Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
CUPRINS
PREFA de GHEORGHE BENGA ....................................................................... XI
INTRODUCERE ................................................................................................. 1
I. TEHNICI DE BAZ UTILIZATE N LABORATORUL DE BIOLOGIE
MOLECULAR .................................................................................................. 3
I.1Sticlriaiinstrumenteledinmaterialeplastice.....................................................3
Siliconareasticlrieiiainstrumentelordinmaterialeplastice....................................4
Splareaiuscareavaselordelaborator......................................................................5
I.2Msurareavolumelor............................................................................................6
Msurareavolumelorcuajutorulpipetelor..................................................................7
I.3Msurareamaselor.............................................................................................12
Instruciuniprivindutilizareabalaneielectroniceanalitice......................................14
I.4Centrifugarea......................................................................................................15
Instruciuniprivindutilizareacentrifugii.....................................................................16
I.5Tehnicidebazfolositepentrumanipulareamicroorganismelor..........................17
Msuridebiosecuritate..............................................................................................17
Tehnicidesterilizare...................................................................................................21
VI
Cuprins
II.2CultivareaE.colipemediisolide........................................................................41
nsmnarealasuprafaamediilordecultursolide................................................42
nsmnareanprofunzimeamediilordecultursolide..........................................44
II.3CultivareaE.colinmediilichide........................................................................47
Inoculareaicultivareafolosindvolumemicidemediu.............................................47
Inoculareaicultivareafolosindvolumemaridemediu............................................48
II.4MonitorizareacreteriibacterieiE.coli nmediilelichide....................................48
Determinareadensitiiopticecuajutorulspectrofotometrului...............................49
Determinareadensitiiopticecuajutorulhemocitometrului...................................51
DeterminareanumruluidebacteriiprincultivarenplciPetri...............................52
II.5PstrareaculturilordeE.coli.............................................................................54
Pstrareaprincongelarela80oC................................................................................55
Cuprins
VII
IV.4IzolareaADNuluidingelurideagaroz...........................................................103
IV.5PstrareaADNuluipurificat...........................................................................107
VIII
Cuprins
VIII.3Purificareaprin IMACaproteinelorrecombinatencondiiinative................192
VIII.4Purificareaprin IMACaproteinelorrecombinatencondiiidenaturante.......198
VIII.5Determinareamaselormolecularenativeutilizndcromatografiadefiltrareprin
gel(GF)..................................................................................................................200
Determinareamaselormolecularenativeutilizndcromatografiadefiltrarepringel
..................................................................................................................................206
CalibrareacoloaneideGFicalculareamaselormolare..........................................208
Cuprins
IX
ObinereaanticorpilorpoliclonalifolosindadjuvantulFreund.................................275
XI.2Imunoblotingul..............................................................................................278
Electrotransferulproteinelorpemembranensistemsemiuscat..........................279
Imunodeteciaproteinelortransferatepemembranedenitroceluloz...................282
PREFA
Biologia molecular poate fi definit cel mai simplu ca fiind un
concept de studiere a materiei vii prin prisma relaiei structur-funcie la
nivel molecular. Este un concept ce a revoluionat tiinele biologice i
medicale ncepnd cu a doua jumtate a secolului XX. Dar pe lng noile
cunotine teoretice, revoluia produs de biologia molecular a fost
posibil i datorit introducerii de noi metode i tehnici de laborator.
Toate lucrrile experimentale de biologie molecular implic utilizarea
unor astfel de metode i tehnici. De aici rezult i necesitatea unor cri
care s-i ajute pe cercettori n munca zilnic la masa de laborator
(bench). n Romnia nu cunosc s se fi scris o asemenea carte, care s
descrie toate metodele i tehnicile de biologie molecular la modul practic
de lucru.
Efortul tinerilor colegi Marius Mihan, Marius tefan i Zenovia
Olteanu de a redacta o astfel de carte mi se pare de aceea deosebit de
ludabil i rezultatul este o lucrare de mare valoare.
Merit subliniat c sunt descrise pe de o parte unele tehnici de
baz n laboratorul de biologie molecular (dar i n laboratoarele de
analize biomedicale, de biochimie i chimie clinic, de microbiologie, de
biofizic etc), precum: pregtirea sticlriei i a vaselor de laborator,
msurarea volumelor, a maselor, centrifugarea, tehnicile de baz folosite
pentru manipularea microorganismelor, metodele de determinare a
proteinelor, separarea electroforetic a proteinelor, tehnici de imunologie
(obinerea de anticorpi policlonali, imunodetecia proteinelor transferate
pe membrane de nitroceluloz) etc. Pe de alt parte sunt descrise metode
specifice biologiei moleculare: plasmide i tulpini de Escherichia coli
folosite frecvent n biologia molecular, izolarea ADN-ului, purificarea
proteinelor prin cromatografie de afinitate, metode computaionale de
studiu a proteinelor.
Descrierea metodelor i a tehnicilor este foarte bine fcut, de la
principiile teoretice, avantajele i limitele, pn la descrierea concret a
materialelor necesare i a modului de lucru.
n acest fel cartea este un valoros ghid pentru lucrul n laborator,
att pentru nceptori (studeni, masteranzi, doctoranzi), ct i pentru
avansai (cercettori postdoctorali, cadre didactice din nvmntul
Prefa
XII
INTRODUCERE
Dac biologia clasic s-a dezvoltat i a atins nivelul de cunoatere
de astzi prin folosirea cu precdere a studiilor observaionale, biologia
modern se bazeaz n mod fundamental pe noiunea de experiment i
pe procesul de experimentare n scopul dobndirii de noi informaii i
cunotine. Experimentul are rolul de a verifica validitatea unei ipoteze
formulate n prealabil utiliznd pentru aceasta un ansamblu de tehnici i
metode. Reuita unui experiment, adic formularea fr echivoc a unei
concluzii legate de ipoteza de testat, depinde n mare msur de
capacitatea cercettorului de a concepe un model de studiu, de a alege i
de a utiliza n mod corect una sau mai multe metode de investigaie.
Majoritatea lucrrilor de profil din ultima decad, care descriu
metode i tehnici de laborator utilizate n biochimie, enzimologie,
biologie celular i molecular, au fost realizate cu precdere n scopuri
didactice, fiind utilizate ca suport pentru prelegerile teoretice. Metodele
experimentale sunt reduse frecvent la un set de indicaii simple i clare pe
care studenii s le poat urma cu uurin. Lipsa unor informaii generale
despre principiile teoretice i aplicabilitatea metodelor dau ns o fals
impresie de imuabilitate a protocoalelor experimentale, ceea ce face ca
experimentatorul s fie pus deseori n dificultate atunci cnd trebuie s
adapteze metoda n mod specific.
n acest context, lucrarea de fa se dorete a fi un ghid detaliat al
unor metode-cheie, utilizate frecvent n biologia molecular, concentrndu-se nu numai pe simpla formulare a unor protocoale experimentale, ci
i pe explicarea principiilor din spatele fiecrei metode n scopul
precizrii spectrului de aplicabilitate i a rezultatelor scontate. Fiecare din
metodele prezentate au fost testate i utilizate de ctre autori n cadrul
Laboratorului de Biochimie i Biologie Molecular al Facultii de
Biologie, Universitatea Alexandru Ioan Cuza din Iai. Modul de
prezentare este adaptat specificului fiecrei metode n parte, cuprinznd n
general cinci seciuni distincte:
1.
principiul metodei ofer informaii legate de bazele teoretice ale
metodei utilizate;
2.
avantaje furnizeaz informaii legate de domeniul de aplicabilitate al metodei, rezultatele ateptate corelate cu date legate de
sensibilitate, randament etc.;
3.
ANEX
Factor de multiplicare
Abreviere
Atto
10-18
Femto
10-15
Pico
10-12
Nano
Micro
-9
-6
-3
10
10
Mili
10
Centi
10-2
Deci
10-1
Deca
10
da
Hecto
Kilo
10
10
Myria
10
my
Mega
106
Giga
109
Tera
Peta
Exa
12
15
18
10
10
10
336
n:
se multiplic cu:
Microlitri (l)
103
Mililitri (ml)
Litri (l)
10-3
Galoane (US)
2.641 x 10-4
10-6
Litri (L)
6,102 x 10-2
Microlitri (l)
106
Mililitri (ml)
103
Galoane (US)
0,2642
3
103
10-3
Mililitri (ml)
Microlitri (l)
61.02
Litri (l)
10-3
Microlitri (l)
103
Mililitri (ml)
10-3
Litri (l)
10-6
Anex
337
n:
se multiplic cu:
Concentraia
Miligrame per litru (mg/l) Pri pe milion (ppm)
Distana
Centimetri (cm)
Inchi (in)
Milimetri (mm)
Angstromi ()
3,281 x 10-2
Inchi (in.)
0,39
Metri (m)
10-2
Milimetri (mm)
10
Yarzi (yd)
1,094 x 10-2
Centimetri (cm)
2,54
8,333 x 10-2
Metri (m)
2,540 x 10-2
Milimetri (mm)
25,4
Yarzi (yd)
2,778 x 10-2
Centimetri (cm)
0,1
3,281 x 10-3
Inchi (in.)
3,937 x 10-2
Metri (m)
10-3
Nanometri (nm)
0,1
Metri (m)
10-10
Picometri (pm)
100
6,45
104
Curentul i sarcina
electric
Amperi pe centimetru
ptrat (A/cm2)
338
n:
se multiplic cu:
Amperi pe centimetru
ptrat (A/cm2)
0,16
1,55 x 103
Coulombi (C)
3,6 x 103
Faraday (F)
3,731 x 10-2
Coulombi (C)
Faraday (F)
1,036 x 10-5
Coulombi pe centimetru
ptrat (C/cm2)
Amperi or (A-hr)
Coulombi pe metru
patrat (C/m2)
Coulombi pe inci ptrat
(C/in2)
Faraday (F)
104
1,55 x 103
Amperi-or (A-hr)
26.,8
Coulombi (C)
9,649 x 10-4
Bari
1,01
Presiunea
Atmosfere (atm)
Milimetri coloana de Hg
(mmHg) sau torri
Atmosfere (atm)
0,99
Kilograme pe metru
ptrat (kg/m2)
1,020 x 104
psi
14,5
Atmosfere (atm)
1,316 x 10-3
Kilograme pe metru
ptrat (kg/m2)
136
Anex
339
n:
se multiplic cu:
Pascali (P)
Rezistena electric
Ohmi ()
Megaohmi (M)
106
Microhmi ()
10-6
Ore (hr)
24
Minute (min)
1,44 x 103
Secunde (sec)
8,64 x 104
K-273,13
[(K 273,13)
95] + 32
1,8 x oC + 32
(F -32)/1,8
Picioare pe minut
(ft/min)
1,2
Picioare pe secund
(ft/sec)
3,281 x 10-2
Timp
Zile
Temperatura
Grade Kelvin (K)
C + 273,13
Viteza
Centimetri pe secund
(cm/s)
2,237 x 10-2
Mile pe minut
(miles/min)
3,728 x 10-4
340
22% (w/w)
Molecule mici
Ap
70% (w/w)
Monoglucide
3% (w/w)
Lipide
2% (w/w)
Aminoacizi liberi
0,4% (w/w)
Nucleotide
0,4% (w/w)
Ioni anorganici
1% (w/w)
Na+
5-15 mM
K+
140 mM
Mg2+
Ca
Cl
2+
pH
30 mM
1-2 mM
4 mM
7,4
Anex
341
342
Nucleotid
Adenin
Citozin
Guanin
Timin
Uracil
Prescurtarea
cu trei litere
Ala
Arg
Asn
Asp
Cys
Glu
Gln
Gly
His
Ile
Leu
Lys
Met
Aminoacid
Alanin
Arginin
Asparagin
Acid aspartic
Cistein
Glutamat
Glutamin
Glicin
Histidin
Isoleucin
Leucin
Lizin
Metionin
149.2
146.2
131.2
131.2
155.2
75.1
146.2
147.1
121.2
133.1
132.1
174.2
89.1
Prescurtarea cu o Mas
liter
molar
(g/mol)
185
200
170
175
195
75
180
190
135
150
160
225
115
Aria
suprafeei
accesibilea
1.02
-0.67
1.22
1.25
-0.64
-0.67
-0.91
-1.22
0.17
-1.31
-0.92
-0.59
-0.4
94
56
40
96
66
49
93
102
20
106
134
65
100
HidroMutabilitate
b
fobicitate relativ c
Anex
343
Pro
Ser
Thr
Trp
Tyr
Val
Prolin
Serin
Treonin
Triptofan
Tirozin
Valin
117.1
181.2
204.2
119.1
105.1
115.1
165.2
Prescurtarea cu o Mas
liter
molar
(g/mol)
155
230
255
140
115
145
210
Aria
suprafeei
accesibilea
0.91
1.67
0.5
-0.28
-0.55
-0.49
1.92
74
41
18
97
120
56
41
HidroMutabilitate
fobicitateb relativ c
Aria suprafeei accesibile este exprimat n i este calculat pentru fiecare aminoacid ca parte a unui schelet polipeptidic (2)
Hidrofobicitatea este exprimat n uniti arbitrare folosind scala OMH descrisa de Sweet i Eisenberg (1983) (3)
c
Mutabilitatea relativ este exprimat n uniti arbitrare (alanina fiind aleas ca referin) i reprezint probabilitatea ca un aminoacid s sufere o mutaie ntr-un timp
dat (4)
Phe
Fenilalanin
Prescurtarea
cu trei litere
Aminoacid
344
Biologie molecular. Metode experimentale
A
N/A
A
C
D
C
A
D
D
D
D
D
D
D
D
Benzen
Cloroform
Diclorbenzen
Hexan
Nitrobenzen
Fenol
Toluen
Dicloretan
A
A
A
A
A
A
D
N/A
B
D
Alcool amilic
Alcool benzilic
Alcool izopropilc
Etanol
Metanol
Alcooli
N/A
Acrilonitril
A
Acetal
Aceton
Sloveni organici
ABS
CPVC
N/A
LDPE
N/A
PC
PEEK
PP
TABEL A8. Compatibilitate chimic a diverselor tipuri de materiale plastice utilizate n laborator:
PTFE
PVC
N/A
N/A
PVDF
Anex
345
B
A
D
C
D
N/A
N/A
D
D
D
D
D
D
C
A
B
N/A
N/A
C
D
D
Acid citric
Acid formic
HF pn la 75%
HCl 37%
H2SO4 10-75%
H2SO4 98%
HNO3 pn la 50%
HNO3
D
B
A
Amoniac
Mg(OH)2
KOH
Baze
Acetal
Acizi
ABS
N/A
CPVC
LDPE
N/A
PC
N/A
PEEK
PP
PTFE
PVC
PVDF
346
Biologie molecular. Metode experimentale
A
A
D
D
A
A
D
B
B
A
D
B
B
A
Detergeni
Formaldehid
H2O2
Iod
AgNO3
Uree
NaOCl pn la 20%
CPVC
LDPE
N/A
PC
PEEK
PP
PTFE
PVC
PVDF
A = compatibilitate excelent, B = compatibilitate bun, efecte mici o uoar decolorare sau coroziune, C = compatibilitate relativ
bun, efecte mai pronunate, nu se recomand pentru utilizarea continu; pot aprea fenomene de nmuiere sau umflare, D = efecte
severe, nu se recomand utilizarea, N/A = nu exist informaii despre compatibilitate
Acetaldehid
Altele
NaOH pn la 80%
Acetal
ABS
Anex
347
348
FIGURA A1. Nomogram pentru conversia forei centrifuge (g) n vitez de rotaie
(rpm).
Pentru a identifica pe nomogram o valoare necunoscut se traseaz o dreapt
descris de dou puncte de pe celelalte dou coloane. Valoarea dorit se citete la
intersecia dreptei cu coloana de interes. Pentru centrifugri la viteze mai mari se
folosete nomograma din figura A2. Pentru valori precise, se utilizeaz ecuaia
prezentat n subcapitolul dedicat centrifugarii, pagina 15.
Anex
349
350
Anex
351
352
Anex
353