

5
Astfel, membranele de dializă sunt caracterizate prin masa moleculară a
celor mai mici proteine globulare pe care le reţin (cutoff al membranei).
Ex: cut-off pentru Spectrapore 6 este 1.000 Da → prin membrană trec
soluţii cu mase moleculare mai mici de 1.000 Da.
Săculeţul de dializă, ce conţine proba cu concentraţie mare de săruri, este
introdus într-un tampon cu tărie ionică mică. În timp, se atinge un echilibru
între concentraţia soluţiilor din interiorul şi din exteriorul săculeţului.
La echilibru, concentraţia de săruri din probă se calculează astfel:
(vol . prob ă )( conc .saruriprob a ) + (vol .tampon )( conc .tampon )
conc. finală săruri = volumtotal
Notă: deoseori concentraţia de săruri a tamponului este 0M, respectiv
dializa se face faţă de apă distilată.

Volumul de tampon pentru dializă este determinat de concentraţia finală


de săruri pe care dorim să o avem în probă.
Ex: probă 10 ml ce conţine 1,0 M NaCl, necesar pentru următoarea etapă de
purificare o concentraţie de maxim 1mM NaCl.
(0,01 L )( 0,1M ) + (vol .tp )( 0)
= 0,001 M
volumtotal
(0,01 L)(1,0 M )
volum total = =10 L
0,001 M
Volumul de tampon necesar = 10L – 0,01L = 9,99L
Deci, pentru a dializa 10ml probă cu concentraţia de 1,0M NaCl este
necesar un volum de aprox. 10L pentru ca proba să aibă concentraţia finală de
săruri de 1,0mM. (1:1.000 dializă).
Se preferă, însă, dializa secvenţială pentru a evita folosirea unor volume
atât de mari.
Ex. I etapă: dializă 1:32
310ml tp:10ml probă (1,0M)→ 31mM conc. finală
II etapă: dializă 1:32
310ml tp:10ml probă 31mM→ 0,97 mM
În loc de a se folosi 10L de tampon, se pot folosi numai 620 ml, atingând
aceeaşi concentraţie de săruri în probă. În schimb, timpul de dializă este de 2 ori
mai mare (în general, pentru cele mai multe tipuri de membrane, dializa este
completă după 4 ore).
O consecinţă a faptului că are loc dializa, în timp ce sărurile difuzează
spre exteriorul săculeţului, moleculele de apă pătrund în interiorul acesteia. De
aceea, volumul săculeţului creşte („se umflă”), iar concentraţia de proteină
scade.

6
Notă – în cazuri extreme, umflarea săculeţului poate duce la spargerea acestuia,
de aceea săculeţul nu se umple niciodată la volumul maxim, lăsând un spaţiu
gol pentru a permite umflarea acestuia.
În cazul în care prin dializă concentraţia de proteină a scăzut prea mult se
impune concentrarea acesteia, care se poate realiza, tot folosind membrane
semi-permeabile.
Cea mai simplă metodă constă în a acoperi săculeţul de dializă cu
un solut cu masă moleculară mare care poate fi dizolvat cu uşurinţă de
tamponul din săculeţ.
Ex: polietilenglicol sau polivinilpirolidona (m.m. 20.000 Da) sunt uşor
dizolvaţi de apă. Astfel, săculeţul de dializă acoperit cu polimeri aflaţi în stare
uscată va pierde din apă datorită tendinţei apei de a hidrata polimerii, proba
concentrându-se.
O altă variantă de concentrare presupune ca săculeţii de dializă, sub
formă de disc, ce conţin probele să fie supuşi unor forţe de presiune, prin care
apa să fie îndepărtată din interiorul acestora în timp ce proteinele rămân în
interior. Acelaşi lucru se poate obţine prin centrifugarea discului din membrană
semipermeabilă.
Atât în cazul dializei, cât şi al concentrării, este esenţial ca membrana să
nu interacţioneze cu proteina-ţintă (de ex. să nu aibă afinitate cu aceasta şi să
lege proteina de pereţii săculeţului).

2.Metode cromatografice
Preparatele proteice clarificate şi concentrate pot fi folosite pentru
purificare prin metode cromatografice.
Pentru purificarea proteinelor/enzimelor există trei tipuri principale de
metode cromatografice: metode de schimb ionic, de afinitate şi de excludere din
gel (gel-cromatografia), care se folosesc, în general, în această ordine.
Metodele de schimb ionic şi de afinitate cromatografică pot prelucra
rapid cantităţi mari de extracte brute; prima metodă este, însă, mai ieftină şi de
aceea este preferată pentru primele etape de purificare în care scara de operare
este destul de mare.
Gel-filtrarea este o metodă relativ lentă şi are cea mai mică rezoluţie şi
capacitate, fiind utilizată pentru etapele finale de purificare, dar şi ca metodă de
schimbare a tamponului de lucru înaintea etapelor de concentrare, stabilizare şi
comercializare.
Pentru orice metodă cromatografică sunt necesare:
- amestecul de proteine: tamponat corespunzător

7
- faza staţionară: răşină sau matricea
- faza mobilă: tampon

Terminologie
Volum total (Vt) (Bed volume) – volumul total de solvent şi material
absorbant din coloană;
Volum excludere (V0) (Void volume) – volumul fazei lichide
Volum de eluţie (Ve) (Elution volume) – volumul de solvent necesar
pentru a scoate un anumit solut din coloană.
Răşină – materialul adsorbant, ce se prezintă sub formă de pudră uscată
sau de suspensie (50% lichid, 50% răşină).
Mărimea în mesh – se referă la numărul de pori din răşină per inch2. Cu
cât numărul este mai mare, cu atât porii sunt mai mici şi rezoluţia este mai
mare. În aplicaţii de tipul purificării proteinelor se folosesc, în general, 100-200
mesh.
Matricele cromatografice adecvate separării şi purificării proteinelor
trebuie să îndeplinească următoarele condiţii:
- să aibă suprafeţe disponibile moleculelor de proteine;
- să se menţină rigide şi incomprensiblie în timpul eluţiei;
- să fie hidrofile şi inerte;
- să aibă dimensiuni standardizate (pentru separări obişnuite dimensiunile sunt
în domeniul 50-150μm; pentru HPLC acestea sunt de 4-6μmdiametru).
Prepararea răşinilor
Etape de pregătire a răşinilor pentru utilizare presupun:
- hidratarea răşinilor;
- decantarea particulelor fine;
- echilibrarea răşinei şi prepararea suspensiei;
- degazarea suspensiei.
Hidratarea este necesară în cazul răşinilor ce se prezintă sub formă
uscată, de pudră, şi se realizează prin suspendare în tampon, şi hidratare lentă
peste noapte.
Echilibrarea răşinei se face în tamponul ce va fi folosit pentru analize. Nu
se foloseşte un magnet pentru agitare, deoarece agitarea mecanică poate
produce la spargerea perlelor de răşină.
După echilibrarea răşinei şi depunerea ei, se adaugă un volum egal de
tampon pentru a obţine o suspensie 50%, care este suficientă pentru a elibera
bulele de gaz în timpul împachetării coloanei.
În final, suspensia este degazată înainte de împachetarea coloanei pentru
a minimaliza formarea bulelor de aer.

8
Împachetarea coloanei
Coloanele ce sunt folosite la presiuni mici sunt, de obicei, obţinute prin
împachetare sub acţiunea gravitaţiei.
- se adaugă o cantitate mică de tampon;
- se plasează un rezervor la capătul superior al coloanei, deoarece se
foloseşte o suspensie de răşină de 50%, ce este preferabil să se adauge
dintr-o singură manevră, volumul coloanei trebuie să fie suficient de mare
pentru ca întregul volum de suspensie să fie turnat dintr-o dată;
- adăugarea răşinei sub formă de suspensie trebuie făcută cu grijă pentru
a nu se introduce prea multe bule de aer;
- se lasă coloana 5 min pentru a se elima bulele mari de aer;
- se deschide valva de la baza coloanei şi se permite împachetarea
coloanei sub acţiunea gravitaţiei;
- pe parcursul împachetării, nivelul superior al stratului de răşină va
scădea; împachetarea este finalizată când acest nivel rămâne constant.
Colectarea probelor
Sistemele cromatografice funcţionează, de obicei, numai sub acţiunea
gravitaţiei, colectându-se fracţiile. Cele mai obişnuite sisteme presupun
existenţa următoarelor componente:
- pompa peristaltică, cu debit variabil, care, în mod obişnuit, introduce
tamponul în coloană şi nu trage probele din coloană.
- detector, de obicei, de ultraviolete.
- colector de fracţii, care permite colectarea fracţiilor fie după numărul de
picături (~30/ml) sau după timp (corelat cu o pompă controlabilă, timpul de
colectare poate fi tradus în volum colectat).
- recorder ce imprimă continuu markerul fracţiilor colectate.
Probele ce se cromatografiază sunt, de obicei, în soluţii cu tării ionice mici,
eluţia proteinelor legate fiind realizată prin mărirea tăriei ionice fie în gradient,
fie în etape (trepte).
Eluţia în gradient – se referă la faptul că trecerea de la o concentraţie
mică de săruri la o concentraţie mare se realizează printr-o tranziţie lentă şi
continuă. Proteinele slab legate vor elua primele, pe când proteinele puternic
legate de răşină se vor elua ultimele, necesitând concentraţii mari de săruri care
să competiţioneze cu ele pentru ocuparea răşinii ionice.
În cea mai simplă formă tehnică, realizarea unui gradient de concentraţie
presupune existenţa a 2 vase identice, conectate printr-un tub la baza vaselor.
Tamponul din vasul cu concentraţia cea mai mică este trimis către coloană; pe
măsură ce acesta părăseşte vasul, tamponul cu concentraţie mare va intra în
acest vas, concentraţia mărindu-se treptat şi linear:

9
Coloană

agitator magnetic

Eluţia în trepte – se realizează prin eluarea succesivă a coloanei cu volume de


tampoane cu diferite concentraţii de săruri. O astfel de eluţie este mai rapidă şi
realizează eluţia proteinelor în volume mai mici decât prin eluţie în gradient. Se
recomandă în cazul în care contaminanţii se eluează la ţintă sau în cazul în care
cunoaşte concentraţia de săruri la care eluează concentraţii de săruri foarte
diferite de cea la care se face eluţia proteinei-aceasta.

Eluţia în gradient
Conc. săruri

0
Volum
3
Eluţia în trepte 2
Conc. săruri

Volum

10
2.1. Cromatografia de schimb ionic

Enzimele posedă o anumită sarcină electrică în soluţie, în funcţie de


valoarea de pH, structura lor şi pH izoelectric. În soluţii cu valori de pH sub
valoarea punctului izoelectric, enzimele vor avea încărcare pozitivă şi se vor
lega de schimbători cationici, pe când în soluţii cu pH mai mare de punctul
izoelectric vor fi încărcate negativ şi se vor lega de schimbători anionici.
Valoarea de pH trebuie să fie astfel aleasă încât să menţină încărcarea electrică
opusă a proteinei/enzimei şi a schimbătorului de ioni, iar tăria ionică trebuie să
fie suficientă pentru a asigura solubilitatea proteinei, fără ca sarcinile să
competiţioneze cu proteina pentru situsurile schimbătorului de ioni.
Legarea de schimbătorul de ioni este reversibilă, iar tăria legăturii este
determinată de valoarea de pH şi tăria ionică a soluţiei, ca şi structura enzimei şi
a schimbătorului de ioni.
În mod obişnuit, se menţine constantă valoarea de pH, enzima fiind
eluată prin creşterea tăriei ionice a soluţiei.
Schimbătorii de ioni sunt, în general polimeri insolubili în apă, ce conţin
grupări cationice sau anionice.
- schimbătorii cationici conţin grupări anionice: SO3-, -OPO3-, COO-;
- schimbătorii anionici conţin grupări cationice: grupări terţiare şi
cuaternare de amoniu, cu formula generală –NHR2+ şi +NR3+.
Răşini schimbătoare de ioni de natură polistirenică sunt adecvate mai ales
utilizării la scară mare a cromatografiei, dar au capacitate mică de reţinere a
proteinelor datorită dimensiunilor mici ale porilor. Legarea este, ades, puternică
datorită hidrofobicităţii răşinei, iar condiţiile necesare pentru eluarea proteinelor
sunt destul de severe, ceea ce poate determina denaturarea acestora. Cu toate
acestea, răşinile polistirenice au un mare potenţial în concentrarea sau
purificarea enzimelor.
Răşini schimbătoare de ioni de natură celulozică sunt, în general, mai
adecvate purificării enzimelor, putând fi introduse diferite grupări anionice sau
cationice. Practic, nivelul de substituţie al celulozei nu poate să depăşească 1
mol/kg, limită peste care are loc dizolvarea celulozei.

11
Principalele tipuri de schimbători de ioni

Tip de schimbător Grupare funcţională Contra-ion Denumire


Schimbător cationic carboximetil Na+ CM
slab -O-CH2-COO- (celuloză,
sephadex)
Schimbător cationic sulfopropil Na+ SP
puternic -O-CH2- CH2- CH2- (sephadex)
SO3-
Schimbător anionic dietilaminoetil Cl- DEAE
slab (celuloză,
sephadex)
Schimbător anionic amină cuaternară QAE
puternic (dietil-(2- (sephadex)
hidroxipropil) amino
etil)

Tăria unui schimbător de ioni se referă la gradul de ionizare într-un domeniu de


pH. Schimbătorii puternici sunt complet ionizaţi la cele mai multe valori de pH,
pe când ionizarea celor slabi variază cu pH-ul.
Totodată, schimbătorii puternici au, în general, o capacitate mai mare de
reţinere.
Exemplificare a folosirii schimbătorilor de ioni pentru un amestec de
proteină, care la pH 7,0 au următoarele sarcini electrice:
poteina 1 +4
proteina 2 +2
proteina 3 0
proteina 4 -2
proteina 5 -4
Se urmăreşte purificarea proteinei 4.
Etapele procesului de schimb ionic sunt:

a) – se alege faza staţionară (răşina) cu încărcare pozitivă, şi se utilizează un


tampon de tărie ionică mică ce conţine grupări negative

12
- -
+ ++
- +
+ + -

b) – când se adaugă amestecul de proteine, proteinele încărcate negativ


(4 şi 5) vor înlocui ionii negativi ai tamponului şi se vor lega de răşină

-
+ +
+ + -
-
- -P -

c) – proteine încărcate pozitiv şi neutre nu vor interacţiona cu faza staţionară şi


vor trece în volumul de lichid V0 prin eluţie;
d) – după legarea proteinelor, se adaugă un tampon (faza mobilă) ce are tărie
ionică mare (se foloseşte de obicei NaCl);
e) – ionii negativi din acest tampon mai concentrat vor competiţiona cu proteina
pentru sarcinile electrice pozitive ale răşinii;
f) – când tăria ionică este suficient de mare pentru a dislocui proteina, aceasta
va fi eliberată, putând fi eluată din coloană;
g) – cu cât sarcina electrică negativă a proteinei este mai mare, cu atât
concentraţia ionică a tamponului de eluţie este mai mare.
În mod obişnuit, gradientul de NaCl începe de la 0,1M şi creşte gradual
la 0,5 M.
Se pot folosi 2 tehnici diferite de operare:
I – cromatografie pe coloană
II – operare tip batch
I – proba se aplică direct pe coloană
II- după pre-echilibrarea schimbătorului de ioni, acesta este amestecat cu soluţia
de enzime într-un vas răcit. Adsorbţia este de obicei rapidă (30 min). Agitarea
amestecului este esenţială pentru adsorbţia la capacitatea maximă a răşinei, dar
aceasta nu trebuie să conducă la degradarea mecanică a răşinii. Materialul
neadsorbit este îndepărtat, iar eluţia proteinei/enzimei se face prin adăugarea de
tampon concentrat direct peste răşină. După 20-30 minute, se decantează
tamponul ce conţine proteina eluată.

13
Avantajul folosirii tehnicii batch comparativ cu cea pe coloană, constă în
faptul că se evită problemele legate de compresibilitatea răşinii şi scăderea
vitezei de eluţii, mai ales în cazul aplicaţiilor la scară mare.
Avantajul folosirii tehnicii pe coloană este rezoluţia mult mai bună.
Tampoane ce se utilizează în mod preferenţial:
- pentru răşini anionice: TRIS-HCl
- pentru răşini cationice: HEPES-NaCl
Se adaugă azidă de sodiu 0,02% (antibacteriană)

2.2. Gel-cromatografia
Denumită şi „sitare moleculară”, metoda se bazează pe diferenţele de
mărime ale proteinelor. Perlele de răşină prezintă mici pori, în care pot difuza
moleculele de proteină ce sunt suficient de mici. Cele cu dimensiuni mai mari
vor rămâne în faza mobilă şi vor fi eluate din coloană.
Timpul de retenţie al unei proteine depinde de mărimea acesteia.
Proteinele cele mai mari vor fi eluate primele, pe când cele mai mici, ultimele.
Limita de excludere – proteina mai mare decât această limită nu va
penetra în perle şi va rămâne în faza mobilă.
Domeniul de fracţionare – domeniul de mase moleculare ce pot fi
fracţionate prezintă o limită superioară şi una inferioară. Se preferă ca eluţia
proteinei-ţintă să se facă cât mai rapid pentru ca să nu se dilueze staţionând un
timp mare în coloană.
Mărimea particulelor de gel – determină viteza cu care funcţionează
coloana, ceea ce este determinant pentru rezoluţie.
Mărimea coloanei – lungimea trebuie să fie de 20-40 ori mai mare decât
diametrul (cu cât este mai lungă coloana cu atât gel filtrarea se realizează mai
bine)
Mărimea probei – volumul maxim de probă este de 1-2% Vt
Viteza de curgere – cu cât viteza este mai mică cu atât rezoluţia este mai
bună
Aplicaţii ale gel filtrării
1) Purificarea unei proteine dintr-un amestec
2) Determinarea masei moleculare a unei proteine
- un amestec cunoscut de proteine, având mase moleculare bine
determinate se aplică pe o coloană (ex. Sephacryl S 100)
1. Ribonuclează A 13.700
2. Chimotripsinogen A 25.000
3. Ovalbumina 43.000

14
4. Albumină serică bovină 67.000
5. Blue Dextran 2.000.000
- V0 se determină folosind Blue Dextran ca marker
- Vl se determină pentru fiecare din celelalte proteine
- Vt se calculează din formula Vt = πr2xh
- constanta de difuzie, kav se calculează pentru fiecare proteină după
Vl −V0
formula kav= V −V
t 0

- valorile kav obţinute se reprezintă grafic în funcţie de logaritmul


masei moleculare a proteinelor, obţinându-se curba standard a coloanei.
- proteina cu masă moleculară necunoscută este trecută pe aceeaşi
coloană, calculându-se kav şi raportându-se valoarea obţinută pe curba standard
se extrapolează valoarea masei moleculare.
3) Îndepărtarea sărurilor dintr-o probă – se foloseşte o coloană cu limită
de excludere foarte mică, cum ar fi G10 (limita 700 Da), astfel încât orice
proteină cu masa moleculară de 1000 Da va trece prin coloană, fără să fie
reţinută. În schimb, sărurile, ce au kav mari, se vor elua foarte încet.

2.3 Cromatografia de afinitate


În prezent, este un termen ce defineşte generic o varietate de metode de
purificare a enzimelor ce au în comun faptul că se stabilesc interacţii mai mult
sau mai puţin specifice între enzimă şi un ligand imobilizat.
Cea mai specifică formă de ligand este substratul enzimei sau un
inhibitor competitiv.
Ca o alternativă, se poate folosi drept ligand un anticorp.
Matricile specifice sunt costisitoare şi nu pot fi folosite pe scară mare. În
general, prin cromatografie de afinitate se obţin valori mari ale factorului de
purificare (în medie, x10).
O abordare mai puţin specifică, dar adecvată pentru multe enzime este
folosirea de analogi ai coenzimelor, cum ar fi NAD+, drept ligand. În unele
cazuri se folosesc în loc de coenzime diferiţi coloranţi drept liganzi, care
prezintă avantajul că sunt mult mai ieftini şi prezintă, în mod surprinzător,
specificitate pentru diverse enzime.
O altă variantă de cromatografie de afinitate, este cromatografia
interacţiilor hidrofobice, în care caz ligandul este un „spacer arm” de natură
hidrofobică, cum ar fi grupări octil sau fenil. Interacţiile hidrofobice sunt
puternice la tării ionice mari, de aceea trebuie să fie dializate înainte de a fi
aplicate pe adsorbant. Eluţia se realizează prin modificarea de pH sau tărie
ionică sau a constantei dielectrice (ex: prin adăugare de etandiol).

15
Testarea purităţii proteinei purificate

a) La sfârşitul procesului de purificare, se testează gradul de puritate al proteinei


prin electroforeză în gel de poliacrilamidă (PAGE – polyacrylamide gel
electrophoresis). Metoda realizează separarea proteinelor pe baza încărcării
electrice a acestora, în condiţiile menţinerii activităţii lor biologice, ceea ce
permite evidenţierea acesteia prin metode colorimetrice.
În acest mod, se relevă activitatea specifică a enzimei purificate. Prin
compararea poziţiei benzii acesteia cu benzile evidenţiate prin colorare pentru
proteinele totale din probă, se poate determina dacă proteina/enzima este pură
sau nu. Astfel, dacă apare o singură bandă pe gel de electroforeză, care
corespunde atât colorării specifice proteinei, cât şi a activităţii enzimei, atunci
proteina purificată este omogenă. În cazul în care apar maimulte benzi proteice,
dar o singură bandă enzimatică înseamnă cî proteina/enzima-ţintă mai este
însoţită, încă, şi de alte proteine contaminate.
b) Determinarea proprietăţilor biochimice
c) Determinarea masei moleculare a subunităţilor prin SDS-PAGE sau PAGE-
denaturat: metoda presupune denaturarea proteinei în prezenţa unui detergent,
SDS (sodium dodecilsulfat) şi a unui reducător tiol (2-mercaptoetanol) care
scindează punţile disulfurice (Cys-S-S-Cys). Detergentul SDS se leagă de
catena polipeptidică, ceea ce îi conferă o sarcină electrică negativă uniformă. În
acest fel, toate proteinele vor avea aceeaşi încărcare electrică, iar în timpul
electroforezei SDS-PAGE singurul criteriu de separare a proteinelor va fi
mărimea acestora datorită efectului de sitare al gelului. Astfel, polipeptidele cu
mase moleculare mari, respectiv subunităţile proteinei denaturate, se vor regăsi
în capătul superior al gelului PAA deoarece vor migra foarte puţin în timpul
PAGE, pe când polipeptidele cu mase moleculare mici se vor regăsi spre
capătul inferior. Mărimea subunităţilor proteinei testate poate fi determinată
prin folosirea unei curbe de calibrare, realizată prin migrarea în gel, în condiţii
experimentale identice, a unor proteine standard, cu mase moleculare ale
subunităţilor lor cunoscute.
d) Compoziţia în subunităţi a proteinei: se determină prin împărţirea masei
moleculare a proteinei native la masa moleculară a subunităţilor. (masa
moleculară a proteinei native se determină prin gel-filtrare).
Ex: m.m. proteină nativă = 80.000 Da → proteina este un
m.m. subunitate = 38.000 Da dimer

În cazul în care proteina este un monomer, atunci m.m. proteină nativă =


m.m. subunitate. Unele proteine sunt compuse din 2 subunităţi diferite şi, de
aceea, prin analiza SDS-PAGE se vor regăsi 2 polipeptide.

16
Pentru analiza SDS-PAGE se foloseşte numai proteină pură.
În concluzie:
Se folosesc 2 tipuri de PAGE:
1) PAGE nativă – pentru determinarea purităţii
2) SDS-PAGE – pentru determinarea masei moleculare a subunităţilor
Există 2 tipuri de mase moleculare:
1) m.m. a proteinei native – determinată prin gel-filtrare
2) m.m. a subunităţilor – determinată prin SDS-PAGE
Compoziţia în subunităţi a proteinei: m.m. proteină nativă/m.m.
subunităţi = nr. subunităţi din proteină (nr. întreg)

17