Curs XXII.

Haemophilus, Bordetella, Legionella, Corynebacterium

Genul Haemophilus
1.
II.
III.
IV.
V.
VI.
VII.
VIII.
IX.

Minidefinitie
Incadrare taxonomica
Habitat
Implicare in patologia umana
Microbiologie - principalele caractere si implicatii in patogeneza si
diagnosticul microbiologie
Factori de patogenitate
Patogenie
Raspunsul imun. Notiuni de epidemiologie si profilaxie a infectiilor
Diagnosticul de laborator

Cuvinte cheie:
cocobacili gram negativi, pretentiosi, capsul; factori X si V;
afecteaza gazde cu imunitate compromisa; localizari diverse: tract respirator,
sistem nervos central, genito-urinar, septicemii, localizari secundare articulare,
cardiace, digestive etc.
Infecii nosocomiale, rezistena antibiotice

1.

Minidefinitie

Din Genul Haemophilus fac parte cocobacili si/sau bacili Gram negatrvi,
facultativ anaerobi, imobili, nesporulati (tulpinile virulente sunt capsulate), pretenioi
nutritiv, care au nevoie de factori din sange pentru a putea sa se dezvolte:
O Factor X = hematina
O Factor V = NAD
Unele specii pot fi condiionat patogene, provocnd la gazde cu imunodeficiene
infecii cu cele mai diverse localizri.
Denumirea speciei tip, atribuit de Pfeiffer, provine dintr-o confuzie iniial cu
agentul cauzal al gripei (Haemophilus = iubitor de sange; injluenzae = al gripei),
deoarece era frecvent izolat n timpul marii pandemii de gripa din 1889 - 1892.
Ulterior, Smith, Andrews si Laidlaw au demonstrat
rolul secundar al H
irfluenzae. Cu toate acestea, alturi de Streptococcus pneumoniae, Staphzlococcus aureus
i mai rar alte bacterii condiionat patogene este implicat n complicatia bacterian a
cazurilor de grip, care poate mbrca adesea aspecte severe, mai ales la vrste extreme i
la pacieni care prezint ali factori de risc.
II.

Incadrare taxonomica
Familie Pasteurellaceae
O Gen Haemophilus
O Gen Actinobacillus

III.

Gen Pasteurella
Inrudiri:
O Enterobacteriaceae
O Vibrionaceae
O Aeromonaceae
Habitat

H influenzae colonizeaz mucoasele omului, altor mamifere, psrilor, petilor,

reptilelor. Sunt comensali ai tractului respirator, cilor genitale, intestinului. Se pot ntlni la
nivelul plcii dentare.
Spre deosebire de H. inf1uenzae, H aegyptius si H ducreyi sunt totdeauna patogeni.
IV.

Implicare in patologia umana:

Speciile care sunt totdeauna patogene sunt:

H ducreyi - agentul cauzal al ancrului moale;
H aegyptius - agentul cauzal al conjunctivitei purulente i febrei braziliene

Speciile care pot provoca infecii la gazda imunocompromis sunt:

H influenzae in special serovar b
H parainjluenzae
H aphrophilus

Speciile dependente numai de Factor V sunt denumite prin adugarea prefixului

"para".

V.

Principalele forme de infecii cauzate de haemofili sunt:

Tract respirator - pneumonii, meningite, epiglotita acut, otita medie: n special
tulpinile capsulate
Celulite
Bacteriemii, septicemii
Artrite, pericardite, endocardite, osteomielite
Infectii genitale si materno-fetale
Infectii ale plgii
Infectii digestive, biliare
Microbiologie - principalele caractere si implicatii in patogeneza si
diagnosticul microbiologie

n cazul heamophililor se descrie polimorfismul morfologic legat de condiiile de

cretere i vechimea culturii (Fig. 1)
Exist, de asemenea, diferente n relaie cu specia.
Haemophilii sunt "Gram la limita":. Se decoloreaza mai greu, prind mai greu
coloraia secundara: se utilizeaza totdeauna fucsina, NU SAFRANINA.

Fig. 1. Frotiu cu Haemophilus injluenzae - polimorfism

Se dezvolt numai pe medii bogate, suplimentate cu peptone, glucoza etc.

Necesita Factor X si V; uneori numai V sau X.
Factorul X, termostabil ( 45 min la 120 o C), este un precursor al hemului,
protoporfirina IX
Factorul V, termolabil (15 min la 90 o C), este NAD sau NADP - inactivati de
pirofosfataza si nicotinamindezoxiribonucleaza
Aceti factori pot fi obinui prin diferite metode:
- ocolatizarea mediului cu adaos de snge, adic nclzirea treptat la 80 o e, i
meninerea acestei temperaturi timp de 10 minute. Factorii X i V sunt eliberai prin
distrugerea hematiilor.
- adugarea de suplimente cum sunt: factor X i V, supliment Fildes, Levinthal et.
- hemoliza cu eliberarea coninutului hematiilor prin cultivarea pe mediul de
izolare a unui striu de stafilococ hemolitic. n acest caz se observ fenomenul de
satelitism, adic creterea hemofilului doar lng striul de stafilococ (Fig. 2).
Fig. 2. Satelitism la Haemophilus

Unele specii sunt capnofile: H. ducreyi, aphrophylus, unii H. parainjluenzae

Pentru cretere, haemofilii au nevoie de umiditate i uneon

prelungit, mai ales dup tratamente cu antibiotice.
Pentru H ducreyi, incubarea trebuie prelungit la 5 zile.
n cazul prelevatelor nalt contaminate se folosesc medii selective.
VI.

de incubare

Factori de patogenitate

Principalii factori de patogenitate sunt: capsula, lipooligozaharidul, cu rol n

inflamaie, proteinele membranei externe Pl i P2.
Toate tulpinile virulente produc neuraminidaza si o proteaz IgA, dar rolul lor nu
este dovedit.
Fimbriile cresc aderena bacteriei la mucoase. De asemena, pe hematii exist un
antigen la care hamofilii se pot ataa cu ajutorul fimbriilor (antigenul Anton).
VII.
Patogenie
Principalele faze ale instalrii infeciei sunt:
aderena
ptrunderea n submucoas
ptrunderea n circulaie prin limfatice, vase de snge, unde rezist datorit
capsulei
poate ptrunde la nivelul LCR, prin depirea barierei hematoencefalice
fenomene generale provocate de endotoxemie, cu sindrom febril, mergnd n
cazurile grave pn la sindrom de coagulare intravascular diseminat (CIVD)
VIII.

Raspunsul imun. Noiuni de epidemiologie si profilaxie a infeciilor

Anticorpii protectori pot fi sintetizai activ sau transmii de la mam la ft sau la

sugar. In absenta imunizrii, titrul Ac la copii de 2 luni - 3/4 ani este minim. De aceea, se
impune vaccinarea de la 2 luni.
Incidena bolii este invers proportional cu titrul anticorpi lor bactericizi n snge,
achiziionai pasiv de la mam sau sintetizai activ.
Exist vaccinuri conjugate, care se pot administra la copii, cum sunt cele care
asociaz polizaharidul capsular cu anatoxina difteric, sau cu proteine din membrana
extern a N. meningitidis.
IX.

Diagnosticul de laborator

Diagnosticul de infecie cu haemophili trebuie fcut prin corelarea atent a datelor

clinice cu cele de laborator, avnd n vedere faptul c haemophilii fac parte din flora
normal a cilor respiratorii. Prezena factorilor de risc i a semnelor de infecie
bacterian n absena altor microorganisme cu patogenitate recunoscut poate conduce la
diagnosticul unei infecii cu haemophili.
Hemoculturile sunt pozitive in peste 50% din cazurile simptomatice, cu exceptia
celor cu conjunctivit.
Prezena Poliribitolfosfatului n ser i LCR i concentrarea lui n urin apare n
mai mult de 95% din cazurile de meningit cu H injluenzae.

Pentru
O
O
O
O
O
O
O

cultivare se utilizeaz Medii speciale pentru haemophili:

Geloza sange de cal sau iepure
Geloza soco lat
Geloza cu factori X i V
Geloza XV diferenial
Geloza Levinthal
Geloza Fildes
Medii selective

Identificarea preliminar i definitiv se face astfel:

Identificare preliminara: Crestere comparativ pe medii cu factori V, X si VX,
la aer i n atmosfer cu C02
Identificare definitiv etapizat, prin stabilirea spectrului metabolic fa de
aminoacizi, zaharuri etc.; sunt 8 biotipuri de H injluenzae, dup
comportamentul biochimie fa de indol, ureaz, omitin.
Pentru scopuri epidemiologice se utilizeaz tipizarea prin metode imunologice,
pentru incadrare n tipuri in funcie de particularitile unor antigene structurale (capsula,
proteine ale membranei exteme, lipooligozaharid, proteine fimbriale etc.) sau prin
metode moleculare bazate pe analiza ADN.

Genul Bordetella
1.
II.
III.
IV.
V.
VI.
VII.
VIII.
IX.
X.

Minidefiniie
Incadrare taxonomic
Habitat
Implicare n patologia uman
Microbiologie - principalele caractere i implicaii n patogenez i
diagnosticul microbiologie
Factori de patogenitate
Patogenie
Rspunsul imun
Noiuni de epidemiologie i profilaxie a infecii lor nosocomiale
Diagnosticul de laborator

1.

Minidefiniie

II.

Incadrare taxonomic

Domeniu: Bacteria
Phylum: Proteobacteria
Clasa: Betaproteobacterium
Ordin: Burkholderiales
Familia Alcaligenaceae
Genul Bordetella
Speciile genului cu
B..bronchiseptica, B.holmesii
III.

importan

medical:

B.pertussi,

B.parapertussis,

Habitat

Genul Bordetella cuprinde specii obligatoriu parazite pentru om sau animale, cu

tropism pentru mucoasa respiratorie, supravietuire f. scurta in mediul exterior (2 ore)
Sunt distruse de antiseptice si dezinfectante uzuale, UV, temperatura de 55 o C
timp de 30 minute.
IV.

Implicare in patologia umana

B.pertussis, B.parapertussis: izolate numai la om, sunt agenti etiologici ai tusei
convulsive
B.bronchiseptica: izolata de la animale (infectii respiratorii), rar intalnita la om
(imunodeprimati)
B.holmesii: izolata din hemoculturi la om (tineri cu afectiuni subiacente)

Tusea convulsiva
Poate surveni la toate varstele, mai frecvent la nou- nascuti si copii cu vrste sub
5 ani (nevaccinati)
La nou-nascuti, chintele clasice de tuse pot fi inlocuite de crize de apnee, alterare
importanta a starii generale, varsaturi, accese de cianoza, tuse paroxistica
La adulti: semnele clinice clasice sunt f.rare, diagnosticul dificil sau absent
Boala evolueaza in 3 faze:
Incubatie : silentioasa de 8 zile (maxim. 14 zile)
Faza catarala (10 - 15 zile): rinoree, febra moderata (38oC), tuse discreta
nespecifica, neproductiva, tenace, noctuma
Faza paroxistica (stadiul convulsiv, perioada de stare, 15-20 zile): chinte
repetate de tuse spasmodica, emetizante (10-30 pana la 40 in 24 ore),
expectoratie vascoasa, dificila, urmata de varsaturi, insotite de inspiratie

profunda, sonora, prelungita (latrat de caine sau zbierat de magar),

limfocitoza ( pana la 40 000/mm3 )
Faza de convalescenta (3-4 saptamani)
V.

Microbiologie - principalele caractere si implicatii in patogeneza si

diagnosticul microbiologie

Bacteriile din Genul Bordetella sunt cocobacili mici (0,2-0,3Jlm pana la 0,51um), gram negative, dispusi izolati, perechi, rareori lanturi scurte. Bordetella pertussis,
parapertussis i holmesii sunt specii mobile, strict aerobe, cu metabolism respirator,
exigente nutritive mari: cultiva numai pe medii cu aminoacizi, vitamine, saruri minerale,
substante neutralizante (amidon, carbune). Nu necesita factori X si V. Temperatura
optima de cultivare este de 350-370 C.
Speciile genului Bordetella sunt in general inactive metabolic. Nu fermenteaza
hidratii de carbon, nu produc gaz, nu produc indol si hidrogen sulfurat, nu lichefiaza
gelatina, dar alcalinizeaza laptele turnesolat
VI.

Factori de patogenitate

Adezine
Hemaglutinina filamentoasa (FHA) - in fimbrii, se fixeaz pe celulele ciliate,
limfocite si macrofage, are rol in imunogenitate
Aglutinogenele - in fimbrii, se fixeaz pe celulele ciliate, determina serotipulla
B.pertussis (serotipuri majore 1, 2, 3 )
Pertactina - proteina de suprafata ce intervine in procesul de adeziune
Toxine
1. Toxina pertussis(PT)-proteina

hexamerica tip A-B (comuna la germenii gram

negativi). Este raspunzatoare de:

- limfocitoza (semn important in tusea convulsive)
- cresterea sensibilitatii la histamina
- cresterea secretiei de insulina (factor hipogliceminat)
- efect adjuvant manifestat prin cresterea raspunsului in anticorpi IgM, IgG si IgE
Tratata cu formaldehida, toxina pierde activitatile
antigenicitatii.

biologice cu pastrarea

B.parapertussis si B.bronchiseptica poseda copii inactive ale genei responsabile

de sinteza PT
2.Adenilat ciclaza (AC) - proteina complexa bifunctionala, cu activitate
enzimatica si hemolitica
- forma intracelulara (endotoxina), termostabila;apare numai la B.pertussis
- forma extracitoplasmatica (exotoxina), solubila, termolabila la 560C; comuna de
specie si responsabila de:

a) cresterea secretiei seromucoase a cailor respiratorii;

b) permeabilizarea mucoasei respiratorii pentru PT;
c) inhibare a functiei polimorfonuclearelor si macrofagelor alveolare.
3. Toxina dermonecrotica (HLT) - termolabila, se inactiveaza in 15 min. la 56oC,
se elibereaza prin liza germenilor
4. Citotoxina traheala (TCT) - produce ciliostaza cu distrugere celulara
5. Lipopolizaharidul (LPS) - endotoxina, termostabila, cu structura asemanatoare
cu cea de la Enterobacterii, dar cu actiune pirogenica mai scazuta
VII.

Patogenie

Bipertussis are tropism pentru celulele ciliate ale epiteliului respirator, adera pe
cilii vibratili celulari si se multiplica rapid, produce paralizia cililor, activarea secretiilor
mucoase. Nu produce bacteriemie
VIII.

Raspunsul imun

Rspunsul imun este de tip umora!.

IX.

Notiuni de epidemiologie si profilaxie a infectiilor nosocomiale

B.pertussis i parapertussis, speciile importante in patologia umana, sunt

raspunzatoare de tusea convulsiva, boala infectocontagioasa cu declarare obligatorie.
Habitatul natural este mucoasa respiratorie. Transmiterea se face direct pe cale
aeriana de la om la om. Contagiozitatea este prezent in faza catarala.
Receptivitatea este generala. Boala evolueaza endemo-epidemic cu "peak"-uri la
interval de3-4 ani.
n tarile cu protectie vaccinala buna, epidemiile sunt rare, spre deosebire de tarile
cu acoperire vaccinala slaba, n care incidenta este crescuta.
Alte microorganisme
care pot provoca sindrom de tuse convulsiv
"nonbordetella" sunt: adenovirusuri, VRS, Mycoplasma pneumoniae
X.

Diagnosticul de laborator

Se prelev secreii faringiene, cu ajutorul unor tampoane speciale, din dacron sau
alginat de calciu (bumbacul este inhibitor), cu form curbat, pentru a atinge faringele
inferior.
O variant mai puin eficient este metoda "plcii tuite", constnd n pregtirea
unei plci cu mediu Bordet-Gengou, care se pune n faa cavitii bucale a pacientului, n
timpul accesului de tuse.
Diagnostic direct: punerea in evidenta a agentului etiologie
- imunofluorescenta directa (IFD)
- cultura
- cercetarea producerii de adenilat ciclaza

-PCR
Diagnostic indirect urmrete evidenierea rspunsului imun in anticorpi, a
modificrilor n formula (hiperlimfocitoza), evidenierea hipoglicemiei
Diagnosticul direct

Prelevarea probelor se face precoce, la debutul bolii, inaintea administrarii de

antibiotice.
Tip de prelevat: aspirat nazo-faringian sau bronsic (in mediu spitalicesc), tampon
nazo-faringian (Dacron sau calcium alginate), "placa tusita"
Conditii de transport: insamantare la patul bolnavului sau mediu de transport
Regan-Lowe semisolid selectiv, mediude transport universal ( Amies, Stuart)
Cultivarea se face pe mediu Bordet-Gengou selectiv si neselectiv (infuzie de
cartofi, glicerina, sange defibrinat de oaie, cefalexina sau meticilina) sau mediu ReganLowe (carbune activat, amidon, sange de cal)
lncubarea se face la 350 - 370 C, aerobioza, atmosfera umeda 3-4 zile pana la 7
zile.
Identificarea se face pe baza caracterelor morfotinctoriale, caracterelor de cultura,
caracterelor biochimice, antigenice (aglutinare pe lama)
Diagnosticul indirect:
Diagnosticul serologie este util pentru diagnosticul cazurilor cultura negative
sau PCR nerealizabil.
Supravegherea epidemiologica se realizeaz prin diagnosticul cazurilor de boal
i diagnosticul retrospectiv (in faza de convalescenta), Acesta din urm se efectueaza pe
doua probe de seruri recoltate la debut si la 3-4 saptamani de boala.
Metode de diagnostic serologie:
a) reactia de aglutinare in tuburi (tip Flosdorf) - punerea in evidenta a Ac
aglutinanti antipertussis si antiparapertussis
b) ELISA
- determinare IgA (boala) si IgG (boala si vaccinare)
- determinare Ac anti-PT, anti-FHA
Tratament

Tratament simptomatic si preventiv:

- izolare la domiciliu sau spitalizare
- fluidifiante bronsice si mucolitice
- sedative ale tusei
Antibioterapia: eritromicina - antibiotic de electie; alternativa: cotrimoxazol,
fluorochinolone; tratament cu eritromicina la contacti
Imunoprofilaxie

Vaccinare:
Vaccinul DTP (diftero-tetano-pertussis) - 3 inoculari incepand de
la 2 luni, la 2 luni interval si rapeluri in caz de contact cu un caz confirmat: - anatoxina

difterica, anatoxina tetanica, Vaccin Pertussis corpuscular; Varianta - vaccin pertussis

acelular

Legionella
1.
II.
III.
IV.
V.
VI.
VII.
VIII.
IX.
X.

Minidefinitie
Incadrare taxonomica
Habitat
Implicare in patologia umana
Microbiologie - principalele caractere si implicatii in patogeneza si
diagnosticul microbiologie
Factori de patogenitate
Patogenie
Raspunsul imun
Notiuni de epidemiologie si profilaxie a infectiilor nosocomiale
Diagnosticul de laborator

Cuvinte cheie: bacil Gram negativ, biofilm sisteme alimentare cu apa, pneumonie
1.

Minidefinitie

Legionella pneumophila este un bacil gram negativ, necapsulat, nesporulat, care

se dezvolt n mediu cu umiditate crescut, ca de exemplu sistemele de alimentare cu ap
sau de umidificare a aerului, de unde pot ajunge n cile respiratorii ale omului i pot
provoca mbolnviri, n special la gazde cu imunitate sczut.
II.

Incadrare taxonomica

Familie de 46 specii si 64 serogrupuri : L. pneumophila - specia cea mai

importanta in patologia umana - responsabila de peste 95 % din imbolnaviri - L.
pneumophila serogrup 1 asociata la peste 80 % din cazuri
III.

Habitat
Temperatura inferioara la 50 e,
Zone "moarte", prezenta de biofilm, de alte micro organisme din mediul acvatic,
cum sunt cianobacteriile sau amoebele libere (Fig. 1=sau prezenta unor materiale,
cum sunt: fier, zinc, PVC).
D

10

Fig. 1. Legionella

IV.

i amoeba n structura biofilmului

Implicare in patologia umana

Legioneloza = pneumonie cu debut la nivelul comunitatii sau nosocomiala,

provocata de bacterii din genul Legionella, facultativ intracelulare, Gram negative, cu
tropism hidric, larg raspandite in natura - ecosisteme naturale (ape dulci, zone umede) si
retele de distributie a apei
Forme clinice
legioneloza sau maladia legionarilor - incubare 2-10 zile, sindrom pseudogripal,
febra, tuse seaca, cefalee, mialgie, anorexie
febra de Pontiac
forme extra-pulmonare
V.

Microbiologie - principalele
diagnosticul microbiologie

caractere si implicatii in patogeneza

Bacili Gram negativi (slab colorati), nesporulati,

um, cu tropism hidric
VI.

0,3 - 0,9 Jlml2 - 20

Factori de patogenitate

Prtincipalul
VII.

necapsulati,

si

factor de patogenitate

este capacitatea de supravieuire

intracelular

Patogenie

Ptruns la nivelul celulelor fagocitare, Legionella supravieuiete Ia nivelul

fagozomului, unde se multiplic. La suprafaa celulei sunt exprimate antigene proprii

11

bacteriei, pentru ca n final fagocitul s fie distrus, iar bacteriile s treac la alte
celule.(Fig. 2)
Fig. 2. Legionella

VIII.

IX.

Raspunsul

i relaia sa cu fagocitul

imun

Rspunsul imun este de natur umoral.

Notiuni de epidemiologie si profilaxie

Legioneloza se manifesta in tot timpul anului, cu varfuri vara si toamna

Factori de risc:
a. Varsta (> SO ani)
b. Sex (masculin)
c. Tabagism
d. Etilism
e. Tratamente imunosupresoare cu boli asociate
f. Expunere prelungita si repetata la surse de contaminare (calatorii, hoteluri,
centre de ingrijire sau de odihna etc.)
Contaminare prin inhalare de apa contaminate, prin aerosoli contaminati
Declararea cazului obligatorie pentru a permite detectarea precoce a cazurilor
grupate.
Prevenie

Preventie: supraveghere a mediului si clinica - program de intretinere constanta

a retelelor (curatire pt. eliminare tartru, circulare permanenta a apei cu eliminarea
zonelor moarte, o temperatura suficienta a apei (60C la locul de producere si
SOC la punctele de utilizare).

12

Franta: obiectiv tinta in institutiile de sanatate - mentinerea concentratiei

legionelelor < 103 UFC / litru apa.

X.

Diagnosticul de laborator

Dg. de certitudine: pneumonie asociata cu criterii biologice clare (Ag urinar si

cultivare)

Imunofluorescenta directa
Cultivare
Antigene urinare
Serologie
PCR

Cultivare

Creste lent, in 3-10 zile, pe medii speciale: BCYE ("Buffered Charcoal Yeast
Extract") continand cisteina, fier si carbune
Bacterii aerobe strict, capnofile (2,5%)
Colonii cu aspect caracteristic (en "verre fritte" = sticla pisata) (lupa binoculara
marire x 30) (Fig. 3).
Identificare prin imunofluorescenta directa sau latex-aglutinare cu Ac specifici

Fig. 3. Aspect de sticl pisat al colonii lor pe medii de cultur

Depistarea antigenelor urinare

Depistare simpla, rapida si precoce a Legionella pneumophila serogrup 1.
antigenele apar precoce: la 2 - 3 zile dupa semnele clinice (88 % din cazuri).
Excretie lunga si variabila: de la cateva zile la 2 luni, p. la 1 an
Prezenta Ag nu e influentata de antibioterapie

13

Tratament

Antibiotice eficace: macrolide, fluoroquinolone, tetracicline si rifampicina

nu se recomanda antibiograma in vitro (este intracelulara)

Genul Corynebacterium
1.
II.
III.
IV.
V.
VI.
VII.
VIII.
IX.

Minidefinitie
Incadrare taxonomica
Habitat
Implicare in patologia umana
Microbiologie - principalele caractere si implicatii in patogeneza si
diagnosticul microbiologie
Factori de patogenitate
Patogenie
Raspunsul imun. Notiuni de epidemiologie si profilaxie a infectiilor
Diagnosticul de laborator

cuvinte cheie:

1.

Minidefinitie

Corznebacteriile constrtuie un grup heterogen de bacterii coryneforme cu

caractere morfologice, metabolice si structurale commune, Gram pozitivi (exceptie C.
diphtheriae - Gram pozitivi la limita in culturi vechi; granulatii intens G+)
Sunt bacili drepti sau usor curbati, cu capete frecvent maciucate, segmente
colorate neregulat, aspect barat sau segmentat prin prezena granulaiilor metacromatice
(se coloreaza in rosu cu coloranti albastri) de polimetafosfat.
Uneori apar ca bacili subtiri, usor ascutiti, alteori ovoidali sau cocali.
Asezarea este caracteristic in litere ascutite: V, Y, L, litere chinezesti sau
palisade, rar celule paralele
II.

Incadrare taxonomica

Domeniu: Bacteria;
Phylum: Actinobacteria;
Ordin :Actinomycetales;
Familie: Corynebacteriaceae;

14

Gen: Corynebacterium

III.

Habitat

Corynebacteriile colonizeaz mucoase si tegumente la om si unele animale (cai,

caini, maimute); la om, rezervorul este constituit din bolnavi i purttoribolnavi, purtatori
IV.

Implicare in patologia umana

Clasic:, numai C. diphtheriae, C. ulcerans, C. pseudotuberculosis (fost ovis) erau

implicate n patologia uman.
Forme: de boal erau:
difterie;
- septicemii, endocardite, infectii osteoarticulare - posibil C. diphtheriae
toxigen sau netoxigen, la pacieni imunosupresai, uneori chiar la vaccinati
In prezent si alte specii sunt implicate, la persoane cu deficit imunitar.
Aspecte clinice la alte specii: C. ulcerans- difterie, diphtheria-like, faringite acute,
infectii cutanate, abcese
Difteria este o boala infectioasa acuta cu evolutie endemo-epidemica manifestat
pnn;

Fenomene inf1amatorii locale

Pseudomembrane la nivelul faringelui (diphtheria = membrana)
Tulburari toxice generale datorate exotoxinei
Mortalitate crescuta: aritmie cardiaca datorata miocarditei difterice
Asfixie acuta datorita extinderii membranelor in laringe
Romania 0%000; ultimul caz difterie 1989; ultima tulpina toxigena la CNR1998
reemergenta in 14 din 15 foste state URSS: datorit ratei redusa de vaccinare la
copii, cresterii susceptibilitatii populatiei adulte, insuficientei supravegheri a bolii
si circulatiei agentului patogen

Fenomene locale la nivelul amigdalelor

falsa membrana (Fig. 1) care acopera amigdalele cu un depozit cenusiu, aderent,
care se detaseaza greu, lasand tesuturile sangerande; are tendinta de extindere in
rino-faringe; apare ca raspuns inf1amator la necroza celulara determinata de toxina
difterica eliberata de localizarea bacilului difteric in straturile superficiale ale
mucoasei
adenopatia ganglionilor regionali
edem al tesuturilor locale (gat proconsular) - Fig. 2
fenomene generale (febra 38-39, tahicardie, paloare, dispnee, varsaturi,
hipotensiune)
examenele de laborator indica: leucocitoza, albuminurie
in exudatul recoltat din falsa membrana se identifica prezenta bacilului difteric;
titrul anticorpilor antidifterici la bolnav este :S0,01UI/ml

15

Formele clinice:
- clasic, difteria faringo-amigdaliana
care poate evolua cu extinderea membranei spre
laringe, unde poate determina fenomene locale de tip mecanic (crup difteric)
- rinita difterica
- difteria oculara, pe conjunctiva
- difteria vulvara
- difteria cutanata
- forme atipice la persoane tratate anterior cu antibiotice,sau la persoane care prezinta
un nivel de protectie =O,OlUI/ml
Forme: usoare, medii, grave; uneori forme hipertoxice, cu simptomatologie
exacerbata si evolutie fulminanta.
Agenti cauzali: C. diphtheriae, C. ulcerans (produce o toxina identica imunologie si
ca activitate cu toxina difterica). Producerea de toxina este efectullizogenizarii
tulpini lor C. ulcerans cu fag difteric; este neutralizata de serul antidifteric.
Fenomenele toxice se datoreaza leziunilor produse prin fixarea ireversibila a toxinei
la nivelul tesuturilor specializate (miocard, glande suprarenale, rinichi, muschi netezi,
sistem nervos):
miocardita acuta
tardiv, paralizii post difterice cu localizare pe nervii cranieni (oculomotor, glosofaringian)
polinevrite tardive
paralizii de diafragm
Decesul se produce prin fenomene de miocardita
Fig. 1. Falsa membrana

16

Fig. 2. Gat proconsular n difterie

Fig. 3. Difterie cutanat

v.

Microbiologie - principalele caractere si implicatii in patogeneza si

diagnosticul microbiologie

1896 - Bacillus diphtheriae redenumit C. diphtheriae - Lehman Neuman

C. diphtheriae are rezistenta redusa la temperatura umeda; este omorat in 10' la

temperatura de 60oC. Este, usor distrus de alcool si antiseptice uzuale, rezistent la
uscaciune, poate persista in praf timp indelungat.
n cultura pe mediu Loeffler ferit de lumina si in mediu uscat, bacilul difteric poate fi
mentinut viabil 2-3 luni la temperatura camerei; la temperatura de +4oC viabilitatea
culturii de bacil difteric este foarte redusa; pentru acest motiv, culturile stoc vor fi
mentinute la temperatura camerei in tuburi sigilate.

17

Este sensibil la antibioticele uzuale in special la eritromicina, penicilina,

cloramfenicol, tetraciclina, gentamicina; prezinta insa sensibilitate redusa la
oxacilina; sunt citate cazuri de rezistenta la penicilina (in special C.d. gravis),
tetraciclina, lincomicina, neomicina, trimethoprim, rifampicina
Este sensibil la actiunea bacteriofagilor difterici

Fig. 5. Corynebacterium diphtheriae - morfologie microscopic

Peretele celular
muropeptida care contine meso c.s-acid diaminopimelic;
peptidoglican, arabinogalactan
o componenta avand la baza un glicolipid, un diester al trehalozei care
contine acidul corynemicolic si corynemicolenic - cord factor cu efect
de virulenta si invazivitate, determinata de actiunea locala a germenului
fata de tesuturi.
proteine situate la suprafata considerate antigene termolabile specifice
de tip; antigene K Lantrop; fixarea acestora de peretele celular si rolul
lor in infectie si imunitate nu au fost pana in prezent clarificate
receptori pentru bacteriofagii specifici la exterior
Stratul cel mai intern, reprezentat de membrana plasmatica careia i se
recunoaste o participare activa in producerea de toxina difterica.
Granulele de polifosfat (corpusculii metacromatici Babes-Ernst) - in
interiorul celulei; asezate polar sau subpolar; apar in special in conditii de
anaerobioza si constituie elemente de diagnostic diferential fata de speciile cu
habitat comun.
Material genetic - uneori in genomul bacterian material genetic apartinand
unui fag temperat care determina starea de lizogenie si toxinogeneza.
Pe mediu Loeffler (electiv):
- Bacili Gram pozitivi la limita, 1-8 ~ lungime; 0,3-0,5 ~ grosime

18

Polimorfism accentuat: sinteza neechilibrata mureina in medii cu proteine

serice, n prezenta Fe si fosfati in mediul de cultura, n culturi vechi
Dispozitie: X, Y, V, L
Inegalitate tinctoriala - corpusculi Babes-Emst 1888 - granule polifosfat
(Gram violeti pe fond rosu, AM rosu pe fond albastru); mitis: bacili lungi,
moniliformi; intermedius: bacili lungi, burati; gravis: bacili scurti, mai
uniformi (putine granule)
Aspect cocoidal, ovoidal pe alte medii: Gundel- Tietz, Tinsdale
I.Pe medii solide:
Loeffler:
C.diphtheriae: cultura semicremoasa,granulara; alte specii din genul
Corynebacterium: cultura lucioasa, cremoasa
Gundel- Tietz (geloza-sange-cistina-telurit)
C.diphtheriae varianta gravis (Fig. 6): colonii de 1-2 mm, plate, cu marginile
crenelate, cu striatii radiale, suprafata granulara, consistenta friabila; se emulsioneaza
greu; coloniile sunt negre, cenusii, sau negre cu marginea transparenta; cand colonia
este bine izolata si dezvoltata aspectul ei este de margareta;
Fig. 6. Corynebacterium

diphtheriae varianta

ravis

C.diphtheriae varianta intermedius (Fig. 7) : colonii de marime variabila mijlocii

sau mici, cu diametrul de 0.5-0.75 mm, cu aspect plat si centrul usor mamelonat, cu
margini circulare, cu suprafata granulara sau lucioasa; coloniile sunt negre, iar
marginea lor este mai transparenta.
Fig. 7. Corynebacterium

varianta intermedius

19

C.diphtheriae varianta mitis (Fig. 8) : colonii de marime variabila cu diametrul de

1-2 mm, convexe, cu suprafata lucioasa si consistenta cremoasa; prin invechire
coloniile devin mai plate si suprafata mai granulara.
Aspecte asemanatoare apar si pe alte medii care contin telurit: mediu Hoyle-telurit, sau
McLeod (geloza-sange-telurit).
Fig. 8. Corynebacterium

varianta mitis

Pe mediu cu agar snge (Fig. 9):

Aspecte similare cu cele de pe Gundel- Tietz; caracteristic, coloniile au

culoarea alb-gri perle:
- gravis, colonii margareta, suprafata granulara, friabile
- intermedius, plate,uneori acuminate,margini circulare, suprafata
granulara, consistenta sem icre moasa
- mitis,colonii circulare, convexe, lucioase, consistenta cremoasa
Fig. 9. Corynebacterium

diphtheriae pe mediu cu agar-snge

20

Pe mediu Tinsdale modificat (geloza-ser-cistina-telurit-tiosulfat)

- Fig. 10

Cidiphtheriae indiferent de biotip se dezvolta sub forma de colonii mici,

negru-cenusiu, cu halou cafeniu net bine delimitat; haloul isi intensifica

culoarea dupa 48 ore. Mediul permite diferentierea Cidiphtheriae, Culcerans
si Cpseudotuberculosis de alte specii din cadrul genului Corynebacterium
care sunt inhibate cantitativ pe acest mediu, sau daca apar sunt lipsite de
halou
Fig. 10. Corynebacterium diphtheriae pe mediu Tinsdale

Pe medii lichide
Pe medii lichide
Cdiphtheriae gravis creste cu pelicula, depozit, bulionul ramane limpede
Cidiphtheriae intermedius formeaza inel la suprafata, tulbura usor
mediul,formeaza depozit

21

C.diphtheriae mitis tulbura

C.diphtheriae
se dezvolta pe medii simple de cultura; cresterea este favorizata pe
medii imbogatite cu proteine animale: ser de bou, ou
Temperatura de crestere variaza intre 15 -40C cu optimum 37C.
Se dezvolta in conditii aerobe, dar este si facultativ anaerob
Pattern caracteristic de fermentare zaharuri
Reduce sarurile de telur; telurul metalic incorporat sub forma de cristale in celule
- aspect negru al coloniilor pe medii cu telurit
Cistinaza - eliberare H2S (caracter diferential valoros pe mediu Tinsdale cu sercistina-telurit-tiosulfat:
sulfura de telur, halou cafeniu;
Ureaza si fosfataza negative la C diphtheriae si pozitive la C ulcerans si C

uniform,

produce

depozit

pseudotuberculosis

VI.

Hemolizina activa pe hematii de cobai, iepure, oaie pt. tipurile gravis si mitis; nu
pentru intermedius
Nitrat reductaza; negativ la biotipul belfanti; pozitiv la restul biotipurilor C.
diphtheriae, C. ulcerans si C. pseudotuberculosis
Neudaminidaza, catalaza
Culturi vechi: coproporfirina

Factori de patogenitate

Toxina difteric este o exotoxina produsa de Cdiphtheriae toxigen, secretata in

mediu; nu este eliberata prin liza celulara
Tulpinile de Cdiphtheriae apartinand tuturor tipurilor biochimice si culturale,
produc o toxina unica, universal neutralizata de serul antitoxic antidifteric
preparat cu un antigen unic, anatoxina difterica (obtinuta prin detoxifirea toxinei
difterice in urma actiunii combinate a formolului si caldurii).
Este o toxina puternica dotata cu proprietati toxice specializate:
- dermonecrotica
- produce leziuni degenerative la nivelul miocardului (alterarea mitocondriilor),
- tulburari ale activitatii contractile, tulburari de vascularizatie subendocardica,
acumulare de produse toxice
- produce leziuni degenerative cu staza capilara si hemoragii la nivelul
suprarenalei
- leziuni degenerative ale sistemului nervos

Aspecte genetice
Daca o tulpina Cdiphtheriae netoxigena se infecteaza cu un bacteriofag temperat
acesta se poate integra in cromozomul bacterian iar celula devine lizogena; prin
lizogenizare celula devine rezistenta la actiunea fagului pe care il poarta, sau
fata de oricare fag inrudit antigenic cu acesta.

22

Daca bacteriofagul poarta gena tox+, fenomenul de replicare al ADN-ului viral in

bacterie este insotit de producerea unei proteine eliberata extracelular, toxina
difterica (conversie lizogena reversibila). Producerea toxinei este initiata la 3
minute post infectie fagica si eliberarea extracelulara a toxinei se produce inainte
ca primele particule fagice sa fie eliberate de celula devenita lizogena
La o concentratie redusa de Fe, ciclul de multiplicare al virusului se prelungeste,
fapt care mareste productia de toxina difterica
2.Factori de invazivitate
adezine
cord factor (straturile superficiale care contin acizii corynemicolic si
corynemicolenic) actioneaza la nivelul mitocondrii lor care sunt distruse;
fragmentele ramase nu mai pot asigura evolutia normala a proceselor respiratorii
si fosforilarea
neuraminidaza si hialuronidaza factori necrozanti si de difuziune;
neuraminidaza este prezenta la tulpini Cdiphtheriae toxigene si netoxigene
VII.

Patogenie

Aderenta
Multiplicare Ia poarta de intrare
Toxemie - Desi sunt citate cazuri de difterie produse de Cdiphtheriae netoxigen,
difteria tipica este o toxemie, agentul patogen fiind Cdiphtheriae toxigen.
Evolutia bolii este dependenta de cantitatea si de rapiditatea cu care toxina
difterica difuzeaza in organism;
Numai antitoxina difterica administrata rapid dupa internare, poate influenta
favorabil evolutia bolii.

VIII.

Raspunsul imun. Notiuni de epidemiologie si profilaxie a infectii lor

Difteria - boala infectioasa, acuta, transmisibila, cu declarare obligatorie;

Boala obisnuita in zonele temperate si calde, fiind rara in zonele reci;
In zonele temperate difteria are sezonalitate, cu incidenta redusa primavara - vara
si cu incidenta mai mare toamna si iarna
Forma de raspandire a bolii este faringiana; in tarile calde predomina difteria
cutanata
Pana in 1970 a fost mai frecventa la copii de 5-9 ani; rareori a aparut la copii in
primele luni de la nastere datorita anticorpilor transmisi transplacentar. Poate sa
apara insa la toate varstele, incidenta bolii in ultimii ani deplasandu-se catre
varstele mai mari (adolescenti si adulti) datorita reducerii nivelului de.imunitate
antidifterica la aceste grupe de varsta considerate de risc
Este o boala tipica a colectivitatilor; focarele de difterie apar in special in conditii
de contact strans (familie, internate, case de copii)

23

evolutia este determinata de factori socio-economici si de structura imunologica

a populatiei
sursa de infectie:
- omul bolnav,cu rol epidemiologic limitat pentru ca este depistat si tratat in
primele zile de la internare
- purtatorul sanatos de tulpini C.diphtheriae toxigene, in general asimptomatic
(simptomatic in 20% din cazuri)
- purtatorul convalescent
cazul se anunta telefonic
izolarea obligatorie cu masurile care se impun atat in perioada transportului
cat si in spital
- decontaminare terminala la domiciliu
- prelevarea probelor pentru confirmare bacteriologica si serologica
anterior administrarii tratamentului cu antibiotice si seroterapiei
supravegherea contactilor (de familie, de colectivitate) clinic 7 zile; sunt supusi
examenului bacteriologie si se vaccineaza indiferent de antecedentele vaccinale;
chiar cei cu imunizarea completa vor fi revaccinati, daca intervalul de la ultima
revaccinare depaseste 5 ani
desi nu exista dovezi certe referitoare la eficienta, majoritatea specialistilor
recomanda contactilor apropiati tratament preventiv cu antibiotice, preferandu-se
administrarea penicilinei retard, desi eritromicina este mai eficienta
suspectul de difterie este internat si tratat ca bolnav pana la infirmarea
diagnosticului

IX.

Diagnosticul de laborator

prelevarea probe clinice

. izolarea agentului cauzal si obtinerea acestuia in cultura pura
identificarea tulpinilor izolate care permite
stabilirea diagnosticului de specie
- recunoasterea tipului biochimie,
- capacitatea de a produce toxina difterica
La bolnav /suspect:
- in difteria amigdaliana se recolteaza 3 tampoane din falsa membrana (prin detasarea
unei portiuni din falsa membrana sau din depozitele aderente de pe amigdale) si 1 tampon
cu exudat nazal
- in celelalte forme clinice, se recolteaza trei tampoane din leziunile primare: exsudat din
rinita difterica sau secretie purulenta oculara, vulvara, otica. Intrucat leziunea din difteria
cutanata nu se deosebeste uneori de piodermite, tampoanele vor fi recoltate din fiecare
plaga sau leziune cutanata de la suspectul de difterie sau de infectie difterica. In cazul
oricarei localizari, este insa obligatorie si investigarea cavitatii nazale si faringiene
La purtator: se recolteaza exudat faringian si nazal
Prelevarea produsului patologic se efectueaza simultan la toti contactii din
colectivitate; nu necesita alte recomandari fata de metoda de recoltare clasica.

24

Este necesara insamantarea rapida pe mediile specifice. In absenta materialelor necesare,

se recomanda transportul probelor la un laborator de bacteriologie in maximum 2 ore de
la prelevare
Medii de imbogatire: OST (Ou, Ser, Telurit), pentru mentinerea viabilitatii germeni lor 45 ore, sau alte medii de transport (Amiens, mediul Stuart)
La bolnav:
tampoanele prelevate din falsa membrana:
descarcare pe mediul Tinsdale si pe geloza sange
- imbogatire prin introducere in mediu OST
- frotiu colorat Gram
tamponul cu exudatul nazal se introduce in mediul OST
Examen microscopic direct din produs:
Frotiul: permite evidentierea bacililor suspecti Gram pozitiv la limita, flora
polimorfa sau prezenta fuzospirililor (angina Plaut Vincent); procura date pentru
un diagnostic prezumptiv de suspiciune de C.diphtheriae
Mediile insamantate

sunt incubate 24-48 ore la temperatura

de 370 C

a. Geloza- sange - valoare:

caracterele morfologice coloniale
diagnostic diferential cu faringo-amigdalitele
streptococice sau infectiile mixte.
unele tulpini de C.diphtheriae sunt sensibile la tel urit de potasiu, putand fi
inhibate de medii care contin acest ingredient
b. Mediu Tinsdale: colonii negre cu halou cafeniu net, bine delimitat
- frotiul efectuat din colonii este obligator pentru a elimina confuzia cu unele specii de
stafilococ
c. Insamantarea tamponului faringian si nazal imbogatit in OST pe mediul Tinsdale
La purtator:
Tampoanele prelevate din nas si gat - mediul de imbogatire O.S.T.
Incubare 24 ore la 37C,
Descarcare pe mediul Tinsdale - aparitia coloniilor negre cu halou cafeniu net,
bine delimitat dupa incubare 24-48 ore la 37C, indica suspiciunea de

C. diphtheriae.
Identificare
Caractere morfotinctoriale
Caractere de cultura
Teste biochimice:
testul cistinazei,
testul ureazei,
toxinogeneza
Lizotipie

Toxigeneza

25

Testarea curenta "in vitro" prin testul Elek, test de imunodifuzie rapid, simplu,
precis.
Rezultatele la 24-48 ore de incubare la 37C.
Test pozitiv: Aparitia unor linii de precipitare in unghiul format de cultura insamantata si
de antitoxina (sant care contine ser antidifteric) Cdiphtheriae/Culcerans toxigen.
Tulpini de referinta: Cdiphtheriae toxigen, slab toxigen, netoxigen

Alte teste pentru determinarea toxinogenezei:

- testul" in vivo pe cobai, metoda recomandata numai pentru diagnosticul unor
tulpini Cdiphtheriae incerte si numai la nivelullaboratorului National de Referinta
- metode moleculare pentru depistarea genei tox+(PCR), metoda utilizata in
situatia unor tulpini Cdiphtheriae incerte sau netoxigene
Fig. 11. Testul Elek

Lizotipia
Metoda conventionala pentru determinarea tipurilor fagice la Cdiphtheriae
Realizata in cadrullaboratorului National de Referinta si numai in scop
epidemiologic.
Are la baza fenomenele de lizogenie si de specificitate a receptori lor fata de
anumiti bacteriofagi.
Folosind schemele de tipizare (originala si aditionala), lizotipia stabileste sursa de
infectie, delimiteaza focarul si relatiile dintre focare, indica tipul epidemiogen.
In perioadele interepidemice, metoda este utila pentru stabilirea unor tipuri fagice
in cadrul unui biotip de Cdiphtheriae predominant in teritoriu

Metode moleculare
Permit studiul genomului bacterian pt. tipizare si detectie gena tox:
- PCR
digestie prin enzime de restrictie
migrare electroforetica in gel;

Ribotipia (ARN ribozomal 16 si 23S) poate discrimina tulpinile de Cdiphtheriae

in cadrul aceluiasi lizotip
Profilul de macrorestrictie in camp pulsator diferentiaza tulpinile in cadrul
aceluiasi ribotip

26

Distanta genetica dintre tulpinile presupuse cu relatie epidemiologica (calculata

pe baza acestor doua metode) da informatii privind clonalitatea tulpini lor
circulante dintr-un areal
Studiul molecular (RFLP) al unei regiuni de interes epidemiologic, detecteaza
diferente de un nucleotid in secventa genomului a doua tulpini apartinand
aceluiasi taxon

27