ANALIZA CALITII MICROBIOLOGICE A APEI

Direcia Calitate
Serviciu Controlul Calitii

ntocmit
Verificat
Aprobat

Cod: PC-333
Rev. nr.: 03

Funcia
ef laborator Control
Contaminare
ef Serviciu Controlul Calitii
Analize Microbiologice si
Farmacodinamice
Responsabil Asigurarea Calitii
pentru Controlul Calitii

Data intrrii n vigoare: Nr. pag.:

1/7

Nume i prenume

Semntur

Data

Biol. Elisabeta Petru

Biol. Marcela
Strungariu
Farm. Corina Luana
Ciubotaru

Scop: Stabilirea i cunoaterea metodelor de analiz, a responsabilitilor i a nregistrrilor care se

efectueaz pentru verificarea parametrilor de calitate microbiologic a probelor de ap.
Domeniu de aplicare: Controlul Calitii Analize Microbiologice i Farmacodinamice
- Laborator Control Contaminare
Asigurarea Calitii
Procedura:
1. Referine
Ph. Eur.Water for injection, Water Purified,
cap.2.6.12 Microbiological examination of nonsterile products: microbial enumeration tests,
cap.2.6.13 Microbiological examination of nonsterile products: tests for specified microorganisms,
cap.5.1.4 Microbiological quality of non-sterile pharmaceutical preparation and substances for pharmaceutical
use
USP Water for injection, Water Purified
cap.1231 Water for Pharmaceutical Purpose
cap.61 Microbiological examination of nonsterile products: microbial enumeration tests,
cap.62 Microbiological examination of nonsterile products: tests for specified microorganisms,
cap.1111 Microbiological atributes of nonsterile pharmaceutical products
MP-AF Program de monitorizare a calitii apei farmaceutice
PC-124 Calitatea apei farmaceutice
PC-202 Teste pentru microorganisme specifice
PC-293 Identificarea microorganismelor cu ajutorul echipamentului VITEK 2 Compact
PC-341 Norme de bun practic de laborator
AC-PG-032 Investigarea rezultatelor n afara specificaiilor
2. Definiii
Apa farmaceutic este apa utilizat n producerea substanelor active i a produselor finite.
2. Categorii de ap testate n cadrul laboratorului Control Contaminare:
- ap potabil
- ap demineralizat
- ap purificat
- ap pentru injecii

Cod: PC 333
Rev. nr.: 03
Funcia
ef laborator Control
ntocmit
Contaminare
ef Serviciu Controlul Calitii
Verificat Analize Microbiologice si
Farmacodinamice
Responsabil Asigurarea Calitii
Aprobat
pentru Controlul Calitii

Data intrrii n vigoare:

Nume i prenume

Nr. pag.:
2/7
Data

Semntur

Biol. Elisabeta Petru

Biol. Marcela
Strungariu
Farm. Corina Luana
Ciubotaru

4. Parametri de calitate microbiologic

Tabel 1
Categorie de ap
analizat
Ap potabil
Ap demineralizat
Ap purificat

Ap pentru injecii

Parametru analizat
Escherichia coli nr. UFC / 100 ml
Enterococi nr. UFC / 100 ml
Nr. total microorganisme aerobe UFC / ml
Nr. total microorganisme aerobe UFC/ ml
Microorganisme specifice / ml:
Bacterii gram negative tolerante pentru bil
Escherichia coli
Pseudomonas aeruginosa
Salmonella
Staphylococcus aureus
Candida albicans
Nr. total microorganisme UFC / 100 ml
Microorganisme specifice /ml:
Bacterii gram negative tolerante pentru bil

Pseudomonas aeruginosa

Limit alert
max. 400
max. 90

Limit
admisibilitate
absent
absent
max. 500
max. 100

NA
NA
NA
NA
NA
NA
max. 6

absent
absent
absent
absent
absent
absent
max. 10

NA
NA

absent
absent

5. Prelevarea probelor de ap se realizeaz conform procedurii PC-124 Calitatea apei farmaceutice.

Probele prelevate se transfer:
- la laboratorul Controlul Sterilitii - apa pentru injecii
- la laboratorul Control Contaminare - apa potabil
- apa demineralizat
- apa purificat
Probele de ap prelevate trebuie testate n cel mult dou ore de la prelevare, sau n maxim 12 ore dac
probele sunt meninute la 2 - 8 0C (USP cap.1231 Water for Pharmaceutical Purpose).
6. Cerine pentru efectuarea analizelor
6.1.Echipamente:
- hot cu flux de aer laminar Testare contaminare microbian condiii de mediu i utiliti
- camer termostat de 30-35C
- camer termostat de 20-25C
- incubator de 42-44C
- aparat de filtrare pomp Milliflex Plus
- echipament Vitek 2 Compact
6.2. Materiale
- plnii Milliflex sterile. Fiecare plnie prezint n partea inferioar o membran filtrant cu porozitate
nominal de 0,45
- pense sterile
- pipete gradate sterile (1ml, 5ml, 25ml)
- plci Petri sterile 90/100 mm

Cod: PC 333
Rev. nr.: 03
Funcia
ef laborator Control
ntocmit
Contaminare
ef Serviciu Controlul Calitii
Verificat Analize Microbiologice si
Farmacodinamice
Responsabil Asigurarea Calitii
Aprobat
pentru Controlul Calitii

Data intrrii n vigoare:

Nume i prenume

Semntur

Nr. pag.:
3/7
Data

Biol. Elisabeta Petru

Biol. Marcela
Strungariu
Farm. Corina Luana
Ciubotaru

6.3. Medii de cultur / soluii

- mediu casein soia agarizat
- casete Milliflex cu mediu de cultur R2A, sterile
- mediu casein soia lichid
- soluie tampon cu clorur de sodiu pepton, pH 7,0
- medii selective pentru microorganisme specifice conform procedurii PC-202 Teste pentru
microorganisme specifice.
Mediile de cultur i soluia tampon cu clorur de sodiu pepton, pH 7,0 sunt preparate n cadrul
laboratorului Controlul Sterilitii i Pregtire Medii de Cultur conform procedurilor standard de
operare specifice.
Fiecare lot de mediu de cultur livrat laboratorului Control Contaminare este nsoit de un Certificat de
analiz, n care este nregistrat: aspectul macroscopic, pH-ul, sterilitatea i valoarea nutritiv a mediului
de cultur.
6.4. Soluie alcoolic 70 % steril, preparat conform procedurii PC-241 Prepararea soluiilor de
curire i dezinfecie.
7. Divizarea mediilor de cultur n plci Petri
Laboranta:
- fluidific mediul de cultur agarizat pe baia de ap, agitnd uor
- transfer cu o pipet steril, n hota cu flux de aer laminar, cte 20 ml mediu fluidificat n plci Petri sterile
- mpacheteaz plcile Petri cu mediu de cultur n hrtie semipergament, n poziie invers
- identific plcile Petri cu: data divizrii mediului de cultur, denumirea i lotul mediului nutritiv
- transfer plcile Petri cu mediile de cultur divizate n camera termostat la 30-35C, pentru verificarea sterilitii.
n hota cu flux de aer laminar, dup 72 de ore de incubare, nainte de utilizare, biologul verific sterilitatea
mediilor de cultur divizate.
8. Analiza calitii microbiologice a apei
8.1. Apa potabil
Testul pentru enterococi
- biologul, cu o pipet steril transfer 1 ml de ap potabil n 2 plci Petri cu mediu bil aesculin azid agar.
Identific proba cu: numele probei, punctul de prelevare, denumirea mediului de cultur, data.
- laboranta mpacheteaz n hrtie semipergament plcile Petri cu probe i mediu de cultur, le identific
i le transfer n camera termostat la 30-350C n vederea incubrii, timp de 48 ore pentru dezvoltarea
eventualilor enterococi.
Interpretarea rezultatelor
Biologul vizualizeaz probele dup 48 de ore de incubare.
Creterea coloniilor de culoare maroniu deschis pn la negru, a coloniilor albastre sau albastru verzui
indic posibila prezen a enterococilor.
Aceasta se confirm prin teste de identificare conform procedurii PC-293 Identificarea microorganismelor cu
ajutorul echipamentului VITEK 2 Compact.
Proba corespunde cu cerinele testului dac coloniile de tipurile descrise nu sunt prezente sau dac testele de
identificare pentru confirmare sunt negative.

Cod: PC 333
Rev. nr.: 03
Funcia
ef laborator Control
ntocmit
Contaminare
ef Serviciu Controlul Calitii
Verificat Analize Microbiologice si
Farmacodinamice
Responsabil Asigurarea Calitii
Aprobat
pentru Controlul Calitii

Data intrrii n vigoare:

Nume i prenume

Semntur

Nr. pag.:
4/7
Data

Biol. Elisabeta Petru

Biol. Marcela
Strungariu
Farm. Corina Luana
Ciubotaru

Biologul exprim rezultatul ca: Enterococi - prezent sau absent / 100 ml ap potabil.
Testul pentru Escherichia coli
Biologul:
- cu o pipet steril transfer 10 ml de ap potabil n 100 ml mediu casein soia lichid i agit uor
- incubeaz proba obinut la 30-35C, timp de 18 - 24 de ore
- dup 24 de ore, cu o pipet steril, transfer 1 ml din proba incubat n 100 ml mediu lichid MacConkey
- incubeaz proba la 42-44C, timp de 24 - 48 ore
- transfer 1 ml din proba incubat pe 2 plci Petri cu mediu MacConkey agar
- incubeaz plcile Petri cu mediul de cultur i proba de analizat la 30-35C, timp de 18 - 72 ore
Interpretarea rezultatelor
Biologul vizualizeaz probele la sfritul perioadei de incubare.
Proba corespunde cu cerinele testului dac nici o colonie nu este prezent.
Creterea coloniilor indic posibila prezen a microorganismului Escherichia coli.
Aceasta se confirm prin teste de identificare conform procedurii PC-293 Identificarea
microorganismelor cu ajutorul echipamentului VITEK 2 Compact.
Proba corespunde cu cerinele testului dac testele de identificare pentru confirmare sunt negative.
Biologul exprim rezultatul ca: Escherichia coli - prezent sau absent / 100 ml ap potabil.
8.2. Apa demineralizat
- la hota cu flux de aer laminar, biologul transfer cte 1 ml ap demineralizat pe suprafaa mediului
casein soia agarizat din 2 plci Petri. Identific proba cu: numele probei, punctul de prelevare,
denumirea mediului de cultur, data.
- laboranta mpacheteaz n hrtie semipergament plcile Petri cu probe i mediu de cultur, le identific
i le transfer n camera termostat la 30-35 0C n vederea incubrii, timp de 5 zile.
Interpretarea rezultatelor
Biologul:
- vizualizeaz probele la sfritul perioadei de incubare
- numr coloniile dezvoltate pe mediile de cultur din cele dou plci Petri
- calculeaz media aritmetic a coloniilor dezvoltate pe cele dou plci Petri
- exprim rezultatul ca numr de UFC/ ml ap demineralizat
Proba este corespunztoare dac:
- numrul total de microorganisme aerobe este maxim 500 UFC / ml ap demineralizat
n cazul n care apar rezultate n afara specificaiei procedeaz conform prevederilor procedurilor AC-PG-032
Investigarea rezultatelor n afara specificaiilor i PC341 Norme de bun practic de laborator.
8.3. Apa purificat
8.3.1. Determinarea numrului total de microorganisme aerobe
Biologul:
- decontamineaz capul pompei Milliflex cu soluie alcoolic 70 %, steril
- deschide pompa prin acionarea tastei ON/OFF
- selecteaz meniul Sampling, submeniurile Manual i Volum OFF. Confirm selecia prin
acionarea tastei OK

Cod: PC 333
Rev. nr.: 03
Funcia
ef laborator Control
ntocmit
Contaminare
ef Serviciu Controlul Calitii
Verificat Analize Microbiologice si
Farmacodinamice
Responsabil Asigurarea Calitii
Aprobat
pentru Controlul Calitii

Data intrrii n vigoare:

Nume i prenume

Semntur

Nr. pag.:
5/7
Data

Biol. Elisabeta Petru

Biol. Marcela
Strungariu
Farm. Corina Luana
Ciubotaru

- cu o pens steril aplic pe capul pompei un separator aseptic

- monteaz pe capul pompei plnia Milliflex steril de 100 ml i i scoate capacul. Aeaz capacul pe
masa hotei cu suprafaa exterioar n jos
- tansfer 1 ml ap purificat n plnia Milliflex
- acioneaz tasta START pentru filtrarea probei. Dup ce proba a fost filtrat spal membrana cu 100 ml
soluie tampon cu clorur de sodiu pepton pH 7,0
- acioneaz tasta START pentru uscarea membranei
- pune capacul plniei Milliflex
- verific integritatea i sterilitatea unei casete Milliflex cu mediu de cultur R2A
- scoate capacul alb/opalescent al casetei Milliflex
- ndeprteaz cu grij de pe capul pompei plnia Milliflex cu membrana filtrant i proba de analizat i
o aplic pe caseta cu mediu de cultur. Apas ferm cu podul palmei pn la detaarea plniei. Membrana
trebuie s fie n contact direct cu mediul de cultur.
- transfer capacul plniei pe caseta cu mediu de cultur, membrana filtrant i proba de analizat
- identific proba cu: numele probei, punctul de prelevare, denumirea mediului de cultur, data
- cu o pens steril ndeprteaz de pe capul pompei separatorul aseptic
- decontamineaz capul pompei Milliflex cu soluie alcoolic 70 %, steril
- procedeaz n mod asemntor pentru filtrarea a nc 1 ml ap purificat.
Controlul negativ:
Biologul:
- cu o pipet steril transfer 1 ml soluie tampon cu clorur de sodiu pepton pH 7,0 ntr-o eprubet cu 10 ml
mediu casein soia lichid - pentru controlul sterilitii acesteia
- imerseaz pensa utilizat ntr-o eprubet cu 10 ml mediu casein soia lichid - pentru controlul sterilitii acesteia
Laboranta:
- mpacheteaz casetele Milliflex cu probe i mediu de cultur n hrtie semipergament, le identific cu:
numele probei, punctul de prelevare, denumirea mediului de cultur, data i le transfer n camera
termostat la 30-35oC pentru incubare, n poziie invers, timp de 5 zile.
- transfer eprubetele ce constituie controalele negative n camera termostat la 30-35 oC pentru incubare,
timp de 5 zile.
Interpretarea rezultatelor
Biologul:
- vizualizeaz probele la sfritul perioadei de incubare
- numr coloniile dezvoltate pe mediile de cultur din cele dou plci
- calculeaz media aritmetic a coloniilor dezvoltate pe cele dou plci
- exprim rezultatul ca numr de UFC / ml ap purificat
Proba este corespunztoare dac:
- controalele negative nu prezint creteri microbiene
- numrul total de microorganisme aerobe este maxim 100 UFC / ml ap purificat
n cazul n care apar rezultate n afara specificaiei procedeaz conform prevederilor procedurilor AC-PG-032
Investigarea rezultatelor n afara specificaiilor i PC341 Norme de bun practic de laborator.

Cod: PC 333
Rev. nr.: 03
Funcia
ef laborator Control
ntocmit
Contaminare
ef Serviciu Controlul Calitii
Verificat Analize Microbiologice si
Farmacodinamice
Responsabil Asigurarea Calitii
Aprobat
pentru Controlul Calitii

Data intrrii n vigoare:

Nume i prenume

Semntur

Nr. pag.:
6/7
Data

Biol. Elisabeta Petru

Biol. Marcela
Strungariu
Farm. Corina Luana
Ciubotaru

8.3.2. Determinarea microorganismelor specifice

Se efectueaz pe medii selective care permit dezvoltarea i identificarea anumitor categorii de
microorganisme specifice conform procedurii PC 202 - Teste pentru microorganisme specifice .
Determinarea microorganismelor specifice din probele de ap purificat se realizeaz n funcie de
secia care utilizeaz apa purificat (Tabel 2) conform criteriilor de acceptare a calitii microbiologice
pentru fiecare form farmaceutic nonsteril (cap. 5.1.4. Farmacopeea European).
Tabel 2
Forma farmaceutic
Microorganisme specifice
Produse farmaceutice solide uz oral - capsule, comprimate
Escherichia coli
Produse farmaceutice semisolide de uz cutanat Pseudomonas aeruginosa
(unguente, creme, geluri), supozitoare i ovule
Staphylococcus aureus
Candida albicans
Substana farmaceutic activ vrac - nistatin
Bacterii gram negative tolerante pentru bil
Escherichia coli
Salmonella
Pseudomonas aeruginosa
Stapylococcus aureus
8.4. Apa pentru injecii
8.4.1. Determinarea numrului total de microorganisme aerobe se efectueaz n cadrul laboratorului
Controlul Sterilitii i Pregtire Medii de Cultur conform procedurii PC-132 Testarea sterilitii prin
metoda filtrrii prin membran.
8.4.2. Determinarea prezenei microorganismelor Pseudomonas aeruginosa i a b acteriilor gram negative
tolerante pentru bil se efectueaz la probele care prezint creteri microbiene, n cadrul laboratorului Control
Contaminare, conform procedurii PC-293 Identificarea microorganismelor cu ajutorul echipamentului

VITEK 2 Compact.
9. nregistrri
n laboratorul Control Contaminare, laboranta nregistreaz probele prelevate n condica Prelevare
probe ap, abur i rezultatele analizelor cod CC-F-206.33 i iniiaz fia analitic.
Biologul nregistreaz analizele efectuate n condica Rezultate testare contaminare microbian la
probe de ap, abur cod CC-F-206.85 i n fia analitic.
eful de laborator analizeaz rezultatele nregistrate n fia analitic, emite concluzia analizei, semneaz
fia analitic i apoi se redacteaz certificatul de analiz, conform procedurii PC-022 Eliberarea
certificatelor de analiz .
10. Responsabiliti
Laboranta:
- preleveaz probele de ap
- transport i distribuie probele la laboratoarele Control Contaminare, Controlul Sterilitii i Pregtire
Medii de Cultur
- nregistreaz probele prelevate i iniiaz fiele analitice
- pregtete sticlria i materialele necesare testelor

Cod: PC 333
Rev. nr.: 03
Funcia
ef laborator Control
ntocmit
Contaminare
ef Serviciu Controlul Calitii
Verificat Analize Microbiologice si
Farmacodinamice
Responsabil Asigurarea Calitii
Aprobat
pentru Controlul Calitii

Data intrrii n vigoare:

Nume i prenume

Semntur

Nr. pag.:
7/7
Data

Biol. Elisabeta Petru

Biol. Marcela
Strungariu
Farm. Corina Luana
Ciubotaru

- particip alturi de biolog la efectuarea analizelor

Biologul:
- verific probele predate n laborator
- efectueaz analiza probelor
- nregistreaz rezultatele obinute n condicile specifice i n fia analitic
eful de laborator:
- analizeaz rezultatele nregistrate n fia analitic i emite concluzia analizei
- iniiaz redactarea certificatului de analiz pe baza fielor analitice (eful laboratorului Analize Materii
Prime, Ambalaje Primare i Secundare)
- verific i semneaz Certificatele de analiz
- investigheaz rezultatele n afara specificaiilor conform procedurii AC-PG-032 Investigarea
rezultatelor n afara specificaiilor i PC-341 Norme de bun practic de laborator.
11. Istoricul revizuirii
Cod
Revizia Descrierea reviziei
PC-333
00
Procedur nou: Analiza calitii microbiologice a apei
PC-333
01
Au fost modificate subcapitolele: Apa pentru injecii i
7.5. Apa nalt purificat (se analizeaz n cadrul
laboratorului Controlul Sterilitii i Pregtire Medii de
Cultur).
Subcapitolul 6.1. Divizarea mediilor de cultur n plci
Petri a fost reunit cu subcapitolul 6.2. Pregtirea
plcilor cu medii de cultur.
S-au reorganizat capitolele 8. nregistrri i 9
Responsabiliti.
PC-333
02
A fost modificat capitolul 7. Analiza calitii
microbiologice a apei. A fost modificat metoda de
analiz a calitii microbiologice a probelor de ap
potabil i a celor de ap purificat. La probele de ap
purificat se utilizeaz pompa Milliflex Plus n locul
aparatului de filtrare tip Millipore.
La probele de ap purificat prelevate de la secia
Unguente i Supozitoare s-a introdus testul pentru
Candida albicans.
Au fost restructurate capitolele 8. nregistrri i
9. Responsabiliti.
PC-333
03
A fost modificat capitolul 1 Referine.
A fost introdus capitolul 2 Definiii.
A fost introdus subcapitolul 8.4. Apa pentru injecii.

Data
30.04.2010
01.04.2011

20.08.2012