Acizi nucleici

Hidroliza
Distributia

N
O
O

P
O

NH

5`

NH2

3`

NH2
X

O
O

5` GCA 3`

P
O

CH2

3`

NH2
X

O
O

P
O

3`

A
O
-

CH2

N
O

3`

OH

NH

Dou catene antiparalele (una cu polaritate 5-3 i cealalt

antiparalel cu polaritatea 3-5) complementare nu identice
formeaz o dubl helice cu orientare dreapt
H

H2 C
O

H N

N H

Dezoxiguanozin

H
N

O
O

Dezoxicitidin CH2
O
H

H2 C
O

O
H
Dezoxiadenozin

O
H N

H
N

O
O

Dezoxitimidin

H2 C
O

Hidroliza enzimatic
Nucleaze:
-exonucleaze (ADN polimerazele I i III)
-endonucleaze
endonucleaze de restricie (restrictaze)
evideniate la bacterii
recunosc secvene nucleotidice numite
palindroame
taie ADN dublu catenar nemetilat la resturile
de A sau C

Enzima Secvena recunoscut

BamH I 5`-G GATCC-3`

Sursa
Bacillus
amyloliquefaciens H

BglII

Bacillus globigii

EcoR I
EcoRV

5`-A GATCT-3`

5`-CAG
5`-GTT
5`-GAT
5`-G
5`-A
5`-T

5`-G AATTC-3`

Escherichia coli RY13

5`-GAT ATC-3`

Escherichia coli B946

Hind III 5`-A AGCTT-3`

Haemophilus
Rd

Taq I

Thermus aquaticus

5`-T CGA-3`

influenzae

5`---AAGCTT---3`
3`---TTCGAA---5`

5`---TGGCCA---3`
3`---ACCGGT---5`

Hind III
5`---A
3`---TTCGA 5`

Bal I
5`

AGCTT---3`
A ---5`

5`---TGG
3`---ACC

CCA---3`
GGT---5`

5`---GAGCTC---3`
3`---CTCGAG---5`
Sst I
5`---GAGCT3`
C---3`
3`---C
3`TCGAG ---5`

Formare ADN recombinant

ADN1

ADN2

5`---GAATTC---3`
3`---CTTAAG---5`

5`
3`

EcoRI
5`---G
3`---CTTAA

GAATTC
CTTAAG

3`
5`

EcoRI
AATTC---3`
G---5`

5`
3`

G AATTC
CTTAA G

Renaturarea fragmentelor ADN si

sudarea lor de ctre ADN-ligaz
5`---GAATTC
3`---CTTAAG

3`
5`

5`

GAATTC---3`

3`

CTTAAG---5`

Molecule de ADN recombinant

3`
5`

Separarea fragmentelor ADN rezultate

din aciunea enzimelor de restricie
Electroforaza pe gel de poliacrilamid
pentru fragmente <500 perechi de baze
Electroforaza pe gel de agaroz pentru
fragmentele cu dimensiuni mai mari
Hri de restricie

Distribuia i dimensiunile ADN

ADN are form liniar sau circular

Moleculele ADN dintr-o celul alctuiesc

cromozomii acelei celule.

 Ce sunt genele ?
secvene nucleotidice care conin informaia cu
privire la sinteza unui singur lan polipeptidic
sau a unei singure molecule de ARNr sau ARNt

Genom = totalitatea genelor din cromozomii

unei celule.

Distribuie ADN
La procariote:
-ADN cromozomial

Plasmide (ADN extracromozomial, circular)

-molecule mici care trec uor prin membrana celulei gazd
-conin o cantitate redus de informaie genetic
-conin gene care specific proteine, ce confer bacteriei
rezistent la antibiotice
-se autoreplic extrem de rapid i autonom fa de ADN
cromozomial.

La eucariote
ADN se afl n nucleu.
1% din ADN celular total se afl n mitocondrii i este
circular
5-10% din ADN este codificator pentru proteine i ARN

Genele sunt formate din exoni i introni (discontinuitatea

genelor); excepie histone i interferon

 Dup gradul de repetare al secvenelor nucleotidice:

60% din ADN celular sunt secvene ADN nerepetitive, unice;
codific proteine
20% din ADN sunt secvene cu grad mediu de repetare
(zecisute copii/celul); codific ARNr, ARNt, histone
10% din ADN cu grad foarte mare de repetare (mii de
copii/celul); se afl n centromere i telomere;
au rol structural n cromozomi

Dimensiunile ADN
La procariote,
ADN circular = un cromozom cu

E. coli
ADN ~ 1,6 mm
diametrul celulei ~ 2 m

4 x 106 p.b.

La om: cel mai scurt cromozom 34 x 106

p.b.

cel mai lung 263 x 106

Lungimea moleculelor ADN dintr-o singur celul uman

este de ~ 2 m

Structura superhelicoidal a ADN

Suprarsucirea moleculei ADN n jurul
axei proprii

Suprarsuciri
spre stnga

Suprarsuciri
spre dreapta

(superhelix
negativ)

(superhelix
pozitiv)

Helix circular normal

Axa de suprarsucire

Axa de suprarsucire

Topoizomerazele
Topoizomeraza I, nu necesit ATP
Topoizomeraza I
Tyr
P

OH
Incizie si legare
la enzim

Topoizomeraza I
Tyr
5` O
P
OH
3` Rotirea
captului 3`

Topoizomeraza I
Tyr
5` O
P
OH
3`

Enzima
Disocierea
enzimei

Giraza (Topoizomeraza II)

Necesit ATP i face incizii n ambele
catene; introduce suprarsuciri negative

Etapa 1

Etapa 2

Etapa 3

ADN suprarsucit

 Topoizomerazele I i II menin n celulele vii un

grad potrivit de superhelicitate negativ.

antibiotice care inhib ADN-giraza suprim

creterea i dezvoltarea bacterian:
acid nalidixic (negram)
derivaii si fluorurai (norfloxacin, ciprofloxacin),

Cromozomii eucariotelor

Cromatina (cromozomii interfazici)=material amorf prezent n nucleu n

interfaz; conine ADN, proteine, ARN

Cromozomii sunt complexe ADN-proteine rezultate prin condensarea

cromatinei n timpul mitozei
Fiecare cromozom conine o molecul ADN liniar
Nr. Cromozomilor variaz de la o specie la alta (celulele somatice umane conin
46 cromozomi; 23 perechi)

 Histonele = proteine bazice

interacioneaz ionic cu anionii fosfat din
ADN

Sunt 5 tipuri de histone

Histone bogate n lizin: H 2 A i H 2B
Histone bogate n arginin: H 3 i H 4
care intr n structura nucleozomului
Histone de legtur H1 care leag
nucleozomii ntre ei.

Nucleozomii = unitatea de baz a

cromatinei

grad de compactare pentru ADN egal cu 7

Cilindru: 11x11x5,5 nm
140 pb se rsucesc de 2 ori n jurul octamerului histonic

Miezul nucleozomului

ADN de
legtur

(H2A, H2B, H3, H4)2

ADN
Histona H1

Solenoizii asigur o scurtare de 40

de ori a formei B a ADN

Cromozom

Protein nuclear
Fibra de 30 nm

ADN

Octamerul histonic

Histone + ADN

Histona H1

ADN

Dogma central a biologiei

moleculare
ADN conine informaia genetic sub forma unor
secvene de nucleotide

ADN

Transcriere

ARNm

Traducere

Proteine

Revers transcriere

Toat informaia din celula parental este

transferat celulelor fiice.

BIOSINTEZA ADN

REPLICAREA

 Replicarea este
-semiconservativ
-bidirecional
-semidiscontinu

Caten parental

Caten parental

Caten parental

Catene fiice

Caten parental

Catene parentale

Catene
fiice

 Miercuri

Curs 12

Replicare
Mutaii
Tipuri ARN
Transcriere
Prelucrri posttranscriere

2014

Replicarea este
semiconservativ
Prin replicarea unei molecule ADN se formeaz dou
molecule ADN fiice identice cu parentala

replicare

diviziune celular

fiecare celul fiic primete

caten parental de ADN
caten nou sintetizat, complementar cu parentala.

Unde ncepe replicarea ADN

bacterian ?

Originea replicrii

n regiuni origine (ori C) care

conin secvene consens bine conservate de-a
lungul evoluiei,
bogate n A=T, uor de denaturat

 La E.coli
o molecul unic de ADN, alctuiete un
cromozom
exist o singur regiune Ori C care direcioneaz
nceperea replicrii.

 Replicarea poate fi uni sau bi-direcional

Cromozomul circular initial

ORI

ADN initial
1

Puncte de initiere
replicare

Originea replicrii
ADN dup replicare

Bifurcatii de
replicare

Replicarea este bidirecional

n cele mai multe organisme
ADN circular se replic simultan n ambele
direcii.

Cromozomul bacterian are n timpul replicrii

forma literei theta ()

Bucla de replicare formeaz o structur n ADN circular

O singur bifurcatie de replicare

Dou bifurcatii de replicare

Ce este Bifurcaia de replicare ?

bifurcaia de replicare reprezint regiunea

activ n replicare care se deplaseaz de-a
lungul duplexului parental

Sensul de deplasare al bifurcatiei

3`
5`
Catena leading

5`
3`

Catena lagging
Fragmente Okazaki
ARN primer

3`
5`

ARN primer

Replicarea ADN bacterian este bidirecional

Ori
Cromozomi

Terminarea replicrii

Ori

Ori

Cromozomul
circular initial

Bifircatiile de replicare
Catene fiice

Catene parentale

 Terminarea replicrii
are loc atunci cnd
cele dou bifurcaii de replicare
se ntlnesc
ntr-o regiune
opus regiunii Ori

Elementele necesare pentru

sinteza de ADN
Substraturi
dATP, dGTP, dCTP, dTTP i
ATP, GTP, UTP, CTP necesari sintezei de ARN
n cursul replicrii.
Matria (template)
ARN iniiator sau primer necesar iniierii
sintezei de ADN

Enzimele implicate n replicare

ADN polimeraze-ADN dependente

Helicaza
Topoizomeraze (giraza)
ADN ligaza
ADN primaza

ADN polimeraze ADN dependente

La procariote sunt 3 polimeraze: I, II i III
Caracteristici comune ale celor 3 polimeraze:
-au activitate polimerazic
-necesit caten ADN matri
-sintetizeaz catene ADN numai cu directia
5`
3`
-ADN polimerazele nu iniiaz catene ADN, necesit
ARN primer
-prezint activitate exonucleazic 3`
5`

Atribute specifice celor 3

polimeraze
ADN polimeraza I
are activitate polimerazic redus
(comparativ cu ADN polimeraza III)
catalizeaz formarea a 20 de legturi fosfodiesterice
nainte de eliberarea matriei
ADN p I (10 nucleotide pe secund)
ADN p III (1000 nucleotide pe secund).

5`
ARN primer
(10-12 nucleotide)
O

Catena parental
ADN

3`

O
O

CH2

CH2

OH

P
O

O
-

OH

O
O

PPa
..OH

3`

OH

CH2

CH2

OH

3`

O
-

5`
Catena
complementar

O
O

CH2

OH

CH2

5`

OH

5`

 are activitate exonucleazic:

3`5` i
5`3`

Fragment 36 Kd
H2N

Exonucleaz
5`
3`

Fragment 67 Kd
Exonuclez
3`
5`

Polimeraz

COOH

5`

3`
T ...... A

3`

5`

T ...... A

C
C

T ...... A

Locul de hidroliz al
exonucleazei 3` 5`
3` HO

T
C

......

Locul de hidroliz al
exonucleazei 5` 3`

T ...... A
T ...... A

T ...... A

T ...... A

a)

5`

3`

b)

ADN polimeraza I ndeprteaz ARN primer ca urmare a

activitii exonucleazice 5`
3` i l nlocuiete cu ADN ca
urmare a activitii polimerazice.

5`

ADN polimeraza III are rol central n

procesul de replicare n vivo
are o procesivitate mare adic leag strns i
elibereaz catena matri numai dup replicarea
complet a acesteia;
are o eficien catalitic foarte mare n calitate
de polimeraz (polimerizeaz 1000 nucleotide
pe secund);
prin activitatea exonucleazic 3
de corector (proofreading).

5 are rol

ADN polimeraza III asigur fidelitatea procesului

de replicare pe dou ci:
respectarea principiului complementaritii
bazelor; (acuratee de 10 4 perechi de baze)

activitatea de corector (proofreading).

Helicazele

Desfac duplexul ADN pe portiuni mici, cu

consum de ATP, introducnd suprarsuciri
pozitive

ADN suprarsucit

ADN-giraza
ADN-giraza (topoizomeraza II),
cu consum de ATP,
introduce suprarsuciri negative n ADN
cu scopul de a contracara n avans suprarsucirile
pozitive introduse de helizaz n procesul de
replicare.
Este prezent numai la procariote.

ADN ligaza
ADN ligaza catalizeaz
formarea unei legturi fosfo diesterice ntre
gruparea 3`-OH de la captul unei catene ADN, cu
gruparea 5`-fosfat de la captul altei catene ADN

5`

3`

ADN

ADN

3`

5`

A AMP

3`

5`
O

OH
5`

3`

5`

3`

3`

5`

OH

Ligaz
Ligaz-AMP

R
PP

ADN

P-R-A
3`

5`

AMP

 ADN-ligaza necesit AMP

Sursa de AMP este:
ATP pentru eucariote i

NAD

pentru E.coli i alte bacterii.

ADN ligaza NU poate cataliza
legarea a dou fragmente
monocatenare de ADN

 Enzima are rol n:

-sinteza catenelor de ADN;
-repararea ADN;
-recombinarea genetic.

Unete endergonic fragmentele ADN din

catena lagging (sintetizat discontinuu)

ADN primaza
Sintetizeaz fragmente scurte de ARN,
8-10 nucleotide
Este o ARN polimeraz -ADN dependent
Pentru sinteza catenei leading (continu) este
necesar un singur ARN primer.
n cazul catenei lagging (discontinu), fiecare
fragment Okazaki necesit un ARN primer.

Sensul de deplasare al bifurcatiei

3`
5`
Catena leading

5`
3`

Catena lagging
Fragmente Okazaki
ARN primer

3`
5`

ARN primer

Replicarea este semidiscontinu

ADN polimerazele, din orice surs, sintetizeaz
numai catene cu direcia 5`
3`
Cum are loc sinteza catenei avnd ca matri catena
cu direcia 5` 3` ?
Okazaki a propus un model, conform cruia
replicarea este semidiscontinu

Sensul de deplasare al bifurcatiei

3`
5`
Catena leading

5`

ARN primer

3`
Catena lagging
Fragmente Okazaki
ARN primer

3`
5`

catena n avans sau catena leading este sintetizat continuu,

n direcia 5` 3`, de ctre ADN polimeraza III
catena n ntrziere sau catena lagging este sintetizat
discontinuu de ctre ADN polimeraza III.
Enzima sintetizeaz fragmente Okazaki (150-200 nucleotide), n direcia
5` 3` fiecare cu ARN primer.

Replicarea se desfoar in vivo cu viteze

egale pentru ambele catene
5`
3`
Catena "lagging"

ADN ligaza
ADN polimeraza I
Primaza
Helicaza Primozom

3`
ADN polimeraza III

5`
ADN giraza

Catena "leading"
5`
3`

Curs 12

Luni

Replicare eucariote
Mutaii
Transcriere
ARN
Codul genetic
Biosintez proteine
Reglarea biosintezei proteinelor

12.01.2015

Replicarea cromozomului bacterian

Iniiere
Elongare
Terminare
Iniierea replicrii presupune formarea replizomului ( enzimele i
factorii replicrii )
In regiunea ori C helicaza + primaza formeaz primozomul.
Primozom + ADN polimeraza III + ADN giraza + proteine replizomul

ADN
Ori C
1

Segment ADN

ATP-dnaA

responsabil de
corectitudinea iniierii
replicrii

dnaB
dnaC-ATP
3
dnaC
dnaB

4
Replicare

Helicaza

Iniierea
Helicaza denatureaz ADN parental n regiunea OriC
Proteine stabilizatoare mpiedic renaturarea ADN
Primaza iniiaz sinteza unui ARN primer
Primerii, furnizeaz gruparea 3`-OH necesar iniierii sintezei de
ADN de ctre ADN polimeraz

Catena
leading

Catena
lagging

Proteine care se leag

la ADN monocatenar

Polimeraza
Helicaza
Primaza

Elongarea ARN iniiator

ADN polimeraza III catalizeaz

adugarea dezoxiribonucleozid trifosfailor,

la captul 3` al ARN primer,
n ordinea dictat de matri.
ADN polimeraza III sintetizeaz ADN n direcia
5` 3`
Deoarece catenele ADN sunt antiparalele, polimeraza
funcioneaz asimetric

5`
ARN primer
(10-12 nucleotide)
O

Catena parental
ADN

3`

O
O

CH2

CH2

OH

P
O

O
-

OH

O
O

PPa
..OH

3`

OH

CH2

CH2

OH

3`

O
-

5`
Catena
complementar

O
O

CH2

OH

CH2

5`

OH

5`

Replicarea se desfoar in vivo cu viteze

egale pentru ambele catene
5`
3`
Catena "lagging"

ADN ligaza
ADN polimeraza I
Primaza
Helicaza Primozom

3`
ADN polimeraza III

5`
ADN giraza

Catena "leading"
5`
3`

Terminarea replicrii
Proteine specifice
se leag la secvena terminatorie
mpiedicnd helicaza
(proteina dna B)
s desfac duplexul ADN

Fidelitatea replicrii ????

Crearea unei catene noi complementare cu
matria
Activitatea de corector a ADNp III
Necesitatea unui primer
Alegerea unui sens unic al replicrii 5`3`
Existena unui sistem reparator constitutiv
post-replicativ
Existena unui sistem inductibil de reparare

5`

3`
T ...... A

3`

5`

T ...... A

C
C

T ...... A

Locul de hidroliz al
exonucleazei 3` 5`
3` HO

T
C

......

Locul de hidroliz al
exonucleazei 5` 3`

T ...... A
T ...... A

T ...... A

T ...... A

a)

5`

3`

b)

ADN polimeraza I ndeprteaz ARN primer ca urmare a

activitii exonucleazice 5`
3` i l nlocuiete cu ADN ca
urmare a activitii polimerazice.

5`

Replicarea la eucariote
Replicarea la eucariote:
-este semiconservativ
-se desfoar bidirecional
-din mai multe origini.
Replicarea la eucariote are loc n faza
S, de sintez, a ciclului celular (durata 8
ore)

 Diviziunea celular la eucariote are loc n

patru faze distincte

G2
Mitoza

Faza S
G1
G0

 Faza S este separat de faza mitotic prin

perioadele de gol sintetic, G1 i G2
Faza G0, de nondiviziune (resting phase).
Trecerea G0

G1

mitoz

este reglat de kinaze activate de

cicline proteine a cror concentraie crete sau
scade dramatic n cursul ciclului celular.

 Celulele tumorale tiu s evite faza G 0 a

ciclului celular.

La eucariote s-au identificat cinci

polimeraze
, i.
i sunt implicate n replicarea ADN
nuclear.
pentru sinteza catenei lagging

pentru sinteza catenei leading.

(Are aciune 3` 5` exonucleazic)

i sunt implicate numai n repararea

ADN

 La eucariote 100 de bifurcaii de replicare

pe cromozom
la procariote: 1000 perechi de baze/secund
la eucariote: 100 perechi de baze/secund), ca urmare a
interferenelor cu nucleozomii i proteinele cromozomiale.

ADN

La eucariote ADN nuclear este replicat n

ntregime i o singur dat per ciclu celular.

ADN replicat este marcat prin

metilarea, n general a citozinei, la 5-metilcitozin pentru a se evita o nou replicare
pn la mitoz.

Gradul de metilare este de 3-5% pentru

regnul animal.

Terminarea replicrii la
cromozomii liniari
Indeprtarea primerului din captul 5` al catenei
lagging i degradarea ADN monocatenar rmas
duce la scurtarea cromozomului la fiecare rund de
replicare
i pierderea de informaie genetic de la capetele
cromozomilor.

 Cromozomii eucariotelor conin la ambele

capete telomere.
Cromozomii fr telomere sunt instabili:
fuzioneaz cu ali cromozomi
sunt degradai.

Telomerele sunt secvene de cca. 1000

nucleotide bogate n G care se repet n
tandem.
oligonucleotid telomeric (GGGGTTTTGGGG)

quadruplex telomeric, regleaz

activitatea telomerazei
T
T
T
G

T
G

G
G

G
G
G
G

G
G
G
G
G

G
G

G
T

Telomerazele sunt
ribonucleoproteine

Telomeraza funcioneaz astfel similar

cu o revers transcriptaz

 Absena telomerazei, care permite

trunchierea gradual a cromozomilor la
fiecare rund de replicare a ADN, poate
contribui la senescena normal a
celulelor.
Creterea activitii telomerazei poate
permite replicarea i creterea celular
necontrolat, proces care se produce n
cancer.

Reconstituirea cromatinei
In faza S cantitatea de ADN i histone se
dubleaz
n timpul replicrii:
histonele existente se asociaz cu duplexul
care conine catena fiic leading
cele nou sintetizate se asociaz cu duplexul
care conine catena fiic lagging.

Compui care afecteaz replicarea

folosii ca medicamente antibacteriene i antivirale
Antimetaboliii (5-fluorouracilul, metotrexatul, 6mercaptopurine) reduc sau inhib producerea de
substrate (dNTP) pentru replicare.
Substratele analoage (azidotimidina, citozin
arabinozidul) pot fi ncorporate n molecula de ADN de
ctre ADN polimeraze inhibnd viitoarea replicare.
Inhibitori ai ADN girazei (acidul nalidixic i
fluorochinolonele), enzim care elimin torsiunile
introduse de giraz n procesul replicrii.

Reverstranscrierea
Sinteza de ADN pe matri de ARN
Revers transcriptaza este prezent n virusurile
oncogene care conin ca material genetic ARN
Enzima este o ADN polimeraz ARN dependent,
care se activeaz numai la ptrunderea n celula gazda.
Primerul folosit de revers transcriptaz est un ARNt
nglobat n particular viral
Enzima prezint
activitate de revers transcriptaz:
activitate ribonucleazic (ribonucleaza H);
activitate ADN polimerazic ADN dependent.

Virus cu 2 molecule ARN

si revers transcriptaz

Ptrundere n calula gazd

ARN legat de revers transcriptaz
Sinteza ADN de ctre
revers transcriptaz
ARN-ADN hibrid
ARN viral
ADN dublu catenar
Genom gazd
ADN din celula gazd

Sinteza ADN dublu catenar

Integrarea ADN n genomul celulei gazd

 Revers transcriptaza nu prezint activitate

exonucleazic 3`

5`, putnd face greeli n

replicare, ceea ce explic numrul mare de

tulpini virale.

 HIV este un virus versatil rspunztor de SIDA

(virusul conine genele: pol, env i gag)
Revers transcriptaza poate utiliza ca matri
orice ARN pe care construiete un ADNc
(complementar), aceast posibilitate putnd fi
utilizat n obinerea unor gene sintetice.

MUTAII. REPARAREA ADN

Notiunea de mutatie a fost elaborata in anul1901
de catre Hugo de Vries care este autorul
binecunoscutei teorii mutationiste.
Mutaiile sunt modificri permanente ale secvenei
nucleotidice a ADN
Mutaiile punctiforme= modificri ale unei singure
perechi de baze

Mutaiile pot fi produse prin:

Substituia unei baze cu alt baz

tranziia

A..T
G.C

transversia

Deleia
Inseria

AT
CG

Cauzele care determin apariia

mutaiilor

a.Erori n procesul de replicare care scap

celor 2 sisteme:
-activitate de corector a ADN polimerazei III.
-sistemele specializate de reparare postreplicative

5`

3`
T ...... A

3`

5`

T ...... A

C
C

T ...... A

Locul de hidroliz al
exonucleazei 3` 5`
3` HO

T
C

......

Locul de hidroliz al
exonucleazei 5` 3`

T ...... A
T ...... A

T ...... A

T ...... A

a)

5`

3`

b)

ADN polimeraza I ndeprteaz ARN primer ca urmare a

activitii exonucleazice 5`
3` i l nlocuiete cu ADN ca
urmare a activitii polimerazice.

5`

 b.Factori chimici
Agenii nealchilani:
formaldehida (H2C=O): reacioneaz cu gruprile
amino;
hidroxilamina (NH2-OH) reacioneaz specific cu
citozina;
acidul azotos (HNO2) determin dezaminarea oxidativ
a citozinei, adeninei, guaninei modificnd
mperecherea bazelor deoarece o amin se transform
n ceton.
Agenii alchilani.
etilmetan sulfonatul, adaug o grupare metil la azotul
din nucleul purinic labiliznd legtura N-glicozidic prin a
crei hidroliz apare un loc depurinat;

 c.Analogi structurali ai bazelor azotate pot fi

ncorporai n catena de ADN.

5-bromuracilul, se mperecheaz de obicei cu adenina. Forma

enolic se leag cu guanina. Tranziia produs este
AT cu G..C
2-amino purina se mperecheaz de obicei cu timina. Forma sa
tautomer normal (amino), se poate lega cu citozina
producnd mutaia prin tranziie GC la AT.

HN
O

Br

N
H

5-bromo uracil

N
H2N

NH

2-amino purina

 d.Factori fizici
Radiaiile ultraviolete (200-400 nm) induc
formarea dimerilor de timin TT

UV

Formarea dimerului de
timin ntr-o caten ADN

Structura unui dimer

de timin intracatenar

Radiaiile ionizante
Razele X, radiaiile , determin deschiderea
nucleului purinic, depurinarea i ruperea
legturilor fosfo-diesterice.

 e.Depurinri-Hidroliza legturilor glicozidice

f.Dezaminri spontane
CU
G Xantin
A Hipoxantin

 g.Inserie:

Acridin

h.Deleie:

pH i temperatur

Repararea ADN
Prin:
a.excizie
-excizia dimerilor de timin
-excizia unei secvene ce conine o
baz dezaminat
b.direct
-fotoreactivare
-dealchilarea guaninei
c.prin recombinare.

Repararea prin excizie

a.Repararea ADN la procariote prin excizia dimerilor
de timin
5`
3`
3`

5`
Excizia unui fragment
de 12 nucleotide

Sinteza de ADN de ctre

ADN polimeraza I

Formarea unei legturi covalente

de ctre ADN ligaz

 Repararea ADN n cazul dezaminarii uneia

dintre bazele azotate
prin dezaminarea citozinei uracil
adeninei hipoxantina
guaninei xantina
se face analog reparrii prin excizie

DE ce timin n ADN i nu uracil ?

Prezenta timinei i nu a uracilului n ADN
permite repararea ADN ce conine citozina
dezaminat (uracil).
Folosirea timinei n structura ADN i nu a
uracilului mrete fidelitatea mesajului
genetic.

Repararea direct a ADN

prin fotoreactivare
ADN fotoliaza,
o enzim care se afl n toate organismele i care este activat
de radiaiile din domeniul vizibil ( = 400-600 nm).

cliveaz legtura covalent timin-timin din

dimerii de timin
Absena genetic a fotoliazei duce la creterea
riscului de apariie a cancerului de piele.

Caracteristicile structurale ale ARN

Sunt produi de policondensare a
ribonucleozidtrisfosfailor

Structura primar:
H3PO4
-riboz
Baze azotate: A,G,U,C

N
O
O

P
O

NH

5`

NH2

3`

NH2
X

O
O

5` GCA 3`

P
O

CH2

3`

NH2
X

O
O

P
O

3`

A
O
-

CH2

N
O

3`

OH

NH

 Structura secundar
ARN este monocatenar cu poriuni bicatenare
Bucl cu baze
nemperechiate

Segment cu baze
complementare

Coninutul n A al ARN este diferit de cel n U i cel

de G diferit de cel n C

 Rolurile diferitelor tipuri de ARN

 ARNr -caracteristici structurale

conine zone dublu catenare i monocatenare

-este heterogen ca form i mrime.

-la procariote, ARNr : 23S, 16S i 5S
la eucariote, ARNr : 28S, 18S, 5,8S i 5S

ARNr
-este tipul de ARN cel mai stabil metabolic
-reprezint ~80% din ARN celular total.

Ribozomii
ARNr = componenta catalitic a ribozomilor
Ribozomii = complexe ribonucleoproteice
ARNr + proteine
-proteinele:
au roluri catalitice sau
sunt implicate n recunoaterea i legarea ARNm
aminoacil~ARNt la ribozomi

Rolul ribozomilor
Ribozomii constituie sediul biosintezei proteinelor

Ribozomii permit conlucrarea ARNm, ARNt i ARNr, n vederea sintezei proteinelor.

 Conin trei situsuri:

-situsul aminoacid, care leag ARNt purttor al unui
aminoacid;
-situsul peptid, care leag ARNt purttor al unui lan
polipeptidic;
-situsul de eliminare de pe care este eliberat ARNt
liber.

Ribozom 70 S

ARNt

E. Coli conine ~75 tipuri de ARNt

Reprezint ~ 15% din masa ARN celular total

 Structura ARNt (solubil sau adaptor)

conine ntre 75 i 90 ribonucleotide;

raportul A+G/U+C este apropiat de 1;

prezint o conformaie n foaie de trifoi

a)

Situs de
legare aminoacid

3`

CCA

Brat T C

b)

5`

5`
Perechi de baze
complementare
Bratul DHU

Brat T C
Bratul
DHU
Bratul variabil

Bucla
anticodon

Bratul anticodon
Anticodon

3`

 ARNt are cel mai mare coninut de baze minore

baze azotate modificate structural prin:
-metilri
- tiolri
-hidrogenri
dup sinteza ARNt (POST-TRANSCRIERE)

O
H3C

NH
HO H2 C

HO H2 C

OH OH
Dihidrouridin
(DHU)

O
NH

HN
O

OH OH
Ribotimidin
(T)

HO OH
4-Tiouridin

O
O

OH OH
Pseudouridin

NH
HO H2 C

HO H2 C

NH

HO H2 C

N
O

OH OH
Inozin

NH
N

Funciile ARNt
Leag aminoacizii specifici, activai, prezeni
n citosol, la restul adenilic din secvena CCA i
i transport, la ribozomi, sub forma
complexelor aminoacil~ARNt

 Adaptarea aa transportat n dreptul codonului de

pe ARNm prin
recunoaterea codon-anticodon,
pe baza complementaritii bazelor

3` A ~ aa1
C
C

5`

Anticodon 3` C C G 5`

5`

3` A ~ aa2
C
C

5`

Anticodon 3` A G U 5`

GGC

UCA

Codon 1

Codon 2

3`

ARNm

ARNm
Structur

-este monocatenar, liniar, de lungime variabil;

-este sintetizat prin transcrierea catenei matri
sau template (necodificatoare).

-ARNm conine informaia n limbaj nucleotidic.

ADN
5` - G C A T T A T G C - 3`
3` - C G T A A T A C G - 5`

ARN

5` G C A U U A U G C 3`

-informaia depozitat n ARNm

sub forma tripletelor de nucleotide numite codoni
este decodificat la nivelul ribozomilor.

ARNm procariot
este poligenic sau policistronic;

ntre gena transcris,

ARNm i
protein exist
o relaie de colinearitate

ARNm eucariot
este monogenic;
nu este relaie de colinearitate:
gen-ARNm-polipeptid
gena pentru sinteza ARNm cuprinde:
exoni (expressed regions) i
introni (intervening sequences);

 ARNm matur care trec n citoplasm este

prelucrat prin excizia intronilor;

ARNm eucariot are o via de ordinul orelor

ARNm bacterian are o via foarte scurt (2-3
minute)

ARN nuclear de mici dimensiuni

(small nuclear RNA)
Este bogat n uridin
(U1, U2, U4, U5, U6).
se afl n nucleu, citosol i mitocondrie

 prin asociere cu proteine,

genereaz ribonucleoproteine
(small nuclear ribonucleoproteins)
sau snRNP ( denumite snurps)
cu rol n:
-excizia intronilor din ARNm transcript primar;
-controlul traducerii.

TRANSCRIERE
Biosinteza ARN pe matri ADN

Transcrierea
are loc de cte ori este nevoie
n viaa unei celule
nu angajaz tot cromozomul

 Transcrierea este asimetric

catena ARN se construiete numai pe una dintre catenele
ADN dublu catenar nuclear
desemnat drept caten template
matri sau
necodificatoare

 Catena netranscris (codificatoare) a ADN

este identic cu ARN nou sintetizat, cu
excepia nlocuirii timinei cu uracilul

 Catenele ADN vor fi catene template

(necodificatoare) pentru unele gene i catene
codificatoare pentru alte gene.
Catenele template se citesc, invariabil, n
direcia 3` 5`.

Elemente necesare transcrierii:

ADN dublu helicoidal.

Substrate: ATP, GTP, CTP, UTP

Enzime
ARN polimeraze ADN dependente
-au activitate polimerazic
-necesit caten matri
-pot iniia sinteza catenelor poliribonucleotidice
-conin Zn i necesit Mg2+
-nu au activitate de corector
-sintetizeaz ARN n direcia 5` 3`, antiparalel
catenei ADN folosit ca matri

Direcia de sintez

Direcia de cretere a lanurilor ribonucleotidice

rmne obligatoriu 5` 3`.

Reacia global catalizat de ARN polimeraz

este:

N
O
O

P
O

NH

5`

NH2

3`

NH2
X

O
O

5` GCA 3`

P
O

CH2

3`

NH2
X

O
O

P
O

3`

A
O
-

CH2

N
O

3`

OH

NH

Procariotele
Au o singur ARN polimeraz.
Holoenzima, este un pentamer

constituit

din:
enzima miez important n elongare;

subunitatea adiional , proprie iniierii transcrierii.

In absena subunitii , ARN polimeraza, se leag
nespecific la ADN.

Eucariotele
ARN polimeraza mitocondrial
ARN polimerazele nucleare,
(cu sensibilitate diferit la -amanitin -octapeptid biciclic,
toxic, existent n ciupercile otrvitoare):
ARN p I, aflat n nucleoli, sintetizeaz ARNr 45S,
insensibil la -amanitin;

ARN p II, aflat n nucleoplasm, sintetizeaz ARNm, i

ARN nuclear de dimensiuni mici
foarte sensibil la -amanitin;

ARN p III, aflat n nucleoplasm, sintetizeaz, ARNt, ARNr

5S i ARN nuclear de dimensiuni mici
sensibil la concentraii mari de -amanitin

 Etape:
Initiere
Elongare
Terminare

 Unde ncepe transcrierea genei ?

Secvente nucleotidice
Factori de transcriere

A.Secvenele promotor (P)

secvene specifice de nucleotide, din molecula
ADN, responsabile de iniierea transcrierii

 punctul de start al transcrierii, este notat cu +1.

Secvenele nucleotidice situate n amonte

(upstream), fa de punctul de start al transcrierii,

se noteaz cu (-)
Secvenele situate n aval (downstream) fa de +1

sunt notate cu (+)

Promotorii procariotelor sunt situai n amonte fa de

+1 i sunt notai cu minus
Promotorii, pentru cele mai multe gene bacteriene,
au dou secvene consens situate pe catena
codificatoare: caseta 10 (Pribnow) i caseta 35

La eucariote
Acurateea iniierii transcrierii este realizat de:
-elementele de activare n cis a genelor
(secvene de ADN situate pe acelai cromozom cu gena de reglat)
promotori
enhanceri
silenceri
responsive elements care mediaz rspunsul la diferite semnale printre care hormonii
hidrofobi

 La eucariote, fiecare ARN polimeraz,

utilizeaz promotori diferii
ARNp I utilizeaz promotori identici,
ARNp II utilizeaz o diversitate de
promotori, cu secvene consens:
caseta TATA, asemntoare casetei
Pribnow, este responsabil de acurateea
iniierii transcrierii;
casetele CAAT i GC sunt responsabile de
frecvena transcrierii.

B.Factorii de iniiere
La procariote
subunitatea a holoenzimei orienteaz legarea
specific a ARNp la ADN
Bacteriile prezint mai multe tipuri de factori

Etapele iniierii transcrierii :

formarea complexului nchis de iniiere
prin legarea ARNp la promotorul specific,
n regiunea 35 recunoscut de factorul ;

Catena matrit

Promotor

ARN polimeraza holoenzima

formarea complexului deschis de

iniiere
prin denaturarea ADN dublu catenar pe o poriune de
~10 perechi de baze pn la punctul de start al
transcrierii
ARN polimeraza holoenzima

Formarea primei legturi fosfat diesterice

ARNp, aflat cu situsul catalitic n dreptul
semnalului de iniiere a transcrierii,
leag nucleotidul +1, aproape invariabil unul
purinic cu nucleotidul +2;

disocierea subunitii din complexul ARN

polimerazADN-ARN dup legarea primelor
10 nucleotide i
asocierea ei cu alt molecul de ARN polimeraz-miez.

La eucariote
-elementele de activare n trans :
factorii de iniiere a transcrierii = proteine specifice
La procariote factorul
La eucariote fiecare polimeraz are setul su unic de factori de iniiere a transcrierii
(cel puin 6 factori de transcriere acioneaz echivelent cu factorul de
la procariote)

Celulele eucariote au o capacitate de exprimare selectiv a genelor

Viteza de sintez a unei proteine n dou celule din acelai organism poate
diferi de 109 ori

Elongarea lanului polinucleotidic

bucla de transcriere care cuprinde 12-17 perechi de
baze ADN-ARN
Catena ADN codificatoare
Punctul de renaturare

Punctul de denaturare

Directia de avansare a enzimei

Catena matrit
Hibrid ARN-ADN

 La procariote,
rifampin se leag de ARN polimeraz i i schimb
conformaia mpiedicnd iniierea sintezei ARN

La eucariote
rifampinul nu se leag de ARN polimeraz i nu este
afectat sinteza ARN

Terminarea transcrierii
La procariote
a.Terminarea transcrierii independent de factorul
proteic rho
Catena matri ADN conine semnale stop.
Structurile n ac de pr a ARN format, favorizeaz
terminarea transcrierii.

Terminarea transcrierii rho dependent

Factorul rho cu activitate ATP-azic se leag la o
secven specific de ARN monocatenar. ARN este
desprins de catena matri i de enzim

ppp 5`
Proteina rho
ATP + HOH

ADP + Pi

ARN polimeraza

Transcriptul primar ARNm procariot este mai

lung dect gena de transcris.

Inhibitorii transcrierii

a.Antibioticul actinomicin D, ca i colorantul acridin, prin

intercalarea ntre perechile de baze distorsioneaz molecula ADN
mpiedicnd att transcrierea ct i replicarea.

b.-amanitina (octapeptid biciclic, toxic, existent n ciupercile

otrvitoare) este un inhibitor al ARN polimerazelor din celulele animale.

c.Antibioticele din familia rifamicin, inhib specific iniierea

transcrierii la bacterii. Odat iniiat transcrierea, rifamicina nu are rol
inhibitor asupra procesului de elongare.

Rifampin, inhib iniierea transcrierii, la procariote, prin legarea la

subunitatea a ARN polimerazei-holoenzim. Deoarece nu inhib ARN
polimerazele eucariotelor, antibioticul rifampin este folosit n tratarea
tuberculozei i a altor infecii bacteriene.

 La procariote

ARN se nate matur

La eucariote
ARN-polimerazele transcriu ntreaga
gen

Transcriptele primare ARN conin exoni

i introni

 Intronii au dimensiuni cu mult mai mari

dect exonii
(de peste 100 de ori)
NUMAI 5-10% din genomul eucariot
reprezint secvene codificatoare
pentru proteine i ARN.
Prezena intronilor i exonilor la eucariote este
tipic:
ARNm
ARNt
ARNr

Prelucrri post-transcriere la eucariote

eliminare fragmente polinucleotidice;
adugare fragmente polinucleotidice la
capetele 3` i 5`;
modificri covalente ale unor resturi
nucleotidice.

Dualitatea funcional a moleculei de ARN

ARN are rol catalitic i informaional

Moleculele ARN cu rol catalitic =
RIBOZIMI
Substratele ribozimilor sunt molecule de
ARN

Sunt 2 tipuri de Ribozimi:

cu activitate autocataliti
Ex. introni care i catalizeaz propria excludere (selfsplicing)

catalizeaz transformarea unor molecule din

care acetia nu fac parte
Ex. ribonucleaza P care elimin extensia de la captul 5`
din ARNt

Excizia intronilor
Excizia intronilor se realizeaz n nucleu, pentru toate
tipurile de ARN
Enzime specifice:
s recunoasc jonciunile intron-exon
s elimine intronii
s lege exonii

exon

intron
5` __________AGGU------------CAGG

exon

__________

3`

 Mutaii la nivelul jonciunilor intron-exon pot

genera un ARN inactiv
care conine un intron rezidual
Un defect de excludere a intronilor, ar putea duce la o
sintez sczut a lanurilor de -globin, fapt constatat n
unele -thalasemii.

Excizia intronilor din ARNr

se realizeaz autocatalitic
necesit GTP sau guanozina
odat cu excluderea intronului, se leag cei doi
exoni (splicing)
Enzima numit ribozim cu activitate autocatalitic
i modific structura n timpul actului catalitic.

Excizia intronilor din ARNm

este realizat de splicozom format din:
particule ribonucleoproteice (snurps)
(ARN de dimensiuni mici bogai n uracil
(U1, U2, U4, U5, U6) asociate cu proteine)
ARNm transcript primar, subiect al
prelucrrii.

 n splicozom aciunea catalitic este realizat

de ARN de dimensiuni mici.

 Splicozomul dimensiune mare mpiedic

ARNm precursor s prsesc nucleul nainte
de prelucrarea sa complet la ARNm-matur

 desfacerea legturii fosfat diesterice de la

unul dintre capetele intronului este realizat
de un nucleotid din cadrul intronului

Excizia intronului din ARNt

ARNt eucariot conine introni, n regiunea

anticodon (succesiuni de nucleotide (20-40))

Excluderea acestor introni se face de un sistem

multienzimatic cu rol de endonucleaz i ligaz

3` OH

OH 3`

Extensie 5`

5`

Prelucrri posttranscriere

Intron
ARNt matur
ARNt transcript primar

Modificri suplimentare exciziei intronilor

n transcriptele primare ARN

ARNm procariot se nate matur

 Modificri ale ARNm eucariot

la eucariote
ARNm devine funcional numai dup
excizia intronilor i
modificarea capetelor 5` i 3`:
adugarea unui rest de 7-metil guanozin la captul 5`

formarea cozii poliadenilice 3`

 Formarea captului 5`prin adugarea unui

rest de 7-metil guanozin la transcriptul
primar.
O

CH3
+

HN
H2N

O
2`

3`

OH HO
O
7-metil guanozin

CH2 O

OH

O
O

OH

O
O

Transcript primar

OH

legtur 5` - 5` trifosfat
ntre 7-metil-guanozin si transcriptul primar

 Funciile captului 5`:

protejaz moleculele de aciunea 5` 3`
exonucleazelor;
favorizeaz traducerea, fiind recunoscut de
ctre ribozomi ca semnal de iniiere a sintezei
proteinelor.

 Modificarea captului 3` al ARNm prin

formarea unor cozi poliadenilice

de 200-300 nucleotide

Poliadenilarea se produce

dup formarea captului 5` dar

nainte de excizia intronului.

 Poliadenilarea ajut la stabilizarea moleculei

ARNm de aciunea exonucleazelor.

ARNm pentru histone i interferon nu sunt

poliadenilai.

Modificri ale capetelor ARNt

transformarea transcriptul primar multimeric n
ARNt precursori monomerici
care prezint extensii scurte 3` i 5`

Ribonucleaza P
o endonucleaz format din:
ARN cu rol catalitic (ribozim) i
o protein cu caracter bazic)
elimin extensiile din captul 5`

 Formarea captului 3` matur al ARNt

La procariote
secvena CCA este relevat de o exonucleaz
La eucariote
secvena CCA este adugat ulterior de ctre o
nucleotidil-transferaz avnd ca
substrate ATP i CTP
Modificarea covalent a unor baze prin reacii catalizate
enzimatic: alchilare, tiolare, hidrogenare

O
H3C

NH
HO H2 C

HO H2 C

OH OH
Dihidrouridin
(DHU)

O
NH

HN
O

OH OH
Ribotimidin
(T)

HO OH
4-Tiouridin

O
O

OH OH
Pseudouridin

NH
HO H2 C

HO H2 C

NH

HO H2 C

N
O

OH OH
Inozin

NH
N

a)

Situs de
legare aminoacid

3`

CCA

Brat T C

b)

5`

5`
Perechi de baze
complementare
Bratul DHU

Brat T C
Bratul
DHU
Bratul variabil

Bucla
anticodon

Bratul anticodon
Anticodon

3`

Modificri ARNr
La eucariote
Din transcriptele primare 45 se formeaz
ARNr matur:
28 S
18 S i
5,8 S.

ARNr 5 S rezult dintr-o molecul precursoare

diferit

Spatiatori

Transcrip
primar

Clivare
ARNr maturi

Procesarea ARNr eucariot

 La procariote, dup ndeprtarea ARNt obinut

prin transcrierea unor gene ARNt intruse, se
formeaz ARNr maturi: 23 S, 16 S, i 5 S prin
clivarea ARNr precursor 30 S.

Spatiatori
Transcript
primar
Clivare
Clivare
ARNr
maturi

Procesarea ARNr procariot

Subiecte acizi nucleici

1.Structura ribo si dezoxi-ribonucleozide si nucleotide
2.Tipuri de ARN, structur, caracteristici, prelucrare posttranscriere
3.Ribozomii, structur, rol
4.Ce sunt anticodonii ?
3.Care atribute difereniaz replicarea de transcriere
4.Reacia catalizat de ARN polimeraz i ADN polimeraz
5.Atributele ADN polimerazelor (I i III)-ADN dependente i ARN polimerazelor ADN
dependente.
6.Ce este revers transcriptaza, ce activitatii catalitice are ?
7.Tipuri de mutaii punctiforme, factori care determin apariia lor.
8.Metode de reparare a ADN, enzime implicate.
9.Ce este o gen, cum are loc transcrierea ei
10.Cum sunt recunoscute punctele de iniiere i de terminare a transcrierii unei gene ?
11.Ce sunt codonii, ce roluri au ?
12.Caracteristicile codului genetic
13.Reacia de activare a aminoacizilor
14.Care este semnalul de iniiere a traducerii ARNm i cum este recunoscut ?
15.Prelucrri post-traducere, exemple
16.Cum apar n proteine aminoacizii fr cod ?