FASE ESTACIONARIA

Determinar la concentracin bacteriana en la FE (18-24 horas).

10 mL de caldo BHI con inculo del analito a fortificar.
Con este dato realizar diluciones de 10-1 a 10-9 para determinar
la dilucin en la que se tendra la concentracin adecuada para
inocular la matriz.

Determinar la cuenta bacteriana de las diluciones 10-5 a 10-9 por duplicado en agar
cuenta estndar.
Registrar los clculos y datos de volumen y dilucin de FE necesarias para
llegar a la concentracin deseado en las alcuotas de la matriz.

Lmite de deteccin (LD)

En el caso de que el mtodo a validar no cuente con LD declarado,
el LD terico a ser verificado es de 3 ufc/25g (distribucin de
Poisson) para una probabilidad de 95% de detectar el analito.
Clculo:
El nmero de clulas necesario para obtener un resultado positivo
con 95% de confianza seria:
1

c log N

0,05

3,0

donde C= es el nmero medio de microorganismos en la porcin analtica.

En el caso de que el mtodo a validar cuente con LD declarado, el LD

a ser verificado ser la confirmacin del valor declarado.

Lmite de deteccin (LD)

probar ausencia del

750 g matriz
150 g

150 g

6 alcuotas de 25 g

4UFC

preenriquecimiento

enriquecimiento

enriquecimiento

1 alic
2
3

4
5
6

6 alcuotas de 25 g

3UFC

preenriquecimiento

RV

TT

RV

150 g

150 g

6 alcuotas de 25 g

1UFC

analito, 6 veces

TT

10UFC

preenriquecimiento

enriquecimiento
RV

6 alcuotas de 25 g

TT

preenriquecimiento

enriquecimiento
RV

TT

+
+
+

3
Hacer BQ y serologa

Lmite de deteccin (LD)

concentracin No. de
UFC/ 25g o mL replicas

resultado
positivo / negativo

10

6/0

6/0

5/1

3/3

En el caso de que el mtodo declare el LD, se debe replicar 30 veces y aplicar la

siguiente frmula:
RECUPERACIN= _No. positivos_ x 100 con criterio de aceptacin igual o > 95%
No. de replicas.
Por ejemplo, aplicando el sistema de la tabla anterior con 6 replicas:
RECUP = 6 x100 = 100%
6
RECUP = 5 x100 = 83%
6
Por debajo de 6 positivas ya no es confiable la deteccin, el resultado de 83%4esta
por debajo del criterio de aceptacin del 95%

Inclusividad (I)

Se utilizan cepas que pueden ser catalogadas como analito, pueden

ser cepas del mismo analito en cuestin, aisladas de diferentes tipos
de alimentos y/o regiones geogrficas.

Se requieren por lo menos 15 cepas puras del analito (s) ms

prevalentes en la regin o ms frecuentemente aisladas en el
laboratorio (para Salmonella se recomiendan 30 cepas).
No se utiliza la matriz. En su lugar se utiliza la cepa pura.
La Concentracin de los inculos debe estar entre 10 y 100 veces el
LD.
5

Inclusividad (I)
Preparar la FE de los analitos y calcular el volumen y la
dilucin que permitan la concentracin deseada.
Inocular 225 mL de preenriquecimiento
(por separado por cada FE de los analitos)

enriquecimiento
RV

agar cuenta estndar

(preenriquecimiento)

TT

1 anal
2

.
.
.
.

agar cuenta estndar

(enriquecimiento)
RV

TT

15

Hacer BQ y serologa
6
Nota: no se hace por duplicado.

Inclusividad (I)

Hacer un recuento en PCA, para conocer el nmero real

inoculado en cada PASO.

Registrar el nmero de UFC recuperadas en cada uno de

los agares selectivos y comparar con PCA.

Registrar las caractersticas coloniales, si son tpicas o no

sobre los medios selectivos. Registrar la respuesta de BQ y
serologa.

Es deseable que el mtodo en evaluacin sea capaz de

recuperar todos los analitos de inters prioritarios (100%).

Exclusividad (E)
Se utilizan cepas que pueden ser catalogadas como interferentes,
es decir, cepas que compitan en respuesta con el analito en cuestin
(flora competitiva del analito en estudio).

Se requieren por lo menos 15 cepas puras del interferente (s) ms

frecuentemente comunes como flora acompaante.
(lo que se recomienda estadsticamente, son 30 cepas).
No se utiliza la matriz. En su lugar se utiliza la cepa pura.
La Concentracin de los inculos debe estar entre 1000 y 10,000.
8

Exclusividad (E)
Preparar la fase estacionaria de los interferentes y calcular el volumen y
la dilucin que permitan la concentracin deseada.
Inocular 225 mL de preenriquecimiento
(por separado por cada FE de los competidores)

enriquecimiento
RV

agar cuenta estndar

(preenriquecimiento)

TT

1 interferf
2

.
.
.
.

agar cuenta estndar

(enriquecimiento)
RV

TT

15

Hacer BQ y serologa
9
Nota: sin hacer duplicados.

Exclusividad (E)

Hacer un recuento en PCA, para conocer el nmero real

inoculado en cada PASO.

Registrar el nmero de UFC recuperadas en cada uno de los

agares selectivos y comparar con PCA.

Registrar las caractersticas coloniales de los interferentes

sobre los medios selectivos y cuales no son inhibidos
completamente. Registrar la respuesta de BQ y serologa.

Es deseable que el mtodo en evaluacin sea capaz de

inhibir todos o la mayora de los interferentes
diferenciarlos de los de inters prioritario.

10

Linealidad (proporcionalidad)
Las respuestas de recuento de la FE, deben ser
proporcionales a las respuestas de las diluciones aplicadas en
la prueba con relacin a la dispersin de microorganismos. Es
conveniente que el primer punto de fortificacin y por lo
tanto de la lnea recta sea el LD.
La linealidad se ve influida por la concentracin de cada
punto que integra la lnea as como de la cercana entre una y
otra dilucin.
se aplica a mtodos microbiolgicos cuantitativos.

Nota: En diagrama *PCA= fortificar 10 mL de

agua estril, agregar a 90 mL de diluyente e
inocular 0.1 ml al PCA. Realizar el mismo
procedimiento para las siguientes
fortificaciones con las diluciones respectivas
como si fuese un blanco.
11

Linealidad
probar ausencia del

360g matriz
60 g

60 g

60 g

6 alcuotas /10 g

6 alcuotas /10 g

4x103 UFC

4x104 UFC

90 mL diluyente

10

90 mL diluyente

10-1

-1

0.1 mL
*PCA

BP

4 UFC/g

BP

6 alcuotas/ 10 g

8x105 UFC

90 mL diluyente

6 alcuotas /10 g

16x105 UFC
90 mL diluyente

10-1

10-1

40 UFC/g

PCA

60 g

60 g

0.1 mL de
dil. 10-2

0.1 mL
PCA

analito, 6 veces

BP

80 UFC/g

6 alcuotas/ 10 g

20x105 UFC

90 mL diluyente

10-1
0.1 mL de
dil. 10-2

0.1 mL de
dil. 10-2
PCA

BP

160 UFC/g

No. UFC esperadas

Hacer coagulasa y termonucleasa

PCA

BP

200 UFC/g

12

Nota: cada una de 6 alcuotas por fortificacin se siembra por duplicado teniendo que sembrar por columna 6 cajas por duplicado,
es decir, 12 cajas.

Linealidad
Se obtiene la regresin lineal del log. natural de las UFC
recuperadas (y) y las UFC esperadas (x).
Estadstica de linealidad (criterio de aceptacin/rechazo)
Coef. de correlacin de:
Pearson
igual >0.95
Olkin y Pratt
igual > 0.95
% de recobro:
C.V.:

95-105%
No mayor del 5%

13

Repetibilidad (r) y Reproducibilidad (R).

Para verificar el grado de concordancia entre los resultados

obtenidos en diferentes repeticiones realizadas por un
mismo analista en corto espacio de tiempo (repetibilidad) y
por diferentes analistas (reproducibilidad).
Se realiza a travs de recuentos en placa tratando de

recuperar lo que se inocula a partir de diluciones.

Si el mtodo de recuento adopta la inoculacin de 0.1 mL

en superficie, se fortifica la matriz con 300,000 a 400,000
UFC/25g mL. En Mxico la porcin es de 10g para S. aureus,
por lo tanto se fortifica con 120,000 UFC a 160,000 por
porcin.
Nota: En diagrama *PCA= fortificar 10 mL de agua estril, agregar a 90
mL de diluyente e inocular 0.1 ml al PCA. Realizar el mismo
procedimiento para las siguientes fortificaciones con las diluciones
respectivas como si fuese un blanco.

14

Repetibilidad (r)
probar ausencia del

120 g matriz

analito, 6 veces

60 g
6 alcuotas de 10 g

120,000 UFC
(12,000 UFC/g)
90 mL del diluyente
Dil 10-1

L
m
1
0.

1 mL

de la dil. 10-1
*PCA

Preparar dil. 10-2

0.1 mL
1

Conteo 120

Conteo 12

1 mL
Preparar dil. 10-3
*PCA

0.1 mL

*PCA

Conteo 1
15

Nota: con el objeto de tener nmeros contables en placas, se cambia de 12,000 UFC/g a 20,000 UFC/g.

Repetibilidad (r)
probar ausencia del

120 g matriz

analito, 6 veces

60 g
6 alcuotas de 10 g

200,000 UFC
(20,000 UFC/g)
90 mL del diluyente
Dil 10-1

L
m
1
0.

1 mL

de la dil. 10-1
*PCA

Preparar dil. 10-2

0.1 mL
1

Conteo 200

Conteo 20

1 mL
Preparar dil. 10-3
*PCA

0.1 mL

*PCA

Conteo 2
16

Nota: con el objeto de tener nmeros contables en placas, se cambia de 12,000 UFC/g a 20,000 UFC/g.

Evaluacin de resultados de Repetibilidad (r)

1) Calcular la media y la desviacin estndar por hilera de dilucin.
2) Despus calcular la desviacin estndar relativa (RSD) de cada
conjunto de resultados de la misma dilucin:

s
RSD
x

3) Elevar los valores de RSD encontrados al cuadrado de cada

dilucin.
4) Calcular la media cuadrtica de la desviacin estndar relativa
sumando los cuadrados de las cuentas por dilucin y dividendo por el
nmero total de placas ledas (n).

RSDA

RDS12 RDS 22 ... RDSn 2

n

5) Y Calcular la raz cuadrada del resultado para obtener la desviacin

estndar de repetibilidad.
17

Evaluacin de resultados de Repetibilidad (r)

Ejemplo:

Se tuvieron las siguientes lecturas de 2 diluciones:

dil. 10-2
dil. 10-3
1260
120
1200
115
1235
105
1264
125
1270
80
500
123
X=1,121.5
X=111.3
D.est.=305.56

D.est=16.93

DSR=0.2724
DSR=0.1521
___________________

(0.2724)2+(0.1521)2=
12

0.0742 +0.02313 = 0.00811= 0.0900 (9%)

12

Nota: al aplicar la prueba de Grubbs se descarta el valor aberrante de 500 y asi se calcula la DSR. En este
Ejemplo se dejo para que se vea que esta fue la causa de rechazo de la prueba de repetibilidad.

18

Repetibilidad (r)
(ISO13.843)

Criterio de aceptacin/rechazo:
La RSD ideal es <0,04 (4% de desvo estndar de
repetibilidad).
La desviacin estndar mayor que 0,1 (10%) es un
indicativo de la existencia de serios problemas.
Para la repetibilidad del mtodo: r= 2.8 (d.s de r 0.09)
=0.25
Para calcular la reproducibilidad del mtodo R= 2.8 (d.s de
R)

19