Sunteți pe pagina 1din 9

Diagnosticul molecular

Diagnosticul molecular i terapia (MDx) sunt recunoscute ca mijloace importante n


descoperirea, monitorizarea i localizarea bolilor i afeciunilor umane, animale sau vegetale.
Odat cu dezvoltarea reaciei de polimerizare n lan, a fost permis o noua abordare de ctre
cercetatori i cadre medicale asupra mbuntirii calitii vieii i longevitii umane.
n prezent, mai multe domenii ale biomedicinii se folosesc de tehnicile de diagnostic
molecular. MDx este n prezent o pia cu dezvoltare rapid. Conform celui mai recent raport
al Kalorama Information, ce este unul dintre principalii furnizori i publicani de cercetare de
pia pe piaa medical, se prevede c piaa mondiala pentru testele moleculare va crete anual
cu 11%. Se ateapt ca n 2015, aciunile s ajung la 8 mld $, comparativ cu totalul actual de
4 mld $.
Principalii beneficiari ai acestui progres rapid sunt urmtoarele domenii stiintifice:
microbiologie, virusologie, genetic, oncologie i identificare umana. Aplicaiile principale
ale diagnosticului molecular sunt: testele pentru boli infecioase, testele oncologice,
screening-ul de snge, testele de compatibilitate tisular, testele pentru afeciuni
cardiovasculare i neurologice i testele de detecie ale patogenilor alimentari. Principalele
aplicaii sunt prezentate n graficul de mai jos:

Fig.1

Este bine cunoscut faptul c diagnosticul molecular a originat din dezvoltarea reaciei
de polimerizare n lant. Cu toate acestea, alte, fost descoperiri cheie au permis importana n
prezent a MDx pe piaa medical internaional. Descoperirea structurii ADN i tehnicile de
hibridizare urmate de invenia metodei de secveniere a ADN sunt cele mai relevante
descoperiri pentru tehnicile de diagnostic molecular.
Datorit descoperirilor prezentate n tabel, tehnologia actual, ce este crucial n
domeniul diagnosticului molecular, include amplificare de prim generaie, probe ADN,
hibridizare fluorescent in situ, biocipuri, biosenzori i biofluide de secund generaie,
detecie de semnal i profilul expresiei genice utiliznd tehnica microarray.
Cea mai comun metod bazat pe utilizarea acizilor nucleici i implicat n MDx o
reprezint PCR (polymerase chain reaction) i anume reacia de polimerizare n lan.
Reacia PCR (Polymerase Chain Reaction = Reacie de Polimerizare n Lan) este o
metod de amplificare enzimatic in vitro a unei anumite secvene de ADN. n prezent a fost
dezvoltat o adevarat tehnologie PCR care este folosit ntr-o varietate foarte mare de
domenii:

biologie

molecular,

tiinele

mediului,

criminalistic,

tiine

medicale,

biotehnologie, microbiologie, industria alimentar, epidemiologie etc.


Din punct de vedere chimic, reacia PCR este constituit din cicluri succesive de
replicare ADN in vitro, folosind 2 primeri oligonucleotidici ce hibridizeaz cu cele 2 catene
ale secvenei originale (folosit ca matri n replicare). Diferena esenial ntre o asemenea
reacie de replicare i un proces de replicare ADN in vivo, l reprezint faptul c n reacia
PCR etapa de desfacere a dublului helix matri i, respectiv, cea de ataare a primerilor, nu
sunt realizate enzimatic, ci prin parcurgerea unor trepte de temperatur, iar singura enzim
folosit n reacie este o ADN polimeraz ADN-dependent (cu funcie de replicaz).
Principalele 3 etape ale unei reacii PCR pot fi sintetizate astfel :

Fig 2. Reprezentarea schematic a PCR


Principalele componente ale reaciei sunt : ADN matri, o ADN polimeraz
termostabil, primeri oligonucleotidici, deoxinucleotidtrifosfati (dNTP), tamponul de reacie,
ioni de Mg2+. O reacie PCR este format din n cicluri (ntre 25 i 40), n fiecare ciclu fiind
parcurse 3 etape principale: denaturarea termic a matriei (deci, desfacerea dublului helix
ADN), ataarea primerilor i polimerizarea propriu-zis. La terminarea unui ciclu de replicare
in vitro (de amplificare), cantitatea de ADN rezultat este dubl fa de matri. Mai mult,
produsele rezultate ntr-un ciclu sunt folosite ca matri n ciclul urmator, astfel nct numrul
final de copii ADN este de 2n x y, unde y = numrul iniial de copii, iar n = numrul de cicluri
de replicare. Este de subliniat faptul c moleculele acumulate exponenial reprezint copii ale
matriei care la capete au incorporai primerii.
In concluzie, reacia PCR este o metod prin care se obin cantiti mari dintr-o
anumit secven ADN. Aceste molecule pot fi ulterior manipulate/analizate fr a fi necesar
o prealabila clonare molecular a acestora.
Marele avantaj al tehnicilor PCR l reprezint faptul c permite obinerea unei cantiti
mari dintr-o anumit secven ADN, fr a necesita clonarea acesteia n prealabil ntr-o

molecul de tip vector. Pe de alt parte, tehnologia PCR a revoluionat i implicarea geneticii
moleculare n domenii n care se apeleaz la cantiti foarte mici de ADN. Asemenea situaii
se ntlnesc n :
- diagnosticul unor boli monogenice, precum i detectarea de noi tipuri de mutaii n
gene importante n anumite boli;
- diagnosticul unor infecii umane: permite detectarea particulelor infecioase
bacteriene i virale chiar aflate ntr-o proporie mic, chiar pentru specii ce se cultiv dificil in
vitro, chiar pentru patogeni cu variabilitate antigenic mare, i chiar pentru patogeni ce au
perioad mare de laten; astfel, pot fi identificai indivizii umani pozitivi nainte de
seroconversie;
- studii privind mecanismele genetice ce acompaniaz procesele maligne (detectarea
secvenei i esutului n care se exprim anumite oncogene n diverse procese maligne);
- studii de taxonomie, sistematic i filogenie molecular: obinerea rapid a unei
cantiti mari din secvene ADN cu valoare taxonomic i/sau filogenetic;
- biologia populaiilor, inclusiv la organisme mici: tehnologia PCR permite
secvenierea rapid a unor molecule de ADN de la foarte muli indivizi, fr a necesita n
prealabil clonarea acestora;
- studii de antropologie: tehnica PCR permite n prezent recuperarea i analiza unor
secvene ADN din fosile;
- medicin legal: cu ajutorul reaciilor PCR pot fi n prezent analizate la nivel
molecular o serie ntreag de probe biologice.
In afar de toate aceste aplicaii directe ale tehnologiei PCR, pornind de la reacia
iniial de amplificare, au fost imaginate o serie ntreag de variante tehnice ce permit
abordarea unor manipulri ct mai acurate a moleculelor de acizi nucleici.
1. Obinerea unor cantiti suficiente dintr-o anumit secven
Cu ajutorul tehnologiei PCR se pot obine cantiti suficiente dintr-o anumit secven
ADN, astfel nct s poat fi folosit n diverse manipulri, inclusiv pentru secveniere sau
experimente de clonare.
2. Obinerea de sonde ADN/ARN marcate
Foarte multe tehnici de obinere de sonde ADN/ARN folosesc variante de reacii PCR.
Astfel, ntr-o prim variant, se folosesc primeri marcai (n sistem radioactiv sau neradioactiv
de marcare) i dNTP nemarcate. Ampliconii obinui ntr-o asemenea reacie sunt molecule
dublu-catenare marcate la capete (primerii unei reacii PCR intr n structura produilor de
reacie).

Fig.3 Obinerea prin PCR de sonde marcate la capete


Intr-o alt variant tehnic, n reacia PCR se introduc att primeri marcai, ct i
dNTP marcate. Ampliconii obinui vor fi reprezentai de molecule marcate pe toat lungimea.
In ambele cazuri, ampliconii rezultai sunt denaturai termic, obinndu-se n final
sondele monocatenare utilizabile n reaciile de hibridizare molecular.
3. PCR n mutageneza situs-specific
Pornind de la faptul ca primerii folosii ntr-o reacie PCR sunt inclui n produsele
PCR (ampliconi), au fost dezvoltate o serie ntreag de variante tehnice ale acestei reacii.
Astfel, n experimentele de mutagenez situs-specific, modificrile dorite pot fi introduse n
ampliconi pe calea primerilor, fie c este vorba de inserii sau de deleii.
In toate aceste cazuri se utilizeaz o tehnologie PCR n care reacia de amplificare este
mprit n 2 reacii PCR separate n care sunt amplificate cele 2 secvene ADN aflate de o
parte i de alta a situsului de modificat. In aceste 2 etape se folosesc perechi de primeri
constituite dintr-un primer extern (pentru captul moleculei ADN iniiale) i un primer intern
(primerii interni sunt complementari situsului de modificat i conin n secven modificarea
dorit). Prin folosirea unor asemenea primeri, ampliconii rezultai conin deja modificarea
dorit, precum i o zon de complementaritate inter-ampliconi.
Dup aceast etap se realizeaz ndepartarea primerilor interni, amestecarea celor 2
produse PCR, denaturarea termic a moleculelor urmat de renaturarea acestora n condiii de

stringen. Se adaug primeri exteriori i se realizeaz o noua reacie PCR, al crei rezultat va
fi reprezentat de molecule ADN identice cu matria initial, coninnd ns i modificarea
dorit.

Fig. 4 Mutageneza situs specifica utilizand PCR


Spre deosebire de tehnicile clasice de mutagenez, i chiar de experimentele de
mutagenez cu ajutorul transposonilor, asemenea variante tehnice de PCR permit o rezoluie
i o acuratee mult mai mare n obinerea de molecule ADN modificate. In mare majoritate,
aplicaiile practice vizeaz analiza corelaiilor dintre secvena de nucleotide a unor molecule
ADN i realizarea anumitor funcii.
4. PCR n obinerea de molecule ADN recombinate
Un alt set de studii i propun analiza funciilor de promotor a unor secvene ADN, sau
chiar obinerea de molecule ADN recombinate cu rat nalt de transcriere (Fig.5). In acest
scop, se folosete o schem de manipulare genetic similar celei de mai sus. Astfel, se

realizeaz 2 reacii PCR separate n care sunt amplificate secvena potenial promotor i,
respectiv, secvena codificatoare. In ambele reacii PCR se utilizeaz perechi de primeri
constituite dintr-un primer extern i un primer intern (n acest caz, primerii interni conin i o
poriune complementar celeilalte molecule). Etapele urmtoare sunt similare: ampliconii
rezultai n aceste 2 reacii PCR se amestec, se denatureaz i se renatureaz n condiii de
stringen. In aceast a treia reacie PCR se introduc doar primeri externi i se obin molecule
ADN recombinate, formate din secvena promotor i din secvena codificatoare.

Fig 5. PCR combinatorial


5. ARN PCR
O serie ntreag de experimente vizeaz obinerea de molecule de ADNc
(complementar cu anumite molecule ARN). O variant tehnic utilizeaz reaciile de reverstranscriere, n timp ce o alt variant se bazeaz pe reacii PCR. Astfel, dupa denaturarea
structurilor secundare ale moleculelor ARN, se ataeaz un primer complementar capului 3 al
moleculei ARN i are loc sinteza primei catene de ADNc. In aceast reacie se folosete o
ADN polimeraz ARN-dependent (reverstranscriptaz), de tipul AMV-RT (Avian

Mieloblastosis Virus Revers-Transcriptase), MLV-RT (Murine Leukaemia Virus ReversTranscriptase), rTth(recombinant Thermus thermophilus DNA polymerase).
Hibridul ARN-ADN obinut n aceast reacie de revers-transcriere este supus unei
reacii de distrugere a catenei ARN cu RNaza H, dup care la catena ADN rmas este ataat
un primer complementar cu capul 3 al acesteia. Dup sinteza celei de-a doua catene ADN,
moleculele sunt introduse ntr-o reacie PCR obinuit la sfritul creia sunt obinute
moleculele de ADNc (complementar cu moleculele ARN de la care s-a plecat). Avantajul unei
asemenea variante tehnice l reprezint faptul c se obine o cantitate mare a secvenelor
ADNc.
PCR invers
In foarte multe experimente este necesar amplificarea unor molecule de ADN cu
secven necunoscut. Un asemenea caz este i cel n care se studiaz situsurile n care se
insereaz o serie de transposoni sau genomul unor virusuri. In aceast situaie se secioneaz
cu endonucleaze de restricie o molecul ADN ce cuprinde secvena cunoscut (transposon,
genom viral) ncadrat de secvene necunoscute (aparinnd genomului gazdei). Aceast
molecul este apoi circularizat i introdus ntr-o reacie PCR n care se folosesc primeri
complementari cu capetele secvenei cunoscute. Ampliconul rezultat este reprezentat de
secvena necunoscut.

Fig 6. PCR invers

6. PCR in situ
Una din limitrile tehnicii PCR o reprezint necesitatea de a extrage i purifica matria
(ADN sau ARN) nainte de amplificare. Varianta tehnic PCR in situ combin o reacie PCR
cu o hibridizare molecular in situ. Astfel, reacia PCR se realizeaz n celule intacte i este
apoi detectat prin hibridizare in situ (ntreaga reacie, att PCR, ct i hibridizarea, se
realizeaz pe esut mparafinat i plasat pe lama de microscop). Printr-o asemenea tehnic se
poate identifica foarte exact care celule posed o anumita secven ADN, sau care exprima o
anumita gen. Pe de alt parte, se reduce foarte mult riscul contaminrii produselor PCR cu
alte secvene ADN.