SEM II LP.

7 ORGANITELE GENERATOARE DE ENERGIE

MITOCONDRIILE
Generaliti
Organitele de conversie energetic sunt reprezentate de mitocondrii, care sunt prezente n
toate celulele animalelor i plantelor eucariote. n plus, plantele mai posed un organit specific,
cloroplastul n care conversia energiei are loc prin procesul de fotosintez.
istoric: mitocondriile au fost descoperite la microscopul optic de ctre Altman n 1890 i
denumite astfel de ctre Benda n 1897. La microscopul electronic ele au fost descoperite i
descrise de Sjostrand i Palade, independent unul de altul, n 1952. O serie de cercettori
bazai pe tehnica reconstituirii arhitecturii tridimensionale a organitelor celulare, au emis
ipoteze c ntr-o celul ar exista o singur mitocondrie care este ramificat n toat celula, aa
cum a fost deja evideniat la unele organisme inferioare, protozoare i alge.
prezena: cu excepia hematiei, mitocondriile sunt prezente n toate celulele eucariotelor, ele
avnd rolul principal n producerea energiei necesare activitilor celulare: de cretere,
difereniere, diviziune celular, micare, etc. n general, toate mitocondriile dintr-o celul
ocup aproximativ 5-6% din volumul celular, dar n cazul fibrei musculare striate scheletale i
al hepatocitului, ocup 20%, iar fibra muscular cardiac 35% din volumul celulei.
forma: n seciuni prin celule, vzute att la microscopul optic ct i la cel electronic,
mitocondriile au forme sferice, de
bastona, filiforme, ramificate, curbe
sau spirale.

dimensiuni: sunt cuprinse n

medie ntre 1-3m, dar sunt i de 710m

lungime

de

0,5m

diametru.

numr:

depinznd
intensitatea
energetice.

de

este foarte
tipul

celulei

proceselor
Astfel,

variabil,

amoeba

i
sale

are

singur mitocondrie, spermatozoidul

25, nefrocitele (rinichi) 300, iar hepatocitele (ficat) au un numr de aproximativ 2500
mitocondrii.
poziia: depinde de locul n care consumul energetic este mai intens, dispunndu-se cu
predilecie acolo unde intensitatea proceselor metabolice este mai mare. Astfel, n unele celule
renale (nefrocite) mitocondriile se dispun la polul bazal pentru c aici au loc intense procese de
difuziune a apei; n celula intestinal absorbant se dispun la polul apical, deoarece procesele
absorbiei principiilor nutritive din lumen au loc prin microvili; n fibra muscular striat
scheletal i cardiac se dispun printre miofibrile pentru a le furniza energia necesar
contraciei; la spermatozoid se dispun n jurul axonemei flagelului pentru furnizarea energiei

necesare micrii flagelului i a deplasrii spermatozoidului; n hepatocit se dispun n jurul

nucleului, deoarece aici au loc intense procese metabolice.
originea: se consider c mitocondriile sunt evoluate din organisme procariote simbionte,
similare

bacteriilor. Pentru acesta

ipotez

pledeaz urmtoarele

argumente:

matricea

mitocondrial conine un filament de ADN dispus circular-spiralat, analog cu ADN-ul bacterian;

conine ribozomi care au structur similar cu a ribozomilor bacterieni, respectiv au acelai
coeficient de sedimentare (70S). Rezult faptul c mitocondria dispune n cadrul celulei de un
sistem propriu pentru sinteza proteic, independent de nucleul celulei. In plus, mitocondria se
poate autoreplica printr-un proces care este similar cu diviziunea celulei bacteriene. Pe baza
acestor date se consider c mitocondria este un organit semiautonom care a evoluat n
decursul timpului dintr-un parazit bacterian intracelular.
Caracteristicile proceselor de conversie energetic care au loc n mitocondrii sunt:
o

baza structural a conversiei energetice o constituie membrana intern a

mitocondriei plisat sub form de criste mitocondriale;

energia este convertit ntr-o form adecvat meninerii proceselor vitale,

aceasta fiind ATP-ul;

mitocondria, n afara funciei energetice, are i alte funcii metabolice;

mitocondria este un organit autonom deoarece are un genom propriu;

conversia energetic n ATP are la baz un mecanism numit chemiosmoz,

mecanism bazat pe teoria chemiosmotic.

Ultrastructura i compoziia chimic a mitocondriei

La

microscopul

electronic,

mitocondria

apare

constituit

din

urmtoarele

elemente

structurale: membrana extern, membrana intern, spaiul intermembranar i matricea

mitocondrial.
Cele dou membrane, extern i intern, se deosebesc ntre ele prin proteinele i lipidele care
intr n alctuirea lor i ele permit separarea celor dou subcompartimente mitocondriale:
spaiul intermembranar i matricea mitocondrial.
Compoziia chimic global a mitocondriei este urmtoarea: proteine 60-70%; lipide 30-35%
i 0,5% ADN, ARN, ioni, ap, aminoacizi i glucide. Dintre proteine, 70% au funcie enzimatic
i 30% au funcie structural. Dintre lipide, 95% sunt fosfolipide, iar 5% este reprezentat n
primul rnd de colesterol.
Membrana extern
Are o grosime de 6 nm i o structur lipido-proteic trilaminat, n care raportul proteinelipide este de 1/1, semnificnd funcia ei de nveli izolator fa de citosol. Conine i proteine
integrale la nivelul crora au loc procese de transport transmembranar.
Compoziia chimic: 50% proteine i 50% lipide, aceasta fiind asemntoare cu cea a
membranei RE. Membrana mitocondrial extern conine tot colesterolul aflat la nivelul

mitocondriei, precum i proteine integrale, proteine specifice de transport, proteine, respectiv

enzime de conversie i de elongare.
Membrana intern
Are de asemenea o structur trilaminar i o grosime de 6 nm. Caracteristic este ns faptul
c aceast membran este plisat, formnd numeroase creste sau criste mitocondriale care
proemin n interiorul matricei mitocondriale, mrindu-i de peste 5 ori suprafaa. Membrana
intern reprezint o fraciune membranar important n celulele cu multe mitocondrii, aa
cum este cazul n hepatocit, unde aceasta ocup 1/3 din totalul membranelor celulare. De
asemenea, densitatea cristelor este de 3 ori mai mare n mitocondria muchiului cardiac, n
comparaie cu mitocondria hepatocitului, reflectnd producerea i consumul energetic superior
al esutului cardiac.
Faa intern a cristelor este tapisat cu numeroase formaiuni pedicular-sferice, care
reprezint un element extrem de important al mitocondriei, respectiv complexul enzimatic de
sintez al ATP-ului, numit i ATP-sintetaz sau F0F1-ATP-az.

Compoziia chimic: 80% proteine i 20% lipide, ceea ce demonstreaz funcia ei

preponderent metabolic. Membrana mitocondrial intern este strbtut de proteine
integrale i de asemenea aceast membran se caracterizeaz i printr-un coninut foarte
mare de cardiolipin, un fosfolipid care reprezint mai mult de 10% din totalul lipidelor
membranare. Se consider c acest component este responsabil de faptul c aceast
membran, comparativ cu membrana extern, are o permeabilitate foarte restrns, inclusiv
pentru ioni. Datorit selectivitii transportorilor proteici, ea este selectiv permeabil numai
pentru acele molecule ce urmeaz s fie metabolizate n spaiul matricei mitocondriale, sau
pentru intermediarii metabolici care urmeaz s fie expulzai din mitocondrie.
Membrana mitocondrial intern conine trei mari grupe de proteine:
o

proteinele lanului respirator, respectiv lanul de transport de electroni;

proteine de transport specific care regleaz trecerea metaboliilor sau a ionilor

spre interiorul sau spre exteriorul mitocondriei;

un complex enzimatic cunoscut ca ATP-sintetaz, responsabil de producerea i

eliberarea n matricea mitocondrial a ATP-ului.

Aceste complexe enzimatice sunt dispuse pe faa matriceal a membranei mitocondriale

interne. La microscopul electronic ele apar ca mici sfere de 10nm diametru, numite F 1ATP-az
prinse cu un pedicul de legtur de o pies membranar inclus n membrana intern, i avnd
dimensiunile de 46nm i numit particul F0. Acest complex enzimatic, numit ATP-sintetaz sau
F0F1-ATP-az este format din 15 polipeptide cu greutatea molecular total de 464 mii daltoni.
El conine un canal protonic transmembranar i reprezint 15% din totalul proteinelor
membranei mitocondriale interne.
Enzima marker a membranei interne este citocromoxidaza, la care se mai adaug ca enzime
specifice: succinat-dehidrogenaza, care este singura enzim a ciclului Krebs legat de
membrana intern, acil-carnitin-transferaza, enzimele -oxidrii acizilor grai i enzime de
elongare a acizilor grai pn la 10 atomi de C.
Spaiul intermembranar mitocondrial
Are n medie un diametru de 8 nm. La ME coninutul acestui spaiu apare clar i omogen, fiind
constituit din soluii apoase de ioni i molecule n care este localizat enzima marker adenilatkinaza ce catalizeaz reacia: ATP + AMP = 2ADP.
Deoarece doar ADP va fi fosforilat la ATP, prin aceast reacie se recupereaz AMP-ul. De
reinut faptul c membrana intern mitocondrial este permeabil numai pentru ATP i ADP, nu
i pentru AMP.
Matricea mitocondrial
Substan fundamental a mitocondriei, conine o mare cantitate de proteine (aproximativ
60%), starea sa fizic este apropiat de gel. La ME apare ca un compartiment delimitat de
membrana mitocondrial intern i avnd o structur fin granular datorit prezenei
ribozomilor mitocondriali care pot fi liberi sau asociai n polisomi sau ataai pe faa matricial
a membranei interne. Ribosomii sunt de tip 70 S ca i cei ai procariotelor.
n mijlocul matricei exist o zon mai electrodens, aici fiind localizat ADN-ul mitocondrial
dublu-catenar dispus circular. ADN-ul mitocondrial este de aproximativ 5m lungime
corespunznd la 15.000 perechi de baze. ADNmt este capabil s sintetizeze aproximativ 35 de
macromolecule, ceea ce confer mitocondriei o autonomie maxim de 35% fa de materialul
genetic nuclear. Restul macromoleculelor mitocondriale sunt codificate n nucleu.
Matricea mitocondrial conine dou feluri de proteine: proteine structurale i aproximativ 200
de proteine enzimatice, precum i nucleotide, aminoacizi, glucide i echivaleni reductori.
Dintre enzime, fac parte:
o

enzimele responsabile de sinteza ADN, ARN i a diferitelor proteine;

enzimele

ciclului

Krebs

(izocitrat-dehidrogenaz,

citrat-sintetaz,

malat-

dehidrogenaz);
o

glutamat oxidaza, o parte din enzimele -oxidrii i piruvat-dehidrogenaz.

Principalele procese metabolice localizate n mitocondrii

1. Acizii grai sunt degradai prin procesul de -oxidare n matricea mitocondrial. Procesul
este ciclic, la fiecare ciclu ndeprtndu-se doi atomi de C de la captul carboxil, rezultnd o
molecul de acetil CoA.
2. Piruvatul, produs n citosol n urma glicolizei, este convertit n matricea mitocondrial la
acetil CoA.
3. Acetil CoA, n matricea mitocondrial, intr n ciclul Krebs (ciclul acidului citric) i la fiecare
ciclu se obin dou molecule de CO2, 3 molecule de NADH (nicotin-amid-dinucleotid redus) i o
molecul de FADH2 (flavin-adenin-dinucleotid redus).
4. Moleculele de NADH i FADH 2 sunt oxidate n membrana mitocondrial intern, n lanul
respirator, n cadrul procesului de respiraie celular, folosindu-se oxigen molecular.
5. Energia eliberat prin procesele de oxidare este stocat prin sinteza de ATP, prin intervenia
ATP-sintetazei din membrana mitocondrial intern.

Important de menionat c celulele vii ard, de fapt hidrogenul i nu carbonul, deci reacia

final este: 2H++1/2O2 = H2O. n celule, energia obinut prin arderea hidrogenului nu este

eliberat brusc ci n etape. Prima etap o constituie separarea electronilor cu energie nalt de
protoni. De exemplu NADH = 2e- + H+ + NAD+

Electronii rezultai vor urma lanul respirator, al transportorilor de electroni, situat n

membrana mitocondrial intern. Pe msur ce parcurg lanul, energia electronilor scade,

deoarece energia lor este utilizat de ctre componentele lanului respirator pentru a pompa
protonii din matricea mitocondrial n spaiul intermembranar.

Lanul respirator este format din aproximativ 15 transportori grupai n 3 complexe enzimatice

i la nivelul fiecruia dintre aceste complexe are loc translocarea protonilor n spaiul
intermembranar. n final are loc reacia: 2e- + 1/2O2 + 2H+ = H2O

Prin expulzarea protonilor n spaiul intermembranar se formeaz un gradient electrochimic

protonic, deoarece membrana mitocondrial intern este impermeabil pentru ioni. Gradientul
electrochimic protonic acioneaz ca o for proton-motorie, de introducere a protonilor n
matrice. Protonii pot trece n matrice printr-un singur loc i anume prin ATP-sintetaz, care
convertete fora proton-motric n energie stocat prin fosforilarea ADP.
Exist, deci, n mitocondrii, dou procese cuplate:

oxidarea propriu-zis, care atrage dup sine formarea forei proton-motorii i,

fosforilarea, adic conversia forei proton-motorii n legtura macroergic dintre ADP i fosfat

anorganic (Pi). n ansamblul su procesul poart numele de fosforilare oxidativ. Teoria care
explic cuplarea celor dou procese, prin gradientul protonic electrochimic, se numete teorie
chemiosmotic, iar procesul n sine, chemiosmoz, adic cuplajul proceselor chimice cu
procesele de transport.
Izolarea mitocondriilor
Materiale necesare: sursa de ficat proaspat (soarece), sucroza 0,25 M in buffer HEPES 0,01
mM, pH=7,5 (buffer de omogenizare); sucroza 0,25M in buffer HEPES 0,01 mM, pH=7,5 1 mM
EDTA (buffer de suspensie); omogenizator din Teflon; centrifuga cu refrigerare; Janus Green B;
hemacitometru si microscop
Procedura:
1. Se sacrifica si se exangvineaza soarecele infometat in ultimele 24 h.
2. Se extrage ficatul si se cantareste.
3. Se pune ficatul intr-un recipient si pentru fiecare gram de tesut se adauga 9, 0 ml de
sucroza 0,25 M in buffer HEPES 0,01 mM la pH=7,5. Astfel se va produce un amestec 10%, ce
reprezinta de fapt suspensia de omogenat.
3. Omogenatul se centrifugheaza 10 min la 4500 xg la 4C.
4. Se decanteaza supernatantul in tuburi de centrifuga curate si sinfranatantul se arunca.
5. Se centrifugheaza supernatantul 25 min la 12000 xg la 4C.
6. Se decanteaza si se arunca supernatantul. Infranatantul cu mitocondrii se resuspenda in
sucroza 0,25 M in buffer HEPES 0,01mM . Se trece la pasul 10.
7. Optional: daca este necesara o suspensie pura de mitocondrii se resuspenda in sucroza 0,25
M in buffer HEPES 0,01 mM + 1mM EDTA si se efectueaza pasii 8 si 9.

8. Se recentrifugheaza infranatantul la 16000xg pentru 25 min la 4C.

9. Se decanteaza si se arunca supernatantul. Se resuspenda infranatantul spalat in 20 ml
sucroza proaspata fara EDTA si se pastreaza suspensia in baie de gheata pana la o utilizare
ulterioara. Poate fi folosita in urmatoarele 4-6h daca este pastrata la gheata.
10. Se amesteca citeva picaturi de solutie Janus Green B cu 0,1 ml suspensie de mitocondrii. O
picatura din acest amestec se pune in hemocitometru si se determina numarul de mitocondrii
pe ml. Daca sint prea multe mitocondrii de numarat se fac dilutii seriale de 1/10 pina la 1/1000
si se reface numaratoarea. In suspensia mitocondriala diluata numaratoarea se face mult mai
rapid. Mitocondriile sint foarte instabile si se descompun daca nu sint numarate in citeva
minute de la dilutie.
Microscopia optic
n preparatele microscopice permanente, evidenierea mitocondriilor se face dup fixarea
pieselor n fixatori pe baz de tetraoxid de osmiu sau bicromat de potasiu, includere n
parafin, secionarea i colorarea seciunilor (de 5-7 m grosime) cu lacuri ferice (hematoxilin
feric). Prin aceast metod mitocondriile se coloreaz n cenuiu-negru i apar sub form
granular, aspect denumit n citologia clasic condriom. Uneori condriomul poate lua forma
unor iraguri de granule (condriomite) sau bastonae (condrioconte). n prezent se utilizeaz
termenul de mitocondrii n locul celorlalte denumiri mai mult descriptive, iar ultrastructura
mitocondriilor a fost precizat prin microscopie electronic.
Preparatul examinat: seciune prin ficat, colorare cu hematoxilin feric prin metoda
Heidenhein. Cu obiectivul mic: celule hepatice dispuse n cordoane, cu citoplasm cenuie
granular. ntre cordoanele celulare se observ capilare n lumenul crora hematiile apar
colorate negru intens. Cu obiectivul mare: n citoplasma hepatocitelor apar mitocondriile sub
form de granule mici negre, dispersate n toat citoplasma, uneori mascnd nucleul celulei. n
alte celule este vizibil i nucleul dispus central, clar, cu nucleol.
Teste Recapitulative

3. Rolul principal al mitocondriei este:

1. Glicoliza se realizeaz:

a. sinteza proteinelor

a. n matricea mitocondrial

b. autofagocitarea organitelor uzate

b. n citosol

c. transmiterea unor mutaii genetice prin

c. la nivelul membranei interne

ADN-ul mitocondrial

d. la nivelul membranei externe

d. producerea de energie

2. Ce se obine prin ciclul Krebs:

4. Care din

a. NADH, ATP, H2O

dublu-membranare:

b. NADH, FADH2, ATP si CO2

a. ribozomii

c. NADH, ADP si O2

b. mitocondriile

d. NADH, acetil CoA, H2O

c. aparatul Golgi

urmtoarele

organite

d. reticulul endoplasmic rugos

sunt

5. Complexul ce utilizeaz fora protonmotrice pentru sinteza ATP-ului este:

a. complexul citocrom a-a3
b. complexul II
c. ubiquinona
d. F0F1-ATP-az