Sunteți pe pagina 1din 41

Introducere

n situaia politic i economic actual ne confruntm cu creteri necontrolate ale


preului ieiului i a altor resurse energetice naturale. Criza de energie mondial, accentuat
de modificrile climatice, au reprezentat un semnal de alarm i au generat n rndul
comunitilor tiinifice internaionale dezbateri care au avut drept scop identificarea de noi
tehnologii pentru obinerea biocombustibililor pe cale natural.
Energia din biomas poate fi extras prin incinerare direct (n special biomasa
forestier), ns nu orice fel de biomas este combustibil. Biomasa proaspt recoltat are un
grad de umiditate ridicat i caliti de combustie foarte sczute. Astfel de biomas poate fi
fermentat, obinndu-se produi de fermentaie combustibili (etanol, metan), care se mai
numesc i biocombustibili, datorit provenienei lor. Printre avantajele conversiei biomasei la
biocombustibili se numr faptul c spre deosebire de incinerare, n urma crui proces se
poate obine doar energie termic i/sau electric (care se poate stoca foarte greu pn la
momentul utilizrii), biocombustibilii se pot stoca, teoretic, timp nelimitat i pot fi utiliza i n
echipamente variate, att n transporturi, ct i pentru producerea de energie termic sau
electric, sau ca materii prime n industria chimic (biorafinrie).
n prezent, n lume, numeroi cercettori au activiti de cercetare dezvoltare n
domeniul folosirii biomasei microbiene, vegetale i animale pentru a produce energie. Ei au
demonstrat c din biomas se pot obine biocombustibili. Nu din biomas valoroas (care
poate servi ca furaje sau alimente), ci din biomas nevaloroas, subproduse din agricultur sau
industrie, dejecii sau deeuri, care constituie o povar pentru mediul nconjurtor. n acest
mod, astfel de tehnologii nu numai c produc biocombustibili, care pot nlocui combustibilii
fosili, ci protejeaz i mediul, dar mai mult, nu concureaz consumatorul uman n ceea ce
privete materiile prime. Din aceste cauze se promoveaz cercetrile n ceea ce privete
obinerea de biocombustibili din biomas lignocelulozic (paie, coceni, plante nefurajere i
nealimentare etc) sau din dejecii i deeuri (gunoi de grajd, ape uzate, gunoaie oreneti,
deeuri industriale etc). Aceti biocombustibili au fost denumii biocombustibili de generaia
a doua.
n cadrul cercetrilor doctorale am abordat biotehnologia obinerii biocombustibililor
din biomas lignocelulozic (BLC). Ca surs de BLC am folosit culturi energetice ca
Miscanthus giganteus sau Sorghum bicolor, care conin substane direct fermentescibile, sau
care conin biopolimeri (celuloz) ce pot fi hidrolizai la molecule mai simple (glucoz),
direct fermentescibile cu ajutorul diferitelor microorganisme la etanol sau metan. Obiectivul
central al cercetrilor const n aplicarea integrat a diferitelor biotehnologii, n scopul
obinerii de biocombustibili de generaia a doua din biomas lignocelulozic.

Cap.1. Biomasa lignocelulozic materie prim pentru


producerea de enzime celulozolitice i zaharuri fermentescibile
Mare parte din biocombustibilii produi n ziua de azi provin din culturi alimentare sau
furajere, care ridic o serie de probleme, cum ar fi periclitarea securitii alimentare.
Biocombustibilii de generaia a II-a, lignocelulozici, ar putea evita astfel de probleme.
Biomasa lignocelulozic poate fi obinut prin cultivarea plantelor energetice pe terenuri de
slab calitate, sau pe substrat poluat, impropriu pentru cultivarea plantelor alimentare. O
plant capabil s utilizeze astfel de substraturi i s furnizeze o cantitate ridicat de biomas
este Miscanthus giganteus.
n Romnia, sute de mii de hectare nu sunt cultivate sau sunt poluate i nu se preteaz
pentru culturi convenionale. Aceste terenuri pot fi folosite pentru a cultiva acest tip de plante
energetice, ca materie prim pentru producerea de combustibili.
Biomasa lignocelulozic agricol se preteaz mai bine la procesul biotehnologic de
zaharificare dect biomasa lemnoas, datorit structurii mai moi, coninutului sczut de
lignin i cristalinitii sczute a celulozei. Glucoza i xiloza sunt principalele monozaharide
eliberate prin hidroliza biomasei lignocelulozice. Aceste monozaharide pot fi fermentate la
etanol, metan, sau ali biocompui cu ajutorul microorganismelor (Lange 2007, Lynd 1996).
Hidroliza lignocelulozei la glucide fermentescibile pare a fi principala etap din
procesul de conversie al biomasei, care ridic costul de producie al etanolului lignocelulozic.
Datele din literatur indic faptul c, costul celulazelor reprezint aproximativ 20% din costul
total de producie al etanolului lignocelulozic (Wingrem 2003, Sassner 2007). Din aceast
cauz, eforturile majore se ndreapt spre reducerea costurilor legate de enzimele necesare
hidrolizei biomasei.
Una dintre variantele mai fezabile, din punct de vedere economic, a folosirii enzimelor
celulozolitice pentru hidroliza biomasei lignocelulozice este folosirea ntregului mediu de
fermentaie, brut, obinut din culturi de fungi celulozolitici, fr a mai aplica procese de
separare, concentrare sau altele, care ridic costul de producie al celulazelor.
Studiile arat c, spre deosebire de procedeul clasic, n care celulazele purificate i
stabilizate sunt achiziionate de la un productor la preuri ridicate, producerea celulazelor in
situ (ca etap distinct n procesul de producie al etanolului lignocelulozic) poate reduce cu
mult costurile, care ar putea ajunge la aproximativ 8% din totalul costurilor de producere a
bioetanolului (Sanchez 2007, Merino 2007, Barta 2010).

Figura.1.1. Procesul de producere a bioetanolului cu etapa de producere de


celulazelor (Vintil T., 2013)
La nivel industrial, cele mai folosite microorganisme pentru producerea enzimelor
celulozolitice sunt Trichoderma i Aspergillus. Parte din biomasa care este folosit pentru
producerea de etanol, poate fi folosit pentru producerea de celulaze, utilizate n hidroliza
enzimatic insitu. n acest context, studierea parametrilor de fermentaie, pentru a obine o
producie ct mai mare de celulaze, este un pas esenial n dezvoltarea unui sistem industrial
de producere a celulazelor.
Pentru a putea evalua posibilitatea de a produce celulaze in-situ, au fost derulate o
serie de experimente n care au fost studiai parametrii de fermentaie n bioprocese unde s-a
folosit Miscanthus giganteus ca substrat pentru producerea de enzime celulozolitice.

1.1. Stabilirea parametrilor de biosintez a celulazelor fungice avnd ca


substrat biomas de Miscanthus giganteus
1.1.1. Materiale i metode
n prima etap a cercetrilor am studiat parametrii optimi de bioproces necesari pentru
producerea enzimelor celulozolitice, cu ajutorul tulpinii Trichoderma longibrachiatum
CMIT36, din colecia de microorganisme industriale a universitii.
Parametrii studiai, pentru culturile n mediu lichid sunt:
1. Concentraia substratului, 0,5 4%.
2. Concentraia inoculului, suspensii de spori cu densiti optice ntre 0,33 i 0,96.
3. Viteza de agitare, 120 180rpm.
4. pH, 4 6.
5. Umiditatea, ntre 60 i 80%, pentru culturile n mediu solid.
Pentru prepararea inocului au fost utilizate culturi sporulate n plci cu mediu PDA.
Suspensile de spori a fost obinut prin splarea culturii cu mediu Mandels i raclare gentil,
folosind anse de nsmnare de unic folosin. Suspensia a fost diluat corespunztor i
folosit ca inocul.
3

Mediul Mandels are urmtoarea compoziie: KH2PO4 0.2%, (NH4)2SO4 0.14%, MgSO4
x 7H2O 0.03%, CaCl2 x 2H2O 0.04%, uree 0.03%, pepton 0.03%, tween 80 0.05%, FeSO4 x 7
H2O sol. 5 mg % 1 ml, ZnSO4 x 7 H2O sol. 1.4 mg % 1ml, MnSO4 x 7 H2O sol 1.56 mg % 1
ml, CoCl2 sol 2 mg % 1 ml. Sterilizarea se face la 121C timp de 20 minute.
Pretratarea biomasei
Biomasa mcinat a fost introdus n pahare Erlenmeyer, umectat cu soluie NaOH
2%, n proporie de 6:1 lichid solid, i autoclavat la 120C timp de 30 minute. Biomasa
astfel pretratat a fost ulterior splat i neutralizat pna la un pH de 5 5,5. Volumul de ap
folosit pentru splare este de aproximativ 12 ori mai mare dect cantitatea iniial de biomas.
Producerea celulazelor n sistem submers (SLC)
n flacoane Erlenmeyer de 300 ml s-au introdus 50 ml mediu Mandels i 2% biomas
mcinat de Miscanthus, ca surs de carbon i substrat pentru producerea de celulaze. Acest
amestec a fost inoculat cu 10% suspensie de spori. Ca prob martor s-a folosit mediu Mandels
cu celuloz Avicel PH101, ca surs de carbon i substrat pentru obinerea de celulaze. Mediile
inoculate au fost incubate ntr-un incubator cu agitare. n timpul fermentrii s-au prelevat
probe pentru a determina activitatea enzimatic, prin metodele FPU i CMC.
Producerea de celulaze prin fermentaie n substrat solid (SSC)
Substratul celulozic, biomasa de miscantus pretratat, a fost introdus n flacoane
Erlenmeyer de 300 ml, n straturi de 1cm grosime(50 ml sau 13 g). Flacoanele au fost
autoclavate la 121C timp de 30 minute, pentru a asigura sterilitatea mediului de fermentaie.
Mediul Mandels a fost adugat n mod aseptic peste biomasa steril i s-a fcut inocularea cu
suspensie de spori. n cazul fermentaiei n substrat solid singurul parametru de bioproces
studiat este umiditatea, ceilali parametrii au fost studiai anterior de ctre echipa noastr
(Vintil, 2009).
Metode de analiz
Metoda FPU se aplic pentru determinarea cantitiv a celulazelor folosind ca substrat
hrtia de filtru. ntr-o eprubet se pipeteaz 1ml tampon citrat 0,05M, pH 4,8. Se adaug
0,5ml enzim (diluat n tampon citrat). Se recomand folosirea mai multor diluii, pentru o
acuratee mai bun a rezultatelor. Se nclzete la 50C, se adaug fii de hrtie de filtru
Whatman No.1 (1x6 cm). Se incubeaz 60 min la 50C. Se adaug 3 ml DNS (acid
dinitrosalicilic) i se agit. Eprubetele se introduc ntr-o baie de ap la fierbere 5 minute. Se
adaug 20ml ap distilat i se omogenizeaz. Dup 20 minute, solu ia din eprubete se
transfer n cuve de spectrofotometru i se msoar absorbana la 540nm.
Calculul activitii enzimatice se face dup urmtorii pai. Se construiete o curb de
etalonare cu o soluie stoc de glucoz (2 mg / ml glucoz anhidr), n 5 diluii diferite:
1 ml +0.5 ml tampon citrat = 1:1,5 = 6,7 mg / ml (3,35 mg / 0,5 ml)
1 ml +1.0 ml tampon citrat = 1:2 = 5 mg / ml (2,5 mg / 0,5 ml)
1 ml +2.0 ml tampon citrat = 1:3 = 3,3 mg / ml (1,65 mg / 0,5 ml)
1 ml +4.0 ml tampon citrat = 1:4 = 2 mg / ml (1 mg / 0,5 ml)
Se construiete curba de etalonare folosind cantitile absolute de glucoz (mg / 0,5
ml) raportate la A540.
4

Cu ajutorul acestei curbe se transform absorbana obinut n eprubetele cu reac ie


enzimatic n glucoz.
Se transform diluiile folosite n concentraie enzimatic. Dup care se aplic formula
de calcul
FPU = mg glucoz eliberat x 0,185.
unde,
1 mg glucoz = 1 / 0,18 x 0,5 x 60 micromoli -1 ml-1 substrat hidrolizat
= 0,185 uniti ml -1.
O unitate internaional (UI) de enzim este definit ca i cantitatea de enzim ce
elibereaz 1 micromol de glucide reductoare / minut, n condiiile de reacie standard.
Metoda CMC se aplic pentru determinarea activitii endoglucanazice a enzimelor.
Substratul folosit este carboximetil celuloz CMC 7L2 n tampon citrat 0,05M, pH 4,8.
ntr-o eprubet se pipeteaz 0,5ml enzim, diluat n tampon citrat. Se recomand
folosirea mai multor diluii. Se nclzete la 50C. Se adaug 0,5ml soluie substrat (CMC n
tampon citrat), se amestec bine i se incubeaz timp de 30 minute la 50C. Eprubetele se
introduc ntr-o baie de ap la fierbere 5 minute. Se adaug 20ml ap distilat i se
omogenizeaz. Dup 20 minute, soluia din eprubete se transfer n cuve de spectrofotometru
i se msoar absorbana la 540nm.
Calculul activitii enzimatice se face dup urmtorii pai. Se construiete o curb de
etalonare cu o soluie stoc de glucoz (2 mg/ml), n 5 diluii diferite:
Nediluat
= 2 mg/ml (1 mg/ 0,5 ml)
1 ml +0.5 ml tampon citrat = 1:1,5 = 1,33 mg/ml (0,67 mg/ 0,5 ml)
1 ml + 1 ml tampon citrat = 1:2 = 1,0 mg/ml (0,5 mg/ 0,5 ml)
1 ml + 2 ml tampon citrat = 1:3 = 3,3 mg/ml (1,65 mg/ 0,5 ml)
1 ml + 3 ml tampon citrat = 1:4 = 0,5 mg/ml (0,25mg/0,5 ml)
Se construiete curba de etalonare folosind cantitile absolute de glucoz (mg / 0,5
ml) raportate la A540.
Cu ajutorul acestei curbe se transform absorbana obinut n eprubetele cu reac ie
enzimatic n glucoz.
Se transform diluiile folosite n concentraie enzimatic. Dup care se aplic formula
de calcul
CMC = mg glucoz eliberat x 0,37
unde,
1 mg glucoz = 1 / 0,18 x 0,5 x 30 micromoli -1 ml-1 substrat hidrolizat
= 0,37 uniti ml -1.
Tamponul citrat 0,05M are urmtoarea compoziie, pentru 100ml: 20,5ml soluie acid
citric 0,1M; 29,5 soluie citrat de sodiu 0,1M; 50ml ap distilat. Pentru a-l aduce la un pH de
4,8 se adaug, fie citrat de sodiu, fie acid citric, n funcie de pHul iniial.
1.1.2. Rezultate i discuii
n ceea ce privete biosinteza enzimelor celulozolitice n sistem SLC rezultatele
obinute arat c concentraia de substrat are o influen direct asupra producerii de enzime
de ctre tulpina T. longi. Cea mai bun activitate enzimatic, exprimat n FPU, s-a obinut n
5

mediul de cultur coninnd 4% biomas, ca substrat celulozic (fig.1.2). Concentraia de


substrat nu a putut fi crescut mai mult de 4% pentru a evita creterea vscozitii mediului de
cultur.

Fig.1.2. Cinetica activitii enzimatice a tulpinii T.longi cultivat n sistem SLC n


medii cu diferite concentraii de substrat
Raportul de inoculare este un paramentru important care are un efect direct asupra
procesului de producere a celulazelor de ctre fungi din genul Trichoderma. n cazul tulpinii
T. longibrachiatum CMIT36 un raport de inoculare de 5%, cu o suspensie de spori cu
densitatea optic de 0,5, este cel potrivit pentru iniierea unui bioproces cu productivitae
ridicat de enzime celulozolitice. (fig.1.3).

Fig.1.3. Cinetica activitii enzimatice a tulpinii T.longi cultivat n sistem SLC n


medii cu diferite concentraii ale inoculului
Fungi din genul Tricoderma sunt organisme productoare de micelii,aerobe, astfel,
concentraia de oxigen dizolvat n mediul de cultur poate avea un impact direct asupra
cineticii producerii de enzime. n cazul fermentaiilor de laborator, n flacoane de sticl,
concentraia poate fi sporit prin creterea vitezei de agitare. ns, aceste microorganisme au
tendina s se adune i s formeze aglomerri, la turbulene mari a mediului de cultur. Acest
fenomen reduce suprafaa de contact dintre hife, nutrieni i oxigen, sczndu-le astfel
productivitatea. Aeraia este influenat i de cantitatea de miceliu din cultur. Lund aceti
factori n considerare am studiat productivitatea fungilor la diferite viteze de agitare mpreun
cu dou rate de inoculare diferite. Dup cum se poate vedea n fig.1.4., rezultatele cele mai
bune s-au obinut la o rat de inoculare de 5% i o vitez de agitare de 180 rpm.

Fig.1.4. Efectele vitezei de agitare i a ratei de inoculare asupra cineticii producerii


enzimelor

n ceea ce orivelte efectul pH-ului mediului de cultur asupra producerii de enzime


celulozolitice, rezultatele din figura 1.5. indic faptul cp la pH 5,5, tulpina testat are
acticitatea celulozolitic maxim.

Fig.1.5.Efectele pHului mediului de cultur asupra cineticii producerii enzimelor

n ceea ce privete culturile n substrat solid, datele din fig.1.6. arat activitatea
enzimatic celulozolitic detectat per gram de substrat cultivat cu T. Longibrahiatum
CMIT36.

Figura 1.6. Efectul umiditii asupra producerii de enzime celulozolitice din culturi fungice,
n substrat solid
Cinetica producerii enzimelor arat c producia de endoglucanaze este mai mare n
culturile n substrat solid constnd din miscantus umectat cu suspensie de spori cu o umiditate
de 60%. De asemenea, datele arat c, cantitatea cea mai mare de endoglucanaze este produs
n prima parte a procesului de incubare. Se observ c, n cazul procesului desfurat n
condiiile descrise mai sus, T. longibrahiatum produce un titru mai mare de endoglucanaze
dect de celulaze. n ambele cazuri, o umiditate de 60% a mediului solid duce la cea mai mare
activitate enzimatic. Cea mai mare concentraie de celulaze, 2FPU/g substrat, a fost obinut
prin incubarea acestei tulpini timp de 10 zile n sistem SSC.
O comparaie a titrului de enzime produs n sistem SSC i SLC, folosind miscantus ca
substrat, arat c n sistem SSC se obine un titru mai mare de enzime dect n sistemelele
SLC, dar, dup extracia enzimelor din substratul solid cu lichid de splare, concentraia
acestora n lichidul de splare este comparabil cu concentraia enzimelor din mediul lichid
obinut n sistem SLC.

1.2. Evaluarea capacitii de hidroliz a biomasei cu ajutorul celulazelor


1.2.1. Materiale i metode
Ca substrat pentru cultivarea fungilor celulozolitici i producerea de enzime am folosit
biomas lignocelulozic provenit din ntreaga plant Miscanthus sinesis giganteus. Acest
hibrid triploid, steril a fost cultivat n zona Copa Mic, Sibiu, o zon poluat chimic, cu
pmnt bogat n cadmiu i plumb. Concentraia de metale grele din partea aerian a plantei a
fost raportat anterior (Pavel, 2009, Barbu, 2009).
9

Tabelul.1.1. Carcateristicile principale ale pmntului poluat, folosit pentru cultivarea


miscantusului (Pavel, 2009)
Adncime
pH
P2O5
K2O
Pb
Cd
(cm)
mg/kg
mg/kg
mg/kg
mg/kg
0-20
5,2
110
460
682,5
13,47
20-40
5,3
73
361
492,5
10,23
40-60
6,2
88
301
67,5
4,67
Tabelul.1.2. Concentraia de metale grele n diferite prti ale plantei(Pavel, 2009, Barbu,
2009)
Sectiunea plantei
Pb mg/kg
Cd mg/kg
Frunze
6,48
3,73
Tulpin
5,03
2,98
Rizom
483,3
7,54
Compziia biomasei, folosit ca materie prim, este detaliat n tabelul 1.3. Aceste
valori au fost prezentate n studii anterioare.

Tipul
de
biomas
Paie de gru
Coceni
de
porumb
Miscanthus

37,6
37,5

Tabelul.1.3. Compoziia biomasei (Vintil, 2010)


Hemiceluloz Lignin (%)
Protein
Cenu (%)
(%)
brut (%)
28,8
15,8
3,7
6,1
26,4
18,5
4,8
6,0

43,5

25,8

Celuloz (%)

15,4

3,5

2,4

Biomasa a fost uscat n aer liber i mcinat cu o moar cu ciocane, la dimensiunea


teoretic de 2 mm. Ca celuloz standard am folosit Avicel PH101.
Microorganisme i propagare
Sporii micotici sunt pstrai n Colecia de Microorganisme Industriale din Timioara
(CMIT), aparinnd Facultii de Zootehnie i Biotehnologii, prin criogenare la -70C n
soluie de glicerol 16%, ca agent crioprotector. Microorganismele folosite sunt:
a.) Trichoderma longibrachiatum CMIT36, obinut de la D.S.M.Z. Germany, unde este
pstrat ca T. longibrachiatum DSM 769 (alt denumire: T. reesei ATCC26921,
numit iniial T. reesei Simons), este un mutant al T. viride Persoon, sau QM 9123
(ATCC24449), cunoscut i ca QM 9124.
b.) Trichoderma viride ATCC- 13.631;
c.) Trichoderma viride CMGB1, obinut de la Universitatea din Bucureti, Facultatea de
Biologie;
d.) Aspergillus niger CMIT3.8, izolat din rumegu de pin mucegit;
e.) Aspergillus oryzae CMIT3.12, obinut de la Universitatea din Bucureti, Facultatea
de Biologie
Plci cu mediu agarizat PDA au fost inoculate cu suspensii de spori i au fost incubate
timp de 5 zile la 30C.

10

Evaluarea activitii enzimatice a celulazelor


Au fost evaluate activitiile ctorva enzime celulozolitice comerciale i a enzimelor
produse in-situ. Biomasa hidrolizat a fost miscanthus, paie de gru i coceni de porumb.
Toate cele trei tipuri de biomas au fost pretratate conform procedurii amintite anterior, n
subcapitolul 1.1. Enzimele comerciale sunt provenite de la Novozyme i sunt notate astfel:
22086, 22119, 22118, 22083. Cantitatea folosit este cea recomandat de productor.
Hidroliza s-a fcut n condiii sterile la temperatura de 50C timp de 60 de ore, la o
valoare a pHului de 5. Probe au fost recoltate la fiecare 12 ore pentru a putea determina
valoarea glucidelor reductoare prin metoda DNS. Scopul este de a compara producia de
glucide care se poate obine din biomas pretratat i hidrolizat provenit din miscanthus
(mai puin studiat) cu producii obinute la plante mai studiate, paie i coceni.
Metode de analiz
S-au folosit dou metode de determinare (Chose, 1987, Sohail, 2009) folosind ca
substrat CMC pentru endoglucanaze i hrtie de filtru pentru celulazele de zaharificare.
Metoda FPU determin activitatea celulazelor prin intermediul hrtiei de filtru. ntr-o
eprubet se pipeteaz 1ml tampon citrat 0,05M, pH 4,8. Se adaug 0,5ml enzim (diluat n
tampon citrat). Se recomand folosirea mai multor diluii, pentru o exactitate mai mare a
rezultatelor. Se nclzete la 50C, se adaug hrtia de filtru Whatman No.1 (1x6 cm). Se
incubeaz 60 min la 50C. Se adaug 3 ml DNS (acid dinitrosalicilic) i se agit. Se fierbe
eprubeta exact 5 minute. Se adaug 20ml ap distilat i se omogenizeaz. Dup 20 de minute
soluia din eprubet se msoar la 540nm cu spectrofotometru.
Metoda CMC determin activitatea carboximetil celulatelazelor pentru endoglucanaze.
Substratul folosit este carboximetil celuloz CMC 7L2 n tampon citrat 0,05M, pH 4,8.
ntr-o eprubet se pipeteaz 0,5ml enzim, diluat n tampon citrat. Se recomand
folosirea mai multor diluii. Se nclzete la 50C. Se adaug 0,5ml soluie substrat, se
amestec bine i se incubeaz timp de 30 minute la temperatura dat. Se fierbe eprubeta timp
de 5 minute dup care se adaug 20 ml ap distilat, se omogenizeaz i se las la rcit.
Soluia se msoar cu spectrofotometru la 540nm.
Tamponul citrat 0,05M are urmtoarea compoziie, pentru 100ml: 20,5ml soluie acid
citric 0,1M; 29,5 soluie citrat de sodiu 0,1M; 50ml ap distilat. Pentru a-l aduce la un pH de
4,8 se adaug, fie citrat de sodiu, fie acid citric, n funcie de pHul iniial.
Cantitatea de glucide reductoare a fost determinat prin metoda DNS. O unitate
internaional (UI) de enzim este definit ca i cantitatea de enzim ce elibereaz 1mol de
glucide reductoare/ minut, n condiii standard.
Metoda DNS determin cantitatea de glucide simple din mediul de hidroliz. ntr-o
eprubet se pipeteaz 0,5ml prob de determinat, se adaug 1ml DNS i se agit. Se fierbe
timp de 5 minute dup care se aduce la 10ml cu ap distilat, se adaug 8,5 ml. Soluia este
msurat la spectrofotometru la 540nm. Denstitiile optice astfel citite se transform n mg
glucide/ ml mediu cu ajutorul unei curbe de etalonare n 6 puncte ntre 0 1000
micrograme/ml.

11

1.2.2. Rezultate i discuii


n prima parte a experimentului am studiat capacitatea fungilor de a produce celulaze
prin fermentaie n mediu lichid. S-a determinat activitatea enzimatic prin metodata CMC,
FPU. Activitatea celulazelor este exprimat diferit, n funcie de substratul folosit. Pentru
metoda FPU activitatea este exprimat n uniti de hrtie de filtru aceasta denot activitatea
celulazelor de zaharificare. Dac CMC (carboxymetilceluloz) este substratul, activitatea este
exprimat n endoglucanaze.
Activitatea enzimatic determinat prin metoda CMC este redat n tabelul 1.4. i
figura 1.6. Datele arat c tulpinile T. longibrachiatum, cocultura T. longibrachiatum i A. niger,
i cocultura T. viride ATCC i A. niger au cea mai mare activitate. Ct despre substrat se
observ c biomasa lignocelulozic agricol, ce nu presupune costuri foarte ridicate, poate
servi pentru producia de enzime la nivel nalt. Cantitatea de enzime produs este mai mare n
mediile de fermentaie unde s-a folosit Miscanthus giganteus ca substrat dect n mediile unde
s-a folosit celuloz pur, scump, pentru a induce biosinteza enzimelor celulozolitice. Ba
chiar mai mult, coculturile de Trichoderma longibrachiatum i Aspergillus niger au produs
endoglucanaze doar n mediile cu Miscanthus giganteus ca substrat, nu i n cele unde s-a
folosit celuloz pur.
Tabelul.1.4.Activitea enzimatic (endoglucanaze) a fungilor testai
Cod
CMC, CMC, CMC, CMC, CMC,
Ziua 2 Ziua 4 Ziua 6 Ziua 8 Ziua 10
T.longibrahiatum + Miscanthus
1
0
1,52
2,80
2,87
2,87
T.longibrahiatum + Avicel
2
0
0,56
2,25
2,51
2,69
T.longibrahiatum + A.oryzae +
3
0
0
0,09
0,16
0,31
Mischantus
T.longibrahiatum + A.oryzae + Avicel
4
0
0
0
0
0,16
T.longibrahiatum + A.niger +
5
1,15
2,47
2,32
2,29
2,29
Mischantus
T.longibrahiatum + A.niger + Avicel
6
0
0
0
0
0,05
T. viride ATCC + Miscanthus
7
0
0
0
0
0,20
T. viride ATCC + A.oryzae +
8
0
0
0
0
0,01
Miscanthus
T. viride ATCC + A. niger +
9
1,00
3,13
2,36
2,36
2,36
Miscanthus
T.viride CMGB + Mischantus
10
0,38
1,63
1,33
1,33
1,33
T.viride CMGB + A.oryzae +
11
0,27
1,48
1,22
1,22
1,22
Mischantus
T.viride CMGB + A.niger +
12
0
1,15
1,15
1,19
1,19
Mischantus
A.oryzae + Miscanthus
13
0
0,60
2,51
1,04
0,82
A.niger + Miscanthus
14
1,26
2,87
1,59
1,48
1,48

12

Fig.1.7. Activitatea endoglucanazic a fungilor testate (uniti/ml lichid de cultur)


Tabelul.1.5. Activitatea FPU a fungilor testai (valorile reprezint FPU/ml mediu de cultur)
Cod
FPU,
FPU, FPU, FPU,
FPU,
Ziua 2 Ziua 4 Ziua 6 Ziua 8 Ziua 10
T.longibrahiatum + Miscanthus
1
0
0,01
0,67
0,78
0,82
T.longibrahiatum + Avicel
2
0
0
1,30
2,14
3,35
T.longibrahiatum + A.oryzae +
3
0
0
0,01
0,06
0,09
Mischantus
T.longibrahiatum + A.oryzae + Avicel
4
0
0
0
0
0
T.longibrahiatum + A.niger +
5
0,27
0,56
0,56
0,78
0,78
Mischantus
T.longibrahiatum + A.niger + Avicel
6
0
0
0
0
0
T. viride ATCC + Miscanthus
7
0
0
0
0
0,09
T. viride ATCC + A.oryzae +
8
0
0
0
0
0
Miscanthus
T. viride ATCC + A. niger +
9
0,49
0,56
0,56
0,75
0,78
Miscanthus
T.viride CMGB + Mischantus
10
0
0
0
0,01
0,01
T.viride CMGB + A.oryzae +
11
0
0
0
0
0,01
Mischantus
T.viride CMGB + A.niger +
12
0
0
0
0
0,01
Mischantus
A.oryzae + Miscanthus
13
0
0
0
0
0
A.niger + Miscanthus
14
0
0,53
0,56
0,60
0,75

13

Fig.1.8. Activitatea FPU a fungilor testate (FPU/ml lichid de cultur)


Datele din fig.1.8. reprezint activitatea FPU a tulpinilor testate. Rezultatele arat c
tulpinile cu activitatea endoglucanazic cea mai ridicat prezint, de asemenea, i
productivitatea cea mai mare de celulaze. Pe lng variantele experimentale amintite mai sus,
i varianta cu Aspergillus niger cultivat pe Miscanthus giganteus ca substrat, poate fi trecut
n grupa celor cu un bioproces cu randament ridicat.
Pentru a evalua productivitatea celulazelor, culturile lichide cu cea mai mare activitate
enzimatic i enzimele celulozolitice comerciale au fost folosite pentru a hidroliza cele trei
tipuri de biomas: miscanthus, coceni de porumb i paie de gru.
n urma hidrolizei s-a constant c celulazele produse in-situ, cu ajutorul fungilor, pot
produce mai multe glucide fermentescibile dect unele din enzimele comerciale. Tabelul i
graficul de mai jos evidenieaz acest lucru.

Nr.

Prob

1
2
3
4
5
6
7
8
9

Misc. + enz 1
Misc + enz 2
Misc + enz 9
Misc + enz 14
Misc + 22086
Misc + 22119
Misc + 22118
Paie + 22086
Paie + 22119

Tabelul.1.6. Producia de glucide dup hidroliza biomasei


Glucidele produse mg/ml
12 ore
24 ore
36 ore
42 ore
60 ore
5,38
7,77
8,97
9,92
10,16
4,43
7,29
8,97
8,97
8,97
3,71
6,82
6,34
6,10
6,10
3,71
4,90
5,62
5,62
5,62
8,49
15,66
16,13
17,09
17,09
2,28
2,75
3,23
3,7
3,71
2,28
2,75
2,99
3,23
2,47
2,99
8,49
12,31
15,18
15,18
6,10
2,28
2,75
2,75
2,75
14

10
11
12
13
14
15
16
17

Paie + 22118
Paie + enz 2
Paie + enz 5
Paie + 22119 +
22083
Coceni + 22086
Coceni + 22119
Coceni + 22118
Coceni + 22119 +
22083

2,75
3,71
3,71
7,77

2,75
7,05
4,90
15,42

2,99
9,44
8,49
15,66

3,23
13,27
8,49
15,66

3,71
13,27
8,49
15,66

6,82
2,51
3,23
10,64

14,70
5,99
3,23
10,88

15,66
3,23
3,71
11,36

17,09
3,71
3,71
15,66

17,09
3,71
3,71
18,5

12 h
24 h
36 h
48 h
60 h

Fig.1.9. Hidroliza enzimatic a biomasei lignocelulozice agricole

1.3Concluzii.
Datele ne sugereaz c biomasa lignocelulozic, Miscanthus sinesis giganteus,
ntreaga plant, cultivat pe terenuri poluate, poate fi folosit ca substrat pentru creterea
fungilor celulozolitici i pentru a induce producia de celulaze n speciile Trichoderma i
Aspergillus.
Mai mult, o tulpin foarte productiv, Trichoderma longibrahiatum CMIT36, a fost
selectat pentru a se putea stabili un set de valori pentru parametrii bioprocesului, astfel nct
s se obin o concentraie ct mai mare de celulaze n mediu de cultur.
Comparnd cinetica enzimelor n mediu de cultur lichid i solid, au fost stabilii
parametrii optimi pentru a produce enzime celulozolitice (concentraia substratului,
concentraia inoculului, pHul, viteza de agitare, durata de cultivare, i umiditatea).
Exist o gam larg de celulaze disponibile n comer care pot fi folosite n procesul de
hidroliz enzimatic. Preul, activitatea enzimatic, stabilitatea i disponibilitatea sunt cei mai
15

importani factori care trebuie luai n considerare n selecia preparatelor celulozolitice care
se vor folosi la scal mare pentru hidroliza lignocelulozei.
Au fost descoperite diferene mari n cantitatea de glucide obinute, folosind diferite
celulaze. Iar datele ne las s concluzionm c enzimele produse in-situ pot fi integrate n
procesul unei biorafinrii.
Productivitatea enzimelor obinute n aceste fermentaii, mpreun cu alte
considerente, precum costul sczut i disponibilitatea larg, recomanda Miscanthus s.
giganteus ca substrat ideal pentru biosinteza celulazelor cu ajutorul fungilor.

16

Cap.2. Conservarea biomasei prin nsilozare


Datorit coninutului ridicat n zaharuri, dup recoltare sorgul este atacat rapid de ctre
microorganisme, care consum glucidele i elibereaz produse de fermentaie (acizi organici,
alcooli, CO2 etc). Pentru a evita pierderea glucidelor, dup recoltare, au fost dezvoltate o serie
de metode de conservare a biomasei.
Una dintre aceste metode este extragerea sucului dulce din plante, iar resturile, rmase
n urma stoarcerii, sunt fie uscate, fie nsilozate n prezena bacterilor lactice. Alt metod este
nsilozarea materialului proaspt, n prezena acidului formic sau propionic (Rohowsky, 2011,
Mills, 2002) sau cu ajutorul enzimelor (Schmidt, 1997).
Dac materialul este destinat producerii de biogaz, cea mai bun metod de nsilozare
este cea prin fermentaie lactic. Studiile arat c producerea biogazului din biomas
nsilozat se face cu un randament mai mare dect din biomas proaspt (Weiland 2010,
Herrman, 2011). Folosirea aditivilor coninnd bacterii lactice la nsilozare influeneaz
procesul de metanogenez, dependent de compoziia chimic a materialului organic folosit
(Amon, 2007).
n vederea obinerii de bioetanol, nu este recomandat nsilozarea cu bacterii lactice,
pentru c fermentaia lactic va consuma o mare parte din glucidele din biomas, astfel c
acestea nu vor mai fi disponibile pentru fermentaia alcoolic. Ca aditiv pentru conservarea
biomsei se poate folosi acoolul etilic. Etanolul, produs n urma procesrii sorgului, poate fi
folosit pentru a conserva biomasa pn la momentul procesrii. Acesta poate fi recuperat n
timpul procesrii, deci, doar o mic parte din produsul finit va fi consumat de-a lungul unui
ciclu complet de producere a bioetanolului.
Pentru a putea observa mai bine efectele acestor aditivi de nsilozare asupra biomasei
au fost efectuate o serie de experimente cu silozuri din sorg zaharat, bagas, i amestecuri de
sorg cu coceni de porumb tratate cu diferii aditivi de nsilozare.
2.1.Materiale i metode
Ca materie prim s-a folosit biomas de sorg (Sorghum bicolor) i porumb (Zea Mays)
obinute n dou loturi experimentale diferite din judeul Timi.
tiuleii de porumb au fost recoltai separat iar resturile, alctuite din tulpini i frunze,
au fost tiate la lungimea teoretic de 1cm, cu ajutorul unei combine de recoltat furaje.
Sorgul a fost recoltat ca plant ntreag, n perioada de lapte, dup care a fost tiat la
lungimea teoretic de 1cm, cu ajutorul combinei de recoltat furaje. Din materialul tiat s-a
extras sucul dulce cu o pres de ulei, Pellet Mills cu capacitatea de 500 kg materie prim/or,
bagasa obinut fiind folosit n acest experiment.
Silozurile au fost pregtite n flacoane de plastic, 1L volum, aerul a fost extras cu o
pomp de vid dup care au fost etanate. Acestea au fost pstrate la 20C pn la deschidere.
Biomasa a fost tratat cu aditivi de nsilozare, cu excepia martorilor.
Inocularea cu bacterii lactice (Lactobacillus plantarum i Lactobacillus acidophilus) s-a
fcut ntr-o concentraie de 2 - 5 x 105 UFC (uniti formatoare de colonii) g -1 material
17

proaspt. S-au folosit tulpini de bacterii lactice provenite din colecia universit ii, acestea
fiind testate nainte n silozuri la scar de laborator i industrial (Vintila, 2006, 2010).
Inocularea cu etanol, 8g soluie etanol 95% / 100g material proaspt, s-a facut doar n
silozurile ce conin sorg, plant ntreag, i bagas obinut n urma extragerii sucului,
deoarece acestea se pot folosi ca materie prim n industria etanolului. Sucul dulce pentru
bioetanolul de generaia I i bagasa pentru bioetanolul de generaia a II-a, lignocelulozic.
Astfel au fost obinute 12 tipuri de silozuri, dup cum urmeaz:
1. Sorg fr aditivi
2. Sorg cu LAB
3. Sorg cu etanol
4. Bagas fr aditivi
5. Bagas cu LAB
6. Bagas cu etanol
7. Sorg i coceni de porumb fr aditivi
8. Sorg i coceni de porumb cu LAB
9. Bagas i coceni de porumb fr aditivi
10. Bagas i coceni de porumb cu LAB
11. Coceni de porumb fr aditivi
12. Coceni de porumb cu LAB
Pentru a determina valoarea nutritiv a biomasei folosite, s-au fcut urmtoarele
determinri standard, conform schemei WEENDE:
- Substana uscat (SU%) prin uscarea n etuv la 105C.
- Proteina brut (PB%) prin metoda Kjeldahl.
- Grsime brut (GB) prin metoda Soxhlet
- Celuloza brut (CB%) prin metoda Van Soest.
- Cenua (%) prin uscarea n sobe, la 600C.
O serie de alte analize au fost efectuate, mpreun, cu cele menionate mai sus, att pe
biomasa proaspt ct i pe biomasa nsilozat. S-au determinat urmtorii parametrii.
pH-ul a fost msurat cu pH-metrul Consort C932. Probele au fost pregtite prin
amestecarea a 5g biomas n 45ml ap distilat timp de 30 minute.
Unitile formatoare de colonii (UFC). S-au analizat pentru a determina numrul de
microorganisme prezente n silozuri. Suspensii lichide ale biomasei au fost diluate i
nsmnate n plci cu nutrient agar i incubate timp de 2 zile la 37C.
Aciditatea de titrare este definit ca miligrame echivalent de soluie bazic, 0,1M
NaOH, necesar pentru a titra pH-ul probelor din siloz la valoarea de 6,5. Aceasta indic
concentraia acizilor prezeni n siloz. Aciditatea de titrare poate fi corelat cu aciditatea total
a silozurilor la plante precum sorgul zaharat, care au o capacitate de tamponare redus.
Valorile mari indic o fermentaie avansat, o cantitate de acid mai mare cu o stabilitate
ridicat a silozurilor. Totui, o valoare prea mare pune probleme datorit conversiei
substratului organic n acizi, n cantiti prea mari, i dificultatea de a menine o valoare
optim a pH-ului n timpul digestiei anaerobe la producerea de biogaz.
Glucidele solubile (GS). Au fost determinate prin amestecarea a 10 g siloz n 100ml
ap distilat timp de 30 minute. Probele au fost ulterior centrifugate pentru a separa partea
lichid de cea solid, dup care partea lichid a fost analizat pentru a determinat concentraia
de glucide reductoare n extractul apos, prin metoda DNS (Warwick, 1982).

18

2.2. Rezultate i discuii


Caracteristicile biomasei nainte de nsilozare sunt prezentate, mai jos, n tabelul 2.1.
Dup 100 zile de pstrare, silozurile au fost deschise i au fost analizai parametrii nutriionali
i igienici. Caracteristicile senzoriale sunt un factor foarte important pentru determinarea
integritii i calitii silozurilor, aa c, mediat dup deschidere, silozurile au fost analizate
din punct de vedere al culorii, texturii i mirosului.

Biomas
Sorg zaharat
Bagas
Coceni de porumb

pH
6.9
6.2
6.4

Tabelul 2.1. Caracteristicile biomasei nainte de nsilozare


Indicatori nutriionali i de calitate
log10
GS
SU
PB
GB
CB
Cenu
ufc g-1 mg*g- %
%
%
%

1
%
1.35
65.5
23.5
2.58
2.78
9.05
3.35
1.45
50.3
27.7
3.54
2.38
10.48
2.52
1.60
38.2
81.7
3.10
1.89
42.65
5.54

Toate variantele experimentale i-au pstrat textura iniial, bucile de plante nu s-au
nmuiat (nmuierea este efectul hidrolizei biomasei de ctre microorganisme strine). Mirosul
a fost diferit de la un lot la altul, de exemplu n loturile de sorg fr aditivi i sorg cu LAB
mirosul a fost unul acru, asemntor cu castraveii murai. n lotul de sorg cu etanol, mirosul a
fost unul mai plcut, dulce acrior, aromat, iar loturile care conineau bagas aveau cel mai
plcut miros, de pine proaspt. Mirosul acesta, plcut a fost gsit i n loturile care
conineau coceni de porumb. Culoarea silozurilor s-a schimbat i ea. Loturile cu sorg i
bagas fr aditivi au trecut de la o culoare verde viu, la una verde nchis, msliniu iar loturile
cu sorg i bagas cu aditivi au trecut la o culoare verde deschis. Cele cu coceni de porumb iau pstrat culoarea iniial.

19

pH
acidity
log10 cfu*g-1

10

11

12

Fig.2.1. Caracteristicile de pstrare a biomasei nsilozate


Parametrii prezentai mai sus, n figura 2.1, pH, aciditate i unitile formatoare de
colonii sunt principalele caracteristici care indic calitatea pstrrii silozurilor.
Valorile ridicate ale pH-ului, gsite la cocenii de porumb, variantele 11 i 12, arat c
fermentaia nu a avut loc n aceste silozuri, chiar i dup adugarea bacterilor lactice, varianta
12. Inocularea cocenilor cu culturi de bacterii lactice se pare c are chiar un efect invers,
ajutnd formarea de microorganisme contaminante, probabil datorit umezelii i nutrienilor
adugai n acelai timp cu bacterile lactice.
Adugarea de bacterii lactice n silozurile cu sorg i bagas, variantele experimentale 2
i 5, mbuntete calitatea de pstrare a biomasei (pH mai sczut, aciditate ridicat, numr
mic de microorganisme contaminante).
Adugarea etanolului ca aditiv de pstrare n silozurile cu sorg i bagas, 3 i 6, are
efecte asemntoare cu adugarea bacterilor lactice, din punct de vedere al pHului, aciditii i
microorganismelor contaminante. Diferena apare ns cnd ne uitm la numrul de glucide
solublile rmase n urma nsilozrii.
Concentraia iniial de glucide solubile n ap a sorgului este de 65.5 mgg -1. n silozul
cu sorg inoculat cu etanol s-au gsit 91,25% din concentraia iniial de glucide solubile dup
100 zile de pstrare. n cazul silozurilor cu sorg inoculat cu bacterii lactice i neinoculat s-au
gsit 56,64%, respectiv 65,02% din cantitatea iniial de glucide.
n silozurile cu bagas, datele arat acelai efect. 97,15% din cantitatea iniial de
glucide au fost gsite n silozul inoculat cu etanol iar n silozurile inoculate cu bacterii lactice
i neinoculate s-au gsit 78,42%, respectiv 87,79%.

20

Tabelul 2.2.Caracteristicile silozurilor dup 100 zile de pstrare


Lot

Coninut

pH

acidita
te

Parametrii nutriionali i calitativi


log10 GS
SU
PB
GB
ufc g- mg*g-1 %
%
%

CB
%

Cenu
%

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12

Sorg
Sorg + LAB
Sorg + etanol
Bagas
Bagas + LAB
Bagas + etanol
Sorg + coceni de
porumb
Sorg + coceni de
porumb + LAB
bagas + coceni
de porumb
bagas + coceni
de
porumb+
LAB
Coceni
de
porumb
Coceni
de
porumb + LAB

3.8
3.7
3.6
3.3
3.5
3.3
4.6

4,4
5,4
5
5,2
4,6
4,6

3.20
1.5
1.9
4.65
3.45
3.25
4.75

42.59
37.10
59.86
44.16
39.45
48.87
46.52

23.1
22.5
23.8
27.5
28.4
26.8
39.6

2.05
2.54
2.60
3.06
2.90
3.53
3.13

2.62
2.93
2.05
2.32
2.47
2.30
2.30

11.56
10.91
9.20
10.82
14.14
13.64
15.00

3.54
3.41
3.47
2.55
3.54
2.77
6.10

3.9

32.39

38.4

3.51

2.44

15.33

3.91

2.45

33.18

35.9

2.80

1.92

19.58

4.21

3.20

34.75

38.1

3.05

2.11

15.72

4.05

3.30

36.22

82.5

3.08

1.82

44.81

6.10

3.65

33.39

76.8

3.49

1.97

40.75

5.54

4,4
3.9
5,4
3.6
4,7
3.5
5,7
6
1
6.3
1,2

Datorit umiditii sczute a cocenilor de porumb, nsilozarea acestui tip de biomas


este destul de dificil. Acest tip de biomas rezidual poate fi folosit ca materie prim pentru
producerea de biocombustibili. Potenialul de producere de biogaz a cocenilor de porumb este
de 380 460 litri biogaz/ kg substan uscat organic (Nikolic 2009).
Un alt el al acestor experimente a fost s cretem umiditatea i concentraia de glucide
solubile ale silozurilor de coceni de porumb prin adugarea de sorg i bagas, variantele
experimentale 7,8,9 i 10. Datele din tabelul de mai sus arat c un amestec de 1:1 a cocenilor
de porumb cu celelalte dou tipuri de biomas duc la fermentaie lactic i nsilozarea
biomasei.
Valorile aciditii, pHului i UFC arat c n toate cele 4 loturi a avut loc fermentaia i
biomasa a fost bine pstrat. Rezultatele recomand adugarea de bacterii lactice pentru
silozurile ce conin sorg i coceni de porumb.
Analiza celorlali parametrii, protein brut, grsime brut, celuloz brut i cenu,
arat c toate cele 12 loturi s-au pstrat bine, din punct de vedere nutriional, diferenele ntre
biomasa nensilozat i cea nsilozat sunt foarte mici.
Cele mai importante constatri n urma analizei datelor este c silozurile inoculate cu
etanol pstreaz mai bine att coninutul de glucide solubile ct i cel de protein brut. Este
recomandat astfel ca pentru biomasa folosit ca materie prim pentru producia de
biocombustibil, ce trebuie nsilozat, s se foloseasc etanolul ca aditiv.

21

2.3. Concluzii
Adugarea bacterilor lactice n silozurile de sorg i cele amestecate amelioreaz
parametrii de pstrare, dar duce la o pierdere mai mare a glucidelor solubile.
Concentraii mari de glucide au fost pstrare n silozurile cu etanol ca aditiv. Acesta
mpiedic epuizarea proteinei din siloz ct i multiplicarea microorganismelor contaminante.
Folosirea etanolului ca aditiv pstreaz biomasa calitativ, reduce pierderea de proteine i
glucide solubile.
Diferen n substan uscat, protein, grasime brut, celuloz nu este semnificativ la
nici o form de nsilozare.
O parte mic din etanolul produs ntr-o biorafinrie poate fi folosit, aadar, pentru a
pstra materia prim necesar biorafinriei pentru mai mult timp.
Parametrii de pstrare a cocenilor de porumb pot fi mbuntiti dac acetia sunt
amestecai cu sorg sau bagas.

22

Cap.3. Sorgul zarahat ca materie prim pentru producerea de bioetanol

n zonele tropicale, subtropicale i aride din Statele Unite, Mexico, China, India,
Africa i alte ri n curs de dezvoltare, unde condiiile agricole vitrege domin, una dintre
cele mai promitoare plante, pentru producerea de combustibil este sorgul zaharat (Sorghum
bicolor). (Reddy, 2005; Zhang, 2010).
Aceasta este o plant foarte eficient care a atins o producie global de 56 milioane
tone boabe n 2009 (FAOSTAT 2011).
Sorgul este o plant din grupa C4, foarte rezistent la factorii biotici i abiotici cum ar
fi insecte, secet, salinitatea sau alcalinitatea solului. Aceasta are una dintre cele mai bune rate
de asimilare a carbonului, 50g/m/zi, care permite o cretere rapid i o mai bun utilizare a
dioxidului de carbon (Prasad, 2007). Sorgul are nevoie de o treime din cantitatea de ap
comparativ cu trestia de zahr i 80 90% comparativ cu porumbul, fiind astfel una din cele
mai rezistente la secet. Mai mult dect att, ea are nevoie de o cantitate mult mai mic de
ngrminte, 1/3 comparativ cu trestia de zahr i ciclul ei de cretere este ntre 3 i 5 luni,
permind astfel 2 sau 3 cicluri de cretere anual.
Pe lng avantajele ecologice, sorgul este o plant foarte maleabil din punct de
vedere genetic, ceea ce permite creerea de soiuri adaptabile mai multor regiuni de pe glob cu
uurin.
Produsul principal obinut din sorg este sucul, bogat n glucide fermentescibile. Acest
suc este compus n principal din glucoz, zaharoz i fructoz, deci poate fi fermentat i
transformat n etanol cu o eficien de peste 90% (Wu, 2010).
Sorgul zaharat are randament mai bun din punct de vedere al inputului i outputului
energetic dect multe dintre plantele folosite n momentul actual, cum ar fi trestia de zahr,
sfecla de zahr, porumbul, etc. (Almodares, 2009).
Pe lng sucul obinut, bagasa rezultat n urma extragerii poate fi folosit ca materie
prim pentru producerea de etanol.
Conversia biomasei lignocelulozice la etanol este un proces mprit n trei etape. n
prima etap polimerii glucidici sunt eliberai din lignoceluloz, n a 2-a etap acetia sunt
hidrolizai n glucide fermentescibile iar ultima etap presupune fermentarea glucidelor la
etanol (Lange 2007).

3.1. Determinarea activitii entimatice


n vederea procesrii sorgului pentru obinerea de etanol primul pas a fost
determinarea activitii enzimelor celulozolitice disponibile.
3.1.1. Materiale i metode
Ca substrat pentru determinarea activitii enzimatice s-a folosit sorg zaharat
(Sorghum bicolor), acesta a fost cultivat n Timioara, Romnia, pe terenurile aparinnd
23

Universitii de tiine Agricole i Medicin Veterinar a Banatului Regele Mihai I al


Romniei. Dup recoltare, paniculii au fost ndeprtai, restul plantei a fost uscat la aer liber
i mrunit cu o moar Retsch SM 100, la dimensiunea de 2 cm.
Enzimele testate sunt enzime celulozolitice comerciale provenite de la Novozyme. Sau pregtit diferite cocktailuri enzimatice pentru a determina care variant este cea mai bun
pentru a fi folosit n procesul de producere a etanolului din sorg. Amestecurile au fost fcute
n funcie de caracteristicile enzimelor.
Astfel am obinut patru preparate enzimatice, i anume:
a. NS22086
b. NS22086 + NS22118 + NS22119 + NS22035
c. NS22086 + NS22083 + NS22002
d. NS22086 + NS22083 + NS22002 + NS22118 + NS22119 + NS22035
Tabelul.3.1. Enzimele comerciale NOVOZYME
Cod enzim Tipul enzimei
NS22086
Complex
celulazic

NS22083

Xylanaze

NS22118

glucozidaze

NS22119

Complex
enzimatic

NS22002

glucanaze
xylanaze

NS22035

Glucoamilaze

Descriere
- Principala
enzim
pentru
hidroliza
biomasei
hidrocelulozice
- Catalizeaz desfacerea materialului celulozic n glucoz,
celobioz i polimeri de glucoz
- Principalii produi de reacie sunt celobioza i glucoza
- Endoxylanaze de puritate nalt cu specificitate ctre
pentozele solubile
- Capabil s elibereze pentozele din hemiceluloza
biomasei
- Cunoscute i ca celobiaze, transform celobioza n
glucoz
- Conine o gam larg de carbohzdraze, incluznd
arabinase, glucanaze, celulaze, hemicelulaze,
pectinaze i xylanaze
- Conine un amestec de glucanaze i xylanaze
- Are i activii secundare, inclusiv celulaze,
hemicelulaze
- Folosit pentru medile de hidroliz ce conin amidon

S-au pregtit mai multe diluii ale preparatelor enzimatice, cu tampon citrat 0,05M,
pH4,8, pentru a putea urmrii mai exact activitatea enzimatic i concentraia optim necesar
pentru hidroliza biomasei.
Testul de activitate s-a fcut prin dou metode i anume, determinarea activitii
enzimatice prin metoda FPU i prin hidroliza enzimatic a sorgului zaharat.
Pretratarea biomasei
Pentru hidroliza ezimatic s-au folosit dou tipuri de pretratare a biomasei, pentru a
determina n acelai timp i metoda optim de pretratare ce va fi folosit n procesul de
conversie a biomasei la bioetanol.
24

Pretratarea mecanic a biomasei care presupune mrunirea la o dimensiune de


0,25mm. Pretratarea alcalin (fizico chimic) a biomasei implic umectarea sorgului
mrunit (2cm lungime teoretic) cu soluie NaOH 2%, n raport de 10:1 lichid solid i
autoclavarea acestuia la 120C timp de 30 minute (Silverstein, 2007; Ming, 2009) . Dup
autoclavare, biomasa umed rezultat a fost splat cu ap, un volum aproximativ de 12 ori
mai are dect cantitatea de biomas, i neutralizat cu sol. H2SO4 2% pn a atins pHul de
5,3.
Hidroliza enzimatic
Biomasa pretratat mecanic i fizico chimic a fost introdus n flacoane Erlenmeyer
de 300ml. S-a introdus echivalentul n biomas a 1g celuloz, adic 2,5g sorg substan
uscat. Sorgul conine aproximativ 33 44% celuloz/ gram biomas (Sarna-Saldivar, 2009).
Astfel, n flacoane s-au introdus 2,679g sorg pretratat mecanic i 13,469g sorg pretratat fizico
chimic.
Tabelul.3.2. Substana uscat sorg
Substan uscat (%)
93,3
18,56

Tip biomas
Sorg pretratat mecanic
Sorg pretratat fizico-chimic

La acestea, s-au adugat 50ml tampon citrat 0,05M, pH 4,8 i Tween80, 5g/l pentru a
mbuntii hidroliza enzimatic (Ming, 2008). Flacoanele astfel pregtite au fost autoclavate
la 121C timp de 20 minute, pentru a asigura sterilitatea mediului. n flacoane au fost
introduse preparatele enzimatice descrise anterior. Doar din preparatele b i d a fost exclus
enzima NS22035. Cantitativ, s-au introdus 15 micolitri din enzima NS22086 i 50 microlitri
din celelalte enzime.
Hidroliza s-a fcut timp de 72h la temperatura de 50C, cu agitare de 150rpm. La
fiecare 24 de ore i la momentul iniial s-au prelevat probe pentru a determina glucidele
reductoare cu medota DNS i glucoza.
S-a determinat substana uscat dup pretratare i dup hidroliz prin uscarea ntr-o
etuv la 105C timp de 24 ore. Toate probele i analizele s-au realizat n triplicate.
Metode de analiz
Metoda FPU determin activitatea celulazelor prin intermediul hrtiei de filtru. ntr-o
eprubet se pipeteaz 1ml tampon citrat 0,05M, pH 4,8. Se adaug 0,5ml enzim (diluat n
tampon citrat). Se recomand folosirea mai multor diluii, pentru o exactitate mai mare a
rezultatelor. Se nclzete la 50C, se adaug hrtia de filtru Whatman No.1 (1x6 cm). Se
incubeaz 60 min la 50C. Se adaug 3 ml DNS (acid dinitrosalicilic) i se agit. Se fierbe
eprubeta exact 5 minute. Se adaug 20ml ap distilat i se omogenizeaz. Dup 20 de minute
soluia din eprubet se msoar la 540nm cu spectrofotometru.
Pentru determinarea analitic a concentraiei de glucoz din mediile de hidroliz s-a
aplicat metoda enzimatica cu glucozoxidaza si dozare spectrofotometrica la 510 nm, cuva de
1 cm. Etalonare in 5 puncte in intervalul 90-700 mg/1oo mL; R 2 pentru curba de etalonare:
0.9701,Ecuatia de etalonare: Y (Ext)= 0.0026 X (mg/100 mL)
25

Principiul metodei: glucoza este oxidata de catre glucozoxidaza la acid gluconic si


peroxid de hydrogen. Acesta in prezenta enzimei reactioneaza cu fenolul si 4-aminoantipirina
formind un colorant iminochinonic de culoare roz, cu maximum de absorbtie la 510 nm.
Intensitatea roza a solutiei este proportional cu continutul in glucoza. Masuratorile au fost
executate cu Spectrofotometrul Specord 205, Analytik Jena, Germania in Cadrul
Laboratorului de Spectrometrie atomica si moleculara a USAMVB Timisoara. Metoda
prezinta specificitate pentru glucoza.
Metoda DNS determin cantitatea de glucide simple din mediul de hidroliz. ntr-o
eprubet se pipeteaz 0,5ml prob de determinat se adaug 1ml DNS i se agit- Se fierbe
timp de 5 minute dup care se aduce la 10ml cu ap distilat, se adaug 8,5 ml. Soluia este
msurat la spectrofotometru la 540nm fa de spectrul zero. Denstitiile optice astfel citite
se transform n mg glucide/ ml mediu cu ajutorul unei curbe de etalonare n 6 puncte ntre 0
1000 micrograme/ml.
3.1.2. Rezultate i discuii
n prima parte s-a determinat activitatea enzimatic a preparatelor Novozyme prin
metoda FPU. n tabelul 3.3. sunt redate datele obinute n urma testrii enzimelor.
Tabelul.3.3. Activitatea preparatelor enzimatice (exprimat n FPU)
Notati
e

Cocktail enzimatic

NS22086

NS22086 +
NS22118 +
NS22119 +
NS22035

NS22086 +
NS22083 +
NS22002

NS22086 +
NS22118 +
NS22119 +
NS22035 +
NS22083 +
NS22002

Dilutie
x20
x50
x100
x200
x20
x50
x100
x200
x20
x50
x100
x200
x20
x50
x100
x200

26

1,497
0,854
0,391
0,254
1,398
0,849
0,446
0,350
1,959
1,154
0,514
0,374
1,593
0,947
0,462

FPU/ microlitru
preparat
enzimatic
1,108
1,581
1,448
1,883
0,259
0,393
0,413
0,647
0,483
0,712
0,634
0,922
0,196
0,292
0,285

0,415

0,512

glucoza eliberata
(mg)

FPU/ microlitru preparat enzimatic

FPU/ microlitru preparat


enzimatic

Fig.3.1. Activitatea preparatelor enzimatice (FPU)


Datele prezentate mai sus arat c preparatul enzimatic cel mai potrivit este NS22086,
acesta prezentnd cea mai mare activitate enzimatic, dei toate preparatele conin complexul
enzimatic NS22086, n aceiai cantiti. O explicaie poate fi, c dei cantitatea de enzim
NS22086 este n aceiai cantitate n toate amestecurile, faptul c n amestecurile b,c i d
aceasta este diluat cu alte enzime, produsul final care acioneaz asupra substratului s
conin mai puin enzim.
Pentru a avea o imagine mai clar a activitii, n a 2-a parte a experimentului s-a
efectuat o hidroliz enzimatic a sorgului zaharat, dup metoda enunat mai sus. n urma
hidrolizei s-au analizat cantitatea de glucoz eliberat i cantitatea de glucide reductoare.

Variant
experimental

Na
Nb
Nc
Nd
Pa
Pb
Pc
Pd

Tabelul.3.4.Glucidele reductoare eliberate n urma hidrolizei


Glucide obinute (mg/ml)
T0 (0h)
T1(24h)
T2(48h)
T3(72h)
1,816
1,766
1,808
1,784
0,236
0,252
0,244
0,244

4,842
5,415
5,553
6,335
18,66
16,290
21,443
22,702

5,679
6,557
6,539
7,430
10,59
20,684
21,79
24,531

unde: N sorg pretratat mecanic


P sorg pretratat fizico chimic
a,b,c,d preparatele enzimatice

27

6,156
6,818
7,110
7,688
19,90
22,389
20,160
26,705

Rezultatele arat c, pentru orice preparat enzimatic, randamentul este mai mare n
cazul pretratrii biomasei fizico chimic. n timp ce hidroliza biomasei pretratate mecanic
produce o cantitate maxim de 7,6 mg/ml glucide (Nd), n cazul pretratrii fizico chimice
acelai preparat enzimatic produce 26,7 mg/ml glucide (Pd), avnd un randament 4 ori mai
mare.

Na
Nb
Nc
Nd
Pa
Pb
Pc
Pd

Fig.3.2. Glucidele eliberate n timpul hidrolizei


Ca i productivitate, preparatul enzimatic d este cel mai bun, elibernd 26,7 mg/ml
glucide urmat de preparatul b cu o producie de 22,3 mg/ml glucide i preparatul c, cu o
producie de 20,1 mg/ml, cel mai putin productiv fiind preparatul a, 19,9 mg/ml.

Variant
experimental

Na
Nb
Nc
Nd
Pa
Pb
Pc
Pd

Tabelul.3.5. Glucoza eliberat n timpul hidrolizei enzimatice


Glucoza (mg/ml)
T0 (0h)
T1(24h)
T2(48h)
T3(72h)
0,577
0,631
0,529
0,631
0,110
0,049
0,092
0,082

3,398
4,058
2,965
4,479
6,395
6,177
5,896
6,036

4,094
4,473
4,357
3,342
6,298
6,501
5,239
5,973

4,387
4,913
5,656
5,113
6,176
6,015
5,761
5,618

unde: N sorg pretratat mecanic


P sorg pretratat fizico chimic
a,b,c,d preparatele enzimatice
Dei cantitatea cea mai mare de glucide este eliberat din biomas de preparatul d, n
urma determinrii glucozei eliberate n urma hidrolizei se observ c, din acest punct de
28

vedere, cel mai performant cocktail este a, care elibereaz o cantitate de 6,175 mg/ml
hidrolizat, cu 0,5557 mg/ml mai mult dect amestecul d (5,618mg/ml). Preparatul a este
urmat, ca performan de preparatul b, cu o producie de 6,015 mg/ml, apoi de preparatul c
(5,761mg/ml), cel mai putin productiv devenind astfel preparatul d.
Lund n considerare c interesul nostru este direcionat spre obinerea unei cantiti
ct mai mari de glucoz, putem afirma c preparatul optim pentru procesele defurate n
continuare este complexul a.

Nb3
Nc3
Nd3
Pa2
Pb3
Pc3
Pd3
Pd

Fig.3.3. Glucoza eliberat n timpul hidrolizei (mg/ml)


Analiznd mai amanunit datele obinute, putem vedea c hidroliza are activitatea cea
mai intens n primele 24 ore, ba mai mult, n cele mai multe cazuri, dup primele 24 ore de
proces, cantitatea de glucoz ncepe s scad. Chiar dac pentru varianta Pb, cantitatea de
glucoz continu s creasc pn la 48 ore, diferena, de doar 0,324mg/ml glucoz nu justific
prelungirea procesului cu nc 24 ore.

Prob

Na
Nb
Nc
Nd
Pa
Pb
Pc
Pd

Tabelul.3.6. Biomasa hidrolizat (substan uscat)


Biomas supus
Cantitatea de
Raport de hidroliz
hidrolizei (g, S.U.)
biomas hidrolizat
(g %)
(g, S.U.)
2,5
0,185
7,389
2,5
0,206
8,233
2,5
0,229
9,171
2,5
0,187
7,472
2,5
1,705
68,210
2,5
1,365
54,581
2,5
1,642
65,692
2,5
1,366
54,627
29

n tabelul de mai sus sunt afiate cantitile de biomas care au fost hidrolizate de
enzime. Din nou, se observ o diferen clar de eficien ntre pretratarea mecanic i cea
fizico chimic. Pe cnd pretratarea mecanic faciliteaz accesul enzimelor la maxim 9,1%
din biomas (Nc), pretratarea fizico chimic desface structura biomasei n aa msur, nct
enzimele pot hidroliza pn la 68,2% din biomasa disponibil (Pa), o diferen de randament
de aproximativ 60%.
3.1.3. Concluzii
Pretratarea biomasei este un aspect foarte important n procesul de conversie a
biomasei la biocombustibil. Alegnd metoda de pretratare adecvat, randamentul hidrolizei
poate crete cu pn la 60% din biomasa procesat.
Pretratarea fizico chimic pregtete biomasa pentru procesul de hidroliz
enzimatic mult mai bine dect pretratarea mecanic.
Din toate preparatele enzimatice testate, NS22086, folosit pur, neamestecat cu alte
complexe enzimatice arat activitatea cea mai mare.
Dei, din punct de vedere al glucidelor eliberate, amestecuri dintre NS22086 i alte
enzime, au un randament mai mare, din punct de vedere al glucozei, NS22086 folosit in stare
pur ofer o eficien mai ridicat.
Hidroliza enzimatic are activitatea cea mai intens n primele 24 ore de la start,
ulterior, n cele mai multe cazuri, glucoza din hidrolizat ncepe s se piard.
Chiar dac exist cazuri n care hidroliza continu s desfac biomasa i s elibereze
glucide, cantitatea eliberat nu justific continuarea procesului dup primele 24 ore.

3.2. Conversia sorgului zaharat la bioetanol


3.2.1. Materiale i metode
Ca substrat pentru conversie s-au folosit trei hibrizi de sorg (Sorgum bicolor), i
anume Jumbo, Fundulea FT132 i Sugar Graze II. Acetia au fost cultivati n Timioara,
Romnia, pe terenurile aparinnd Universitii de tiine Agricole i Medicin Veterinar a
Banatului Regele Mihai I al Romniei. Dup recoltare, paniculii au fost ndeprtai iar
plantele au fost lsate s se usuce la aer. Dup uscare plantele au fost mrunite cu o moar
tietoare Retsch SM 100, la dimensiunea de 2 cm.
Pretratarea biomasei
Biomasa astfel mrunit a fost introdus n flacoane Erlenmeyer de 2000 ml, umectat
cu sol. NaOH 2% n raport de 6:1 lichid solid i autoclavat la 120C timp de 30 minute.
(Silverstein, 2007; Xuebing, 2008; Ming, 2009). Pentru a evita refularea coninutului, datorit
presiunii ridicate din timpul autoclavrii, n flacoane au fost introduse doar 100 g biomas i
600 ml soluie NaOH 2%.

30

Dup autoclavare, biomasa pretratat a fost splat cu ap i neutralizat cu sol.


H2SO4 2% pn la pH 5. Volumul de ap folosit la splare fost aproximativ de 12 ori mai
mare dect cantitatea de biomas.
Tabelul.3.7. Valoarea pHului sorgului pretratat
Tip biomas (sorg)
pH
Sugar Graze II
4,9
Jumbo
5,2
Fundulea
4,8
Valoarea pHului trebuie s fie ntre 5 i 5,5 deoarece activitatea enzimelor folosite este
cea mai mare ntre aceste valori ale mediului de hidroliz.
S-a determinat substana uscat prin uscarea ntr-o etuv la 105C timp de 24 ore.
Hidroliza enzimatic
n urma determinrii activitii enzimatice a celulazelor disponibile, complexul
enzimatic NS22086 a fost selectat pentru etapa hidrolizei biomasei.
n flacoane de 1000 ml s-au introdus biomas pretratat, 5% substan uscat din
totalul volumul mediul de hidroliz i s-a adus la 500 ml cu tampon citrat 0,05M, pH 5. n
tamponul citrat, pe lng Tween 80, 5g/l (Ming, 2008), s-a mai introdus 2% pepton i 1%
extract de drojdie, nutrieni necesari n etapa urmtoare a procesului, fermentaia alcoolic.

Tip biomas

Sugar Graze
II
Fundulea
Jumbo

Tabelul.3.8. Cantitatea de biomas supus hidroliz


Substan
Substana
Biomas
uscat (%)
uscat a
supus
biomasei
hidrolizei
dup
(g)
pretratare (%)
92,47
19,59
127,5
92,26
88,92

18,24
18,85

137,06
132,6

Datele din tabelul.3.8. indic modul n care umiditatea biomasei supuse pretratrii
crete n aceast etap tehnologic. Pentru a avea aceleai condiii experimentale n etapa de
hidroliz a celor trei tipuri de sorg, cantitatea de biomas supus hidrolizei s-a calculat n
funcie de coninutul n substan uscat a biomasei umede, dup pretratare. Astfel, cantitatea
de biomas pretratat supus hidrolizei corespunde a 25 g substan uscat. Am estimat c
aceast cantitate de biomas conine aproximativ 10 g celuloz (conform compozi iei medii n
celuloz a sorgului din datele de literatur). Cantitatea de 25 g (S.U.) biomas a fost introdus
n 500 ml mediu de hidroliz, astfel c am obinut un mediu de hiroliz cu o concentra ie de
5% substrat brut (biomas lignocelulozic, S.U.).
Flacoanele astfel pregtite au fost autoclavate la 121C timp de 20 minute, pentru a
asigura asepsia procesului.
31

La mediul de hidroliz s-a adugat complexul enzimatic NS22086, n cantitate de 50


microlitri pentru fiecare gram teoretic de celuloz (2,5 g substan uscat), adic 500
microlitri enzim n fiecare flacon. (cantitate recomandat de productor).
Flacoanele au fost incubate timp de 24h la 50C ntr-un incubator cu agitare, la
150rpm. Au fost luate probe din mediul de hidroliz, nainte de introducerea enzimelor, la 6,
12 i 24 de ore pentru a determina glucidele reductoare i glucoza.
Fermentaia alcoolic
Dup 24 ore de hidroliz, flacoanele au fost rcite la temperatura camerei dup care au
fost introduse ntr-o baie de ap la 35C i inoculate cu o cultur de drojdie Saccharomyces
cerevisiae n proporie de 1g drojdie / 100 g mediu de fermentaie. Toate variantele
experimentale s-au realizat n triplicat.

Fig.3.4.Instalarea etapei de fermentare

32

Fig.3.5. Instalarea etapei de fermentare (2)


Flacoanele coninnd mediul de fermentaie astfel pregtit au fost instalate (vezi
figurile 3.4, 3.5) dup cum urmeaz:
La cte un flacon din fiecare triplicat au fost conectai senzori NIR de EtOH i CO 2
(BlueSens) n vederea monitorizrii n timp real a concentraiei de etanol i CO 2 n timpul
fermentaiei. Datele sunt nregistrate de senzori la fiecare dou minute i sunt reprezentate
grafic n timp real cu ajutorul programului BACVis ntr-un computer la care sunt ata a i
senzorii.
Fermentaia a fost oprit cnd s-a constatat c, concentraia de etanol rmne la un
nivel constant. Lichidul fermentat a fost separat de faza solid n vederea determinrii
glucidelor reziduale i a substanei uscate ca indice a raportului de hidroliz a biomasei.
Toate analizele s-au realizat n triplicat.
Metode de analiz
Pentru determinarea analitic a concentraiei de glucoz din mediile de hidroliz s-a
aplicat metoda enzimatica cu glucozoxidaza si dozare spectrofotometrica la 510 nm, cuva de
1 cm. Etalonare in 5 puncte in intervalul 90-700 mg/1oo mL; R 2 pentru curba de etalonare:
0.9701,Ecuatia de etalonare: Y (Ext)= 0.0026 X (mg/100 mL)
Principiul metodei: glucoza este oxidata de catre glucozoxidaza la acid gluconic si
peroxid de hydrogen. Acesta in prezenta enzimei reactioneaza cu fenolul si 4-aminoantipirina
formind un colorant iminochinonic de culoare roz, cu maximum de absorbtie la 510 nm.
33

Intensitatea roza a solutiei este proportional cu continutul in glucoza. Masuratorile au fost


executate cu Spectrofotometrul Specord 205, Analytik Jena, Germania in Cadrul
Laboratorului de Spectrometrie atomica si moleculara a USAMVB Timisoara. Metoda
prezinta specificitate pentru glucoza.
Metoda DNS determin cantitatea de glucide simple din mediul de hidroliz. ntr-o
eprubet se pipeteaz 0,5ml prob de determinat se adaug 1ml DNS i se agit- Se fierbe
timp de 5 minute dup care se aduce la 10ml cu ap distilat, se adaug 8,5 ml. Soluia este
msurat la spectrofotometru la 540nm fa de spectrul zero. Denstitiile optice astfel citite
se transform n mg glucide/ ml mediu cu ajutorul unei curbe de etalonare n 6 puncte ntre 0
1000 micrograme/ml.
3.2.2. Rezultate i discuii
Dup cum se poate vedea n tabelul 3.9, n urma hidrolizei enzimatice a biomasei sau hidrolizat 8, resprectiv 10 grame substan uscat din cele 25 supuse procesului.
Randamentul hidrolizei este de 32% pentru Sugar Graze II i 40% pentru variantele Jumbo i
Fundulea.
Tabelul.3.9. Cantitatea de biomas fermentat (substan uscat)
Prob
Cantitatea
de Biomas
Raport
de
biomas iniial hidrolizat (g)
hidroliz
(g)
(%)
Sugar Graze II
25
8
32
Jumbo
25
10
40
Fundulea
25
10
40
n timpul hidrolizei enzimatice au fost eliberate 11,011, 17,050 i 15,755 mg/ml pentru
Sugar Graze II, respectiv Jumbo i Fundulea. Dup fermentaia alcoolic au mai rmas 1,034,
0,433 i 0,818mg/ml glucide n lichidul de ferementaie. Ceea ce nseamn c, n timpul
fermentaiei s-au consumat 9,997mg/ml glucide pentru varianta Sugar Graze II, 15,617 mg/ml
i 14,973mg/ml glucide pentru variantele Jumbo, respctiv Fundulea. Randamenzul cel mai
bun se observ la soiul Jumbo.

Prob
T0 (0h)

Tabelul.3.10. glucidele eliberat n timpul hidrolizei


Glucide eliberate (mg/ml)
Glucide
T1(12h)
T2(24h)
reziduale
(mg/ml)
9,674
11,011
1,034

Sugar graze II

0,789

Jumbo

0,372

3,302

17,050

1,433

Fundulea

0,525

8,583

15,755

0,818

34

Sugar Graze II
Jumbo
Fundulea

Fig.3.6. Curba de producere a glucidelor n timpul hidrolizei i glucidele reziduale (mg/ml)

n tabelul 3.11. i figura 3.6. se observ cantitatea de glucoz eliberat n timpul


hidrolizei, cea procesat n timpul fermentaiei i curba producerii de glucoz n timpul
hidrolizei. Pe sorgul Jumbo ca substrat hidroliza a fost cea mai productiv, elibernd 4,539
mg/ml glucoz, n 24 ore. O cantitate cu 0,439mg/ml mai mare dect varianta Fundulea
(4,1mg/ml) i cu 0,84mg/ml mai mare dect n cazul variantei experimentale cu Sugar Graze
II.
i eficiena fermentaiei a fost cea mai ridicat n cazul Jumbo, glucoza rezidual are o
valoare de 0,005mg/ml lichid de fermentaie. Urmat de varianta Fundulea cu 0,098mg/ml i
variuanta Sugar Graze II cu 0,242 mg/ml lichid de fermentaie, glucoz rezidual.

Prob

Sugar graze II
Jumbo
Fundulea

T0 (0h)
0,046
0,039
0,031

Tabelul.3.11. Glucoza eliberat n timpul hidrolizei


Glucoz eliberat (mg/ml)
Glucoz
rezidual
T1(12h)
T2(24h)
2,927
3,699
0,242
4,461
4,539
0,005
4,1
4,652
0,098

n cazul variantei Fundulea se observ o uoar depreciere a valorii glucozei n mediul


de hidroliz ntre 12 i 24 ore.

35

Sugar Graze II
Jumbo
Fundulea

Fig.3.7. Curba de producere a glucozei n timpul hidrolizei i glucoza rezidual (mg/ml)


Figurile 3.8 i 3.9 arat evoluia concentraiei de etanol i dioxid de carbon n timpul
fermentaiei. Dup cum era de astepat, concentraia de dioxid de carbon (fig.3.9.) crete foarte
repede n primele ore ale fermentaiei, cand drojdia este foarte activ, atingnd o concentraie
de 95,82% n cazul variantei Jumbo, 92,02% Sugar Graze i 68,02% Fundulea n primele 5
ore ale fermentaiei. Dup acest punct, valorile ncep s se stabilizeze atingnd o concentraie
maxim de 99,03% n cazul Jumbo, 97,69% i 68,78% n cazurile Sugar Graze II, respectiv
Fundulea.

36

1.96
1.79

1.81

1.92

1.74
1.72
1.65
1.59
1.52 1.49 1.52 1.52 1.57 1.49
1.46
1.43
1.36 1.37 1.41 1.4
1.3
1.28
1.19

Jumbo
Sugar Graze II
Fundulea

0.87
0.74

0.63
0.49

0.05 0.01
0.02

Fig.3.8. Evoluia concentraiei de alcool n timpul fermentaiei


Concentraia de alcool produs de-a lungul fermentaiei crete ntr-un ritm constant dea lungul procesului i atinge maximul dup 48 ore de proces, moment n care incepe s se
stabilizeze. Concentraia cea mai mare de etanol se gsete n varianta experimental ce
conine Sugar Graze II ca substrat, 1,92% etanol, urmat de varianta Fundulea cu 1,74% i
varianta Jumbo cu 1,65% etanol. Diferenele nu sunt foarte mari, 0,16% ntre Sugar Graze II
i Fundulea i 0,27% ntre varianta Sugar Graze II i Jumbo.

98.54 99.03
95.82 94.46 96.56
92.31 90.78 94.71
96.44 97.69
93.05
92.02
90.97
89.98 90.38
85.95
59.53
68.69 66.63 67.69 67.76 68.02 67.85 68.49 68.76 68.78

Jumbo
Sugar Graze II
Fundulea

44.28

0
0

Fig.3.9.Evoluia concentraiei de dioxid de carbon n timpul fermentrii


37

Concret, n urma procesului de conversie, se pot obine 1,92ml etanol din 5g substan
uscat sorg Sugar Graze II, 1,74ml etanol din 5g substan uscat sorg Fundulea i 1,65ml
etanol din 5g substan uscat sorg Jumbo.
Comparativ cu cantitatea de glucide eliberate n timpul hidrolizei, concentraia de
alcool este mai mare. Acest lucru se poate ntampla be baza activitii i inhibiiei enzimelor.
n timpul hidrolizei acestea elibereaz glucide din biomas pn acestea ating o anumit
concentraie, dup care activitatea enzimatic este inhibat. n timpul procesului de
fermentaie glucidele sunt transformate n etanol iar enzimele i pot relua activitatea de
desfacere a structurii a biomasei.
3.2.3. Concluzii
Hidroliza enzimatic a biomasei de sorg, pretratat fizico chimic, cu sol. NaOH 2%,
cu enzima NS22086 de la Novozyme are un randament de 32% pn la 40%.
n timpul fermentaiei se consum peste 90% din glucidele eliberate n timpul
hidrolizei enzimatice.
Procesul de fermentaie este cel mai intens n primele 6 ore, atunci cnd activitatea
drojdiei este mare iar acesta se stabilizeaz i poate fi oprit dup 48 ore.
La o ncrctur enzimatic de 50 microlitri/ gram de celuloz teoretic se poate obine
o concentraie maxim de 1,92% etanol n urma procesului.
Dintre toate variantele experimentale, soiul Sugar Graze II este cel mai productiv din
punct de vedere al conversiei la etanol.

38

Bibliografie

1. Alive, L.A., Filipe M.G.A., Silva J.B.A.E., Silva S.S., Prata A.M.R., Applied
Biochemistry and Biotechnology, 70-72, 89-98, 1998.
2. Almodares A, Hadi M.R., Production of bioethanol from sweet sorghum: A review,
African Journal of Agricultural Research, Vol.5, No.9, pp.772 780, ISSN
1991637X, September 2009.
3. Amon T., Amon B., Kryvoruchko V., Zollitsch W., Mayer K., Gruber L., Biogas
production from maize and dairy cattle manure - influence of biomass composition on
the methane yield. Agriculture, Ecology & Environ., 118, 173-182, 2007.
4. Antonopoulou, G., Gavala H. N., Skiadas I.V., Angelopoulos K., Lyberatos G. Bioresce
Technology, 99, 110-119. Doi: 10.1016/j.biortech.2006.11.048, 2008.
5. Antonopoulou G., Gavala H.N., Skidias I.V., Lyberatos G., Effect of substrate
concentration on fermentative hydrogen production from sweet sorghum extract,
International Journal of Hydrogen Energy, 36, 4843-4851, 2011.
6. Barta, Z., Kovacs K., Reczey K., Zacchi G., Process design and economics of on-site
cellulase production on various carbon sources in a softwood-based ethanol plant,
Enzyme Research, article ID 734182, 2010.
7. Bernal M.P., Navarro A.F., Roig A, Cegarra J, Garcia D., Carbon and nitrogen
transformation during composting of sweet sorghum bagasse, Biology and Fertility of
Soils, 22, 141-148, 1996.
8. Ghose, T.K. - International union of pure and applied chemistry Applied chemistry
division Commission on biotechnology, Measurement of cellulase activities, in Pure
and Applied Chem., vol. 59, No.2, 257-268, 1987.

39

9. Gnansounou E., Dauriat A., Wyman C.E., Refining sweet sorghum to ethanol and
sugar: economic trade-offs in the context of North China, Bioresource Technology, 96,
985-1002, 2005.
10. Herrman C., Heiermann M., Idler C., Effect of ensiling, silage additives and storage
period on methane formation of biogas crops, Bioresource Technology 102, 51535161, 2011.
11. Lange, J.P., Lignocellulose conversion: an introduction to chemistry, process and
economics. Biofuels Bioproducts & Biorefining, Vol. 1, No 1, 39-48, 2007.
12. Lynd, L.R., Overview and evaluation of fuel ethanol from cellulosic biomass:
technology, economics, the environment, and policy, Ann. Rev. Energy Environ., 21
403465, 1996.
13. Merino, S.T., Cherry J., Progress and challenges in enzyme development for biomass
utilization,
in
Biofuels,
vol.
108
of
Advances
in
Biochemical
Engineering/Biotechnology, pp. 95-120, 2007.
14. Mills J, Kung L Jr., The effect of delayed ensiling and application of a propionic acidbased additive on the fermentation of barley silage, J Dairy Sci., 85 (8), 1969-75,
2002.
15. Ming C., Jing Z., Liming X., Comparison of four different chemical pretreatments of
corn stover for enhancing enzymatic digestibility, Biomass and Bioenergy, 33, pp.1381
1385, 2009.
16. Ming C., Jing Z., Liming X., Enzymatic hydrolysis of maize straw polysaccharides for
the production of reducing sugars, Carbohydrate Polymers, 71, pp.411 415, 2008.
17. Nikolik V., Vintil T., Producerea i utilizarea biogazului pentru ob inerea de
energie, Editura Mirton Timi oara, 2009.
18. Parasad S., Singh A., Jain N., Joshi H.C. Ethanol production from sweet sorghum
syrup for utilization as automotive fuel in India Energy & Fuels, Vol.21, No.4,
pp.2415 -2420, ISSN 0887 0624, 2007.
19. Pavel, B.P., Barbu C.H., Sand C., Pop M.R., Direct determination of heavy metals in
plant samples using HR-CS-AAS, Metal in Environment, Medicine and Biology, Cluj
University Press, Romania, IX, 49-52, 2009.
20. Picco D., Pin M., Vecchiet A., Alibardi L., Sandon A., Milgliardi D., Biogas Production
from By-Products of the Sweet Sorghum Bioethanol Chain, European Biomass
Conference and Exhibition (EU BC&E) Proceedings Volume, 2012.
21. Reddy N., Yang Y., Biofibers from agricultural by products for industrial applications,
Trends in Biotechnology Vol.23, No.1, 22-27, ISSN 0167-7799, January 2005.
22. Sassner, P., Zacchi G., Integration option for high energy efficiency and improved
economics in a wood-to-ethanol process, Biotechnology for Biofuels, vol. 1, article 4,
2008.
23. Silverstein R. et al. - A comparison of chemical pretreatment methods for improving
saccharification of cotton stalks Bioresource Technology, 98, pp.3000 301, 2007.
24. Sohail, M., Siddiqi, R., Ahmad A., Shakeel A.K., Cellulase production from Aspergillus
niger MS82: effect of temperature and pH, New Biotechnology, 25 (6) 437441, 2009.
25. Sanchez, O.J., Cardona C.A., Trends in biotechnological production of fuel ethanol
from different feedstocks, Bioresource Technology, xxx 1 26, 2007.
26. Sassner, P., Galbe M., Zacchi G., Techno-economic evaluation of bioethanol
production from three different lignocellulosic materials, Biomass and Bioenergy, vol.
32, no. 5, 422-430, 2008.

40

27. Schmidt J., Siopcz J., Kaszas I., Szakacs G., Gyepes A., Tengerdy R. P., Preservation
of sugar content in ensiled sweet sorghum, Bioresource Technology, 60 (1), p. 9-13,
1997.
28. Rohowsky B., Witzelsperger J., Remmele E., Faulstich M., Preservation of sweet
sorghum under anaerobic conditions by using forming acid as an additive. Proc. 19th
European Biomass Conference and Exhibition, Berlin, 191194, 2011.
29. Vintila, T., Dragomirescu M., Vintila D., Croitoriu V., Hydrolysis of three types of
lignocelluloses from agriculture using commercial enzymes and culture filtrate of
Trichoderma viride, Journal of Biotechnology, vol. 150S. 2010.
30. Vintila, T., Dragomirescu, M., Jurcoane, S., Vintila, D., Caprita, R., Maniu, M.
Production of cellulase by submerged and solid-state cultures and yeasts selection for
conversion of lignocellulose to ethanol, Romanian Biotechnological Letters, Vol. 14,
Nr.2, 4275-4281, 2009.
31. Vintil T., Researches to elaborate a cheap and easy method for silage inoculation
applicable in small farms. Proceedings volume of 57th Annual Meeting of the
European Association for Animal Production 17-20, 252, Sept 2006.
32. Vintil T., Vintil D., Nica D., Dragomirescu M.. New Inoculants Containing Lactic
Bacteria Applied in Forage Ensiling. Scientific Papers: Animal Science and
Biotechnologies Vol. 43 (1), Editura AGROPRINT Timisoara, p. 341-345, 2010.
33. Vintil T., - Biofeuls and Renewable Resources Ed. Mirton, 2013
34. Warwick L.M., Peter P.G., Greg J.N., Mark R.Q. Evaluation of the DNS method for
analysing lignocellulosic hydrolysates, Chemical Technology and Biotechnology, 32,
Issue 7-12, 1016-1022, 1982.
35. Weiland P., Biogas production: current state and perspectives. Appl. Microbiol.
Biotechnol., 85, 849-860, 2010.
36. Wingren, A., Galbe M., Zacchi G., Techno-economic evaluation of production ethanol
from softwood: comparison of SSF and SHF and identification of bottlenecks,
Biotechnology Progress, vol. 19, no.4, 1109-1117, 2003.
37. Xilin L.; Simmonds S.H.; BelayachiI L.; Delmas M., Sweet sorghum bagasse: A raw
material for the production of chemical paper pulp. - Effect of depithing, Industrial
Crops and Products, 6, 229-232, 1997.
38. Wu X., Jampala B., Robbins A., Hays D., Yan S., Xu F., Rooney W., Peterson G., Shi Y.,
Wang D., Ethanol fermentation performance of grain sorghum (Sorghum Bicolor) with
modified endosperm matrices, Journal of Agricultural and Food Chemistry, Vol.58,
No.17, pp.9556 9562, ISSN 0021-8561, September 2010.
39. Xuebing Z., Lihua Z., Dehua L., Comparative study of chemical pretreatment methods
for improving enzymatic digestibility of crofton weed stem, Bioresource Technology,
99, pp.3729 3736, 2008,.
40. Zhang C., Xie G., Li S., Ge L., He T., The productive potential of sweet sorghum
ethanol in China, Applied Energy, Vol.87, No.7, , pp.2360 2368, ISSN 0306-2619,
July 2010.

41