Sunteți pe pagina 1din 31

BIOLOGIE

MOLE CULAR - Metode experimentale


Marius Mihan, Marius tefan, Zenovia Olteanu
Prefa de Gheorghe Benga

Descrierea CIP a Bibliotecii Naionale a Romniei


MIH AN, MARIUS, TE FAN, MARIUS, OLTE ANU, ZE NOVIA
Biologie molecular: metode experimentale / Marius Mihan,
Marius tefan, Zenovia Olteanu; prefa de Gheorghe Benga. Iai:
E ditura Universitii Al.I. Cuza, 2012
Bibliogr.
ISBN 978-973-703-816-6

CUPRINS
PREFA de GHEORGHE BENGA ....................................................................... XI
INTRODUCERE ................................................................................................. 1
I. TEHNICI DE BAZ UTILIZATE N LABORATORUL DE BIOLOGIE
MOLECULAR .................................................................................................. 3
I.1Sticlriaiinstrumenteledinmaterialeplastice.....................................................3
Siliconareasticlrieiiainstrumentelordinmaterialeplastice....................................4
Splareaiuscareavaselordelaborator......................................................................5
I.2Msurareavolumelor............................................................................................6
Msurareavolumelorcuajutorulpipetelor..................................................................7
I.3Msurareamaselor.............................................................................................12
Instruciuniprivindutilizareabalaneielectroniceanalitice......................................14
I.4Centrifugarea......................................................................................................15
Instruciuniprivindutilizareacentrifugii.....................................................................16
I.5Tehnicidebazfolositepentrumanipulareamicroorganismelor..........................17
Msuridebiosecuritate..............................................................................................17
Tehnicidesterilizare...................................................................................................21

II. METODE DE CULTIVARE A BACTERIEI ESCHERICHIA COLI ....... 29


II.1Mediiutilizatepentrucultivarea bacterieiEscherichiacoli.................................30
Mediideculturminimale..........................................................................................31
Mediideculturcomplexe.........................................................................................33
Mediidecultursolide...............................................................................................36
Mediiminimalesolide............................................................................................36
Mediideculturcomplexesolide..........................................................................36
Agardeacoperire.......................................................................................................37
Agardeconservareprinnepare...............................................................................38
Antibioticeutilizatelapreparareamediilordecultur...............................................39

VI

Cuprins

II.2CultivareaE.colipemediisolide........................................................................41
nsmnarealasuprafaamediilordecultursolide................................................42
nsmnareanprofunzimeamediilordecultursolide..........................................44
II.3CultivareaE.colinmediilichide........................................................................47
Inoculareaicultivareafolosindvolumemicidemediu.............................................47
Inoculareaicultivareafolosindvolumemaridemediu............................................48
II.4MonitorizareacreteriibacterieiE.coli nmediilelichide....................................48
Determinareadensitiiopticecuajutorulspectrofotometrului...............................49
Determinareadensitiiopticecuajutorulhemocitometrului...................................51
DeterminareanumruluidebacteriiprincultivarenplciPetri...............................52
II.5PstrareaculturilordeE.coli.............................................................................54
Pstrareaprincongelarela80oC................................................................................55

III. PLASMIDE I TULPINI DE ESCHERICHIA COLI UTILIZATE


FRECVENT N BIOLOGIA MOLECULAR ............................................... 57
III.1Vectoriplasmidialiutilizaifrecventningineriagenetic...................................59
Principalelecaracteristicialevectorilorplasmidialiutilizainingineriagenetic......61
VectorulpUC19c....................................................................................................61
VectorulpBlueScriptIISK(+/)...............................................................................62
VectorulpET21a....................................................................................................62
VectorulpMALc5x.................................................................................................62
III.2TulpinideEscherichiacoliutilizatefrecventningineriagenetic.......................63

IV. METODE I TEHNICI FOLOSITE PENTRU IZOLAREA I


PURIFICAREA ADNULUI ........................................................................... 73
IV.1IzolareaADNuluiplasmidial.............................................................................75
IzolareaADNuluiplasmidialfolosindmetodalizeialcaline........................................76
IzolareaADNuluiplasmidialutilizndmetodalizeiprinfierbere...............................81
IV.2IzolareaADNuluigenomic................................................................................84
IzolareaADNuluigenomicdinbacterii......................................................................85
IzolareaADNuluigenomicdinplante........................................................................90
IzolareaADNuluidinesuturianimale.......................................................................95
IV.3PurificareaADNuluidinsoluiiapoase...........................................................100

Cuprins

VII

IV.4IzolareaADNuluidingelurideagaroz...........................................................103
IV.5PstrareaADNuluipurificat...........................................................................107

V. AMPLIFICAREA ENZIMATIC IN VITRO A


ACIZILOR NUCLEICI .................................................................................. 111
V.1AmplificareaenzimaticinvitroaADNului sau PCR.........................................113
AmplificareaenzimaticinvitroafragmentelordeADNdepnla4kb................116
V.2Criteriipentrualegereaoligonucleotideloramors(primer)..............................126

VI. DETERMINAREA CONCENTRAIEI ACIZILOR NUCLEICI N


SOLUIE ........................................................................................................ 133
V.1DeterminareaconcentraieiacizilornucleiciprinspectroscopieUVVIS.............133
DeterminareaconcentraieiacizilornucleiciprinspectroscopieUV........................134
V.2.Determinareaconcentraieiacizilornucleiciprinfluorimetrie..........................138
Determinareaconcentraieiacizilornucleicifolosindbromuradeetidiu.................139
Determinareaconcentraieiacizilornucleici folosindmetodacufoliedinplastic....141
DeterminareacantitiideADNpegelurideagaroz..............................................143

VII. SEPARAREA ELECTROFORETIC A ADNULUI ......................... 147


VII.1Electroforezaclasicngelurideagaroz.......................................................150
VII.2.SeparareaADNprinelectroforezngeldepoliacrilamidcugradientdeagent
denaturant............................................................................................................157
VII.3DeteciaADNuluingelurideagaroz...........................................................168
DeteciaADNuluifolosindbromuradeetidiu.........................................................169
DeteciaADNuluingelurideagarozfolosindcoloranidetipSYBR.....................171
DeteciaADNuluingelurideagarozfolosindalbastruldemetilen......................173

VIII. PURIFICAREA PROTEINELOR PRIN CROMATOGRAFIE DE


AFINITATE FA DE METALE ................................................................. 177
VIII.1Strategiideclonareagenelornvectorideexpresie......................................181
VIII.2Identificareacondiiiloroptimedesupraexpresieaproteinelorrecombinate.186

VIII

Cuprins

VIII.3Purificareaprin IMACaproteinelorrecombinatencondiiinative................192
VIII.4Purificareaprin IMACaproteinelorrecombinatencondiiidenaturante.......198
VIII.5Determinareamaselormolecularenativeutilizndcromatografiadefiltrareprin
gel(GF)..................................................................................................................200
Determinareamaselormolecularenativeutilizndcromatografiadefiltrarepringel
..................................................................................................................................206
CalibrareacoloaneideGFicalculareamaselormolare..........................................208

IX. DETERMINAREA CONCENTRAIEI PROTEINELOR .................. 215


IX.1DeterminareaconcentraieiproteinelorprinspectroscopieUV........................216
IX.2Metodecolorimetricededeterminareaconcentraieiproteinelor...................219
MetodaLowry...........................................................................................................219
MetodaBradford ......................................................................................................224
MicrometodaBradforddedozareaconcentraieiproteinelor............................227
Metodacuacidbicinchoninic(BCA).........................................................................229
MicrometodaBCAdedozareaproteinelor.........................................................231
Macrometoda BCAdedozareaproteinelor........................................................232
IX.3Realizareacurbelordeetalonareiprelucrareadatelor...................................234

X. SEPARAREA ELECTROFORETIC A PROTEINELOR ................... 241


X.1Electroforezanativaproteinelornsistemdiscontinuu...................................243
X.2Electroforezaproteinelorncondiiidenaturante(SDSPAGE)...........................253
X.3Deteciaproteinelorseparateprinelectroforezapegeluridepoliacrilamid.....257
Colorareagelurilordepoliacrilamidnvedereaevidenieriiproteinelor................257
ColorareacuComassieBrilliantBlueR250.........................................................259
Colorareacuargintagelurilordepoliacrilamid.................................................261
X.4Fotografiereagelurilorianalizaimaginilor.Stabilireamaseimolecularerelative
.............................................................................................................................264

XI. EVIDENIEREA IMUNOLOGIC A PROTEINELOR TEHNICA


WESTERNBLOT ......................................................................................... 273
XI.1Obinereaanticorpilorpoliclonali.Tehnicideimunizare..................................273

Cuprins

IX

ObinereaanticorpilorpoliclonalifolosindadjuvantulFreund.................................275
XI.2Imunoblotingul..............................................................................................278
Electrotransferulproteinelorpemembranensistemsemiuscat..........................279
Imunodeteciaproteinelortransferatepemembranedenitroceluloz...................282

XII. METODE COMPUTAIONALE DE STUDIU A PROTEINELOR . 285


XII.1FiiereFASTAioperaiisimplecusecvene....................................................286
XII.2Bazededatecuinformaiidespreproteine.....................................................290
Bazededatecusecveneproteice...........................................................................291
Bazededatecustructuriproteice............................................................................294
XII.3IdentificareafuncieiproteinelornecunoscutecuajutorulprogramuluiBLAST .295
XII.4Modelareacomputaionalastructuriitridimensionaleaproteinelor............308
Programe,servereimetaservere............................................................................311
Aplicaiialemetodelordemodelareastructurilortridimensionaleaproteinelor..316
XII.5Modelareacomputaionalacomplecilorliganziproteine............................316
Problematicaandocriimoleculare..........................................................................317
Evaluarearezultatelorobinuteprinandocaremolecularcomputerizat..............324
Aplicaiialeandocriimoleculare.............................................................................324

ANEX ........................................................................................................... 335

PREFA
Biologia molecular poate fi definit cel mai simplu ca fiind un
concept de studiere a materiei vii prin prisma relaiei structur-funcie la
nivel molecular. Este un concept ce a revoluionat tiinele biologice i
medicale ncepnd cu a doua jumtate a secolului XX. Dar pe lng noile
cunotine teoretice, revoluia produs de biologia molecular a fost
posibil i datorit introducerii de noi metode i tehnici de laborator.
Toate lucrrile experimentale de biologie molecular implic utilizarea
unor astfel de metode i tehnici. De aici rezult i necesitatea unor cri
care s-i ajute pe cercettori n munca zilnic la masa de laborator
(bench). n Romnia nu cunosc s se fi scris o asemenea carte, care s
descrie toate metodele i tehnicile de biologie molecular la modul practic
de lucru.
Efortul tinerilor colegi Marius Mihan, Marius tefan i Zenovia
Olteanu de a redacta o astfel de carte mi se pare de aceea deosebit de
ludabil i rezultatul este o lucrare de mare valoare.
Merit subliniat c sunt descrise pe de o parte unele tehnici de
baz n laboratorul de biologie molecular (dar i n laboratoarele de
analize biomedicale, de biochimie i chimie clinic, de microbiologie, de
biofizic etc), precum: pregtirea sticlriei i a vaselor de laborator,
msurarea volumelor, a maselor, centrifugarea, tehnicile de baz folosite
pentru manipularea microorganismelor, metodele de determinare a
proteinelor, separarea electroforetic a proteinelor, tehnici de imunologie
(obinerea de anticorpi policlonali, imunodetecia proteinelor transferate
pe membrane de nitroceluloz) etc. Pe de alt parte sunt descrise metode
specifice biologiei moleculare: plasmide i tulpini de Escherichia coli
folosite frecvent n biologia molecular, izolarea ADN-ului, purificarea
proteinelor prin cromatografie de afinitate, metode computaionale de
studiu a proteinelor.
Descrierea metodelor i a tehnicilor este foarte bine fcut, de la
principiile teoretice, avantajele i limitele, pn la descrierea concret a
materialelor necesare i a modului de lucru.
n acest fel cartea este un valoros ghid pentru lucrul n laborator,
att pentru nceptori (studeni, masteranzi, doctoranzi), ct i pentru
avansai (cercettori postdoctorali, cadre didactice din nvmntul

Prefa

XII

superior, tehnicieni de laborator cu experien) i trebuie s se afle pe


masa de lucru din laborator (ori aproape de masa de lucru).
Fiind eu nsumi autor al unei cri pentru laboratoarele clinice (Ion
Manta, Mircea Cucuianu, Gheorghe Benga, Adriana Hodrnu, Metode
biochimice n laboratorul clinic, Editura Dacia, Cluj-Napoca, 1975) i al
unui ndrumtor pentru lucrrile practice cu studenii (Gh. Benga -Ed.ndrumtor pentru lucrrile practice de biologie celular i molecular,
Editura Carpatica, Cluj-Napoca, 1997) mi dau bine seama de dificultatea
scrierii unei astfel de cri i apreciez efortul foarte mare depus de autori.
Recomand clduros lucrarea scris de cei trei autori tuturor
categoriile de cititori (i utilizatori) menionai mai sus, dar i celor care
nu aplic sau nu vor aplica niciodat metodele i tehnicile de laborator ale
biologiei moleculare, dar care vor s se orienteze n metodele i tehnicile
laborator de biologie molecular, spre a nelege mai bine aplicaiile
acesteia n tiinele medicale i biologice.
Cluj-Napoca, 12 noiembrie 2012
Prof. Univ. Dr. Dhc. Gheorghe Benga
Membru corespondent al Academiei Romne
Membru Titular al Academiei de tiine Medicale din Romnia
Medic specialist de Laborator Clinic, Chimist,
Medic primar de Genetic Medical,
Laboratorul de Explorri Genetice I al Spitalului Clinic Judeean de Urgen Cluj-Napoca
Profesor Univ. Asociat, Disciplina de Biologie Celular i Molecular,
Universitatea de Vest Vasile Goldi din Arad
Preedinte al Filialei Cluj a C.R.I.F.S.T.
(Comitetul Romn pentru Istoria i Filosofia Stiinei i Tehnicii) al Academiei Romne
Honorary Associate, School of Molecular Biosciences,
University of Sydney, Australia
Past-President, Societatea Romn de Medicin de Laborator
Past-President, Balkan Federation of Clinical Laboratory
E-mail: gbgbenga@gmail.com

INTRODUCERE
Dac biologia clasic s-a dezvoltat i a atins nivelul de cunoatere
de astzi prin folosirea cu precdere a studiilor observaionale, biologia
modern se bazeaz n mod fundamental pe noiunea de experiment i
pe procesul de experimentare n scopul dobndirii de noi informaii i
cunotine. Experimentul are rolul de a verifica validitatea unei ipoteze
formulate n prealabil utiliznd pentru aceasta un ansamblu de tehnici i
metode. Reuita unui experiment, adic formularea fr echivoc a unei
concluzii legate de ipoteza de testat, depinde n mare msur de
capacitatea cercettorului de a concepe un model de studiu, de a alege i
de a utiliza n mod corect una sau mai multe metode de investigaie.
Majoritatea lucrrilor de profil din ultima decad, care descriu
metode i tehnici de laborator utilizate n biochimie, enzimologie,
biologie celular i molecular, au fost realizate cu precdere n scopuri
didactice, fiind utilizate ca suport pentru prelegerile teoretice. Metodele
experimentale sunt reduse frecvent la un set de indicaii simple i clare pe
care studenii s le poat urma cu uurin. Lipsa unor informaii generale
despre principiile teoretice i aplicabilitatea metodelor dau ns o fals
impresie de imuabilitate a protocoalelor experimentale, ceea ce face ca
experimentatorul s fie pus deseori n dificultate atunci cnd trebuie s
adapteze metoda n mod specific.
n acest context, lucrarea de fa se dorete a fi un ghid detaliat al
unor metode-cheie, utilizate frecvent n biologia molecular, concentrndu-se nu numai pe simpla formulare a unor protocoale experimentale, ci
i pe explicarea principiilor din spatele fiecrei metode n scopul
precizrii spectrului de aplicabilitate i a rezultatelor scontate. Fiecare din
metodele prezentate au fost testate i utilizate de ctre autori n cadrul
Laboratorului de Biochimie i Biologie Molecular al Facultii de
Biologie, Universitatea Alexandru Ioan Cuza din Iai. Modul de
prezentare este adaptat specificului fiecrei metode n parte, cuprinznd n
general cinci seciuni distincte:
1.
principiul metodei ofer informaii legate de bazele teoretice ale
metodei utilizate;
2.
avantaje furnizeaz informaii legate de domeniul de aplicabilitate al metodei, rezultatele ateptate corelate cu date legate de
sensibilitate, randament etc.;

Biologie molecular. Metode experimentale

3.

limitri prezint condiiile n care metoda nu poate fi aplicat,


dezavantajele sau inconvenientele sale n comparaie cu metode
similare;
4.
materiale necesare conine lista complet a reactivilor, materialelor, instrumentelor i aparaturii necesare, alturi de instruciuni
legate de prepararea reactivilor i indicaii privind potenialele
pericole care pot s apar n laborator;
5.
mod de lucru ofer indicaii simple i precise privind suita de
operaii care trebuie efectuate pentru obinerea rezultatelor finale.
Prin coninut i structur lucrarea se adreseaz cu precdere
studenilor care frecventeaz studiile masterale i de doctorat, cercettorilor post-doctorat, cadrelor didactice care coordoneaz lucrrile de
disertaie i doctorat, tinerilor angajai n activitatea de cercetare, care fac
primii pai n domeniul tiinelor vieii, precum i specialitilor din
domenii conexe. Prin aspectele teoretice abordate, prezenta lucrare poate
fi util i cercettorilor i tehnicienilor cu experien care au deprins i
utilizeaz aceste protocoale de ani buni, dar care nu au acordat suficient
importan cunotinelor teoretice care fundamenteaz metodele
respective. Puini vor fi cei care vor parcurge aceast lucrare de la un
capt la altul, dar sperm c o vom regsi pe masa de lucru a ct mai
multor cercettori, funcionnd ca un ghid pentru selecia, dezvoltarea i
adaptarea protocoalelor experimentale la nevoile specifice ale
experimentatorului.
Mesajul final pe care aceast lucrare dorete s l transmit este c
reproducerea n detaliu a fiecrei etape a unui protocol nu este suficient
pentru utilizarea cu succes a acestuia. Este mai important poate de
cunoscut cum funcioneaz, n ce condiii se poate utiliza, ce informaii
poate i ce informaii nu poate s ofere o anumit metod, precum i care
sunt parametrii critici de care trebuie s se in cont la utilizarea unei
tehnici experimentale.
Mulumim anticipat celor care vor transmite sugestii, observaii i
recomandri care s conduc la completarea acestei lucrri n scopul
mbuntiri unei viitoare ediii.
Autorii

Textul complet este disponibil in format electronic gratuit. Nu ezitati sa ma


contactati in aceasta directie prin e-mail la adresa:
marius.mihasan@uaic.ro

ANEX

TABEL A1. Multipli i submultipli ai unitilor de msur


Prefix

Factor de multiplicare

Abreviere

Atto

10-18

Femto

10-15

Pico

10-12

Nano
Micro

-9

-6

-3

10
10

Mili

10

Centi

10-2

Deci

10-1

Deca

10

da

Hecto
Kilo

10
10

Myria

10

my

Mega

106

Giga

109

Tera
Peta
Exa

12

15

18

10
10
10

Biologie molecular. Metode experimentale

336

TABEL A2. Tabel de conversie a celor mai utilizate uniti de volum


Pentru a converti:

n:

se multiplic cu:

Centimetri cubi (cm3)

Microlitri (l)

103

Mililitri (ml)

Litri (l)

10-3

Galoane (US)

2.641 x 10-4

Metri cubi (m3)

10-6

Picioare cubice (cubic feet, 3,531 x 10-5


ft3)

Litri (L)

Inchi cubici (cubic inches


(in.3)

6,102 x 10-2

Microlitri (l)

106

Mililitri (ml)

103

Galoane (US)

0,2642
3

Centimetri cubi (cm )

103

Metri cubi (m3)

10-3

Picioare cubice (engl.cubic 3,531 x 10-2


feet, ft3)

Mililitri (ml)
Microlitri (l)

Inchi cubici (engl.cubic


inches (in.3)

61.02

Litri (l)

10-3

Microlitri (l)

103

Mililitri (ml)

10-3

Litri (l)

10-6

Anex

337

TABEL A3. Tabel de conversie a celor mai utilizate uniti de msur


Pentru a converti din:

n:

se multiplic cu:

Concentraia
Miligrame per litru (mg/l) Pri pe milion (ppm)

Distana
Centimetri (cm)

Inchi (in)

Milimetri (mm)

Angstromi ()

Picioare (engl. feet, ft)

3,281 x 10-2

Inchi (in.)

0,39

Metri (m)

10-2

Milimetri (mm)

10

Yarzi (yd)

1,094 x 10-2

Centimetri (cm)

2,54

Picioare (engl. feet, ft)

8,333 x 10-2

Metri (m)

2,540 x 10-2

Milimetri (mm)

25,4

Yarzi (yd)

2,778 x 10-2

Centimetri (cm)

0,1

Picioare (engl. feet, ft)

3,281 x 10-3

Inchi (in.)

3,937 x 10-2

Metri (m)

10-3

Nanometri (nm)

0,1

Metri (m)

10-10

Picometri (pm)

100

Amperi pe inci ptrai


(A/in2)

6,45

Amperi pe metru patrat


(A/m2)

104

Curentul i sarcina
electric
Amperi pe centimetru
ptrat (A/cm2)

Biologie molecular. Metode experimentale

338

Pentru a converti din:

n:

se multiplic cu:

Amperi pe inci ptrai


(A/in2)

Amperi pe centimetru
ptrat (A/cm2)

0,16

Amperi pe metru patrat


(A/m2)

1,55 x 103

Coulombi (C)

3,6 x 103

Faraday (F)

3,731 x 10-2

Coulombi (C)

Faraday (F)

1,036 x 10-5

Coulombi pe centimetru
ptrat (C/cm2)

Coulombi pe inci ptrat 64,52


(C/in2)

Amperi or (A-hr)

Coulombi pe metru
patrat (C/m2)
Coulombi pe inci ptrat
(C/in2)

Faraday (F)

104

Coulombi pe centimetru 0,16


ptrat (C/cm2)
Coulombi pe metru
patrat (C/m2)

1,55 x 103

Amperi-or (A-hr)

26.,8

Coulombi (C)

9,649 x 10-4

Bari

1,01

Presiunea
Atmosfere (atm)

Milimetri coloana de Hg 760


(mmHg) sau torri
Bari (bar)

Milimetri coloana de Hg
(mmHg) sau torri

Atmosfere (atm)

0,99

Kilograme pe metru
ptrat (kg/m2)

1,020 x 104

psi

14,5

Atmosfere (atm)

1,316 x 10-3

Kilograme pe metru
ptrat (kg/m2)

136

Anex

339

Pentru a converti din:

n:

se multiplic cu:

Pascali (P)

Newtoni pe metru ptrat 1


(N/m2)

Rezistena electric
Ohmi ()

Megaohmi (M)

106

Microhmi ()

10-6

Ore (hr)

24

Minute (min)

1,44 x 103

Secunde (sec)

8,64 x 104

Grade Celsius (oC)

K-273,13

Grade Fahrenheit (oF)

[(K 273,13)
95] + 32

Grade Kelvin (oK)

Grade Fahrenheit (oF)

1,8 x oC + 32

Grade Celsius (oC)

(F -32)/1,8

Picioare pe minut
(ft/min)

1,2

Picioare pe secund
(ft/sec)

3,281 x 10-2

Timp
Zile

Temperatura
Grade Kelvin (K)

Grade Celsius (oC)


Grade Fahrenheit (oF)

C + 273,13

Viteza
Centimetri pe secund
(cm/s)

Kilometri pe or (km/hr) 3,6 x 10-2


Metri pe minut (m/min) 0,6
Mile pe ora (miles/hr)

2,237 x 10-2

Mile pe minut
(miles/min)

3,728 x 10-4

Biologie molecular. Metode experimentale

340

TABEL A4. Date generale privind concentraia aproximativ a diverilor


constitueni intracelulari dup Ausubel et al., 2002 (1)
Macromolecule (proteine, acizi nucleici, poliglucide)

22% (w/w)

Molecule mici
Ap

70% (w/w)

Monoglucide

3% (w/w)

Lipide

2% (w/w)

Aminoacizi liberi

0,4% (w/w)

Nucleotide

0,4% (w/w)

Ioni anorganici

1% (w/w)

Na+

5-15 mM

K+

140 mM

Mg2+
Ca
Cl

2+

pH

30 mM
1-2 mM
4 mM
7,4

Anex

341

TABEL A5. Factori de conversie utilizai frecvent n studiul proteinelor i acizilor


nucleici
Masa molar medie a unei perechi de baze = 649 Da
1 kb de ADN codifica 333 amino-acizi, adic 36.000 Da
1 fragment de 1 kB este echivalentul a 6,5 x 105 Da ADN dublu catenar,
3,3 x 105 Da ADN mono catenar sau 3,4 x 105 Da ARN monocatenar
1 g/ml ADN conine 3,08 M fosfat
1 g/ml ADN cu dimensiunea de 1 kb conine 3,08 nM capete 5
1mol pBR322 (4363 bp) este echivalent a 2,83 g
Masa molar medie a unui aminoacid = 110 Da
10 kDa dintr-o protein conine 91 aminoacizi i este codificat de 273
nucleotide

Biologie molecular. Metode experimentale

342

TABEL A6. Modul de notare prescurtat a nucleotidelor


Prescurtare

Nucleotid

Adenin

Citozin

Guanin

Timin

Uracil

Adenin sau Citozin

Adenin sau Guanin

Citozin sau Guanin

Citozin sau Timin

Guanin sau Timin

Adenin, Citozin sau Guanin (oricare, exceptnd


Timina)

Adenin, Citozin sau Timin (oricare, exceptnd


Guanina)

Adenin, Guanin sau Timin (oricare, exceptnd


Citozina)

Citozin, Guanin sau Timin (oricare, exceptnd


Adenina)

Oricare din cele cinci nucleotide

Prescurtarea
cu trei litere
Ala
Arg
Asn
Asp
Cys
Glu
Gln
Gly
His
Ile
Leu
Lys
Met

Aminoacid

Alanin

Arginin

Asparagin

Acid aspartic

Cistein

Glutamat

Glutamin

Glicin

Histidin

Isoleucin

Leucin

Lizin

Metionin

149.2

146.2

131.2

131.2

155.2

75.1

146.2

147.1

121.2

133.1

132.1

174.2

89.1

Prescurtarea cu o Mas
liter
molar
(g/mol)

TABEL A7. Principalele proprieti fizico-chimice ale aminoacizilor

185

200

170

175

195

75

180

190

135

150

160

225

115

Aria
suprafeei
accesibilea

1.02

-0.67

1.22

1.25

-0.64

-0.67

-0.91

-1.22

0.17

-1.31

-0.92

-0.59

-0.4

94

56

40

96

66

49

93

102

20

106

134

65

100

HidroMutabilitate
b
fobicitate relativ c

Anex
343

Pro
Ser
Thr
Trp
Tyr
Val

Prolin

Serin

Treonin

Triptofan

Tirozin

Valin

117.1

181.2

204.2

119.1

105.1

115.1

165.2

Prescurtarea cu o Mas
liter
molar
(g/mol)

155

230

255

140

115

145

210

Aria
suprafeei
accesibilea

0.91

1.67

0.5

-0.28

-0.55

-0.49

1.92

74

41

18

97

120

56

41

HidroMutabilitate
fobicitateb relativ c

Aria suprafeei accesibile este exprimat n i este calculat pentru fiecare aminoacid ca parte a unui schelet polipeptidic (2)
Hidrofobicitatea este exprimat n uniti arbitrare folosind scala OMH descrisa de Sweet i Eisenberg (1983) (3)
c
Mutabilitatea relativ este exprimat n uniti arbitrare (alanina fiind aleas ca referin) i reprezint probabilitatea ca un aminoacid s sufere o mutaie ntr-un timp
dat (4)

Phe

Fenilalanin

Prescurtarea
cu trei litere

Aminoacid

344
Biologie molecular. Metode experimentale

A
N/A
A
C
D
C
A

D
D
D
D
D
D
D
D

Benzen

Cloroform

Diclorbenzen

Hexan

Nitrobenzen

Fenol

Toluen

Dicloretan
A
A
A
A
A

A
D
N/A
B
D

Alcool amilic

Alcool benzilic

Alcool izopropilc

Etanol

Metanol

Alcooli

N/A

Acrilonitril
A

Acetal

Aceton

Sloveni organici

ABS

CPVC

N/A

LDPE

N/A

PC

PEEK

PP

TABEL A8. Compatibilitate chimic a diverselor tipuri de materiale plastice utilizate n laborator:

PTFE

PVC

N/A

N/A

PVDF

Anex
345

B
A
D
C
D
N/A
N/A
D
D
D

D
D
D
C
A
B
N/A
N/A
C
D
D

Aqua Regia (HCl 80%, HNO3


20%)

Acid citric

Acid formic

HF pn la 75%

HCl 37%

H2SO4 10-75%

H2SO4 98%

Acid tricloracetic, TCA

HNO3 pn la 50%

HNO3

H3PO4 mai concentrat de 40%)


D
A
A

D
B
A

Amoniac

Mg(OH)2

KOH

Baze

Acetal

Acid acetic glacial

Acizi

ABS

N/A

CPVC

LDPE

N/A

PC

N/A

PEEK

PP

PTFE

PVC

PVDF

346
Biologie molecular. Metode experimentale

A
A
D
D
A
A
D

B
B
A
D
B
B
A

Detergeni

Formaldehid

H2O2

Iod

AgNO3

Uree

NaOCl pn la 20%

CPVC

LDPE

N/A

PC

PEEK

PP

PTFE

PVC

PVDF

A = compatibilitate excelent, B = compatibilitate bun, efecte mici o uoar decolorare sau coroziune, C = compatibilitate relativ
bun, efecte mai pronunate, nu se recomand pentru utilizarea continu; pot aprea fenomene de nmuiere sau umflare, D = efecte
severe, nu se recomand utilizarea, N/A = nu exist informaii despre compatibilitate

Acetaldehid

Altele

NaOH pn la 80%

Acetal

ABS

Anex
347

348

Biologie molecular. Metode experimentale

FIGURA A1. Nomogram pentru conversia forei centrifuge (g) n vitez de rotaie
(rpm).
Pentru a identifica pe nomogram o valoare necunoscut se traseaz o dreapt
descris de dou puncte de pe celelalte dou coloane. Valoarea dorit se citete la
intersecia dreptei cu coloana de interes. Pentru centrifugri la viteze mai mari se
folosete nomograma din figura A2. Pentru valori precise, se utilizeaz ecuaia
prezentat n subcapitolul dedicat centrifugarii, pagina 15.

Anex

349

FIGURA A2. Nomogram pentru conversia forei centrifuge (g) n vitez de


rotaie (rpm).
Pentru a identifica o valoare necunoscut folosind nomograma reprezentat n figura se
traseaz o dreapt descris de dou puncte de pe celelalte dou coloane. Valoarea
dorit se citete la intersecia dreptei cu coloana de interes. Pentru valori precise, se
utilizeaz ecuaia prezentat n n subcapitolul dedicat centrifugarii, pagina 15

Biologie molecular. Metode experimentale

350

FIGURA A3. Harta situs-urilor de restricie a plasmidului pUC19c


A. organizarea general a plasmidului (mcs situs multiplu de clonare; lacZ
fragmentul Nterminal al genei ce codific galactozidaza din calea metabolic a
lactozei; Ori originea de replicare provenind din plasmidul pMB1; bla(AmpR) confer
rezisten la ampicilin) B. Secvena n zona MCS

Anex

351

FIGURA A4. Harta situs-urilor de restricie a plasmidului pBluescript II SK


A. organizarea general a plasmidului (mcs situs multiplu de clonare; f1 ori originea
de replicare provenind din fag; lacZ fragmentul Nterminal al genei ce codific
galactozidaza din calea de metabolic a lactozei; Plac promotorul sub controlul cruia
este pus gena clonat; pUC ori originea de replicare provenind de la plasmidul pUC;
bla(ApmR) gena ce confer rezisten la ampicilin) B. Secvena n zona MCS.

352

Biologie molecular. Metode experimentale

FIGURA A5. Harta situs-urilor de restricie a plasmidelor pET21a;

A. organizarea general a plasmidului (mcs situs multiplu de clonare; f1 ori


originea de replicare provenind din fag lacZ fragmentul Nterminal al genei ce codific
galactozidaza din calea metabolic a lactozei; face posibil selecia alb/albastr prin
complementare alfa pe plci cu Xgal; ori originea de replicare provenind de la
plasmidul pUC; lacI represorul din operonul lac cu rol n controlul expresiei genei
clonate; bla(ApmR) gena ce confer rezisten la ampicilin) B. Secvena n zona
MCS.

Anex

353

FIGURA A6. Harta situs-urilor de restricie a plasmidului pMAL-c5X


A. organizarea general a plasmidului (mcs situs multiplu de clonare;
bla(ApmR) gena ce confer rezisten la ampicilin; ori originea de replicare
provenind de la plasmidul pBlueScript; lacIq represorul din operonul lac cu rol n
controlul expresiei genei clonate; P tac promotorul sub controlul cruia este pus gena
clonat; malE maltose binding protein, proteina cu afinitate pentru maltoz din E.coli,
rrnBT1T2 zona de semnalizare a sfritului transcripiei B. Secvena n zona MCS.

Bibliografie pentru Anexa


Bibliography
1. Ausubel, M. F., Brent, R., Kingston, E. R., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, A. J., Struhl, K.
(2002) Short Protocols in Molecular Biology, p A2-1,. John Wiley & Sons Inc.
2. Chothia, C. (1976) The nature of the accessible and buried surfaces in proteins, Journal of
Molecular Biology, 105, 1-12.
3. Sweet, R. M., Eisenberg, D. (1983) Correlation of sequence hydrophobicities measures
similarity in three-dimensional protein structure, Journal of Molecular Biology , 171, 479-88.
4. Dayhoff, M., Schwartz, R., Orcutt, B. (1978) A model of evolutionary change in proteins, Atlas
of Protein Sequence and Structure, 5, 345-352.