Raport tiinific

privind implementarea proiectului n perioada octombrie decembrie 2011

Proiect:
PN-II-ID-PCE-2011-3-0152
Denumire proiect:
Injecie de volume mari de solveni nemiscibli cu faza mobil n
cromatografia de lichide de nalt presiune.
Contract numr:
310/05.10.2011
Director Proiect:
Prof. Dr. Andrei Medvedovici
Perioad acoperit de raport:
05.10.2011 30.12.2011
Obiectivele planificate pentru aceast etap sunt urmtoarele:
Obiectivul 1 / aciunile 1-2; Obiectivul 8
Obiectivul 1: Studiul unor aspecte fundamentale privitoare la procesul de injecie de volume
mari de prob dizolvat n solveni nemiscibili cu faza mobil n cromatografia de lichide.
- aciunea 1. efectul diverilor solveni utilizai la solubilizarea probei;
- aciunea 2. evaluarea unor amestecuri de solveni nemiscibili cu faza mobil pentru
injecia n cromatografia de lichide.
Obiectivul 8: Crearea unui web-site asociat proiectului.
Rezultate:
Condiii experimentale:
Analitul model considerat n studiul experimental a fost tartratul de metoprolol, cu
structura chimic de mai jos:
OH

(C4H5O6)+

N
H2

O
CH3O

Metoprolol base: CAS 51384-51-1

Formula moleculara: C15H25NO3
Mw 267.364 g/mol
Log P exp. 1.88 (Hansch C. et al., 1995)
Log P calc. 1.69 (Fragment theory, KOWWIN, Episuite)

Metoprololul este un blocant al receptorilor 1 utilizat n tratamentul diferitelor afeciuni

ale sistemului cardiovascular, n special hipertensiunea arterial. S-au preparat soluii
echivalente la 1000 ppm metoprolol baz n faz mobil i n metanol. Pentru obinerea
soluiilor n ali solveni nemiscibili cu apa, o soluie apoas echivalent la 1000 ppm
metoprolol baz a fost adus la pH 12 cu o soluie de NaOH 1N, dup care s-a procedat la
extracia lichid-lichid, faza extractant fiind reprezentat chiar de diluentul care urmeaz a fi
studiat. Coloana cromatografic a fost ntotdeauna ncrcat cu echivalentul la 1 g
metoprolol baz (n consecin, soluiile folosite la injecia de volume cresctoare au fost
diluate corespunztor cu solventul evaluat).
Diluenii nemiscibili cu faza mobil care au fcut obiectul studiului au fost urmtorii:
-acetatul de butil (C6H12O2; CAS: 123-86-4; Mw=116,16 g/mol; log Pexp. = 1,78;
log Pcalc. = 1,85; solubilitate n ap = 7 g/1000 mL la 25 oC; densitate 0,883 g/mL; vscozitate
0,72 CP la 20 oC);
1

- tetraclorura de carbon (CCl4; CAS: 56-23-5; Mw=153,82 g/mol; log Pexp. = 2,83;
log Pcalc. = 2,44; solubilitate n ap = 0,8 g/1000 mL la 20 oC; densitate 1,594 g/mL;
vscozitate 0,91 CP la 27 oC);
- 1-octanol (C8H18O; CAS: 111-87-5; Mw=130,23 g/mol; log Pexp. = 3,00;
log Pcalc. = 2,81; solubilitate n ap = 0,54 g/1000 mL la 25 oC, densitate 0,827 g/mL;
vscozitate 10,6 CP la 15 oC );
- ciclohexan (C6H12; CAS: 110-82-7; Mw=84,16 g/mol; log Pexp. = 3,44;
log Pcalc. = 3,18; solubilitate n ap = 0,06 g/1000 mL la 25 oC, densitate 0,778 g/mL;
vscozitate 1,0 CP la 20 oC );
- n-hexan (C6H14; CAS: 110-54-3; Mw=86,18 g/mol; log Pexp. = 3,90; log Pcalc. = 3,29;
solubilitate n ap = 0,013 g/1000 mL la 20 oC, densitate 0,655 g/mL; vscozitate 0,297 CP la
20 oC );
Au fost considerate 3 coloane cromatografice avnd riguros aceeai geometrie, n
spe 15 cm lungime, 4,6 mm diametru interior i 5 m diametrul particulelor de umplutur.
Fazele staionare considerate au avut la baz silicagel modificat chimic avnd dimensiunile
porilor de 100 . Modificarea chimic a coloanei a fost reprezentat prin: coloana 1 faz
staionar octadecil silicagel inertizat chimic (Zorbax XDB C18 puternic dezactivat pentru
utilizare n mediu bazic); coloana 2 faz staionar octil silicagel inertizat chimic (Zorbax
XDB C8 puternic dezactivat pentru utilizare n mediu bazic); coloana 3 faz staionar
octadecil silicagel cu linker hidrofil ncorporat (grupare amidic, cu inertizare, indicator Zorbax
Stable Bond AQ). Pentru toate cele 3 coloane activitatea gruprilor silanol reziduale de pe
suprafaa silicagelului a fost minimizat prin inertizare (end-capping).
Eluia s-a realizat n condiii izocratice, utiliznd un raport volumetric de 9/1 ntre
componentele A i B ale fazei mobile. Componenta A este o soluie apoas de 50 mM formiat
de amoniu i 0,2% trietilamin adus la pH 3,5 cu acid formic. Componenta B a fazei mobile
este acetonitrilul. Debitul ales al fazei mobile a fost de 1 mL/min, iar coloanele au fost
termostate la 25 oC. n cazul injeciilor cu solveni nemiscibili cu faza mobil, dup eluia
picului analitului, a urmat un gradient de tip treapt (100% acetonitril n 0,01 min i
meninerea n regim izocratic la aceast compoziie timp de 5 min.) Revenirea la compoziia
iniial s-a efectuat n 0,1 min. cu o perioad de echilibrare de 3 min. Acest profil de
compoziie a fazei mobile a fost necesar pentru eliminarea din coloan a "dopului" de solvent
de injecie nemiscibil cu faza mobil adsorbit n faza staionar. Detecia a fost spectrometric
(n domeniul UV, la o lungime de und analitic de 280 nm).
Volumele de prob injectate au fost: 1, 5, 10, 20, 50, 75, respectiv 100 L, pstrnd
constant cantitatea de analit ncrcat n coloan.
Modalitate de lucru:
Datele experimentale "brute" care au fost nregistrate sunt:
- timpul mort al coloanei cromatografice n condiiile de exploatare (to, se determin
prin observarea timpului absolut de retenie a azotatului de potasiu, soluie apoas
1000 ppm, injecie monitorizat la 210 nm);
- timpul absolut corespunztor picului asociat picului de metoprol (tRM);
- factorul de retenie corespunztor picului de metoprolol (k = (tRM-to)/to);
- eficiena procesului cromatografic aferent eluiei metoprololului, msurat prin
numrul de talere teoretice asociate picului n cauz (N = (tRM)2/2); este abaterea
standard asociat populaiei valorilor timpilor de retenie asociate picului
cromatografic i se calculeaz prin msurarea lrgimii picului cromatografic la
2

jumtate din nlimea sa - w1/2 ( s = w1/2/2,355);

factorul de asimetrie asociat picului cromatografic, msurat la 0,1 din nlimea sa
(FA=b/a, unde b este msurat pe o paralel la linia de baz trasat la 0,1 din
nlimea picului cromatografic i este determinat ca fiind segmentul la intersecia
nlimii coborte din vrful picului pe aceast paralel i latura descresctoare a
picului, iar a este msurat pe o paralel la linia de baz trasat la 0,1 din nlimea
picului cromatografic i este determinat ca fiind segmentul dintre latura cresctoare
a picului cromatografic i intersecia nlimii coborte din vrful picului pe aceasta);
factorul de tren USP, notat TF (TF = (a+b)/2a, unde a i b au semnificaiile susamintite, cu singura diferen c se vor msura la 0,05 din nlimea picului
cromatografic);
asimetria picului (skewness) notat cu sk; sk poate cpta valori negative dac
picul cromatografic nregistreaz un fenomen de "fronting", sau pozitive dac picul
cromatografic nregistreaz un fenomen de "tailing". O valoare sk nul indic o
distribuie oarecum egal n raport cu media, aceasta neimplicnd ns o simetrie
perfect. sk-ul unei variabile aleatoare X reprezint cel de-al treilea moment
standardizat, notat cu i definit ca = E[(X-)3/], unde este media, este
abaterea standard, iar E este operatorul de estimare a unei variabile aleatoare (ca

medie ponderat a tuturor valorilor posibile a variabilei, E[X] = ( xi pi ) , pi

i =1

reprezentnd ponderile valorilor concrete xi).

Rezultatele experimentale ar trebui s conduc la urmtoarele observaii (aa cum
rezult i din studiile efectuate de echipa noastr publicate anterior n reviste de specialitate
[1,2]):
- s se nregistreze o reducere liniar a factorului de retenie cu volumul injectat de
prob atunci cnd diluentul nu este miscibil cu faza mobil;
- distorsiunea picului cromatografic trebuie s fie semnificativ n condiiile n care
analitul prezint un caracter hidrofob mai accentuat dect diluentul;
- eficiena s descreasc liniar cu volumul injectat;
- toi indicatorii de simetrie ai picului cromatografic trebuie s se modifice n condiiile
creterii volumului de injecie n solveni nemiscibili cu faza mobil.
Determinarea valorilor primare n condiiile injeciei de volume cresctoare de prob
dizolvat n faza mobil indic domeniul normal de variaie pentru parametrii n cauz.
Injecia de volume cresctoare de prob dizolvat n metanol (log Pexp. = -0,77;
log Pcalc. = -0,63) trebuie s indice volumul maxim dincolo de care distorsiunea picului
cromatografic devine inacceptabil n cazul unor determinri analitice orientate n sensul
dozrii compusului n cauz din diferite matrici.
Discuii:
Corelaiile dintre factorii de retenie corespunztori picului de metoprolol n condiiile
injeciei de volume cresctoare de prob n diveri solveni, respectiv pe diverse faze
staionare sunt prezentate n Tabelul 1. Pentru ilustrare, Figura 1 indic maniera n care
factorul de retenie variaz cu volumul de injecie n cazul fazei staionare XDB C18.
Valoarea Vinj(k=0) reprezint volumul de injecie extrapolat la retenie nul i corespunde,
din punct de vedere fenomenologic, cu volumul de diluent care satureaz ntreaga faz
staionar din coloana cromatografic. Acest parametru este cu att mai mare cu ct diluentul
3

are o mai mare capacitate de adsorbie multistrat, deci "consum" un volum mai mic de faz
staionar. Acest parametru ar trebui s fie independent de natura analitului folosit ca marker
de retenie, i ar trebui s fie determinat doar de natura diluentului, a tipului de faz staionar
i de compoziia fazei mobile. Independena parametrului Vinj(k=0) n raport cu natura analitului
va trebui verificat n experimente ulterioare.
Tabel 1. Parametrii de regresie liniar pentru variaia factorului de retenie n raport cu
volumul de prob injectat.
Coloan

C18

C18 AQ

C8

Diluent

Pant

Intercept

Faz mobil
MeOH
AcOBu
CCl4
1-Octanol
Ciclohexan
Hexan
Faz mobil
MeOH
AcOBu
CCl4
1-Octanol
Ciclohexan
Hexan
Faz mobil
MeOH
AcOBu
CCl4
1-Octanol
Ciclohexan
Hexan

-0.0002
-0.0081
-0.0547
-0.0397
-0.0407
-0.0370
-0.0410
0.0004
-0,0072
-0.0238
-0.0185
-0.0182
-0.0183
-0.0198
0.0010
-0,0062
-0.0464
-0.0306
-0.0331
-0.0305
-0.0313

23.814
23.543
23.699
23.851
23.782
23.983
23.864
14.418
14,412
14.410
14.401
14.439
14.415
14.332
20.222
20,189
20.142
20.277
20.378
20.292
20.302

Coef. de
corelaie
(rxy)
0.2668
0.8623
0.9984
0.9986
0.9976
0.9979
0.9987
0.7438
0,8021
0.9970
0.9965
0.9992
0.9989
0.9984
0.7595
0,8324
0.9991
0.9997
0.9994
0.9986
0.9981

Figura 1. Variaia factorului de retenie cu volumul injectat

(diveri dilueni pe coloana C18).
25.0
24.0
23.0

M.Ph.
MeOH

22.0

AcOBu

CCL4
1-Octanol

21.0

CycloHex
Hex

20.0
19.0
18.0
0

20

40

60

80

Vol. inj. (uL)

100

120

(k=0)

Vinj

(
L)

433
601
584
648
582
606
778
793
788
724
434
663
616
665
649

Intervalele normale de variaie pentru parametrii calculai ai separrilor cromatografice,

aa cum rezult acestea din injeciile de volume cresctoare de prob dizolvat n faza
mobil, sunt prezentate n Tabelul 2.
Tabelul 2. Intervale normale de variaie pentru factorul de retenie, eficien i descriptori de
asimetrie a picului cromatografic, aa cum rezult ele din injecia de volume cresctoare de
prob dizolvat n faza mobil.
Coloan
C18

C18 AQ

C8

Caracteristic

RSD (%)
Interval Normal variaie

RSD (%)
Interval Normal variaie

RSD (%)
Interval Normal variaie

k
0,027
0,11
0,06
0,021
0,10
0,04
0,050
0,26
0,1

N
197
1,7
400
178
1,6
360
277
2,3
560

Parametru
FA
0,035
2,1
0,07
0,039
2,6
0,08
0,069
4,5
0,14

TF
0,019
1,5
0,04
0,016
1,3
0,04
0,038
2,9
0,08

sk
0,029
6,8
0,06
0,026
7,1
0,06
0,039
10,5
0,08

Se poate lesne observa c factorul de retenie este parametrul cel mai sensibil, el
rmnnd practic constant odat cu variaia volumului de injecie, atunci cnd solventul
probei este chiar faza mobil (abatere relativ standard sub 0,25%). Variaii ale numrului de
talere teoretice n intervalul de 500 nu indic de fapt o modificare semnificativ a eficienei
globale a separrii (abaterea relativ standard situndu-se sub 2,5%). Dintre toi indicatorii de
simetrie pentru picul cromatografic, factorul de tren USP pare s fie cel mai puin afectat de
erorile experimentale, variind cu cel mult o unitate la prima zecimal semnificativ,
corespunztor unei abateri relative standard sub 3%.
Spre deosebire de rezultatele experimentale comunicate anterior n [2], obinute pentru
analii mai polari, n cazul metoprololului, pentru toate cele trei faze staionare i toi diluenii
studiai, eficiena scade n mod exponenial cu volumul injectat, dup o relaie general de
forma y = A0 + A1exp[-(x-B0)/B1]. Coeficienii de corelaie determinai pentru regresiile
neliniare (exponeniale descresctoare) se ncadreaz n intervalul 0,9232 0,9978. Pentru
exemplificare, n Figura 2 sunt ilustrate variaiile eficienei n raport cu volumul injectat pe
coloana XDB C18 i pentru diluenii utilizai n studiu.
n ceea ce privete variaia descriptorilor de simetrie a picului cromatografic,
dependenele funcionale sunt mai complexe. Considernd factorul de asimetrie la 0,1 din
nalimea picului cromatografic, pentru fazele staionare de tip silicagel funcionalizat cu
radicali alchil (XDB C8 i XDB C18), octanolul folosit ca diluent genereaz o tendin de
fronting, pe cnd ciclohexanul i hexanul o tendin de tailing (n aceast ordine
descresctoare). Singura diferen este indus de acetatul de butil, care n cazul fazei
staionare XDB C18 produce o tendin de tailing odat cu creterea volumului injectat, pe
cnd n cazul XDB C8, tendina este de fronting. n ambele cazuri, tetraclorura de carbon nu
produce modificri ale simetriei picului odat cu creterea volumului injectat. n cazul fazei
staionare de tip C18 AQ, ciclohexanul este cel care nu produce modificri de simetrie la
creterea volumului injectat. n acest caz octanolul, hexanul i acetatul de butil (n aceast
ordine descresctoare) genereaz fronting pe cnd tetraclorura de carbon genereaz tailing.
Explicaia efectului de fronting n cazul octanolului (pe toate fazele staionare) poate fi legat
de fenomenul de canelare vscoas [3,4], avnd n vedere diferena foarte mare ntre
5

vscozitatea "dopului" de solvent i faza mobil. In virtutea aceleeai logici, tetraclorura de

carbon i ciclohexanul, cu vscoziti cvasiidentice cu faza mobil, ar trebui s nu contribuie
n mod semnificativ la deformarea picului cromatografic, cel puin din punctul de vedere al
contribuiei prin canelare vscoas. Procesul de deformare a picului cromatografic este
determinat, fr ndoial, nu numai de contribuia efectului de canelare vscoas (care apare
preferenial n zona de gradient descresctor de vscozitate ntre frontul de diluent i faza
mobil) dar i de solubilitatea diluenilor n faza mobil. Pentru exemplificare, n Figura 3 este
prezentat variaia factorului de asimetrie cu volumul injectat n cazul coloanei de tip C18 AQ.
Figura 2. Variaia eficienei cu volumul injectat pentru coloana
XDB C18 i diluenii considerai n studiu.
14000

12000

10000

M.Ph.
MeOH
AcOBU
CCL4
Oct
CycHex
Hex

8000

6000

4000

2000

0
0

20

40

60

80

100

120

Vinj

Figura 3. Variaia factorului de asimetrie cu volumul injectat

pentru faza staionar C18 AQ (pentru diluenii considerai n
studiu).
3

2.5

AF

M.Ph.
AcOBu
CCL4
Oct
CycHex
Hex

1.5

0.5

0
0

20

40

60

80

Vinj

100

120

Privitor la modul n care variaz Vinj(k=0) n raport cu hidrofobicitatea diluentului

(exprimat ca log P) i hidrofobicitatea fazei staionare (aproximat prin log P echivalent al
radicalului care funcionalizeaz silicagelul), se obine variaia tridimensional din Figura 4.
Figura 4. Variaia Vinj(k=0) prin raportare la hidrofobicitatea diluentului i a fazei staionare.

Rezultatele experimentale pot prea la prima vedere discutabile, atta vreme ct

formarea multistratului de adsorbie a diluentului la nivelul suprafeei fazei staionare se
observ cu precdere n cazul fazei C18 AQ (asta chiar i n cazul diluenilor puternic
hidrofobi). O posibil explicaie a acestui fenomen aduc n discuie efectele sterice.
Experimentele au fost toate realizate n condiiile utilizrii unei faze mobile foarte
bogat n component apoas (90%) tocmai pentru a fora adsorbia diluentului n faza
staionar. n aceste condiii, radicalii alchil legai de suprafaa silicagelui (la rndu-i inertizat)
au tendina de colapsare steric datorit efectului de tensiune superficial. n cazul fazei
staionare cu linker hidrofil tendina de colapsare practic nu se manifest tocmai datorit
gruprii amidice, care leag radicalul alchil de silicagel. n acest mod centrii de adsorbie sunt
mai bine expui interaciilor cu moleculele diluentului (oricare ar fi acesta, cu pronunat
caracter apolar, sau oarecum polar), ceea ce crete probabilitatea formrii multistratului.
Concluzii:
1. Injecia de volume mari de prob dizolvat n solveni nemiscibili cu faza mobil
este posibil doar n cazul n care diluentul are afinitate mai mare pentru faza
staionar prin raportare la analitul de interes. Din acest motiv, injeciile n acetat de
butil au aproape aceleai limitri ca i injecia n metanol pur (max. 20 L). Faza
7

2.

3.

4.

5.

staionar C18 AQ este cea mai permisiv, acceptnd un volum de injecie n

acetat de butil de 50 L.
ntotdeauna injecia de volume mari n dilueni nemiscibili cu faza mobil produce o
scdere exponenial a eficienei asociate picului cromatografic. Acest efect nedorit
poate fi compensat prin aplicarea unui profil de eluie n gradient liniar (plecnd de
la o compoziie a fazei mobile bogat n component apos i ajungnd la final la o
compoziie mai bogat n solvent organic). Profilul n gradient este absolut necesar
pentru eliminarea diluentului adsorbit n faza staionar, deci o astfel de abordare
rezolv simultan ambele aspecte.
n funcie de vscozitatea i solubilitatea n ap a diluentului, la injecia de volume
mari se pot observa efecte de deformare a picului cromatografic. Aceste corelaii
funcionale complexe trebuie analizate de la caz la caz. Atunci cnd diluentul
prezint o vscozitate asemntoare cu a fazei mobile (la nceputul separrii) i
solubilitatea sa n aceasta este redus, exist anse seminificative ca volumele
mari de injecie s nu induc deformri ale picului cromatografic. Diluenii cu
vscozitate mare n raport cu cea a fazei mobile pot fi folosii cu succes n cazul
analiilor care au tendina de a genera un uor tailing n condiiile normale de eluie,
deoarece prin efectele de canelare vscoas, efectul de fronting contrabalanseaz
tendina iniial.
Datorit stereochimiei centrilor de adsorbie de la suprafaa fazei staionare (n
condiiile utilizrii unor faze mobile foarte bogate n component apoas),
ncrcarea cea mai mare cu diluent nemiscibil se poate realiza n cazul utilizrii
linkerilor hidrofili (cu favorizarea adsorbiei multistrat).
Injecia de volume mari n dilueni nemiscibili cu faza mobil este un procedeu
accesibil n cazul utilizrii mecanismului de separare n faz invers, care poate fi
optimizat uor i rapid.

Referine bibliografice:
[1] Medvedovici A., David Vasile, David Victor, Georgita C. Retention phenomena induced by
large volume injection of solvents non-miscible with the mobile phase in reversed phase
liquid chromatography, J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 30, 199-213 (2007).
[2] Udrescu S., Medvedovici A., David V., Effect of large volume injection of hydrophobic
solvents on the retention of less hydrophobic pharmaceutical solutes in RP-LC, J. Sep.
Sci., 31, 2939-2945 (2008).
[3] Keunchkarian S., Reta M., Romero L., Castells C.B. Effect of sample solvent on the
chromatographic peak shape of analytes eluted under reversed-phase liquid
chromatographic conditions, J. Chromatogr. A, 1119(1/2), 20-28 (2006).
[4] Castells C.B., Castells R.C. Peak distortion in reversed-phase liquid chromatography as a
consequence of viscosity differences between sample solvent and mobile phase, J.
Chromatogr. A, 805(1/2), 55-61 (1998).
Web site-ul asociat proiectului a fost realizat i poate fi consultat la adresa:
http://www.chimie.unibuc.ro/cercetare/analitica/web%20Med.pdf
n baza prezentrii domeniului de cercetare prin conferina plenar susinut de directorul
de proiect n cadrul celui de-al XVII-lea Simpozion Internaional de tiine ale Separrii
desfurat la Cluj-Napoca, Romnia, n perioada 5-9 Septembrie 2011 (respectiv al
rezumatului publicat n volumul simpozionului) a fost solicitat indexarea proiectului n baza
8

internaional de date IndustryGateWay. n consecin, informaii preliminare asupra

proiectului pot fi gsite i la adresa:
http://industrygateway.org/db/viewProject.do?projectID=5319&source=1&action=fetch
sub codul 004175. Certificatul nregistrrii n baza internaional de date se ataseaz n copie
prezentului raport tiinific (vezi Anexa 1).
Deoarece a existat oportunitatea obinerii unor probe reale provenite dintr-un studiu
clinic de bioechivalen ntre dou formulri farmaceutice pentru administrare oral coninnd
simvastatin i metabolitul su asociat acidul simvastatic (prin bunvoina S.C. Labormed
Pharma S.A.) a putut fi dezvoltat i Obiectivul 4 (programat pentru anul 2012) legat de
identificarea i utilizarea unor solveni "verzi" n tehnicile bioanalitice care s permit
aplicarea principiului injeciei de volume mari de dilueni nemiscibili cu faza mobil.
Rezultatele experimentale obinute s-au constituit ntr-un manuscris care a fost deja naintat
pentru publicare.
Director de proiect,
Profesor Dr. Andrei Valentin Medvedovici,

Departamentul de Chimie Analitic

Facultatea de Chimie
Universitatea din Bucureti
os. Panduri nr. 90-92, Bucureti-050663, Romnia
E-mail: avmedved@yahoo.com
Fax: 021 4102279
Tel.: 072 3330423