Sunteți pe pagina 1din 13

10.12.

2014

ADN

ARN

Secveniere

Northernblot

Westernblot

PCR

RT-PCR

Secveniere

Southernblot

Hibridarea
in situ

Analiza
histochimic

Hibridarea
in situ

Proteine

Analiza
funciei

Utilizarea tehnicilor de analiz


a acizilor nucleici
Analiza ADN:
depistarea mutaiilor genice diagnostic precis al bolilor genetice
(prenatal, postnatal precoce);
identificarea polimorfismului individual dactiloscopie genomic
(analiza filiaiei);
depistarea ADN strin (bacterian, viral) diagnosticul bolilor
infecioase i gradului de infectare.

Analiza ARNm:
analiza expresiei genice esut-specific;
evaluarea gradului de expresie a genei normale / patologice;
Depistarea ARN strin (viral) diagnosticul bolilor infecioase i
gradului de infectare.

10.12.2014

Izolarea acizilor nucleici


ADN
Colectarea materialului biologic
(celule nucleate din orice esut)

Izolarea nucleilor (opional)


prin lezarea celulelor n soluii hipotonice

Lezarea celulelor (nucleilor)


prin aciunea detergenilor

Deproteinizarea:
prin aciunea proteazelor, urmat de prelucrarea
cu solveni organici (fenol, cloroform)

Precipitarea acizilor nucleici


n prezena alcoolilor i a srurilor (70% etanol)

Izolarea acizilor nucleici


ARN
Colectarea materialului biologic
din esutul de interes la stadia de interes

Lezarea celulelor
n prezena detergenilor i a inhibitorilor de ARNaze

Deproteinizarea
cu utilizarea solvenilor organici

Precipitarea selectiv a ARN


n prezena srurilor (LiCl, CH3COONa)

Precipitarea ARN
n prezena alcoolului.

ADN recombinant
molecul de ADN obinut
din segmente de origine
diferit, capabil s
funcioneze

ADN
recombinant

10.12.2014

Scopul tehnologiei ADN rec


Clonarea
genei/secvenei de
interes cu scop de:

multiplicare;
izolare i formare a bibliotecilor de ADNrec;
analiz molecular.

Expresia genic cu
scop de:

analiz a funciei genei clonate;


obinerea produsului proteic.

Etapele obinerii ADN recombinant


Izolarea ADN de cercetat i a vectorilor de clonare
Clivare enzimatic a ADN de cercetat i vectorului de clonare
Ligarea fragmentului de ADN de interes cu vectorul de clonare obinerea ADN
recombinant
Introducerea ADN recombinant ntr-o gazd de clonare transformare
Clonarea genei de interes prin replicarea vectorului
Expresia genei de interes prin sinteza proteinei
Selecia celulelor transformate prin tratare cu antibiotice i utiliznd marcherei
radioactivi sau fluoresceni

Etape necesare pentru manipularea


ACIZILOR NUCLEICI
-

Cum se izoleaz ADN sau ARN dintr-o celul?


Cum se obin fragmente de ADN de cercetat?
- FR (ER, SR, RFLPs, hri de restricie)
- ADNc (ADN complimentar unei mol. ARNm);
Cum se separ fragmentele de AN i cum se apreciaz
lungimea comparare a ADN la diferite persoane
(electroforeza AN)?;
Cum se vizualizeaz ADN, avnd dimensiuni
submicroscopice?
Principiile clonrii ADN in vivo (vectori de clonare,
gazde de clonare) i clonrii ADN in vitro;
Denaturarea ADN in vitro
Hibridizarea mol. ADN (ADN/ADN; ADN/ARN)

10.12.2014

Componentele necesare pentru


tehnologia AND rec = clonarea ADN in vivo:
ADN de clonat (de cercetat): FR, ADNc
Vector de clonare
Enzime de restricie = restrictaze
Gazd de clonare compatibil cu vectorul
Sistem de selecie a clonelor analizate
Set de enzime pentru manipularea ADN

Dimensiunile inseriilor clonate n diferii


vectori
Vectorul

Dimensiunile fragmentului
inserat

Gazda de
clonare

Plasmide

Pn la 10 kb (ADN
genomic, ADNc)

Bacterii,
Drojdii

Bacteriofagi

Pn la 25 kb (ADN
genomic, ADNc)

Bacterii

Cosmide

30-45 kb (ADN genomic)

Bacterii

BAC (Cromozom artificial


al bacteriilor)

Pn la 300 kb (ADN
genomic)

Bacterii

YAC (Cromozom artificial


al drojdiilor)

0,2-2.0 Mb (ADN genomic)

Drojdii

Vectorul:
-se replic autonom n celula gazd (conine punct ori)
-are capacitate s insereze i s transfere ADN strin (conine situsuri de
restricie)
-conine gene de rezisten la antibiotice (capacitate de a fi selectate)

10.12.2014

Celula bacterian

Vector plasmidic

Cromozom artificial
al drojdiilor (YAC)

Ligarea inseriilor n vector

10.12.2014

Obinerea FR fragmentelor de restricie prin


aciunea specific a ER (enzimelor de restricie)

Situsuri recunoscute de enzime de restricie

10.12.2014

RFLPs polimorfismul FR la dou persoane X i Z

ER

edonucleaz situs specific de origine


bacterian care recunoate un SR i cliveaz
ADN bicatenar

SR

secven palindromic de nucleotide,


recunoscut i clivat de enzimele de
restricie

FR

fragment ADN bicatenar obinut prin clivare


cu ajutorul restrictazelor

RFLPs
Hri de
restricie

Polimorfismul Lungimii Fragmentelor de


Restricie, ce identific diferenele
individuale ale moleculelor de ADN
dispunerea relativ a situsurilor de restricie
ntr-o molecul de ADN

12 kb
10 kb

10 kb

8 kb

2,5 kb
10 kb

6 kb

6 kb

5 kb

6 kb

4 kb

5 kb

2,5 kb
2 kb

+
M

10.12.2014

Vizualizarea ADN
Colorarea specific
Fuxn bazic
(in situ)

Vizualizare cu sonde marcate

Fluorescente
(reci)

Radioactive
(calde)

Bromur de
etidiu
(n geluri)
Este necesar de tiut
Sunt necesare

structura secvenei

cantiti mari de ADN

ADN de cercetat

10.12.2014

Clonarea in vivo, ntr-o cel


bactrerian, a unei gene umane

Probleme:
Genele umane sunt mari;
Conin secvene reglatoare
diferite de cele a bacteriilor;
Conin introni ce nu pot fi
nlturai ce celula
bacterian.

Soluie:
Obinerea unui ADNc pe baza
ARNm caracteristic genei
int

Izolarea ARN poli(A)+


Hibridarea poli(A) cu oligo(dT)
Sinteza ADNc cu ajutorul revertazei
(ARN-polimeraz-ADN-dependent)

Hidroliza ARN
(ARN-aza H)

Sinteza ADN bicatenar


(ADN-polimeraza)

Etapele obinerii ADNc (ADN


complementar)

Rolul practic al tehnicilor de analiz a acizilor nucleici:


Cercetare secvenierea ADN, formarea bibliotecilor de gene, studiul
expresiei genice, studiul mecanismelor de reglare, studiul consecinelor
mutaiilor.
Depistarea persoanelor purttoare de mutaii - prenatal sau postnatal,
cu scop de prevenire a naterii copiilor cu anomalii genetice sau
manifestrii unor patologii severe.

Terapie genic (alegerea genei int, construirea vectorilor de gene


etc.).

Depistarea ADN strin (viral sau bacterian) n diagnosticul bolilor


infecioase.

Identificarea polimorfismelor individuale n analiza filiaiei, n criminalistic.

10.12.2014

Molecule
ADN

Clonare
ADN

Clonare in
vivo

Analiz
molecular

Clonare in
vitro (PCR)

Hibridare
molecular

Clonarea ADN
= multiplicarea unei mol ADN prin replicare repetat

in vivo

in vitro

Tehnologia ADN recombinat


Utilizarea celulei gazd de
clonare
Replicarea ntr-un vector de
clonare cu utilizarea aparatului
de replicare a celulei gazd
Cu posibilitatea obinerii
produsului proteic

Tehnica PCR
Este realizat n eprubet
Replicarea unei secvene de
interes cu ajutorul unui aparat
de replicare artificial

Clonarea in vitro PCR


(reacia ciclic de polimerizare a
noilor copii de ADN)

10

10.12.2014

Componentele necesare pentru


clonarea in vitro (PCR):
- ADN de cercetat
- Primeri specifici secvenei de clonat
complimentari secvenelor flancante
- Taq-polimeraza ADN-polimeraz termostabil
- Dezoxinucleozidtrifosfai (dNTP)
- Instalaie de modificare ciclic a temperaturii:
- t de denaturare ADN
- t de renaturare (ADN+primer)
- t de polimerizare (elongarea catenelor
noi de ADN)

Etapele tehnicii PCR


A. Pregtirea amestecului cu toate componentele reactante
B. Repetarea automat a procedurelor de denaturarerenaturare-elongare de 30-35 ori
Denaturarea ADN la 96oC
Rcirea pn la temperatura de renaturare a primerilor
Elongarea catenelor ADN la 72oC
C. Analiza produilor PCR
- electroforeza
- colorarea
- interpretarea rezultatelor

11

10.12.2014

Biblioteci de gene
Biblioteci genomice conin secvene de ADN
genomic, obinut prin digestie enzimatic

Biblioteci ADNc conin secvene de ADNc,


obinute n baza setului de ARNm
Biblioteci cromozomiale conin secvene
caracteristice unui cromozom

Etapele obinerii
bibliotecii genomice

Izolarea ADN genomic


Restricia ADN genomic
i vectorial
Ligarea ADN vectorial cu
fragmente ADN genomic
Introducerea moleculelor
recombinate n gazd
Selecia clonelor

12

10.12.2014

Etapele obinerii bibliotecii ADNc


Izolarea ARNm
Sinteza ADNc
Ligarea linkerilor
la capetele ADNc
Restricia ADNc i
a vectorului
Ligarea ADNc vector
Transformarea
gazdei potrivite
Selecia clonelor

13